Nghiên cứu đề xuất phương pháp phân tích đa dư lượng hoạt chất bvtv trong chè

Việc phân tích, kiểm soát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong chè hiện nay còn gặp nhiều khó khăn do trong chè có chứa nhiều chất tananh, loại bỏ cơ chất trong khi phân tích dư lượng th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

***

VŨ LÊ TIẾN

NGHIÊN CỨU ĐỀ XUẤT PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

ĐA DƯ LƯỢNG HOẠT CHẤT THUỐC BVTV TRONG CHÈ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà Nội - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

***

VŨ LÊ TIẾN

NGHIÊN CỨU ĐỀ XUẤT PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

ĐA DƯ LƯỢNG HOẠT CHẤT THUỐC BVTV TRONG CHÈ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS ĐINH THỊ PHƯƠNG ANH

Hà Nội - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này do bản thân tôi thực hiện, những kết quả nghiên cứu được đưa ra trong luận văn này là của bản thân tôi và chưa từng được ai nghiên cứu, sử dụng và công bố trên các tạp chí khoa học trước đây, các số liệu và kết quả nghiên cứu được thực hiện một cách trung thực và chính xác

LỜI CẢM ƠN

 

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Thị Phương Anh, bộ môn Công nghệ Hóa Dược và Bảo vệ thực vật, Đại học Bách Khoa Hà nội đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, phương pháp nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và các thầy, cô giáo Viện Kỹ Thuật Hóa Học - Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình dạy bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nội dung học tập và thực hiện đề tài thuận lợi

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, lãnh đạo và cán bộ Phòng Kiểm định Dư lượng và Chất luợng thuốc BVTV, phòng khảo nghiệm thuốc BVTV – Trung tâm Kiểm định và Khảo nghiệm thuốc BVTV phía Bắc – Cục Bảo Vệ ThựcVật đã tạo điều kiện, giúp

đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, và các bạn cùng lớp cao học Kỹ thuật hóa học 2016A đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hện luận văn

Hà Nội, tháng 9 năm 2018

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật 3

1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật 3

1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật 3

1.1.2.1 Phân loại theo độ độc 3

1.1.2.2 Phân loại theo mục đích sử dụng 4

1.1.2.2.1 Phân loại theo mục đích sử dụng: 4

1.1.2.2.2 Phân loại theo độ bền vững 9

1.1.2.2.3 Phân loại theo cơ chế tác động 9

1.2 Sơ lược về một số hóa chất bảo vệ thực vật trong nghiên cứu 10

1.2.1 Acephate 10

1.2.2 Acetamiprid 11

1.2.3 Buprofezin 12

1.2.4 Chlorothalonil 13

1.2.5 Fipronil 14

1.2.6 Hexaconazole 15

1.2.7 Profenofos 17

1.3 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần HPLC- MS/MS 18

1.3.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 19

1.3.1.1 Pha tĩnh trong HPLC 20

1.3.1.2 Pha động trong HPLC 20

1.3.2 Nguồn ion hóa và bộ phận phân tích khối phổ 21

1.3.2.1 Bộ phận phân tích khối phổ 21

1.3.2.2 Các nguồn ion hóa 24

1.3.2.2.1 Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI) 25

1.3.2.2.2 Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) 26

1.4 Phương pháp QuEChERS phân tích đa dư lượng thuốc BVTV 26

1.4.1 Phương pháp QuEChERS EN15662 27

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 29

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 29

2.2.1 Chuẩn bị dung môi pha động và dung dịch chuẩn 29

2.2.2 Các hoá chất khác 30

2.2.3 Dụng cụ 30

2.2.4 Thiết bị 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 31

2.3.2 Điều kiện phân tích 32

2.3.2.1 Điều kiện phân tách trên hệ thống HPLC 32

2.3.2.2 Điều kiện phân tích trên hệ thống khối phổ ESI - MS/MS : 33

2.3.3 Thẩm định xác định giá trị sử dụng của phương pháp 34

2.3.3.1 Tính chọn lọc, đặc hiệu 34

2.3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 34

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 35

2.3.3.4 Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng) 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng 7 HCBVTV 37

3.1.1 Tối ưu hoá các điều kiện đo trên thiết bị HPLC – MS/MS 37

3.1.1.1 Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC 37

3.1.1.1.1 Chọn điều kiện bơm mẫu 37

3.1.1.1.2 Chọn cột tách 37

3.1.1.1.3 Khảo sát thành phần pha động và chế độ chạy 37

3.1.1.1.4 Khảo sát tốc độ dòng pha động 38

3.1.1.2 Khảo sát các điều kiện khối phổ MS/MS 39

3.1.2 Nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 40

3.1.2.1 Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp 40

3.1.2.2 Khảo sát xây dựng đường chuẩn 40

3.1.2.3 Giới hạn phát hiện LOD 43

3.1.2.4 Giới hạn định lượng LOQ 44

3.1.2.5 Khảo sát điều kiện chiết hỗn hợp chuẩn trong mẫu thực 45

3.1.2.6 Khảo sát ảnh hưởng thể tích 5% acid formic đến hiệu suất thu hồi 46

3.1.2.7 Đánh giá độ chính xác của phương pháp 47

3.2 Kết quả phân tích một số mẫu chè thực tế 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 56

Phụ lục 1 : Một số sắc ký đồ phân tích mẫu 56

Phụ lục 2 Một số đường chuẩn được xây dựng trong nghiên cứu 59

6 MRLs Mức dư lượng tối đa cho phép

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại HCBVTV theo độ độc

Bảng 2.1: Các thông số của chế độ ion hóa ESI

Bảng 3.5: Độ lặp lại của thiết bị tại nồng độ 4 ng/ml

Bảng 3.7: Ảnh hưởng Vacid formic đến hiệu suất thu hồi trên mẫu thêm chuẩn Bảng 3.8: Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn

Bảng 3.9: Độ thu hồi của từng HCBVTV

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo của Dicofol

Hình 1.2: Cấu tạo của 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyl N-methylcarbamate Hình 1.3 : Cấu tạo của Acetamiprid

Hình 1.4: Dinitrophenol

Hình 1.5: Dalapon

Hình 1.6: Benzimidazole

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Acephate

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Acetamiprid

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của Buprofezin

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của Chlorothalonil

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của Fipronil

Hình 1.12 Công thức cấu tạo của Hexaconazole

Hình 1.13 Công thức cấu tạo của Profenofos

Hình 1.14: Sơ đồ khối thiết bị HPLC-MS/MS

Hình 1.15: Mô hình thiết bị khối phổ MS ( LC-MS )

