Đánh giá khả năng phòng trị của xạ khuẩn đối với bệnh cháy lá khoai môn do nấm phytophthora sp gây ra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÕNG TRỊ CỦA XẠ KHUẨN ĐỐI VỚI BỆNH CHÁY LÁ K

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÕNG TRỊ CỦA

XẠ KHUẨN ĐỐI VỚI BỆNH CHÁY

LÁ KHOAI MÔN DO NẤM

Phytophthora sp GÂY RA

TRẦN PHƯƠNG DINH

AN GIANG, THÁNG 4/2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÕNG TRỊ CỦA

XẠ KHUẨN ĐỐI VỚI BỆNH CHÁY

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Đánh giá khả năng phòng trị của xạ khuẩn đối với

bệnh cháy lá khoai môn do nấm Phytophthora sp gây ra” này là công trình

nghiên cứu khoa học của bản thân, các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực

An Giang, ngày…20 tháng …04… năm 2019

Tác giả luận văn

Trần Phương Dinh

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ “Đánh giá khả năng phòng trị của xạ khuẩn đối với

bệnh cháy lá khoai môn do nấm Phytophthora sp gây ra”, do học viên Trần

Phương Dinh thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Lê Minh Tường Tác giả đã báo cáo luận văn nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo thông qua ngày 20 tháng 04 năm 2019

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn:

Thầy PGS.TS Lê Minh Tường đã tận tâm hướng dẫn, hỗ trợ kiến thức và kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận văn của mình

Thầy ThS Nguyễn Phú Dũng đã giúp đỡ, góp ý và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Thầy Cô trong Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên Thiên nhiên đã hỗ trợ kiến thức và tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài

Phòng Đào tạo sau Đại học và các phòng ban của trường Đại học An Giang đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình

Bộ môn Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ máy móc, trang thiết bị, phòng thí nghiệm và nhà lưới để tôi thực hiện đề tài này

Các bạn và các em sinh viên Đại học Cần Thơ: Quý, Rany, Thủ, Thịnh đã hỗ trợ tôi nhiệt tình trong quá trình thu thập mẫu, bố trí thí nghiệm và ghi nhận số liệu

Gia đình, vợ con, bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ để tôi hoàn thành chương trình học và luận văn tốt nghiệp của mình

Tập thể anh em học viên lớp Cao học Khoa học cây trồng khóa 2,3 đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẽ thông tin, kiến thức để tôi hoàn thiện bài luận văn này Lời nói sau cùng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả mọi người đã luôn luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài Trong quá trình viết không tránh khỏi những sai sót vì vậy rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn

An Giang, ngày…20 tháng …04… năm 2019

Tác giả luận văn

Trần Phương Dinh

LÝ LỊCH KHOA HỌC

1 LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Họ và tên: Trần Phương Dinh Giới tính: Nam

Ngày sinh: 10/03/1993 Nơi sinh: Bình Phú, Châu Phú, An Giang

Quê quán: Châu Phú, An Giang Dân tộc: Kinh

Địa chỉ liên lạc: Ấp Bình An, xã Bình Phú, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang

Số điện thoại: 0919.856.813 – 0363.078.735

E-mail: ts.bvtv@gmail.com

2 QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO

Từ năm 1999-2004: Học sinh – Trường tiểu học “B” Bình Phú

Từ năm 2004-2008: Học sinh – Trường Trung học cơ sở Bình Phú

Từ năm 2008-2011: Học sinh – Trường THPT Đoàn Kết

Từ năm 2011-2015: Sinh viên – Ngành Bảo vệ Thực vật, Trường Đại học An Giang

3 QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC

Từ năm 2015-2019 nhân viên Công ty Bông Lúa Việt

An Giang, ngày 20 tháng 04 năm 2019

Tác giả luận văn

Trần Phương Dinh

TÓM LƢỢC

Đề tài được thực hiện từ tháng 6/2017 đến tháng 12/2018 trong phòng thí nghiệm và nhà lưới của bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ nhằm mục tiêu tìm ra các chủng xạ khuẩn có hiệu quả cao trong phòng trị bệnh cháy lá khoai môn do nấm Phytophthora sp gây ra Bước đầu phân lập được 9 chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh cháy lá khoai môn ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như Đồng Tháp, Trà Vinh

và An Giang Đánh giá khả năng gây hại của các chủng nấm gây bệnh cháy lá khoai môn được thực hiện trong điều kiện nhà lưới Kết quả cho thấy chủng nấm PĐT2 (phân lập tại huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp) có khả năng gây bệnh nặng nhất và được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp sau

Kết quả tiếp theo đã phân lập được 83 chủng xạ khuẩn từ đất trồng khoai môn

ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Sau đó tiến hành đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm gây bệnh cháy lá khoai môn, thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm với 5 lần lặp lại Kết quả cho thấy 6 chủng xạ khuẩn là LV.ĐT1, DH.TV5, DH.TV6, TG1, DT13

và LV.ĐT22 có khả năng đối kháng cao với bán kính vòng vô khuẩn lần lượt 20,6mm; 13,4mm; 11,4mm; 10,8mm; 12,7mm; 8,6mm và hiệu suất đối kháng lần lượt là 63,0%; 51,3%; 55,9%; 55,5%; 48,4%; và 41,8% ở thời điểm 7 ngày sau thí nghiệm

Tiếp tục đánh giá khả năng ức chế sự hình thành bọc bào tử nấm Phytophthora sp của 6 chủng xạ khuẩn (LV.ĐT1, DH.TV5, DH.TV6, TG1, DT13 và LV.ĐT22) được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm với 4 lần lặp lại Kết quả cho thấy 3 chủng TG1, DH.TV5 và LV.ĐT1 có khả năng ức chế sự hình thành bọc bào tử mạnh nhất thông qua log mật số bọc bào tử thấp lần lượt là 4,27; 4,54; 4,68 (bào tử/ml) ở thời điểm 7 ngày sau thí nghiệm Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy lá khoai môn của 3 chủng TG1, DH.TV5 và LV.ĐT1 được thực hiện trong điều kiện nhà lưới với 4 lần lặp lại Kết quả cho thấy cả 3 chủng xạ khuẩn đều có khả năng phòng trị bệnh cháy lá trên khoai môn trong điều kiện nhà lưới với những mức độ khác nhau Trong

đó, chủng LV.ĐT1 với biện pháp phun kết hợp trước sau có khả năng quản lý bệnh cháy lá khoai môn tương đương với biện pháp phun thuốc hóa học Mataxyl 500WP đến thời điểm 6 ngày sau khi bố trí thí nghiệm

Từ khóa: Bệnh cháy lá khoai môn, bọc bào tử, Phytophthora sp., xạ khuẩn

SUMMARY

The research was carried out from June 2017 to December 2018 in the laboratory and net-house of Plant Protection Department, College of Agriculture, Cantho University, were to screen actinomyces isolates which able to control Phytophthora sp fungus causes leaf blight disease on taro The research have 4 experiment:

There were 9 Phytophthora sp strains that were collected from Taro field in Mekong Delta such as Dong Thap, Tra Vinh and An Giang province The pathogenicity of these strains was tested in nethouse condition The result showed that PĐT2 strain (collected from Chau Thanh district, Dong Thap province) was high pathogenicity and was used in next experiments

Eighty three actinomyces isolates were collected from Taro filed in some province of Mekong Delta The antagonistic ability against Phytophthora sp fungus of these actinomyces isolates were determined in laboratory condition with 5 replications The results found that 6 isolates LV.ĐT1, DH.TV5, DH.TV6, TG1, DT13 and LV.ĐT22 could reduce mycelia growth of Phytophthora sp fungus with radiuses of inhibition zones reaches 20.6mm; 13.4mm; 11.4mm; 10.8mm; 12.7mm and 8,6mm, respectively and antagonistic efficacy 63.0%; 51.3%; 55.9%; 55.5%; 48.4%; and 41,8% respectively at 7 days after inoculation

The ability of inhibiting sporulation of Phytophthora sp by Actinomyces isolates was checked with 4 replications The results showed that TG1, DH.TV5 and LV.ĐT1 isolates have the highest inhibition efficiency with the lowest conidia concentration reaching 4.27, 4.54 and 4.68 conidia/ml, respectively at 7 days after testing

