Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ fallopia multiflora (thunberg) haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao TT

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MU

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ THOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ

FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2021

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Hải Đăng

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Ngày nay, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên đang có xu hướng tăng mạnh, do đó cần có biện pháp quản lý chất lượng dược liệu từ khâu nguyên liệu đến sản phẩm Chất lượng dược liệu phần lớn phụ thuộc vào thành phần hoạt chất, những chất hoá học có hoạt tính sinh học đóng góp vào tác dụng dược lý của dược liệu đó Có nhiều nguyên nhân có thể ảnh hưởng đến thành phần hoạt chất trong dược liệu bao gồm nguồn gốc nguyên liệu không đảm bảo; địa hình địa lí trồng trọt, thu hoạch và bảo quản dược liệu Cũng có thể do quá trình chế biến dược liệu không đúng kỹ thuật dẫn đến mất hoạt chất hoặc biến đổi hoạt chất, từ hoạt chất có lợi thành chất gây hại cho con người Ngoài ra, hoá chất độc hại cũng có thể được sử dụng trong bảo quản dược liệu Thậm chí, một số dược liệu có thành phần hoạt chất thấp hoặc dược liệu giả mạo cũng được bán trên thị trường với danh nghĩa là dược liệu quý Do vậy dược liệu nói chung cần được kiểm tra chất lượng sản phẩm đặc biệt là hàm lượng các hoạt chất có trong thành phần dược liệu nhằm đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng, bảo vệ sức khỏe con người

Hà thủ ô đỏ là một loại dược liệu phổ biến sử dụng trong chế biến thuốc đông dược Dược liệu này được sử dụng trong các sản phẩm đông dược dùng làm thuốc bổ, nhuận tràng, trị thần kinh suy nhược, các bệnh về thần kinh, bổ máu, làm đen râu tóc Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ được coi là một vị thuốc quý và an toàn do quan niệm dân gian và có nguồn gốc tự nhiên Ngày nay, hà thủ ô đỏ đã được chế ở rất nhiều dạng khác nhau như: dược liệu miếng hà thủ ô chế, bột hà thủ ô, trà hà thủ ô, viên thuốc hà thủ ô đỏ Các sản phẩm này được bày bán tại các hiệu thuốc tây y, hiệu thuốc đông y và có thể mua một cách dễ dàng Điều này khẳng định dược liệu hà thủ ô đỏ đỏ được coi là sản phẩm an toàn Tuy nhiên, trên sản phẩm, hàm lượng các hoạt chất của dược liệu được công bố không chi tiết và không có cảnh báo dùng trong bao lâu

Do vậy có thể dẫn đến hàm lượng hoạt chất không đủ để cải thiện trình trạng bệnh, hoặc tác dụng tích cực

Mặt khác, gần đây đã và đang có một số báo cáo khoa học công bố về một số tác dụng phụ có liên quan đến hà thủ ô đỏ Các công bố này chủ yếu đưa ra các cảnh báo về các tác dụng phụ do sử dụng các chế phẩm hà thủ ô đỏ trong thời gian dài Tuy cơ chế gây độc chưa được làm sáng tỏ nhưng đã cảnh báo rằng khi liều dùng không phù hợp sẽ gây lên những tác động xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng Vì vậy, nhằm sử dụng dược liệu một cách an toàn và hiệu quả cần tăng cường quản lý chất lượng thông qua đánh giá hàm lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Để góp phần đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ trên thị trường Việt Nam, trước tiên phải xác định rõ thành phần hoá học của chúng, phân lập và

xác định cấu trúc của những hoạt chất chính Từ đó thiết lập các điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm phân tích định tính và định lượng các hoạt chất của các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu

phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg)

Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của rễ củ hà thủ ô đỏ Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất phân lập được Ứng dụng quy trình phân tích đã thiết lập đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ Các kết quả nghiên cứu đạt được làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái tại Hà Giang, Việt Nam

Thiết lập một số điều kiện phân tích sắc ký HPLC trên thiết bị HPLC-DAD-MS từ chất sạch phân lập được Lập đường chuẩn định lượng và thẩm định quy trình phân tích đã thiết lập theo tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức AOAC

Ứng dụng quy trình phân tích đã thiết lập phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất trên một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, so sánh và đưa ra kết luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chi Fallopia

1.2 Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ

1.3 Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ trên thế giới

1.3.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

1.3.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.3.3 Các nghiên cứu về khả năng gây độc gan của hà thủ ô đỏ