Hình 1.16: Cấu tạo và hoạt động bộ tứ cực

Hình 1.17: Mô hình thiết bị khối phổ MS/MS

Hình 1.18: Cấu tạo đầu phun ESI

Hình 1.19: Vùng phản ứng của chế độ ion hóa APCI

Hình 2.1: Quy trình phân tích mẫu

Hình 3.1: Sắc ký tổng của các HCBVTV

Hình 3.2 Sắc đồ pic mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn

Hình 3.3: Đường chuẩn của Acephate trong khoảng tuyến tính

Hình 3.4: Sắc ký đồ EIC và phổ khối Fipronil của mẫu thêm chuẩn tại 10 ng/ml Hình 3.5: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của chuẩn Fipronil tại 10 ng/ml

Hình 3.6: Sắc ký đồ 3 mẫu chè xuất khẩu

Hình 3.7: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Acetamiprid ở nồng độ 20 ng/ml

Hình 3.11: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Hexaconazole ở nồng độ 10 ng/ml

Hình 3.12: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Profenofos ở nồng độ 10 ng/ml

Hình 3.13: Đường chuẩn Acetamiprid Hình 3.14: Đường chuẩn Buprofezin Hình 3.15: Đường chuẩn Chlorothalonil Hình 3.16: Đường chuẩn Fipronil

Hình 3.17: Đường chuẩn Hexaconazole Hình 3.18: Đường chuẩn Profenofos

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia có vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho phát triển nông nghiệp, cơ cấu cây trồng đa dạng và phong phú trong đó cây chè là loại cây trồng đem lại nhiều giá trị kinh tế cũng như giá trị tiêu dùng Trong những năm gần đây sản phẩm chè không những được tiêu thụ mạnh mẽ trong nước mà còn là một mặt hàng quan trọng xuất khẩu ra nước ngoài đem lại lợi nhuận cho nền kinh tế nước nhà Hiện nay, Việt Nam là nước sản xuất chè lớn thứ 7 và xuất khẩu chè lớn thứ 5 toàn cầu, với 124.000 ha diện tích trồng chè và hơn 500 cơ sở sản xuất, chế biến, công suất đạt trên 500.000 tấn chè khô/năm Tuy nhiên Việt Nam mới chỉ xuất khẩu được sang các thị trường dễ tính như Ấn Độ, Pakistan, Nga,…chưa đưa vào các thị trường tiềm năng nhưng khó tính như Nhật Bản, Mỹ và Châu Âu Nguyên nhân của việc này là do sản phẩm chè chưa đa dạng

về mẫu mã, chủng loại (chủ yếu là chè đen, chè xanh và chè nguyên liệu) Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật chưa được kiểm soát chặt chẽ dẫn đến trong sản phẩm còn tồn tại nhiều dư lượng thuốc bảo vệ thực vật gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm, ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng, gây ô nhiễm môi trường sinh thái

Việc phân tích, kiểm soát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong chè hiện nay còn gặp nhiều khó khăn do trong chè có chứa nhiều chất tananh, loại bỏ cơ chất trong khi phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật là một vấn đề cần được khảo sát nghiên cứu để đưa ra các phương pháp phân tích nhanh, hiệu quả, độ chính xác cao Trong khi đó, để đưa được sản phẩm chè vào thị trường khó tính như Nhật Bản, Châu Âu chúng ta phải tuân thủ các qui trình phù hợp với những yêu cầu khắt khe Một yếu tố quan trọng nhất khi xuất khẩu vào thị trường này đó là kiểm soát tồn dư thuốc bảo vệ thực vật Các phương pháp kiểm tra cũng phải phù hợp với yêu cầu cụ thể của từng nước nhập khẩu Trước yêu cầu thực tế

như vậy, Chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu đề xuất phương pháp phân tích đa dư

lượng hoạt chất thuốc BVTV trong chè” để xác định đồng thời dư lượng của 7 hoạt chất

bảo vệ thực vật gồm acephate, acetamiprid, buprofezin, chlorothalonil, fipronil,

hexaconazole và profenofos trên thiết bị HPLC – MS/MS 6410MS (Agilent) được đặt tại Trung Tâm Kiểm Định và Khảo Nghiệm Thuốc BVTV Phía Bắc với các mục tiêu sau:

- Khảo sát các điều kiện phân tích

- Thẩm định phương pháp đã xây dựng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật

1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật

Hóa chất bảo vệ thực vật được chuyển nghĩa từ thuật ngữ tiếng Anh “pesticide” có nghĩa là thuốc trừ côn trùng gây hại Tuy nhiên, hiện nay khái niệm này được mở rộng cho nhiều loại hóa chất được sử dụng trong trồng trọt bao gồm cả thuốc điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá, thuốc trừ cỏ…[7][42]

Tổ chức Nông nghiệp và Lượng thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra định nghĩa về HCBVTV như sau: “HCBVTV là bất kỳ hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của thực vật hoặc động vật gay hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chung HCBVTV còn được dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm Cũng có thể dùng HCBVTV cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển” [33]

1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật

Có nhiều cách phân loại HCBVTV khác nhau tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng

1.1.2.1 Phân loại theo độ độc

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) phân loại HCBVTV dựa vào các nghiên cứu về nguy

cơ độc hại, chủ yếu là độ độc cấp tính đường miệng và đường ngoài da khi thử nghiệm trên chuột

Theo cách phân loại này, HCBVTV được chia thành 5 nhóm độc như sau:

Bảng 1.1: Phân loại HCBVTV theo độ độc

Ghi chú: LD50 là kí hiệu chỉ độ độc cấp tính của thuốc qua đường miệng hoặc qua

da Trị số của nó là liều gây chết trung bình được tính bằng miligam (mg) hoạt chất có thể gây chết 50% số động vật thí nghiệm (tính bằng kg) khi tổng lượng thể trọng của số động vật trên bị cho uống hết hoặc phết vào da Gía trị LD50 càng nhỏ thì hóa chất đó càng độc

Có thể nhận biết tính độc của thuốc bảo vệ thực vật theo dấu hiệu màu trên bao bì thuốc như sau:

+ Vạch màu đỏ trên bao bì là thuốc độc nhóm I, thuộc loại rất độc và độc

+ Vạch màu vàng trên bao bì là thuốc độc nhóm II, thuộc loại trung bình

+ Vạch màu xanh trên bao bì da trời là thuốc độc nhóm III, ít độc

+ Vạch màu xanh lá cây trên bao bì thuộc nhóm độc thứ IV, độc nhẹ

1.1.2.2 Phân loại theo mục đích sử dụng

Có nhiều cách phân loại TBVTV[40], trong đó có 4 cách phân loại chủ yếu sau

đây:

1.1.2.2.1 Phân loại theo mục đích sử dụng:

* Nhóm các chất trừ sâu, trừ nhện, trừ côn trùng gây hại:

+ Nhóm các chất trừ sâu có chứa Clo ( organnochlorine):

HC BVTV Clo hữu cơ là các hợp chất hữu cơ được hình thành khi thay thế các nguyên tử hydro của phân tử hydrocacbon và dẫn xuất bằng các nguyên tử Clo

Trong phân tử các hợp chất này tồn tại vòng benzen hoặc di vòng (O, N, S ), thường là các dẫn xuất Clo của một số hợp chất như Diphenyletan, Cyclodien, bezen, hexan ) Đặc điểm quan trọng của các hợp chất này là độc tính cao, phổ tác động rộng, nhưng kém chọn lọc và rất bền vững trong môi trường, thời gian phân hủy dài, do đó chúng ít bị đào thảo và tích lũy vào cơ thể sinh vật qua chuỗi thức ăn) Chính vì dư lượng

HC BVTV trong nông sản, sự tích lũy và đầu độc cao với cơ thể con người, động vật, mà ngày nay đa số các HC BVTV cơ Clo đã bị cấm sử dụng

Điển hình cho nhóm Clo hữu cơ là: Aldrine; BHC(BHC alpha, beta, gamma, and delta); Chlorobenzilate; Dieldrin; DDT (o,p'-DDD, p,p'-DDD, p,p'-DDE, p,p'-DDT); Endosulfan (Endosulfan alpha, beta, and Endosulfan sulfate); Endrin; Heptachlor (Heptachlor, Heptachlor Epoxide isomer A, isomer B); Dicofol; Phenisobromorate; DDT; Clodan

Hình 1.1: Cấu tạo của Dicofol

+ Nhóm các chất trừ sâu có chứa Photpho (organophosphorus):

HC BVTV nhóm lân hữu cơ chủ yếu là hợp chất của Photpho hóa trị V, chúng là các este của axit photphoric (H3PO4) và dẫn xuất Các hợp chất cơ photpho có độc tính rất cao nên hiệu lực diệt trừ sâu hại cao và nhanh chóng, phổ tác dụng rộng, kém bền vững trong môi trường kiềm và axit Cơ chế hoạt động của nhóm này dựa trên nguyên tắc: ức chế enzym Cholinesterase (ChE) không phục hồi do enzym ChE bị photphoryl hóa (WHO, 1996) Hậu quả là làm ứ đọng Acetylcholin gây rối loạn dẫn truyền hệ Cholonergic Nhiễm độc Lân hữu cơ là nhiễm độc Acetylcholin nội sinh (Moschlein S 1980; Nguyễn Văn Nguyên 1983; With W.1985; Kramer 1998) Hợp chất cơ photpho là những chất cực

độc, vừa có khả năng tích lũy mạnh, vừa gây độc cấp tính cho hệ thần kinh nên ngày nay

đã bị cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới Điển hình của nhóm này bao gồm một số chất parathion, malathion, diclorvos, clorpyrifos, dimethoat, trichlorfon, edifenphos…

+ Nhóm các hợp chất Cabamat:

Hình 1.2: Cấu tạo của 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyl N-methylcarbamate

HC BVTV nhóm cacbamat với công thức chung dạng thường là các este của axit cacbamic (H2N-COOH) Các hợp chất cacbamat có độc tính cao, phổ tác động hẹp hơn so với hợp chất cơ Clo và Photpho, hiệu lực trừ sâu hại cao, kém bền do dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm và axit Cơ chế gây độc giống nhóm lân photpho hữu cơ, chúng tác động trực tiếp vào men Cholinestraza của hệ thần kinh

Đại diện cho nhóm này: Bendiocarb, Benthiocarb, Carbaryl, Chloro IPC, Diethofencarb, Fenobucarb, Isoprocarb, Metolcarb, Pirimicarb, Propoxur, Swep, XMC, Xylylcarb

+ Nhóm Pyrethroid

Là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp của các este khác nhau với cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống cúc Sau đó những PY tổng hợp xuất hiện và được sử dụng phổ biến Cơ chế hoạt động của nhóm này luôn giữ kênh Na+

mở trong tế bào thần kinh gây ảnh hưởng sự dẫn truyền các xung thần kinh

+ Nhóm Neonicotinoid:

Tiền chất của nhóm Neonicotinoid chính là Imidacloprid được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1991 Là nhóm thuốc trừ sâu có liên quan đến nicotin Nhóm này có tính độc thấp hơn nhóm cacbamat và nhóm lân hữu cơ; hơn nữa độc tính thấp trên người Tuy nhiên, đã

có bằng chứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng rối loạn sụt giảm bầy đàn đối với mật ong, nên tại một một số quốc gia hạn chế sử dụng thuốc thuộc nhóm này

Một số chất tiêu biểu: imidachloprid, acetamiprid, thiamethoxam, dinotefuran

Hình 1.3 : Cấu tạo của Acetamiprid

* Nhóm các chất (vô cơ) trừ nấm, trừ bệnh, trừ vi sinh vật gây hại:

+ Các hợp chất chứa đồng:

Là các loại hợp chất vô cơ, có phổ tác động rộng, các thuốc thuộc nhóm này đều lại loại thuốc tiếp xúc, ít độc với động vật máu nóng, không ảnh hưởng xấu đến cây trồng, không tích lũy trong đất Các ion đồng được tế bào nấm và bào tử nấm bệnh hút, xâm nhập vào bên trong Ở đây, đồng sẽ kết hợp với các phân tử protit, phá hủy tính keo thường của nguyên sinh chất Đồng thời kìm hãm hoạt động của các enzim, đặc biệt là các ezim trao đổi hydratcacbon và enzim hô hấp Có một số thuốc đại diện như: Dupont kocide 46.1 DF, COC 85WP (Copper hydroxide) phòng bệnh sương mai cà chua, cháy lá

vi khuẩn và thối nhũn trên cây bắp cải

+ Các hợp chất chứa Lưu huỳnh:

Dùng để phun hoặc hun để xử lý bệnh nấm phấn trắng, rệp hại nho, nhện đỏ trên bông