The biocontrol ability of 3 actinomyces isolates TG1, DH.TV5 and LV.ĐT1 were tested in net-house condition The results indicated that 3 actinomyces tested have potential biocontrol of leaf blight disease on taro On the other hand, the LV.ĐT1 isolate was applied before and also after inoculaton 1 days showed high ability to control the leaf blight disease on Taro and were not significantly with chemical treatments (Mataxyl 500WP) at 6 days after inoculation

Keywords: Actinomyces, leaf blight disease on taro, Phytophthora sp.,

sporulation

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG ii

LỜI CẢM TẠ iii

LÝ LỊCH KHOA HỌC iv

TÓM LƯỢC v

SUMMARY vi

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH x

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1 1

GIỚI THIỆU 1

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 2 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY KHOAI MÔN 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Tình hình sản xuất 3

2.1.3 Thành phần cấu tạo 4

2.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH CHÁY LÁ KHOAI MÔN 6

2.2.1 Tình hình gây hại của bệnh cháy lá khoai môn 6

2.2.2 Tác nhân gây bệnh 6

2.2.3 Triệu chứng bệnh 7

2.2.4 Cơ chế xâm nhiễm 7

2.2.5 Điều kiện phát sinh và lây lan 8

2.2.6 Biện pháp phòng trừ 10

2.3 PHÒNG TRỪ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP 11

2.4 XẠ KHUẨN VÀ TIỀM NĂNG SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH HẠI CÂY TRỒNG 12

2.4.1 Giới thiệu chung và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 12

2.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh học của xạ khuẩn 14

2.4.3 Một số cơ chế phòng trừ sinh học của xạ khuẩn liên quan đến khả năng ức chế tác nhân gây bệnh 15

2.4.4 Những thành tựu trong nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn 18

2.5 ĐẶC TÍNH CỦA THUỐC HÓA HỌC MATAXYL 500WP ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM ĐỐI CHỨNG PHUN THUỐC HÓA HỌC 23

CHƯƠNG 3 25

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 25

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.2.1 Phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh cháy lá trên cây khoai môn 26

3.2.2 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây hại của các chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh cháy lá khoai môn 27

3.2.3 Phân lập xạ khuẩn 28

3.2.4 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với

nấm Phytophthora sp trong điều kiện phòng thí nghiệm 29

3.2.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với sự hình thành bọc bào tử nấm Phytophthora sp trong điều kiện phòng thí nghiệm 31

3.2.6 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng phòng trị của các chủng xạ khuẩn đối với bệnh cháy lá trên khoai môn do nấm Phytophthora sp gây ra trong điều kiện nhà lưới 32

3.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU 34

CHƯƠNG 4 35

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

4.1 PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY HẠI CỦA CÁC CHỦNG NẤM PHYTOPHTHORA SPP TRÊN KHOAI MÔN 35

4.1.1 Kết quả thu mẫu và phân lập nấm Phytophthora spp gây bệnh cháy lá trên khoai môn 35

4.1.2 Khả năng gây hại của các chủng nấm Phytophthora spp gây bệnh cháy lá trên khoai môn 37

4.2 PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA XẠ KHUẨN ĐỐI VỚI NẤM PHYTOPHTHORA SPP (PĐT2) GÂY BỆNH CHÁY LÁ TRÊN KHOAI MÔN 41

4.2.1 Phân lập xạ khuẩn ở vùng rễ của cây khoai môn tại một số tỉnh ĐBSCL 41

4.2.2 Khả năng đối kháng của xạ khuẩn lên nấm PĐT2 gây bệnh cháy lá trên khoai môn trong điều kiện phòng thí nghiệm 43

4.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ HÌNH THÀNH BỌC BÀO TỬ NẤM PHYTOPHTHORA SPP (PĐT2) CỦA 6 CHỦNG XẠ KHUẨN TRIỂN VỌNG TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM 47

4.4 HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ CỦA 3 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐỐI VỚI BỆNH CHÁY LÁ TRÊN KHOAI MÔN DO NẤM PHYTOPHTHORA SPP (PĐT2) GÂY RA TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI 48

4.4.1 Tỉ lệ bệnh 48

4.4.2 Cấp bệnh 50

4.4.3 Chỉ số bệnh 51

4.4.4 Hiệu quả giảm bệnh 53

CHƯƠNG 5 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

5.1 KẾT LUẬN 56

5.2 ĐỀ NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ BẢNG 66

DANH SÁCH BẢNG

Tên Bảng Trang Bảng 2.1: giá trị dinh dƣỡng của khoai môn so với khoai tây

Bảng 2.2: Tỷ lệ thành phần các chất trong củ khoai môn (khối

Bảng 3.1: Các nghiệm thức đƣợc đƣợc bố trí trong thí nghiệm 32

Bảng 4.1: Các chủng nấm Phytophthora spp gây bệnh cháy lá

trên khoai môn thu thập đƣợc ở Đồng Tháp, An Giang, Trà

Bảng 4.5: Bán kính vòng vòng vô khuẩn (BKVVK) của các

chủng xạ khuẩn đối với nấm PĐT2 ở các thởi điểm 3, 5, 7

ngày sau bố trí (NSBT)

44

Bảng 4.6: Hiệu suất đối kháng (HSĐK) của các chủng xạ

khuẩn đối với nấm PĐT2 ở các thởi điểm 3, 5, 7 ngày sau bố

DANH SÁCH HÌNH

Tên hình Trang

Hình 2.1: Chu kỳ xâm nhiễm của nấm Phytophthora

Hình 2.2: (1) vết bệnh ban đầu của bệnh cháy lá do nấm

Phytophthora colocasiae gây ra trên khoai môn 4 tháng tuổi

(2) ruộng khoai môn bị cháy rụi hoàn toàn sau nữa tháng

nhiễm (3) quan sát túi bào tử của nấm Phytophthora

colocasiae bằng kính hiển vi (4) quan sát sự sản sinh bào tử

của túi bào tử Phytophthora colocasiae trong nước cất vô

trùng ở nhiệt độ tối ưu (20-21 0C) bằng kính hiển vi (5) quan

sát sự nẩy mầm bằng cách tạo ra ống mầm của bào tử nấm

Phytophthora colocasiae trong nước cất vô trùng ở nhiệt độ

tối ưu (20-28 0C) (Nguồn: Misra et al., 2008)

9

Hình 3.1: Mô tả phương pháp thử đối kháng của xạ khuẩn đối

Hình 4.1: Triệu chứng bệnh cháy lá khoai môn do nấm

Phytophthora spp ở ngoài đồng tại các địa điểm thu thập mẫu

bệnh A: Ruộng khoai môn bệnh ở Đồng Tháp; B: Ruộng

khoai môn bệnh ở Trà Vinh; C: Ruộng khoai môn bệnh ở An

Hình 4.4: Triệu chứng bệnh do lây bệnh nhân tạo của một số

chủng nấm ở thời điểm 4 ngày sau chủng bệnh 40

Hình 4.5: Biểu hiện bệnh cháy lá khoai môn do nấm

Phytophthora sp của một số chủng nấm ở thời điểm 4 ngày

rốt

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Theo kết quả điều tra của chương trình cây có củ quốc gia năm 1993 cho thấy hàng năm có khoảng 150.000ha khoai môn được trồng với năng suất bình quân khoảng 8-13 tấn/ha tùy giống (Trường Văn Hộ, 2000) Trong những năm gần đây, khoai môn đang có xu hướng mở rộng diện tích trồng nguyên nhân là

do hiệu quả kinh tế từ trồng môn cao hơn rất nhiều so với trồng lúa (Trần Thị

Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2015), giúp nhiều hộ nông dân vươn lên thoát nghèo Tuy nhiên trong quá trình canh tác người dân gặp không ít khó khăn trong khâu chăm sóc và quản lý sâu bệnh hại, trong đó bệnh cháy lá thối củ là bệnh hại phổ biến, làm thất thu năng suất và giảm chất lượng nghiêm trọng trên khoai môn, nếu bị bệnh cháy lá nặng có thể giảm đến 50% năng suất