1.3.4 Các nghiên cứu về phân tích định tính, định lượng hoạt chất của hà thủ ô đỏ

1.4 Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ tại Việt Nam

1.5 Tổng quan về thẩm định phương pháp phân tích

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được thu hái tại huyện Phó Bảng, tỉnh Hà Giang vào tháng 10 năm 2014 Kích cỡ củ tươi trong khoảng 2-5 x 15-20 cm, khoảng 3÷4 năm tuổi Tên khoa học được xác định bởi TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được thu hái tự nhiên hoặc được thu mua từ các thị trường dược liệu và được

mã hóa Mẫu HG là mẫu được sử dụng để tiến hành phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học các hợp chất trong hà thủ ô đỏ Đồng thời các chất được phân lập từ mẫu HG được sử dụng làm chất chuẩn sử dụng trong quá trình định lượng Mẫu TT6 được sử dụng trong nghiên cứu xác định độ thu hồi của phương

pháp định lượng Các mẫu còn lại được sử dụng nhằm định lượng các hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ

từ nhiều nguồn khác nhau trên thị trường Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC): sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn TLC Silica gel 60

F254 (Merck 1,05715), RP-18 F254S (Merck) Vị trí chất trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến hiện màu

Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với pha tĩnh là silica gel pha thường và pha đảo,

sephadex LH-20 hoặc nhựa trao đổi diaion HP-20 (Sigma) Bột sắc ký silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck) Bột sắc ký silica gel pha đảo RP-C18 có cỡ hạt 12 nm

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được là sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm:

Phương pháp phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên hệ máy

Agilent 1260 series LC-MS single quadrupole 6120 của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phương pháp phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): phổ khối phân giải cao được đo trên

máy Mass Spectrometter LTQ Orbitrap XL tại khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy

Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là TMS (tetramethyl silan)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY và NOESY

Điểm nóng chảy (Mp): đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Độ quay cực riêng [α]D: đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.4 Phương pháp phân tích định tính, định lượng các hợp chất

Hàm lượng các hợp chất được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và được thực hiện trên thiết bị HPLC-DAD-MS Agilent Technologies 1260 của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất chuẩn sử dụng khi thiết lập đường chuẩn là chất sạch được phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang Chất sạch sau khi phân lập được chạy kiểm tra độ tinh khiết để đảm bảo độ sạch cho thiết bị HPLC

Hòa với 2 lít nước, chiết với 1 lít n-hexane (3 lần),

cất loại dung môi

Chiết với 1 lít ethyl acetate (3 lần), cất loại dung môi

(28,8 g)

FMWC (62,9 g)

CC, diaion HP-20, M/W (gradient)

CC: Column chromatography M: methanol

W: nước

Hình 2.2 Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu củ hà thủ ô đỏ

FMWC (62,9 g)

CC, silica gel Gradient, 100%D → 100%M

CC, silica gel D/M-6/1

FMWC6 (5,0 g) FMWC7 (8,0 g)

CC, LH-20 M/W-1/1,2

CC,YMC-RP18 A/W-1/3 FMW6.2

CC, silica gel D/M/W-5/1/0,01

CC, silica gel D/M-6/1

CC, LH-20 M/W-1/1

CC,YMC-RP18 A/W-1/1,5

FMWC5 (1,1 g)

FM3

(8 mg)

FMW5.1

CC,YMC-RP18 A/W-1/1,5

CC,YMC-RP18 A/W-1/2

CC, LH-20 M/W-1/1,2 A: acetone

FME (214,5 g)

CC, silica gel Gradient, 100%H → 100%A

CC, silica gel D/M-16/1

CC, silica gel H/A-1/1

CC: Column chromatography A: acetone

D: dichloromethane H: hexane

M: methanol W: nước

CC, LH-20 M/W-1/1

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn ethyl acetate mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ

Như vậy, tiến hành phân lập mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang thu được tổng số 11 hợp chất sạch

Các hợp chất được kí hiệu từ FM1 đến FM11

2.4 Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các hợp chất

2.4.1 Hợp chất FM3: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid

8-O-β-D-glucopyranoside (chất mới)

Chất dạng bột màu vàng nhạt Độ quay cực riêng [a]𝐷24 = +23,4o (c = 0,05, CH3OH) HR-ESI-MS

m/z 433,1110 [M+Na]+ Tính toán lí thuyết cho công thức C19H22NaO10, 433,1111 Công thức phân tử:

C19H22O10 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,30 (3H, s, 3-CH3), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,56 (1H, m,