ít độc với động vật máu nóng

+ Các hợp chất chứa Thủy ngân:

Các hợp chất thủy ngân vô cơ khi xâm nhập vào nấm, vi khuẩn nấm làm ngưng tụ nguyên sinh chất của nấm và vi khuẩn gây chết nấm bệnh Các hợp chất thủy ngân hữu cơ kết hợp với các axit amin của protit hay enzim, phá hủy các chức năng sống của sinh vật Tuy nhiên, khả năng bay hơi của thủy ngân làm cho thuốc có độ bay hơi mạnh, khả năng xâm nhập lớn, gây hại cho cả người và động vật

* Nhóm các chất trừ cỏ dại, làm rụng lá, kích thích sinh trưởng:

Hình 1.5: Dalapon + Triazole, benzimidazol

Hình 1.6: Benzimidazole

Là nhóm thuốc mới chứa nhiều hợp chất trừ nấm, phổ tác động rộng, các thuốc nhóm này đều là loại thuốc nội hấp có tác dụng bảo vệ và diệt trừ: dừng phun lên cây hoặc xử lý hạt, cây giống: một số sản phẩm đại diện như: Difenonconazole (Score 250EC), Triadimefon( Bayleton 250), Bavistin 50FL, Carben 50 SC, Zoom 50SC

* Nhóm các chất diệt chuột và động vật gặm nhấm: Photphua kẽm và Warfarin

1.1.2.2.2 Phân loại theo độ bền vững

Các HC BVTV có độ bền vững rất khác nhau, nhiều chất có thể lưu đọng trong môi trường đất, nước, không khí và trong cơ thể động, thực vật Do vậy các HC BVTV có thể gây ra những tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khỏe con người Dựa vào độ bền vững của chúng, có thể sắp xếp chúng vào các nhóm sau:

+ Nhóm chất không bền vững: nhóm này gồm các hợp chất photpho hữu cơ, cacbamat

Các hợp chất nằm trong nhóm này có độ bền vững kéo dài trong vòng từ 1-12 tuần

+ Nhóm chất bền vững trung bình: Các hợp chất nhóm này có độ bền vững từ 1-18

tháng Điển hình là thuốc diệt cỏ 2,4D (thuốc loại hợp chất có chứa Clo)

+ Nhóm chất bền vững: Các hợp chất nhóm này có độ bền vững từ 2-5 năm Thuộc

nhóm này là các loại thuốc trừ sâu đã bị cấm sử dụng tại Việt Nam là DDT, 666,…đó là các hợp chất Clo bền vững

+ Nhóm chất rất bền vững: Đó là các hợp chất kim loại hữu cơ, loại chất này có chứa

các kim loại nặng như Thủy ngân (Hg), Asen (As) không bị phân hủy theo thời gian, chúng bị cấm sử dụng tại Việt Nam

1.1.2.2.3 Phân loại theo cơ chế tác động

* TBVTV tác dụng tiếp xúc

Cách thông thường để kiểm soát sâu hại là phun TBVTV lên sâu hại hoặc lên bề mặt đối tượng cần bảo vệ có sâu đi qua với một lượng đủ thấm qua lớp vỏ cơ thể sâu hại Thuốc có tác dụng như vậy gọi là thuốc có tác dụng tiếp xúc

* TBVTV tác dụng vị độc

Thuốc có tác dụng vị độc được sử dụng dạng phun, bột rắc hay mồi độc và được dùng

để diệt các loài có hại qua đường miệng của chúng Các loài có hại ăn phải thuốc cùng với thức ăn qua miệng

* TBVTV tác dụng nội hấp

Một vài loài côn trùng như ve, rệp…hút nhựa bằng miệng Chúng dùng miệng nhỏ hình kim cắm vào cây trồng và hút nhựa Loài côn trùng này rất khó diệt bằng thuốc có tác dụng tiếp xúc Nhờ cách gây độc vào nguồn thức ăn của chúng là nhựa cây, chúng ta có thể đưa thuốc vào cơ thể côn trùng đó Đó là cách gây tác dụng nội hấp

* TBVTV tác dụng xông hơi

Để loại trừ một số sâu hại ngũ cốc, bột mì, chúng ta phải áp dụng biện pháp xông hơi Thuốc xông hơi được đưa vào khu vực cần xử lý dạng rắn, lỏng hoặc dạng khí Thuốc lan tỏa khắp không gian có sâu hại và diệt sâu hại qua đường hô hấp

1.2 Sơ lược về một số hóa chất bảo vệ thực vật trong nghiên cứu

1.2.1 Acephate

Theo IUPAC, Acephate có tên gọi khác là 0,S-dimetyl axetylphotphoramidothioat,

có công thức phân tử là C4H10NO3, khối lượng phân tử là 183.2 g/mol

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Acephate Acephate là thuốc trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ Acephate nguyên chất có dạng tinh thể không màu; nhiệt độ nóng chảy ở 88 – 90oC; độ tan ở 20oC trong nước 790g/l, trong axeton 151, benzen 16, etanol >100 g/l Khá bền DT50 ở 40oC, pH 9 là 60 giờ; pH3-

7 10 là giờ Bị thuỷ phân DT50 trong nước 50 ngày (pH 5-7 ở 21oC)

Phương thức tác động và sử dụng: Thuốc nội hấp, có tác động tiếp xúc và vị độc Kìm hãm hoạt động của men cholinesteraza Nhiều côn trùng có men pyrethroid esteraza

có khả năng thuỷ phân các hợp chất pyrethroid, nên vô hiệu hoá tác dụng của các hợp chất pyrethroid Do acephate và một số thuốc trừ sâu lân hữu cơ có khả năng kìm hãm hoạt tính của pyrethroid esterasa, nên khi hỗn họp acephate với các thuốc pyrethroid sẽ làm tăng hoạt tính trừ sâu của chúng, Dùng trừ nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút, nhện hại cây; rệp muội, bọ trĩ, sâu non bộ cánh vảy, sâu đục lá, sâu ăn lá, bọ nhảy, sâu đục thân ngô, rầy, bọ xít trên cây ăn quả, cây công công nghiệp (bông vải, lạc, cây lương thực và cây thực phẩm) Thuốc an toàn cho cây, nhưng có thể gây cháy nhẹ rìa lá táo