(Nguyễn Phi Hùng, 2010) Bệnh do nấm Phytophthora sp gây hại bằng sinh

sản vô tính là sản sinh ra các túi bào tử và phóng thích động bào tử xâm nhập vào lá, bẹ làm cháy lá và xuống củ làm thối củ Bệnh phát sinh và phát triển tốt trong điều kiện ẩm độ cao (>95%), nhiệt độ mát (20-250C) (Nguyễn Phi Hùng, 2010) Biện pháp hóa học đang là giải pháp tạm thời mà nhiều nông dân

sử dụng hiện nay, vừa dễ dàng áp dụng còn mang lại hiệu quả tức thì Tuy nhiên, tình trạng lạm dụng nhiều loại hóa chất liên tục gia tăng trong thời gian dài gây ảnh hưởng không nhỏ đến hệ sinh thái nông nghiệp, làm thoái hóa đất đai, tăng phát thải khí, làm mất đi sự đa dạng trong sinh học về số lượng và số loài côn trùng có ích giảm đi rất nhiều, dẫn đến sự mất cân bằng sinh thái là nguyên nhân chính cho sự xuất hiện càng nhiều các loài dịch hại (Nguyễn Thị Phong Lan, 2016) Vậy nên phòng trừ sinh học là hướng nghiên cứu mới giúp bảo vệ cây trồng, an toàn với môi trường và bền vững với các loài dịch hại cây trồng, là xu thế phát triển của nền nông nghiệp sạch mà nhiều quốc gia trên thế giới đang hướng đến Đã có nhiều nghiên cứu ghi nhận xạ khuẩn có khả năng

quản lý một số mầm bệnh hại cây trồng như: Xanthomonas oryzae (Hastuty et

al., 2012), Rhizoctoria solani (Lê Minh Tường và Ngô Thị Kim Ngân, 2014), Pyricularia oryzae (Nguyễn Thị Phong Lan, 2016), Colletotrichum sp (Đổ

Văn Sử và Lê Minh Tường, 2016) Vì thế để nối tiếp những thành tựu trên, nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm ra chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với chủng nấm bệnh gây cháy lá thối củ trên cây khoai môn có biểu hiện rõ rệt nhất, làm tiền đề cho những nghiên cứu sau này giúp tạo ra sản phẩm sinh học vừa có khả năng quản lý bệnh vừa thân thiện với môi trường

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đánh giá khả năng gây hại và tìm ra chủng nấm Phytophthora sp có khả năng

gây hại khoai môn nặng nhất

Tìm ra các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp

trong điều kiện phòng thí nghiệm

Tìm ra các chủng xạ khuẩn có hiệu quả phòng trị bệnh cháy lá khoai môn do

nấm Phytophthora sp gây ra trong điều kiện nhà lưới

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trên đối tượng là xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm

Phytophthora sp gây bệnh cháy lá khoai môn

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Phân lập và đánh giá khả năng gây hại của các chủng nấm Phytophthora sp

gây bệnh cháy lá trên khoai môn

Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm

Phytophthora sp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Đánh giá khả năng ức chế sự hình thành bọc bào tử nấm Phytophthora sp của

xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm

Đánh giá khả năng phòng trị của xạ khuẩn đối với bệnh cháy lá trên khoai

môn do nấm Phytophthora sp gây ra trong điều kiện nhà lưới

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

 Đóng góp về mặt khoa học: có ý nghĩa khoa học trong công tác

nghiên cứu và giảng dạy về khả năng đối kháng của xạ khuẩn

 Đóng góp về mặt thực tiễn: ứng dụng kết quả nghiên cứu để tạo ra sản

phẩm sinh học có khả năng phòng trừ bệnh cháy lá trên khoai môn ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

 Đóng góp bảo vệ môi trường: giúp cung cấp thêm giải pháp phòng trừ

sinh học trên cây trồng, an toàn với môi trường

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY KHOAI MÔN

2.1.1 Nguồn gốc

Khoai môn (Colocasia esculenta) là một loại cây trồng nhiệt đới với gần 1000

loài và là một loại cây lương thực thiết yếu cho người dân ở các nước đang phát triển Ở khắp các hòn đảo của Thái Bình Dương, các quần đảo Châu Á, Trung Phi, Trung Mỹ, Tây Ấn Độ và quần đảo Caribê, khoai môn đóng một vai trò quan trọng trong khẩu phần ăn của người dân (Chandra và Sivan, 1984)

Khoai môn được thuần hóa đầu tiên ở Đông Nam Á sau đó lan truyền khắp các nước trên thế giới, và bây giờ đã trở thành loại cây trồng quan trọng ở cả Châu Á, Thái Bình Dương và Châu Phi (Davinder Singh, 2012)

Theo Nguyễn Thị Duệ và Đinh Thế Lộc (2005), cây khoai môn đã được thuần hóa từ rất sớm cách đây khoảng 10.000 đến 15.000 năm, trước hơn cả lúa nước và được sử dụng khá phổ biến trong bữa ăn hàng ngày của người dân Việt Nam từ xưa

Việt Nam là quốc gia có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho việc trồng và phát triển cây khoai môn Khoai môn có mặt ở nhiều tiểu vùng sinh thái trong cả nước như Bắc Kạn, Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái, Nghệ An, Đà Lạt, Trà Vinh,… Nó được trồng trên nhiều loại đất khác nhau từ vườn rộng ở đồng bằng đến đất đồi núi triền dốc (đất nương rẫy) ở miền núi (Trần Thanh Trang, 2015)

Ở Việt Nam, khoai môn là cây lấy củ quan trọng thứ 4 sau khoai tây, khoai lang và sắn (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs., 2010) Theo Vũ Thị Nự (2010) hằng năm nước ta xuất khẩu khoai môn sang Đài Loan, Nhật Bản, Singapor đạt trên 400.000 USD/năm với mức giá khoảng 350 USD/tấn

2.1.3 Thành phần cấu tạo

Khoai môn (Colocasia esculenta) là loài cây thân thảo đa niên có thân ngầm

phát triển thành củ chứa nhiều tinh bột ăn được và được dùng làm lương thực

và thực phẩm ở các nước Châu Á (Chandra và Sivan, 1984)

+ Thân: cây khoai môn có thân ngầm phát triển thành củ Thân giả mọc phía trên nơi các bẹ lá xếp với nhau Chiều cao của cây chủ yếu là bẹ lá cao 0,5-1

m

+ Củ: phần thân ngầm phát triển thành củ, mỗi bụi có từ 1 đến nhiều củ Vỏ củ

có màu xám, tím…tùy giống

+ Lá: lá đơn rộng, mọc so le, phiến lá hình tam giác, gốc lỏm Bẹ lá gợp thành thân giả hoặc rời, phát triển từ thân ngầm ở dưới mặt đất

+ Hoa: mọc thành chùm vào cuối giai đoạn sinh trưởng của cây Cây sinh sản

vô tính bằng chồi non phát triển từ củ Củ khoai môn thích hợp để dùng tươi

và chế biến công nghiệp

Khoai môn có tiềm năng về năng suất rất lớn, Misra (1991,1999) đã tiến hành những cuộc khảo sát ở những vùng trồng khoai môn có diện tích lớn và đã cho thấy năng suất của chúng khoảng 30-50 tấn/hecta

Khoai môn có chứa rất nhiều tinh bột và được sử dụng ở khắp mọi nơi như là một loại rau củ Bên cạnh đó, cây trồng này có giá trị dược liệu lớn và được sử dụng trong nhiều chế phẩm của ngành y học cổ truyền Ấn Độ (Ayurvedic) Giá trị dinh dưỡng của khoai môn cao hơn nhiều so với khoai tây và một số loại rau củ khác về những thành phần như protein, chất xơ, phốt pho, sắt… (Misra và Chowdhury, 1997) (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: giá trị dinh dưỡng của khoai môn so với khoai tây và các loại cây

trồng lấy củ nhiệt đới khác

Khoai tây

(Solanum tuberosum)

Khoai mì

(Manihot esculenta)

Khoai lang

(Ipomoea batatas)

Khoai mỡ

(Dioscorea alata)

Cây Khoai môn là loại cây dị hợp tử, do vậy sự đa dạng về giống dẫn đến sự

đa dạng về thành phần dinh dưỡng Tùy theo giống mà thành phần hóa học của khoai môn thay đổi Trong củ tươi nước chiếm 63 – 85% và cacbon hydrat chiếm 13 – 29% tùy thuộc vào giống, trong đó tinh bột chiếm tới 77,9% với 4/5 là amylopectin và 1/5 là amylose Hạt tinh bột của khoai môn rất nhỏ nên

dễ tiêu hóa, chính ưu thế này đã tạo cho khoai môn có ưu thế như là món ăn đặc biệt phù hợp cho trẻ nhỏ bị dị ứng và những người bị rối loạn dinh dưỡng

Bảng 2.2: Tỷ lệ thành phần các chất trong củ khoai môn (khối lượng tươi)

theo FAO/ Onwueme (1994)