H-5′), 3,54 (1H, m, H-3′), 3,58 (1H, m, H-2′), 3,77 (1H, dd, J = 12,5, 5,5 Hz, Hb-6′), 3,88 (3H, s, OCH3),

3,96 (1H, dd, J = 12,5, 2,5 Hz, Ha-6′), 5,12 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 7,05 (1H, m, H-4) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,8 (C-1), 123,9 (C-2), 135,5 (C-3), 120,3 (C-4), 102,5 (C-5), 160,4 (C-6), 104,4 (C-7), 157,2 (C-8), 110,3 (C-9), 139,1 (C-10), 171,0 (C-11), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,1 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,3 (C-4′), 78,8 (C-5′), 62,4 (C-6′)

2.4.2 Hợp chất FM4: 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (chất mới)

Chất dạng bột màu vàng cam Độ quay cực riêng [a]𝐷24 = +12,6o (c = 0,05, CH3OH) HR-ESI-MS

m/z 549,1578 [M+Na]+, tính toán lí thuyết cho công thức C24H30NaO13, 549,1584 Công thức phân tử:

C24H30O13 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,28 (3H, s, 3-CH3), 2,60 (3H, s, CH3CO), 3,36 (2H,

m, H-5″), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,51 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-3′), 3,57 (1H, m, H-2′), 3,68 (1H, m, H-5′), 3,70

(1H, m, Hb-6′), 3,80 (1H, d, J = 9,5 Hz, Hb-4″), 4,01 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2″), 4,04 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha

-4″), 4,12 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha-6′), 5,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1″), 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,72 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 6,91 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD),

 (ppm): 154,0 (C-1), 123,2 (C-2), 135,2 (C-3), 119,6 (C-4), 105,5 (C-5), 158,1 (C-6), 104,9 (C-7), 157,4

(C-8), 109,7 (C-9), 139,3 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,6 (CH3CO), 20,2 (3-CH3), 104,3 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,5 (C-4′), 77,6 (C-5′), 68,6 (C-6′), 111,0 (C-1″), 78,1 (C-2″), 80,5 (C-3″), 75,1 (C-4″), 65,7 (C-5″)

2.4.3 Hợp chất FM1: Emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)

Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng cam ESI-MS m/z 269,0 [M-H]- Công thức phân tử:

C15H10O5 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6), H (ppm): 2,36 (3H, s, 3-CH3), 6,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2),

7,04 (2H, br s, H-4, 7), 7,37 (1H, br s, H-5) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6), C (ppm): 161,2 (C-1), 123,7 (C-2), 147,9 (C-3), 120,1 (C-4), 107,6 (C-5), 165,3 (C-6), 108,5 (C-7), 164,2 (C-8), 189,3 (C-9), 180,9 (C-10), 134,8 (C-11), 108,6 (C-12), 113,0 (C-13), 132,5 (C-14), 21,2 (3-CH3)

2.4.4 Hợp chất FM2: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-gluopyranoside

Chất dạng bột vô định hình màu nâu ESI-MS m/z 429,0 [M+Na]+ Công thức phân tử: C20H22O9

1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 3,85-3,44 (6H, m, 6H của phân tử đường), 4,53 (1H, d, J = 8,0

Hz, H-1″), 6,28 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-4), 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,64 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 7,47 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′), 6,95 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 7,73 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 121,6 (C-1), 137,8 (C-2), 151,9 (C-3), 103,5 (C-4), 155,8 (C-5), 108,1 (C-

6), 133,6 α), 130,8 β), 130,0 1′), 129,1 2′), 116,4 3′), 158,2 4′), 116,4 5′), 129,1 6′), 102,7 (C-1″), 75,4 (C-2″), 77,8 (C-3″), 70,7 (C-4″), 78,1 (C-5″), 62,0 (C-6″)

(C-6′)

2.4.6 Hợp chất FM6: Physcionin (Physcion 8-β-D-glucopyranoside)

Chất dạng bột màu vàng ESI-MS m/z 469,1 [M+Na]+ Công thức phân tử C22H22O10 1H-NMR

(500 MHz, DMSO-d 6), H (ppm): 2,41 (3H, s, 3-CH3), 3,17 (1H, m, H-4′), 3,35 (1H, m, H-3′), 3,46 (2H, m, H-2′, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 10,0, 5,5 Hz, Ha-6′), 3,95 (3H, s, 6-OCH3), 5,16 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 7,17 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 7), 7,35 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,47 (1H, br s, H-4) 13C-NMR (125 MHz,