Độc tính thuộc nhóm độc III (WHO), LD50 qua miệng chuột 866 – 945 mg/kg; chó

>681 mg/kg, LD50 qua da thỏ >10000 mg/kg LC50 hô hấp (4giờ) với chuột > 15 mg/l

Thuốc giữ hoạt tính trong cây 10-15 ngày, chất chuyển hoá chính là methamidophos; trong đất và trong môi trường bị vi sinh vật phân huỷ nhanh, không tích luỹ

Ở Việt Nam, acephate là hoạt chất chính trong 1 số tên thương phẩm như Monster 40EC, Monster 75WP, Anitox 50SC, Binhmor 40EC… để trừ rầy xanh chè

1.2.2 Acetamiprid

Theo IUPAC, Acetamiprid có tên gọi khác là (E)-N1-(6-clo-3-pyridyl)metyl-N2xyano-Nl-metylexetamidin, công thức phân tử C10H11ClN4, khối lượng phân tử 222.7 g/mol

-Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Acetamiprid Acetamiprid là thuốc trừ sâu thuộc nhóm xyano amidin/neonicotinoit Acetamiprd nguyên chất có dạng bột mịn màu trắng; nhiệt độ nóng chảy ở 98.9oC; độ tan ở 25oC trong nước 4.25 g/l, tan trong axeton, ethanol, methanol, acetonitrile Bền trong dung dịch đệm có pH 4,5 và 7 Bển với ánh sáng Bị phân huỷ chậm ờ pH 9 ở 45°C

Phương thức tác động và sử dụng: Tương tự nicotin, nhưng bền và có phổ tác động rộng hơn nicotin Những neonicotinic tác động đến vị trí kết nối axetyl cholin của cơ quan cảm nhận nicotinic axetylcholin như một chất gây kích thích, sau cùng là tê liệt và chết

Là thuốc trừ sâu nội hấp, có tác động tiếp xúc và đường ruột Dùng để trừ sâu non bộ cánh nửa, bộ cánh vảy, bộ cánh tơ; đặc hiệu trừ rệp muội trên nhiều cây trồng khác nhau, bằng cách xứ lý đất và phun lên cây rau các loại (75-300 g/ha), cây ăn quả, chè, cây công nghiệp và cây cảnh (100-700 g/ha) Thuốc có thể được dùng để trừ mối

Độc tính thuộc nhóm độc II (WHO), LD50 qua miệng chuột 146 – 217 mg/kg, LD50

qua da chuột > 2000mg/kg LC50 hô hấp (4giờ) với chuột > 0.29 mg/l Thuốc không tồn tại lâu trong đất

Ở Việt Nam, acetamiprid là hoạt chất chính trong 1 số tên thương phẩm như Sutin 5EC, Mospilan 3EC, Mospha 80EC… để trừ rầy xanh chè

1.2.3 Buprofezin

Theo IUPAC, Buprofezin có tên gọi khác là phenyl-l,3,5-thidiazinan-4-one , công thức phân tử C16H23N3OS, khối lượng phân tử 305.4 g/mol

2-tert-butylimino-3-isopropyl-5-Hình 1.9 Công thức cấu tạo của Buprofezin Buprofezin là thuốc trừ sâu thuộc nhóm điều tiết sinh trưởng côn trùng Buprofezin nguyên chất có dạng tinh thể trắng; nhiệt độ nóng chảy ở 104.5 – 105.5oC; độ tan ở 25oC trong nước 0.9 g/l; trong cloroform 520; benzen 370; toluen 320; axeton 240; etanol 80; hexan 20 g/l Bền trong môi trường axit và kiềm; bền với nhiệt độ và ánh sáng

Phương thức tác động và sử dụng: Kìm hãm tổng hợp chitin, phá vỡ cân bằng hoocmon lột xác ecdyson, cản trở quá trình lột xác sâu non và nhộng trần của một số côn trùng bộ cánh đều, cánh cứng và một số nhện (bộ Acarina) Thuốc còn tác động đến khả nãng đẻ trứng do ức chế hình thành prostagladin trong trứng Là thuốc trừ sâu tiếp xúc và

vị độc, tác dụng xông hơi yếu, không có tác dụng nội hấp Hiêu lực khá dài Tuy không có

khả năng diệt trứng, nhưng ngăn cản sự tạo phôi và phát triển phôi của bọ phấn Bemisia

tabaci, làm giảm khả năng trứng nở và sự phát triển của ấu trùng Thuốc được dùng để

phòng trừ ấu trùng các loài cánh đều, một số loài cánh cứng và một số loài trong bộ nhện Acarina Lượng dùng để trừ ấu trùng rầy trên lá và thân; bọ xít hại lúa 50-250g a.i./ha (hiệu lực dài, không gây tái phát rầy lúa); trừ bọ cánh cứng khoai tây, các loài rệp muội và rệp sáp rầy xanh, bọ xít, các loài rệp (rệp muội và rệp sáp), bọ xít hại cây ãn quả; rầy xanh

trên bông, chè, dậu đỗ bọ phấn rau với lượng 250-500g a.i./ha Có thể gây hại nhẹ cho cải trắng

Độc tính thuộc nhóm độc III (WHO), LD50 qua miệng chuột 2198 – 2355 mg/kg; chuột nhắt > 10000 mg/kg LD50 qua da chuột >5000 mg/kg LC50 hô hấp (4giờ) với chuột

> 4.57 mg/l Không gây ung thư và đột biến Thuốc ít chuyển hoá trong cây

Ở Việt Nam, buprofezin là hoạt chất chính trong 1 số tên thương phẩm như Aklaut 10WP, Apolo 25WP, Butal 10WP, Butyl 400SC… để trừ rầy xanh chè, bọ xít muỗi chè

25oC trong nước 0.81g/l; trong xylen 80, xyclohexanol, dimetylfocmamid 30, axeton, dimetyl sulíoxyd 20, kerosen < 10 g/kg (25°C) Bền ở nhiệt độ phòng Bền với tia cực tím trong môi trường nước và ở dạng tinh thể Bền trong dung dịch axit và tương đối bền trong dung dịch nước kiềm Bị thuỷ phân chậm ở pH >9