2.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH CHÁY LÁ KHOAI MÔN

2.2.1 Tình hình gây hại của bệnh cháy lá khoai môn

Bệnh cháy lá khoai môn lần đầu tiên xuất hiện ở Ấn Độ và đã gây thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều nơi từ năm 1905 (Butler & Kulkarni, 1913)

Tại Mauritius, khoai môn được trồng rộng rãi trong các vùng của phía Bắc Sản lượng khoai môn bị sụt giảm khá nhanh chóng từ 480 tấn năm 1993 xuống còn 45 tấn năm 1997, nguyên nhân làm sản lượng khoai môn giảm là

do bùng phát dịch bệnh cháy lá gây ra bởi nấm Phytophthora colocasiae vào

năm 1995 Nhiều biện pháp kiểm soát bệnh không hiệu quả dẫn đến sản lượng khoai môn luôn trong tình trạng không ổn định trên nhiều vùng của quần đảo Mauritius Điều này xảy ra tương tự như ở Ấn Độ, Indonesia và nhiều nước ở Thái Bình Dương gây mất sản lượng lên đến 50% (Onwueme, 1999)

Cháy lá khoai môn (Taro Leaf blight – TLB) gây ra bởi nấm Phytophthora

colocasiae Raciborski (P colocasiae) có mặt tại Thái Bình Dương từ những

năm đầu 1900 Căn bệnh này được ghi nhận ban đầu ở Guam năm 1918 và sau

đó ở Hawaii năm 1920 Trước sự xuất hiện của bệnh ở Hawaii, người ta nghĩ rằng đã có hơn 300 giống khoai môn khác nhau, nhưng chỉ có một vài giống sống sót sau tác động của bệnh Tương tự như vậy, ở Guam, hơn 60% các giống nổi tiếng được cho là đã mất đi như một hệ quả của bệnh Ở Papua New Guinea, sự bùng phát của bệnh cháy lá khoai môn được cho là đã làm suy giảm quá trình sản xuất khoai môn và cho rằng nhiều khả năng bênh lây lan từ Indonesia trong chiến tranh thế giới thứ hai Dịch bệnh này trong những năm 1993-1994 ở American Samoa là thảm họa đối với người trồng khoai môn Vì trước đó khoai môn là sản phẩm xuất khẩu chính của Samoa, nhưng trong vòng 6 tháng xảy ra dịch bệnh, sản lượng giảm 0,4 triệu tấn mỗi năm so với trước, và làm giảm sản lượng cao nhất là 5 tấn vào cuối năm 1995 Năm 1993, giá trị xuất khẩu khoai môn của Somoa là 3.500.000 USD (khoảng 58% kim ngạch xuất khẩu nông nghiệp của Somoa) nhưng đến năm 1994 giá trị đã giảm xuống còn ít hơn 60.000 USD Trong vòng 2 năm kể từ khi dịch bệnh cháy lá khoai môn bắt đầu bùng phát ở Somoa, chỉ còn 200 nông dân trồng khoai môn, những người khác hầu hết chuyển sang trồng những loại cây trồng khác như chuối, khoai lang và sắn Trong năm 2010, bệnh cháy lá khoai môn đã lây sang các quốc gia Tây Phi của Cameroon, nơi nó gây ra tổn thất sau thu hoạch

lên đến 90% (Davinder Singh et al., 2012).

2.2.2 Tác nhân gây bệnh

Raciborski là người đầu tiên mô tả sinh vật gây bệnh cháy lá trên khoai môn

do nấm P colocasiae vào năm 1890 từ Indonesia Các khuẩn ty (mycelium)

(sợi nấm) có màu trong suốt, cấu tạo đa nhân thường được gọi là cộng bào (coenocytic) Các giác mút (haustoria) của nấm rất mãnh, dài và không phân nhánh Điều kiện phát triển tối ưu của nấm ở nhiệt độ 28 0

C và pH=6,5 (Sahu, 2000)

Nấm P colocasiae thuộc giới Chromista, ngành Oomycota, lớp Oomycestes,

bộ Pernoporales, họ Pythiaceae, chi Phytophthora (Hawksworth et al., 1965) Nấm P colocasiae có sợi nấm phát triển đơn bào, không có vách ngăn, phân

nhánh vuông góc và túi bào tử rụng nhiều Túi bào tử có nhiều dạng khác nhau như hình quả lê ngược, hình trứng ngược, thỉnh thoảng có dạng chóp 2 đầu Cành bào tử có dạng cành đơn, phân nhánh, túi bào tử đính riêng lẽ hoặc thành từng chùm 2 - 5 túi trên 1 cành (Nguyễn Phi Hùng, 2010)

Bào tử động của P colocasiae nảy mầm sau 5 ngày ủ bệnh Những bào tử

không nảy mầm trở thành bào tử nghỉ bằng cách tăng vách dày hoặc hình thành chlamydosphore Nguồn bệnh có thể lưu tồn trong đất ẩm hơn 3 tháng

Ngoài ra, các động bào tử nang hóa của P colocasiae có thể chịu đựng trong

nhiều tháng mà không có mặt của ký chủ sống nhưng chỉ tồn tại ít hơn 1 năm

do động bào tử thiếu khả năng sống ngoại sinh (Quitugua và Trujillo, 1998)

2.2.3 Triệu chứng bệnh

Triệu chứng bệnh ban đầu là trên lá xuất hiện các đốm nâu nhỏ hơi mọng nước sau đó lan rộng tạo thành các vết cháy lớn có màu nâu sậm, xung quanh vết bệnh thường có viền màu vàng Cây nhiễm nấm thứ cấp sẽ làm cho lá bị cháy nhanh chóng, có thể xảy ra trong 10-20 ngày hoặc ít hơn đối với những giống nhiễm Bệnh làm giảm đáng kể chức năng quang hợp của lá và có thể làm giảm năng suất đến 50% (Trujillo & Aragaki, 1964; Trujillo, 1967; Jackson, 1999)

2.2.4 Cơ chế xâm nhiễm

Đơn vị sinh sản chính của nấm Phytophthora sp là bọc bào tử cần sự hiện diện của nước để nảy mầm ( Singh và cs., 2012)

Có hai hình thức nảy mầm của túi bào tử Đầu tiên đó là hình thức gián tiếp, trong điều kiện lạnh (khoảng 200C), các tế bào chất trong mỗi bọc bào tử phân biệt thành 15-20 du động bào tử, các động bào tử này thoát ra ngoài qua các lỗ phóng thích và di chuyển qua bằng roi trong môi trường nước Các du động bào tử bám trên bề mặt lá khoảng 10 phút nhờ lông roi của chúng và tạo thành một khối u tròn và tiếp tục nảy mầm để tạo thành một ống mầm Nguồn nhiễm mới có thể được bắt đầu trong vòng một giờ, một bọc bào tử được hình thành

và nấm Phytophthora sp.có thể tiếp tục hình thành bào tử và lây nhiễm trong thời gian ngắn Hình thức nảy mầm này giúp tác nhân gây bệnh tăng đến 15 lần trong nguồn bệnh (Singh và cs., 2012) Trong điều kiện ấm (khoảng 250C), hình thức nảy mầm trực tiếp sẽ xảy ra Các túi bào tử nảy mầm trực tiếp bằng ống mầm gây tổn thương lá So với hình thức nảy mầm gián tiếp thì hình thức nảy mầm này mất khá nhiều thời gian khoảng 5-6 giờ cho một bọc bào tử nảy mầm Tỷ lệ các túi bào tử nảy mầm trực tiếp thường là thấp hơn nhiều so với

sự hình thành động bào tử (Davinder Singh và cs., 2012)

2.2.5 Điều kiện phát sinh và lây lan

Bệnh cháy lá khoai môn phát triển và lây lan mạnh trong điều kiện thời tiết ấm

áp với nhiệt độ 24-300C và ẩm độ cao Bệnh xảy ra hàng năm, bắt đầu từ giữa tháng Tư và có thể đạt đỉnh điểm vào tháng bảy và tháng tám, khi nhiệt độ ổn

Kiểu lai A1+A2 Bào tử noãn

Bào tử noãn nảy mầm

hình thành bọc bào tử

Sinh sản hữu tính

Bọc bào tử/bào tử động lan truyền bởi gió, nước

mưa

Sinh sản vô tính

Hệ sợi nấm phát triển

Hình 2.1: Chu kỳ xâm nhiễm của nấm Phytophthora colocasiae (Nguồn:

Brook, 2005)

định 27-290C và lượng mưa trung bình hàng tháng trong khoảng 201-308 mm (Dang Vu Thi Thanh và cs., 2004)