DMSO-d 6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,2 (C-2), 147,1 (C-3), 119,3 (C-4), 106,5 (C-5), 164,7 (C-6), 107,3 (C-7), 160,6 (C-8), 186,4 (C-9), 181,8 (C-10), 136,3 (C-11), 114,4 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C-14), 21,4 (3-CH3), 56,0 (6-OCH3),100,6 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,5 (C-3′), 69,8 (C-4′), 77,4 (C-5′), 60,7 (C-6′)

2.4.7 Hợp chất FM7: Benzyl gentiobioside

Chất dạng bột màu trắng ESI-MS m/z 431,2 [M-H]- Công thức phân tử: C19H28O11 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 3,26 (2H, m, H-2′, 2″), 3,29 (1H, m, H-3′), 3,30 (2H, m, H-4″, 5″), 3,38 (1H, m, H-3″), 3,30 (1H, m, H-4′), 3,48 (1H, m, H-5′), 3,68 (1H, m, Hb-6″), 3,83 (1H, m, Hb-6′), 3,89 (1H, m, Ha-

6″), 4,19 (1H, dd, J = 11,5, 1,5 Hz, Ha-6′), 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 4,44 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 4,68 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-7), 4,94 (1H, d, J = 12,0 Hz, Ha-7), 7,28 (1H, br d, H-4), 7,34 (2H, br d, H-3, 5), 7,44 (2H, br d, H-2, 6) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 138,9 (C-1), 129,3 (C-2, 6), 129,2 (C-

3, 5), 128,7 (C-4), 72,0 (C-7), 103,3 (C-1′), 75,0 (C-2′, 2″), 77,9 (C-3′, 3″, 5″), 71,4 (C-4′), 77,0 (C-5′), 69,7

(C-6′), 104,8 (C-1″), 71,5 (C-4″), 62,6 (C-6″)

2.4.8 Hợp chất FM8: emodin-8-β-D-glucopyranoside

Chất dạng bột màu vàng cam ESI-MS m/z 455,0 [M+Na]+ Công thức phân tử C21H20O10 1H-NMR

(500 MHz, DMSO-d 6), H (ppm): 2,40 (3H, s, 3-CH3), 3,16 - 3,44 (4H, m, H của đơn vị đường), 3,52 (1H,

dd, J = 11,5, 5,0 Hz, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 5,0 Hz, Ha-6′), 5,04 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 7,00 (1H, d, J

= 2,0 Hz, H-2), 7,14 (1H, br s, H-7), 7,27 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,45 (1H, br s, H-4) 13C-NMR (125

MHz, DMSO-d 6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,1 (C-2), 146,7 (C-3), 119,1 (C-4), 108,4 (C-5), 164,1 (C-6), 100,8 (C-7), 161,1 (C-8), 186,3 (C-9), 182,1 (C-10), 136,4 (C-11), 113,0 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C-14), 21,3 (3-CH3), 100,8 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,3 (C-3′), 69,4 (C-4′), 77,2 (C-5′), 60,5 (C-6′)

2.4.9 Hợp chất FM9: Resveratrol

Chất dạng bột vô định hình màu vàng cam ESI-MS m/z 229,1 [M+H]+ Công thức phân tử:

C14H12O3 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4), 6,47 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 6), 6,77 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,83 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 6,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α), 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 141,2 (C-1), 105,7 (C-2, 6),

159,6 (C-3, 5), 102,6 (C-4), 129,4 (C-α), 127,0 (C-β), 130,4 (C-1′), 128,7 (C-2′, 6′), 116,4 (C-3′, 5′), 158,3 (C-4′)

2.4.10 Hợp chất FM10: Torachrysone 8-O-β- D -glucopyranoside

Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng chanh ESI-MS m/z 431,1 [M+Na]+ Công thức phân tử:

C20H24O9 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,29 (3H, s, 3-CH3), 2,59 (3H, s, CH3CO), 3,46 (1H, t,

J = 9,0 Hz, H-4′), 3,52 (1H, m, H-5′), 3,56 (1H, m, H-2′), 3,58 (1H, m, H-3′), 3,77 (1H, dd, J = 1,0, 12,5

Hz, Hb-6′), 3,86 (3H, s, OCH3), 3,95 (1H, d, J = 1,0 Hz, Ha-6′), 5,10 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,81 (1H, br

s, H-5), 7,00 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,6 (C-1), 123,9 (C-2), 135,4 (C-3), 120,3 (C-4), 102,4 (C-5), 160,3 (C-6), 104,3 (C-7), 157,1 (C-8), 110,2 (C-9), 139,0 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,5 (CH3CO), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,2 (C-1′), 74,8 (C-2′),