Phương thức tác động và sử dụng: Kết hợp với các thiol (đặc biệt là glutation) của bào tử nấm đang nảy mầm, dẫn đến sự gây rối quá trình sản sinh glycolysis và sản sinh năng lượng, kìm hãm sự phát triển của nấm và trừ nấm Thuốc trừ nấm tiếp xúc, phun lên

lá, có tác dụng bảo vệ Chlorothalonil là thuốc trừ nấm phổ rộng, trừ được bệnh trên nhiều loại cây trồng như cây ăn quả cam chanh, chuối, xoài, dừa, cọ dầu, cà phê, nho, thuốc lá,

cà phê, chè, đậu tương lạc, khoai tây, mía, bông, ngô, cây cảnh, nấm rơm, thảm cỏ Thuốc

có thể gây biến màu lá táo, nho, hoa cảnh; một vài loại cây cảnh có thể bị tổn thương Thuốc được dùng để hỗn hợp với nhiều loại thuốc trừ bệnh khác Ở Việt Nam, thuốc được khuyến cáo trừ bệnh đốm lá lạc, đậu, hành, chè; đốm nâu thuốc lá; khô vằn, đạo ôn trên lúa; thán thư xoài; ghẻ nhám haị cây có múi; thán thư cao su; mốc sương hại dưa hấu; phấn trắng dưa chuột, cà chua; đốm vòng cà chua; giả sương mai dưa chuột; bệnh chết rạp cây con bắp cải, thuốc lá; rỉ sắt hại cà phê, lạc

Độc tính thuộc nhóm độc III (WHO), LD50 qua miệng chuột > 10000mg/kg; chó > 5000mg/kg LD50 qua da thỏ bạch > 10000mg/kg LC50 hô hấp (1giờ) với chuột > 4.7mg/l Gây viêm da người khi tiếp xúc với thuốc Trong cây, dư lượng của chúng chủ yếu tồn tại ở dạng không đổi

Ở Việt Nam, chlorothalonil là hoạt chất chính trong 1 số tên thương phẩm như Daconil 75WP, Arygreen 75WP, Binhconil 75WP, Forwanil 50SC… để trừ bệnh đốm lá chè

1.2.5 Fipronil

Theo IUPAC, Fipronil có tên gọi khác là tolyl)-4-triflometylsunfinyl-pyrazol-3-cacbonitril, công thức phân tử C12H4Cl2F6N4OS, khối lượng phân tử 437.2 g/mol

(±)-5-amino-l-(2,6-diclo-α,α,α-triflo-p-Fipronil là thuốc trừ sâu thuộc nhóm thuốc phenylpyrazol (±)-5-amino-l-(2,6-diclo-α,α,α-triflo-p-Fipronil tinh khiết có dạng rắn màu trắng; nhiệt độ nóng chảy 200-201oC, độ tan ở 20oC trong nước 1.9 (pH5); 2.4 mg/l (pH9); trong axeton 545.9; diclometan 22.3; hexan 0.028; toluen 3 g/l (20°C) Bền với nhiệt; bị phân huỷ chậm dưới ánh sáng mặt trời (mất 3% sau 12 ngày); nhưng bị phân huỷ nhanh trong dung dịch nước có chiếu sáng (DT50 khoảng 0.33 ngày)

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của Fipronil Phương thức tác động và sử dụng: Thuốc trừ sâu có tác dụng tiếp xúc và vị độc Có tính nội hấp vừa phải (có thể xử lý giống trước khi gieo cho một số cây trồng hay xử lý đất) Fipronil ức chế hoạt động của GABA Phố rộng Do có cơ chế khác với các thuốc trừ sâu thông thường, nên có hiệu lực cao với các loài sâu hại đã phát triển tính kháng đối với các thuốc lân hữu cơ, cacbamat và pyrethroid Fipronil xử lý giống để trừ cua, ốc (ruộng lúa nước), dế, bọ trĩ, rẩy nâu, sâu đục thân lúa (hiệu quả kéo dài 3-4 tuần) Xử lý đất trừ rầy nâu, sâu năn, sâu đục thân lúa, sâu đục thân mía, mối hại chè, mía (100-200g a.i./ha) Phun lên cây có thể trừ rất nhiều loài sâu miệng chích hút, miệng nhai trên rau các loại, lúa, ngô, bông, cây ăn quả Lượng dùng thấp (10- 80ga.i./ha) Không được hỗn hợp với các chất mang tính kiềm

Độc tính thuộc nhóm độc II (WHO), LD50 qua miệng chuột > 97mg/kg; chuột nhắt

> 95mg/kg LD50 qua da thỏ > 354 mg/kg; da chuột > 2000 mg/kg LC50 hô hấp (4giờ) với chuột > 0.682 mg/l Không gây đột biến, quái thai, ung thư; không ảnh hướng đến khả năng sinh sản ở động vật có vú

Ở Việt Nam, Fipronil là hoạt chất chính trong 1 số tên thương phẩm như Rigell 800WG, Tango 5SC, Termidor 25EC, Forgen 800WG…

1.2.6 Hexaconazole

Theo IUPAC, Hexaconazole có tên gọi khác là l,2,4-triazol-l-yl)hexan-2-ol, công thức phân tử C14H17Cl2N3O, khối lượng phân tử 314.2 g/mol

(RS)-2-(2,4-diclophenyl)-l-(1H-Hình 1.12 Công thức cấu tạo của Hexaconazole Hexaconazole là thuốc trừ nấm thuộc nhóm thuốc triazole/azol Hexaconazole tinh khiết có dạng rắn kết tinh màu trắng; nhiệt độ nóng chảy 110-112oC, độ tan ở 20oC trong nước 0.017g/l; trong diclometan 336; metanol 246; axeton 164; etyl axetat 120; toluen 59; hexan 0.8 g/1 (20°C) Không phân huỷ ớ nhiệt độ thường (6 năm) Không bị thuỷ phân và quang phân trong nước Dạng thành phẩm chứa trong các công ten nơ có nhiệt độ 50°C vẫn giữ được hiệu lực sau 5 tháng; ở nhiệt độ thường, thuốc không bị phân huỷ sau 2 năm

Phương thức tác động và sử dụng: Kìm hãm sinh tổng hợp ergosterol (kìm hãm quá trình khử metyl của steroid) Thuốc trừ nấm nội hấp có tác dụng bảo vệ và diệt trừ Dùng trừ nhiều loại nấm thuộc lớp nấm túi và nấm đảm Trừ các bệnh khô vằn; lem lép hạt lúa; rỉ sắt, nấm hồng cà phê; đốm lá lạc; khô vằn ngô; phấn trắng xoài, nhãn; phấn trắng nho; phấn trắng, đốm đen, rỉ sắt hoa hồng; thối rễ bắp cải Liều dùng rất khác nhau tuỳ thuộc vào cây trồng Có thể hỗn hợp với nhiều loại thuốc trừ sâu và bệnh khác