Nấm phát tán dưới dạng bào tử và lây sang những ruộng cây trồng gần đó thông qua gió, mưa và sương mù Ngoài ra chúng còn có thể lây lan thông qua các nông cụ dùng để canh tác khoai môn và có thể lưu tồn trên thân lá trong khoảng 3 tuần sau khi thu hoạch (Jackson, 1999)

Hình 2.2: (1) vết bệnh ban đầu của bệnh cháy lá do nấm Phytophthora

colocasiae gây ra trên khoai môn 4 tháng tuổi (2) ruộng khoai môn bị cháy rụi

hoàn toàn sau nữa tháng nhiễm (3) quan sát túi bào tử của nấm Phytophthora

colocasiae bằng kính hiển vi (4) quan sát sự sản sinh bào tử của túi bào tử

Phytophthora colocasiae trong nước cất vô trùng ở nhiệt độ tối ưu (20-21 0C)

bằng kính hiển vi (5) quan sát sự nẩy mầm bằng cách tạo ra ống mầm của bào

tử nấm Phytophthora colocasiae trong nước cất vô trùng ở nhiệt độ tối ưu

(20-28 0C) (Nguồn: Misra et al., 2008)

Theo Brooks (2005), thì túi bào tử rời cành bào tử tại mép vết bệnh và lan truyền bởi nước mưa Chúng nảy mầm trên lá, cuốn lá hoặc rửa trôi vào trong đất nơi chúng có thể truyền nguồn bệnh sang củ Nếu có mặt 2 dạng A1 và A2 túi noãn và túi đực có thể hình thành bào tử trứng Nguồn bệnh tồn tại trong cây bằng hệ sợi nấm hoặc bằng bào nang động bào tử trong đất Cây bị nhiễm bệnh, túi bào tử, động bào tử trong nước mưa là nguồn chính để truyền vào cây mới

2.2.6 Biện pháp phòng trừ

2.2.6.1 Biện pháp canh tác

Theo Nguyễn Thị Duệ và Đinh Thế Lộc (2005) để quản lý bệnh cháy lá khoai môn tốt nên thường xuyên vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng khác sau 2

đến 3 năm trồng, cắt bỏ lá bị bệnh và mang ra xa vùng canh tác để tiêu hủy

Sử dụng giống kháng bệnh sẽ đạt hiệu quả cao nhất và thân thiện với môi

trường để kiểm soát bệnh cháy lá khoai môn (Li và cs, 2011)

Theo Singh et al (2012), việc kiểm soát bệnh cháy lá trên khoai môn gồm

những việc loại bỏ các lá bị nhiễm bệnh trong giai đoạn đầu của sự phát triển bệnh, lựa chọn địa điểm được bao quanh như là một rào cản đối với sự lây lan dịch bệnh, cách ly cây trồng mới với những cây bị bệnh, và vệ sinh các dụng

cụ canh tác mang mầm bệnh

2.2.6.2 Biện pháp hóa học

Phun các loại thuốc như Bordeax 1% và Ridomil MZ 0,2% để khống chế bệnh khi thấy có vết bệnh xuất hiện (Nguyễn Thị Duệ và Định Thế Lộc, 2005)

Theo Gollifer and Brown (1974), lợi nhuận sẽ tăng lên khi kiểm soát bệnh bằng các loại thuốc gốc đồng Ngoài ra, sử dụng thuốc gốc đồng khi vết bệnh vừa xuất hiện trong thời gian từ 7 - 14 ngày cho hiệu quả tốt hơn Đồng oxycloride với liều lượng 4,5kg pha với 100 lít nước phun cho 1 ha, cho kết quả tốt khi kiểm soát bệnh ở những hòn đảo của Solomon (Jackson and Gollifer, 1977)

Theo Brook (2005), một số báo cáo cho thấy các thuốc có chứa axit phốt pho, hoạt chất metalaxyl cũng có khả năng kiểm soát tốt bệnh cháy lá trên khoai môn Riêng ở Việt Nam, khi thấy bắt đầu có hiện tượng nhiễm bệnh, phun các thuốc Bordeaux 1%, Ridomil 0,2 %, Anvil 0,2 % để khống chế bệnh cũng là một biện pháp cho hiệu quả cao (Nguyễn Thị Duệ và Đinh Thế Lộc, 2005) Ngoài ra, theo một số nghiên cứu về việc áp dụng các biện pháp hóa học để

phòng trị những bệnh do nấm Phytophthora sp gây ra thì 2 hoạt chất

Mancozed và Dimethomorph cũng cho hiệu quả ức chế cao cụ thể là với nấm

Phytophthora nicotianae gây thối gốc Mè (Lê Thị Ngọc Hà, 2013) Kết quả

khảo sát khả năng ức chế nấm Phytophthora capsici gây thối trên dưa hấu của

8 loại thuốc hóa học trong điều kiện phòng thí nghiệm của Võ Văn Nhiều (2014) cho thấy thuốc Phytocide 50WP (hoạt chất Dimethomorph), và Danjiri

10 SC ( hoạt chất ethaboxam) thể hiện khả năng ức chế nấm cao hơn Ridomil

Gold 68WG và Al famil 25WP

2.2.6.3 Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học trong phòng trị bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và vi sinh vật đối kháng một cách thích hợp để tạo nên cân bằng sinh học cần thiết, đồng thời cũng giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại Nhờ đó bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan trọng về mặt kinh tế (Phạm Văn Kim, 2000) Phòng trừ sinh học bệnh cây là kiểm soát sinh học một cách hoàn toàn hay một phần sự phá hủy mật số của mầm bệnh bởi những vi sinh vật khác xuất hiện trong tự nhiên (Agrios, 2005)

Theo Raj Shekhar Misra et al., (2008) Tiềm năng phòng trị P colocasiae của nấm đối kháng Trichoderma viride là rất cao thông qua khả năng ức chế sự nhân mật số của Phytophthora colocasiae tới 88,88%, trong khi T harzianum

và T pseudockei tỷ lệ này là 77,77% và 88,88%

Theo kết quả nghiên cứu của Trần Thanh Trang (2015) cho thấy tất cả các

chủng vi khuẩn và chế phẩm sinh học đều có khả năng ức chế nấm P

colocasiae cao trên 50%, nghiệm thức CP VKĐK cho kết quả cao nhất đến

70,86%, hai nghiệm thức AGB3 và AGB27 cũng có kết quả khá tốt là 65,14%

và 62,29%

2.3 PHÕNG TRỪ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

Ngày nay để đáp ứng nhu cầu phát triển chung của xã hội, nền nông nghiệp phải luôn chịu áp lực của thâm canh, tăng vụ, sản xuất phải đáp ứng tăng năng suất, tăng sản lượng Phòng trừ sinh học (PTSH) là hướng nghiên cứu bảo vệ cây trồng an toàn với môi trường và bền vững với các loài dịch hại cây trồng,

là xu thế phát triển của nền nông nghiệp sạch mà nhiều quốc gia trên thế giới đang hướng đến Trong nền nông nghiệp sạch PTSH sẽ trở nên phổ biến hơn,

đó là chiến lược nhằm giảm bớt việc lạm dụng thuốc hóa học để quản lý bệnh hại cây trồng Vì vậy việc sử dụng các tác nhân sinh học hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh gây hại là một trong những vấn đề được quan tâm và đánh giá cao (Nguyễn Thị Phong Lan, 2016) Vai trò của PTSH trong sản xuất nông nghiệp được thừa nhận có các ưu điểm:

+ Không gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, cây trồng, vật nuôi, không gây ô nhiễm môi trường sinh thái

+ Có tác dụng giúp duy trì cân bằng hệ sinh thái môi trường, có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông sản Ứng dụng các chế phẩm sinh học còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

+ Có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại và tăng khả năng đề kháng của cây mà không làm ảnh hưởng đến môi trường

+ Có khả năng phân hủy và chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường Cây trồng và vi sinh vật (VSV) đã cùng tồn tại và tiến hóa qua hàng triệu năm,

vì vậy mối quan hệ này là vô cùng phức tạp và rất khó kiểm soát (Ou, 1985)

Vi sinh vật đối kháng có khả năng khống chế sinh học, tác động đối kháng lên nhóm VSV gây bệnh, tiêu diệt hoặc hạn chế quá trình sống của chúng Vì vậy, VSV đối kháng rất có lợi cho việc bảo vệ cây trồng khỏi bị sâu bệnh tấn công