2.5 Kết quả thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC

Trong số 11 hợp chất sạch đã phân lập được từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang, các chất sạch đảm bảo độ sạch và cung cấp đủ lượng chất cho quá trình định lượng được lựa chọn nhằm thiết lập quy trình

định lượng trên thiết bị HPLC Kết quả đã lựa chọn được 7 chất sạch bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4,

FM5, FM6 và FM8 Các chất này được sử dụng là chất tham chiếu cho quá trình định lượng

Các điều kiện HPLC được nghiên cứu bao gồm: thể tích bơm mẫu, cột sắc ký, bước sóng detector, pha động và thành phần pha động, thời gian lưu và độ tinh khiết chất phân tích và khảo sát hệ thống LC/MS

Sau quá trình khảo sát thu được các kết quả sau:

Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại các chất tham chiếu được trình bày trong bảng 2.2:

Bảng 2.2 Bước sóng hấp thụ cực đại của các chất tham chiếu

Các chất FM2, FM3 và FM4 hấp thụ cực đại tại bước sóng 320 nm; FM1, FM5, FM6 và FM8

hấp thụ cực đại tại bước sóng 280 nm Để đảm bảo độ nhạy cho phép phân tích, lựa chọn hai bước sóng

280 nm và 320 nm để định lượng đồng thời bảy hợp chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ

Điều kiện chạy sắc kí:

Cột tách sắc ký: cột XDB C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm)

Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút

Thể tích bơm mẫu: 1 µL

Thành phần pha động: MeOH - nước (0,1% axit acetic), chạy hệ gradient như sau:

Thời gian (phút) % MeOH % H2O (0,1% axit acetic)

Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết chất tham chiếu được trình bày trong bảng 2.3:

Bảng 2.3 Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết các chất tham chiếu

Pic ion giả phân tử được lựa chọn trong hệ LC/MS được trình bày trong bảng 2.4:

Bảng 2.4 Pic ion giả phân tử các chất tham chiếu trên hệ thống LC/MS

2.6 Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng

Sử dụng các chất sạch tham chiếu đã được kiểm tra và đạt độ tinh khiết cần thiết pha dung dịch chuẩn Chạy HPLC theo quy trình đã thiết lập thu được phương trình đường chuẩn định lượng cho từng chất tham chiếu, trình bày trong bảng 2.6:

Bảng 2.6 Kết quả phương trình đường chuẩn định lượng 7 hợp chất

2.7 Quy trình xử lí mẫu phân tích

Mẫu dược liệu phân tích ở các dạng khác nhau được cắt nhỏ đến kích thước ≤ 3 mm rồi phơi khô tự nhiên Cân chính xác 5 gam mẫu, chiết với 25 mL MeOH trong ống falcon 50 mL, đặt trong máy siêu âm

20 phút, lọc dịch chiết bằng giấy lọc thường chuyển vào bình định mức 100 mL Chiết lặp lại 3 lần, thu tất

cả dịch lọc chuyển vào bình định mức 100 mL, định mức bằng MeOH đến vạch

Dùng xilanh hút dịch chiết từ bình định mức 100 mL bơm qua màng lọc mẫu kích thước 0,45 µm Dịch lọc được chuyển vào lọ chứa mẫu rồi đưa vào hệ thống HPLC

2.8 Kết quả thẩm định phương pháp định tính, định lượng

2.8.1 Kết quả xác định tính chọn lọc của phương pháp

Trong sắc ký lỏng sử dụng detector DAD, có thể xác định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của pic sắc kí Độ tinh khiết của pic được xác định bằng cách so sánh phổ UV của pic phát hiện trên sắc ký đồ với pic của chất tham chiếu

Mặt khác, hệ thống HPLC thực nghiệm được kết nối với hệ thống MS Do vậy độ chọn lọc của phương pháp còn được xác định thông qua việc so sánh phổ MS của chất phân tích với phổ MS của chất tham chiếu tương ứng

2.8.2 Kết quả xác định LOD, LOQ

Tiến hành phân tích mẫu chuẩn các chất tham chiếu ở nồng độ thấp gần giá trị nồng độ nhỏ nhất của đường chuẩn Tiến hành thí nghiệm lặp lại 10 lần, tính độ lệch chuẩn SD Khi đó giá trị LOD và LOQ được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn SD

Tiến hành thí nghiệm phân tích với mẫu chuẩn các chất có nồng độ 10 µg/mL, kết quả xác định LOD và LOQ được trình bày trong bảng 2.7:

Bảng 2.7 Kết quả xác định LOD và LOQ

LOQ (µg/mL)