Độc tính thuộc nhóm độc III (WHO), LD50 qua miệng chuột đực > 2189 mg/kg; chuột cái > 6071 mg/kg LD50 qua da chuột > 2000mg/kg LC50 hô hấp (4giờ) với chuột > 5.9 mg/l Thuốc hấp thụ khá nhanh và chuyển hoá mạnh trong cây; bị phân huỷ khá nhanh trong đất

Ở Việt Nam, hexaconazole là hoạt chất chính trong 1 số tên thương phẩm như Annongvin 5SC, Hexavil 5SC, Judi 5SC, T-vil 5SC…

Phương thức tác động và sử dụng: thuốc trừ sâu, nhện có tác động tiếp xúc và vị độc Dễ xâm nhập qua lá, nhung không có tác dụng nội hấp Ức chế hoạt tính của men cholinesteraza Thuốc còn có hiệu lực trừ trứng sâu, nhện Profenofos được dùng để phòng trừ nhiều loại sâu ăn lá lúa (sâu keo, sâu cuốn lá), ngô (sâu đục thân, sâu ăn lá), trên hoa màu và cây công nghiệp (sâu xanh, sâu khoang hại bông; sâu ăn lá đậu nành, lạc, sâu keo ) Thuốc còn trừ nhiều loài nhện đỏ, sâu miệng chích hút (bọ xít, rầy, rệp ) hại cây Có thể gây hại nhẹ cho một số giống bông

Độc tính thuộc nhóm độc II (WHO), LD50 qua miệng chuột > 358 mg/kg; thỏ >

700 mg/kg LD50 qua da chuột > 3300mg/kg LC50 hô hấp (4giờ) với chuột 3 mg/l Trong cây (bông và xà lách), thuốc xâm nhập vào cây nhanh, rồi phân giải thầnh các chất chuyển hoá phân cực DT50 của thuốc trong đất khoảng vài ngày đến một tuần

Ở Việt Nam, profenofos là hoạt chất chính trong 1 số tên thương phẩm như Callous 500EC, Selecron 500EC, Polytrin 440EC,…

1.3 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần HPLC- MS/MS

Hiện nay các chất phân tích và nên mẫu đều phức tạp, giới hạn phát hiện và định lượng yêu cầu ngày một thấp Nên khi phân tích dư lượng hóa chất BVTV bằng các thiết

bị sắc ký khí (GC) (với các detecter cộng kết điện tử (ECD), quang hóa ngọn lửa (FPD)…) hoặc HPLC ( với các đầu dò UV-Vis, DAD …) mẫu phân tích cần lấy lượng lớn Điều này làm phức tạp cho giai đoạn làm sạch của quá trình xử lý mẫu nhất là với những nông sản chứa nhiều đường, tinh dầu Với những hoạt chất kém bền, không ổn định quy trình chuẩn bị mẫu lại càng khó khăn, tốn kém Một trong những trở ngại của phân tích viên là có nhiều hoạt chất do bản chất gần nhau (các họ hoạt chất đồng đẳng, các đồng phân ) nên yếu tố thời gian lưu không đủ cơ sở để định tính các chất Việc phân biệt pic hoạt chất trên nền mẫu, xử lý số liệu cần nhiều thông tin hơn[8]

Để khắc phục những nhược điểm trên các kỹ thuật công nghệ cao được ứng dụng vào trong phân tích công cụ Các detecter dạng UV-Vis, DAD, ECD, FPD, NPD được thay thế bằng bộ phận phân tích khối phổ MS, MS/MS kết hợp với đầu dò phát hiện ion như cốc Faraday, nhân electron thứ cấp

Có thể khẳng định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp với bộ phận phân tích khối phổ MS/MS là một kỹ thuật ứng dụng hiện đại và rất hữu hiệu để phân tích lượng vết, các dạng tồn dư chuyển hóa thuốc BVTV trong nông sản

Hệ thống HPLC-MS/MS có sơ đồ khối như hình 1.14

Hình 1.14: Sơ đồ khối thiết bị HPLC-MS/MS

Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động

2 - Bơm cao áp

3 - Bộ phận bơm mẫu tự động

4 - Cột tách sắc ký

5 - Nguồn ion hóa

6 - Bộ phận phân tích khối MS/MS

7 - Detector thu nhận và chuyển đổi sang tín hiệu điện

8 - Máy tính lưu trữ và xử lý số liệu Hoạt động của thiết bị HPLC-MS/MS theo nguyên tắc sau :

Pha động trong bình chứa (1) được bơm cao áp (2) bơm qua bộ phân bơm mẫu tự động (3) vào cột tách (4), quá trình sắc ký xảy ra tại đây Sau khi rời bỏ cột tách(4) tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử tới nguồn ion hoá (5) Ở đây pha động hoá hơi còn các cấu tử được chuyển thành ion phân tử và đi qua bộ lọc khối phổ MS/MS (6) Tại đây ion phân tử bị bắn phá lần nữa thành các ion thứ cấp, (6) sẽ lọc lựa chọn những số khối m/z của hoạt chất phân tích mới đi qua tới detecter (7) chuyển thành tín hiệu điện Số liệu kết quả được xử lý trên máy tính(8)[24]

1.3.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau[14]

Về cơ bản, LC-MS/MS như các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC bao gồm 3 phần chính:

- Phần đầu là bình chứa dung môi pha động: có 4 bình chứa 4 loại dung môi khác nhau Tùy thuộc vào cấu tạo bơm 2 kênh hoặc bơm 4 kênh kết hợp với chế độ chạy isocratic hoặc gradien mà có thành phần pha động mong muốn

- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách và cột phụ trợ (tiền cột), buồng điều nhiệt cột, bộ phận bơm mẫu tự động Mẫu phân tích được bộ phận bơm mẫu tự động nạp vào hệ thống với dung tích (cỡ µl) tùy thuộc khả năng cột tách

- Phần phát hiện và xử lí số liệu: Ở đây hệ thống HPLC thông thường bao gồm các detector, phần khuếch đại tín hiệu, phần chuyển đổi tín hiệu tương tự sang tín hiệu số

Máy tính sẽ lưu trữ dữ liệu nhận được và phần mềm xử lí số liệu ( tùy thuộc từng hãng theo thiết bị) cho các kết quả phân tích

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc

ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết

1.3.1.1 Pha tĩnh trong HPLC

Trong HPLC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 - 7µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

- Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -

NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluen…Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động là dung môi phân cực như nước, methanol, axetonitril…Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất

phân cực, ít phân cực tới không phân cực [14]