Số lượng VSV đối kháng và VSV có ích trong tự nhiêu nhiều hơn số lượng VSV gây hại (Cook & Baker, 1983) Chúng có thể được sử dụng dưới hai hình thức: nhân nuôi VSV đối kháng rồi phun lên cây hoặc bón vào đất để trừ bệnh hại; bảo tồn làm cho quần thể VSV đối kháng và VSV có ích phát triển mạnh trong tự nhiên Biện pháp này gọi là gìn giữ cân bằng sinh thái có lợi, hoặc là quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) Để bảo vệ, làm phong phú hóa VSV đối kháng và VSV có ích phải làm đất cho luôn thông thoáng, không úng nước, có

độ phì tốt, chủ yếu là bón nhiều phân hữu cơ có chất lượng Không lạm dụng quá nhiều thuốc hóa học, bón quá nhiều phân đạm sẽ giết chết VSV có ích và đối kháng, làm cho đất mất cân bằng sinh thái, tích lũy nhiều nguồn bệnh gây hại cho cây trồng

Trong các nhóm VSV phòng trừ sinh học thì xạ khuẩn được đánh giá là có khả năng ức chế nấm khuẩn gây bệnh hiệu quả và đa dạng nhất Xạ khuẩn được ghi nhận sở hữu nhiều khả năng ức chế mầm bệnh như: kháng sinh, ký sinh, tiêu sinh, … Ngoài ra, còn có thể giúp kích thích tăng trưởng đối với cây trồng

2.4 XẠ KHUẨN VÀ TIỀM NĂNG SỬ DỤNG TRONG PHÕNG TRỪ BỆNH HẠI CÂY TRỒNG

2.4.1 Giới thiệu chung và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn Actinobacteria thuộc nhóm vi khuẩn nhân thật (Eubacteria) phân bố

rất rộng trong tự nhiên, sự tồn tại của xạ khẩn được thừa nhận và biết đến hơn hàng trăm năm nay Ban đầu, xạ khuẩn được xem là một nhóm VSV với nhiều đặc điểm tương đồng với cả vi khuẩn (Prokaryote) và nấm mốc (Eukaryote)

Tuy nhiên việc xác định được thành phần hóa học và cấu trúc của xạ khuẩn từ những năm 1950 đã xác nhận xạ khuẩn là vi khuẩn (Prokaryote) Ngày nay xạ khuẩn được xếp vào bộ Actinomycetales theo hệ thống phân loại của Bergey (Buchanon & Gibbons, 1989), là vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành sợi phân nhánh, có thành phần G + C trong DNA trên 55% (Goodfellow & Cross, 1984)

Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm ôn hòa với nhiệt độ phát triển khoảng 25-30

0C Một vài loài là ưa nhiệt có nhiệt độ phát triển tối ưu ở 45-55 0C Xạ khuẩn trong đất thường được xem là hiếu khí bắt buộc, một số loài là hiếu khí

(Actinomyces humiferus và Agromyces ramosus) hoặc kỵ khí (Oerskovia) Chi Streptomyces là chi bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm 1943 (Waksman & Henrici, 1943) Streptomyces là chi có số loài được mô tả lớn

nhất Các đại diện chi này có khuẩn ty khí sinh (KTKS) và khuẩn ty cơ chất (KTCC) phát triển phân nhánh, khuẩn lạc có đường kính khoảng 1-5 mm, mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS mịn, dày

hơn cơ chất, thường có tính kỵ nước Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô

tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, có móc, xoắn, vòng Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc, có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5m Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy (Waksman, 1957) Phần lớn xạ khuẩn phân lập từ đất thuộc dạng pH trung tính, dao động từ pH = 5,0 đến 9,0 và tối ưu khoảng pH = 7 Một số loài ưa axit có thể phát triển ở pH

= 3,5 đến 6,5 Các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài Streptomycetes ưa

axit cũng phân bố và hiện diện nhiều trong đất tự nhiên, ít có báo cáo về nhóm

xạ khuẩn ưa kiềm Streptomyses caeruleus có thể phát triển được trong khoảng

pH = 6,5 đến 9,5 Xạ khuẩn phân lập từ vùng nước ngọt với các giống phổ

biến là Actinoplanes, Mcromonospora, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces,

Thermoactinomyces (Goodfellow et al., 1988)

Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bề ngoài không khí trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm, khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi Khuẩn lạc của xạ khuẩn có ba lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc của xạ

khuẩn có thể mang màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím

Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên được gọi là khuẩn ty dinh dưỡng Đường kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2 µm – 0,3 µm, khuẩn ty không có vách ngăn và không bị đứt đoạn Tùy loại môi trường mà khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước, có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tùy theo từng loại mà cuống sinh bào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò xo hay xoắn ốc; chúng có thể mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh bào tử có thể từ 5-10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5-7 nm (Goodfellow et al., 1988)

2.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh học của xạ khuẩn

2.4.2.1 Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn, ngoại trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử Hệ sợi của

xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay đổi từ 0,2 - 3µm, chiều dài

hệ sợi đạt tới một vài mm Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong (Nguyễn Lân Dũng

và cs., 2007)

2.4.2.2 Khuẩn ty

Hệ sợi khuẩn ty của xạ khuẩn được chia thành hai phần: khuẩn ty khí sinh (phát triển trên bề mặt cơ chất) và khuẩn ty cơ chất (cắm sâu vào môi trường với chức năng chủ yếu là cung cấp dinh dưỡng) Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ

chất cũng có loại chỉ có khuẩn ty khí sinh (như chi Sporichthya) Khi đó, hệ

sợi khí sinh vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng (Lê Xuân Phương, 2008)

Theo Nguyễn Như Thành và cs (2004) thì khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn và không bị đứt đoạn, có hình que hay hình cầu, đường kính khuẩn ty khoảng 0,2- 0,5µm Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường không ổn định, phụ thuộc vào từng loài và môi trường nuôi cấy

2.4.2.3 Bào tử

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử, đó là cơ quan sinh sản đặc trưng của xạ khuẩn

Cuống bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách, kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que, với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông (Nguyễn Lân Dũng và cs., 1977)

2.4.2.4 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính như: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào: có kết cấu dạng lưới dày 10 – 20 nm có tác dụng bảo vệ tế bào,

duy trì hình dáng của khuẩn ty, gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong

Màng sinh chất: nằm ngay dưới lớp thành tế bào và dày khoảng 50 nm được

cấu tạo chủ yếu bởi hai thành phần là phospholipid và protein, cấu tạo giống như ở vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2002)

Nguyên sinh chất và nhân: Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa

mezosom, ribosome, các thể ẩn nhập (gồm các hạt polyphosphate hình cầu bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch nhuộm Lugol) Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc điển hình chỉ

là những nhiễm sắc thể không có màng (Trần Thị Cẩm Vân, 2001)

2.4.3 Một số cơ chế phòng trừ sinh học của xạ khuẩn liên quan đến khả năng ức chế tác nhân gây bệnh

VSV trong phòng trừ sinh học, trong đó Streptomycaes chiếm 45,6%, nấm chiếm 21,5% và vi khuẩn 16,9% (Ambarwati et al., 2012)

Xạ khuẩn là nhóm VSV có khả năng tạo kháng sinh mạnh, các kháng sinh chọn lọc của các xạ khuẩn rất khác nhau, cả về số lượng lẫn chất lượng Các chất kháng sinh mà xạ khuẩn tiết ra thường phụ thuộc vào loài, có khi phụ thuộc vào chủng, các thành phần của môi trường mà nó phát triển và cũng có khi là điều kiện nuôi cấy (Waksman & Schatz, 1945) Các hợp chất kháng sinh

khác nhau của xạ khuẩn đã được nghiên cứu đặc điểm gồm: aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide,

polyene, polyeste, polykotide, actinomycin, tetracycline (Goodfellow et al.,

1988)

Kháng sinh As1A được sản xuất từ xạ khuẩn Streptomyces libani ức chế nấm

Phytophthora capsici và kháng lại nấm Colletotrichum lagenarium (Kim et al., 1999) Các kháng sinh được phân lập từ Streptomyces spp có khả năng

phòng trị bệnh do vi khuẩn như: streptomycin, tetracyclin, erythromycin, neomycin và kháng sinh phòng trị bệnh do nấm như: nystatin, amphocetin B (George, 2011)

2.4.3.2 Cạnh tranh dinh dưỡng và ký sinh

Cạnh tranh dinh dưỡng là một hiện tượng xảy ra phổ biến trong điều kiện tự nhiên giữa các nhóm VSV có các đặc điểm sinh lý giống nhau và cùng chia sẽ

môi trường sống trong điều kiện dinh dưỡng bị giới hạn (Alabouvette et al.,

2009) Một số yếu tố dinh dưỡng bị cạnh tranh giữa các VSV bao gồm các đơn chất như carbon, nitrogen, sắt và hợp chất phức tạp như chất bài tiết từ cây trồng, xác bã thực vật (Whipps & Gerhardson, 2007) Trong các yếu tố dinh dưỡng nêu trên, sắt là yếu tố quan trọng đối với tất cả các VSV sống, tuy nhiên hàm lượng sắt trong môi trường tự nhiên đặc biệt là vùng rễ có thể sử dụng bởi VSV rất hạn chế (O’Sullivan & O’Gara, 1992) Tuy nhiên, giữa các nhóm VSV cạnh tranh sắt, nhóm phòng trừ sinh học có hệ thống hấp thu sắt hiệu quả hơn so với tác nhân gây bệnh, do khả năng sản sinh nhiều sidorephore (Nelson, 1990) Đây là hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng hấp thu và vận chuyển sắt, được sản sinh bởi các VSV trong điều kiện môi trường có hàm lượng sắt giới hạn (Elad, 1986) Trong số nhóm VSV được sử dụng trong phòng trừ sinh học, xạ khuẩn là nhóm có khả năng sản sinh sidorephore Mối liên hệ giữa hiệu quả phòng trừ sinh học của xạ khuẩn đối với một số bệnh hại cây trồng do VSV gây ra (nấm và vi khuẩn) và hàm lượng sidorephore được sản sinh bởi xạ khuẩn trên môi trường nuôi cấy nhân tạo đã được chứng minh trong rất nhiều công trình nghiên cứu

Sadeghi et al (2006) cho biết, Streptomyces sp với chủng phân lập có khả

năng phòng trừ hiệu quả bệnh chết cây con trên củ cải đường đồng thời có khả năng sản xuất sidorephore trên môi trường nuôi cấy nhân tạo

Ngoài ra, xạ khuẩn còn có thể ký sinh trên bề mặt của bào tử nấm Phạm Văn Kim (2006) đã ghi nhận xạ khuẩn ký sinh nấm Helminthosporium sativus chôn trong đất vườn sau 50 ngày, các vi sinh vật này phá hủy vách tế bào nấm

và tạo ra các lỗ hổng ở vách tế bào nấm

2.4.3.3 Kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng

Tính kháng bệnh trên cây trồng bởi VSV đã được khảo sát qua nhiều công trình nghiên cứu khoa học trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau Có hai loại kích kháng trên cây trồng là kích kháng lưu dẫn và kích kháng tại chỗ, chúng được phân biệt dựa trên chất kích kháng và dấu hiệu kích kháng Kích kháng tại chổ là hiện tượng cây trồng hình thành hệ thống kháng bệnh để phản ứng lại tác nhân gây bệnh sau khi bị tấn công bởi một tác nhân gây bệnh độc

tính hoặc hóa chất (Kessmann et al., 1994) Biểu hiện của tính kháng tại chỗ

có liên quan đến PR-proteins (pathogenesis related proteins) và hình thành axit

salicylic (Sticher et al., 1997) Tính kháng lưu dẫn xảy ra khi rễ cây được xử

lý với VSV kích thích sinh trưởng (Vallad & Goodman, 2004) Hiệu quả phòng trừ sinh học của xạ khuẩn đối với một số bệnh hại cây trồng dựa trên cơ chế kích thích tính kháng bệnh được ghi nhận qua nhiều công trình nghiên

cứu Galal (2006) sử dụng 9 chủng Streptomyces sp để đánh giá khả năng

kích kháng chống lại vi rút CMV (Cucumber Mosaic Vius) gây bệnh khảm

trên cây dưa leo (Cucumis sativus) Kết quả cho thấy, ngâm hạt trong 2 giờ

trong các bộ lọc xạ khuẩn cho hiệu quả ức chế vi rút cao nhất Ngoài ra trước

khi vi rút xâm nhiễm, áp dụng bộ lọc của 5 chủng Streptomyces trên cũng cho

thấy khả năng kháng vi rút cao hơn so với việc áp dụng sau khi chủng vi rút Một nghiên cứu gần đây của Shimizu và cs (2001) đã tìm thấy được chất

kháng sinh actinomycin X2 từ dịch trích của chủng Streptomyces sp R-5

Đồng thời, chất kháng sinh này cũng được tìm thấy trong mô của cây con và môi trường nuôi cấy mô Điều này cho thấy rằng chất kháng sinh có thể di chuyển từ môi trường nuôi cấy mô lên mô của tế bào thực vật

2.4.3.4 Tiết enzym phân giải

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp, enzyme có trong tất cả

tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học (Phạm Thị Trân Châu và cs., 2006)

Xạ khuẩn Streptomyces spp có khả năng tiết ra một số ennzym như chitinase,

cellulase, xylanase, glucanase,… (Jaradat và cs., 2008)

- Chitinase

Theo Phạm Văn Kim (2000) thì trong tế bào nấm có nhiều thành phần như chitin, protein và glucan, trong đó chitin chiếm khoảng 22 – 44% trong vách tế bào nấm

Theo Quecine và cs (2008) thì chitinase kiểm soát nấm gây bệnh bằng hai cơ chế là tác động trực tiếp lên tế bào nấm và làm tăng khả năng kháng bệnh của

cây Chitinase do xạ khuẩn tiết ra có khả năng ức chế nhiều loại nấm gây bệnh bằng cơ chế phân giải thành tế bào của các loại nấm

- β -1,3-glucanase

β -1,3-glucan là một trong những thành phần cấu trúc chình của thành tế bào nấm, β-1,3-glucanase đã được chứng minh là enzyme quan trọng trong sự phân giải thành tế bào của nấm gây bệnh ở thực vật (Elad và cs., 1983; trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Nhân, 2012)

Theo nghiên cứu của Valois và cs (1996) đã phân lập được 13 chủng xạ khuẩn có khả năng tiết enzyme ngoại bào gồm β -1,3-, β-1,4-, β-1,6-glucanase,

phân hủy vách tế bào nấm Phytophthora sp gây bệnh thối rễ trên nhiều loại

cây trồng

- Cellulase

Bùi Thị Hà (2008) cho rằng xạ khuẩn có khả năng thủy phân mạnh tinh bột và cellulose nhằm tạo ra các chất đơn giản để chúng có thể dễ dàng hấp thụ Cellulase là một hệ enzyme gồm các enzyme khác nhau: cellobiohyrolase, endoglucanase, Exo – glucanase, β – glucosidae Trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhờ hệ enzyme ngoại bào

Xạ khuẩn cũng có khả năng phân huy cellulose Những xạ khuẩn thuộc nhóm

ưa nóng, sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 45 – 50oC rất thích hợp trong quá trình phân hủy rác thải (Lê Xuân Phương, 2008)

Bằng chứng về mối liên hệ giữa khả năng sản xuất enzym phân giải và hiệu quả phòng trừ đối với nấm bệnh gây hại trên cây trồng của xạ khuẩn đã được chứng minh qua một số công trình nghiên cứu: Yuan and Crawford (1995)

phân lập Streptomyces lydicus WYEC 108 vừa có khả năng tiết chất kháng nấm vừa tiết chitinases phân hủy vách tế bào nấm Pythium ultinum gây thối rễ

Gomes (2001) đã phân lập được các chủng xạ khuẩn 68 và 80 cho khả năng tiết enzym chitinases, ngoài ra hai chủng xạ khuẩn này còn có khả năng đối

kháng rất cao đối với các nấm collectotrichum gloesporioides và Fusarium

sp

2.4.4 Những thành tựu trong nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học

từ xạ khuẩn

2.4.4.1 Trong nước

Nguyễn Hoàng Chiến (2000) đã tiến hành phân lập từ đất, kết quả thu được

chủng xạ khuẩn Streptomyces sp LD30 có khả năng sinh chất kháng sinh phổ

rộng, kháng cả vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng

Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua Những

nghiên cứu gần đây của Lê Thị Bích (2011) đánh giá khả năng đối kháng của

xạ khuẩn đối với nấm Fusarium oxysporum trong điều kiện in vitro Kết quả

cho thấy các chủng xạ khuẩn được phân lập từ những ruộng rau màu ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy xạ khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của

khuẩn ty, sự nảy mầm cũng như khả năng giết chết bào tử nấm Fusarium

oxysporum

Bùi Thị Việt Hà (2006) chế phẩm TC-54 được chiết xuất từ Streptomyces

hydroscopicus cho hiệu quả tốt đối với việc phòng chống bệnh đốm vằn

(Rhizoctonia solani) ở lúa với hiệu lực gần xấp xị validacin ở điều kiện ngoài

đồng

Bùi Thị Hà (2008) đã phân lập được 80 chủng Streptomyces trên đất trồng chè

của tỉnh Thái Nguyên, có 2 chủng là Đ1 và R2 là có khả năng kháng mạnh chống lại nấm gây bệnh trên chè là CT-2E và CT-5X Trên cây gấc thì đã phân lập được 120 chủng xạ khuẩn tại các vườn gấc ở Đồng bằng sông Cửu Long,

có 26 chủng có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum spp gây bệnh

thán thư hại gấc, trong đó có 2 chủng đối kháng cao là NCT.TG4 và GCT.TG9 (Lê Minh Tường, 2014)