1.3.1.2 Pha động trong HPLC

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh-

- Bền vững và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

- Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao

- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector hoặc phần thiết bị nối tiếp sau

- Không quá đắt

Một pha động phù hợp (về độ phân cực, về detector cũng như các tính chất cần thiết khác như: khả năng tạo phức là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi …) sẽ góp phần tốt nhất có thể được vào qua trình tách[19] Có thể chia pha động làm hai loại: pha động có

độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp:

+ Pha động có độ phân cực cao, có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha đảo

+ Pha động có độ phân cực thấp là các dung môi ít phân cực như xyclopentan, pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene…Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, nên người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích các hỗn hợp mẫu phức tạp Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này gọi là rửa giải gradient nồng độ

n-1.3.2 Nguồn ion hóa và bộ phận phân tích khối phổ

1.3.2.1 Bộ phận phân tích khối phổ

Máy phân tích khối phổ hay chính xác hơn máy phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion “ là thiết bị phân tích dựa trên sự chuyển động của các ion trong môi trường chân không ‘’[14]

Các máy phân tích khối phổ thường được phân loại tuỳ vào việc tách các ion mang điện theo phương pháp nào Ở đây ta chỉ xét thiết bị thông dụng là khối phổ tứ cực ( quadrupole mass spectrometer ) Để rõ đặc điểm của LC – MS/MS ( 2 lần khối phổ ) ta xét thiết bị LC- MS ( một lần khối phổ ) trước

Hình 1.15: Mô hình thiết bị khối phổ MS ( LC-MS )

Phần quan trọng nhất là bộ lọc tứ cực (quadrupole mass spectrometer) Sự ion hoá mẫu xảy ra tại nguồn ion hoá Các ion được phân tách bởi bộ tứ cực Q1 trước khi tới detector [15]

Hình 1.16: Cấu tạo và hoạt động bộ tứ cực Trong đó :

- Source : Nguồn ion hóa

- Resonant ion : ion cộng hưởng (ion được lựa chọn)

- Nonresonnant ion : ion bị loại bỏ

- DC and AC voltages : Nguồn điện một chiều và xoay chiều áp lên bộ tứ cực

Bộ tứ cực gồm 2 cặp thanh hình trụ được đặt song song với nhau một cách chính xác hai đầu đặt lên giá đỡ Từng cặp thanh đối diện được nối điện với nhau Điện xoay chiều

áp lên cả 4 thanh nhưng thanh gắn cực âm đối diện 180o với thanh gắn cực dương Các thanh mang điện + hay - phụ thuộc giá trị điện thế một chiều áp lên Mỗi cặp thanh đối diện nhau chịu tác dụng dòng điện có tần số rất lớn 108 Hz và chiều điện áp trên mỗi thanh cũng thay đổi tương ứng Do ảnh hưởng lực điện từ trường các ion vừa di chuyển trong không gian nằm giữa các thanh trụ vừa dao động quanh trục tâm Như vậy với mỗi giá trị điện áp được áp lên thì chỉ có những ion có tỷ số m/z thích hợp mới đi qua bộ tứ cực tới detecter Khi ta chọn mảnh m/z đặc trưng cho chất được nghiên cứu thì phần mềm chuyển tỷ số này thành sự thay đổi tần số và điện thế áp lên bộ tứ cực để ion quan tâm có được dao động cộng hưởng để di chuyển qua tứ cực và tới bộ phận ghi nhận tín hiệu[34]

Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, chịu ảnh hưởng rõ rệt nền mẫu chất phân tích, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… [26]

Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy (cỡ fentogram ), tăng độ chính xác kết quả loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu

Máy khối phổ MS – MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm (collision cell) MS đầu tiên (tứ cực Q1) được sử dụng để cô lập ion sơ cấp (precursor ion), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion thứ cấp (product ion) tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2) sẽ phân tách những ion này Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu [15,16]

Hình 1.17: Mô hình thiết bị khối phổ MS/MS Trong đó :

- Rough pump : bơm chân không sơ cấp hút loại bỏ các chất không ở dạng ion như dung môi, các cấu tử bền không bị ion hóa…

- Turbo pump : bơm chân không thứ cấp tạo môi trường chân không sâu 2,7–3,3.10-5 torr nhằm tránh sự phân mảnh ion do va chạm

- Collision cell : Nơi các ion bị phân mảnh do va chạm với khí N2 99.999%

1.3.2.2 Các nguồn ion hóa

Việc ghép sắc ký lỏng LC vào máy khối phổ MS không thể thực hiện trực tiếp được, vì muốn đo khối phổ cần phải tạo ra các ion ở thể khí, trong khi sắc ký lỏng được

áp dụng cho các chất ít bay hơi Vấn đề còn phức tạp thêm ở việc khi hợp chất đi ra khỏi cột sắc ký lỏng, hợp chất đó đang ở trong pha động lỏng, cần phải loại bỏ dung môi trước khi đưa hợp chất khảo sát vào MS

Những sự không tương thích cơ bản giữa hai loại kỹ thuật này là :

- Máy khối phổ MS hoạt động trong điều kiện chân không sâu, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ…

- Máy sắc ký lỏng LC hoạt động trong điều kiện : áp suất cao, nhiệt độ tương đối thấp, các chất khảo sát ở thể lỏng, vận tốc dòng chảy lớn…

Để khắc những khó khăn trong việc ghép HPLC và MS cần phải có kết nối chuyển đổi trung gian và kèm theo là các kiểu ion hoá ESI, APCI [16,26]

1.3.2.2.1 Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI)

Đầu phun điện tử (Electrospray Ionization: ESI) có cấu tạo như hình 1.18 [15]

Hình 1.18: Cấu tạo đầu phun ESI

Trong kỹ thuật ESI, sắc ký lỏng được nối với ống mao quản làm bằng thép không

gỉ, pha động (dung môi pha động có thêm chất điện ly ) kết hợp khí nén nitơ áp suất cao (60 psi) được phun sương mù ra khỏi ống mao quản vào vùng có điện trường mạnh (3-6 kV)ở nhiệt độ cao (trên 300oC)

Do ảnh hưởng của nhiệt độ dung môi hoá hơi hoàn toàn và điện thế cao hỗn hợp chất cần phân tích chuyển thành ion phân tử và bị hút vào MS (Q1) Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương (ESI+) và ion âm (ESI-)

ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao Đây cũng là nguồn ion hóa mà đề tài lựa chọn để phân tích HCBVTV