Những nghiên cứu gần đây của Lê Thị Bích (2011) đánh giá khả năng đối

kháng của xạ khuẩn đối với nấm Fusarium oxysporum trong điều kiện in vitro

Kết quả cho thấy các chủng xạ khuẩn được phân lập từ những ruộng rau màu ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy xạ khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển

của khuẩn ty, sự nảy mầm cũng như khả năng giết chết bào tử nấm Fusarium

oxysporum

Chủng xạ khuẩn VN08A12 – Streptomyces toxytricini đã được Nguyễn Bình

Hải (2012) tiến hành nghiên cứu nhằm tìm ra tiềm năng ứng dụng của chủng trên trong việc xử lý bệnh bạc lá lúa, thân thiện với môi trường Khi tiến hành

đánh giá khả năng đối kháng của chủng trên với 10 chủng Xoo thì kết quả

cho thấy vòng ức chế của chủng VN08A12 là từ 0,1 - 2,5 cm Trong đó kết quả tốt nhất là trên môi trường MAPM với vòng ức chế biến động trong

khoảng 1,4-2,5 cm đối với các chủng Xoo

Đoàn Thị Kiều Tiên và cs (2013) đã tiến hành các thí nghiệm để đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên cây mè trong điều kiện in vitro, ở thời điểm 4 ngày sau khi

lây bệnh nhân tạo thì các chủng khuẩn 3, 6, 25, 79 cho bán kính vòng vô khuẩn cao, từ 6,3 - 8,3 mm Ngoài ra dịch trích của 4 chủng xạ khuẩn trên đều

có khả năng ức chế sự mọc mầm, chiều dài ống mầm và khả năng giết chết

bào tử nấm F oxysporum Trong điều kiện nhà lưới, biện pháp xử lý đất 7

ngày trước khi trồng của các chủng xạ khuẩn 25,79 và hỗn hợp chủng xạ khuẩn (3, 6, 25, 79) thể hiện hiệu quả tốt nhất về khả năng làm giảm bệnh héo

rũ do nấm F.oxysporum gây ra trên cây mè

Theo Nguyễn Thị Mai Thảo và Nguyễn Thị Thu Nga (2013), trong số 28

chủng xạ khuẩn được thực hiện thí nghiệm trong điều kiện in vitro, để đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm Rhizoctonia solani

gây bệnh chết cây con trên cải bắp, thì kết quả có 3 chủng 4 RM, 54 và 54 RM

là cho kết quả đối kháng cao nhất với chỉ tiêu bán kính vòng vô khuẩn ở thời điểm 20 giờ sau khi cấy lần lược là: 7,5 mm, 5,6 mm và 6,3 mm Ngoài ra trong điều kiện nhà lưới thì chủng xạ khuẩn 4 RM là chủng cho hiệu quả phòng trị cao nhất

Theo Đoàn Thị Kiều Tiên và cs (2013) trong 187 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng rễ mè và cây rau màu tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long thì có 13

chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium oxysporum gây

bệnh héo rũ trên cây mè, trong đó có 4 chủng xạ khuẩn 3, 6, 25, 79 có khả năng ức chế khuẩn ty của nấm cao nhất, đồng thời dịch trích của 4 chủng xạ khuẩn này cũng có khả năng ức chế sự mọc mầm, chiều dài ống mầm và khả năng giết bào tử nấm Nguyễn Thị Mai Thảo và cs (2013) trong 28 chủng xạ khuẩn được khảo sát có 6 chủng thể hiện khả năng đối kháng với nấm

Rhizoctonia solani gây bệnh chết cây con trên cải bắp, trong đó có 3 chủng 4

RM, 54 và 54 RM có khả năng đối kháng cao nhất và đều cho hiệu quả phòng trị bệnh trong điều kiện nhà lưới

Trong 253 chủng xạ khuẩn được phân lập từ những mẫu đất xung quanh vùng

rễ các cây lúa khỏe, trong đó có 27 chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng ức chế

sự phát triển khuẩn ty của nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn trên lúa

(Ngô Thị Kim Ngân, 2014)

Đinh Hồng Thái và Lê Minh Tường (2016) đã phân lập được 93 chủng xạ khuẩn từ đất trồng sen ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Qua đánh giá

sơ khởi đã chọn được 30 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao với nấm gây bệnh cháy lá – thối thân trên cây sen Khả năng đối kháng của 30 chủng

xạ khuẩn đối với nấm Phytophthora sp được thực hiện trong điều kiện phòng

thí nghiệm với 5 lần lặp lại Kết quả cho thấy, 5 chủng xạ khuẩn CM18, HG3, HG4, TG1 và BL6 luôn thể hiện khả năng đối kháng cao và bền với nấm

Phytophthora sp Trong đó, chủng CM18 thể hiện khả năng đối kháng cao

nhất với bán kính vòng vô khuẩn là 16,75 mm và hiệu suất đối kháng là 89,89% ở thời điểm 60 giờ sau khi cấy Khả năng tiết enzyme β-glucanase của

các chủng xạ khuẩn có triển vọng được thực hiện trên môi trường β-glucan với

5 lần lặp lại Kết quả cho thấy, chủng xạ khuẩn CM18 có khả năng tiết enzyme β-glucanase cao nhất với bán kính vòng phân giải là 10,81 mm ở thời điểm 14 ngày sau khi cấy Bên cạnh đó, các chủng xạ khuẩn thí nghiệm đều có khả năng tiết siderophore dạng hydroxamates

Nghiên cứu của Nguyễn Hồng Quí và Lê Minh Tường (2016) về hiệu quả

phòng trị bệnh thán thư trên xoài do nấm Colletotrichum sp của 3 chủng xạ

khuẩn HG10, HG17 và HG21 được thực hiện trong điều kiện nhà lưới với 5 lần lặp lại Kết quả cho thấy, cả 3 chủng xạ khuẩn thí nghiệm đều có khả năng phòng trị bệnh thán thư trên xoài, trong đó chủng HG10 và HG21 ở thời điểm phun trước và thời điểm kết hợp phun 2 ngày trước và 2 ngày sau khi lây bệnh (NSLB) nhân tạo cho khả năng phòng trị bệnh cao tương đương nghiệm thức thuốc hóa học Carbenzim thông qua phần trăm diện tích lá bị bệnh thấp lần lượt là 5,5 mm; 6,25 mm; 6,00 mm và 6,75 mm và hiệu quả giảm bệnh cao lần lượt là 77,32%; 74,22%; 75,25% và 74,16% ở thời điểm 14 NSLB nhân tạo Khả năng phân giải chitin của các chủng xạ khuẩn được thực hiện trên môi trường chitin agar Kết quả cho thấy chủng HG10 có khả năng phân giải cao

với bán kính vòng phân giải là 26,9 mm ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy

2.4.4.2 Nước ngoài

Theo El-abyad et al (1993), khảo sát tiềm năng kiểm soát một số bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra trên cà chua bởi 3 chủng xạ khuẩn Streptomyces pulcher,

Streptomyces canescens và Streptomyces citreofluorescens Với nồng độ dịch

trích 80% của S pulcher hoặc S canescens có thể ức chế bào tử nảy mầm, sự phát triển của sợi nấm và sự hình thành bào tử của Fusarium oxysporum f.sp

lycopersici, Verticillium albo- atrurn và Alternaria solani Tương tự với cùng

nồng độ dịch trích của S pulcher hoặc S citreofluorescens gây ảnh hưởng bất lợi đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp michiganensis và

Pseudomonas solanacearum Một thí nghiệm khác cũng được ghi nhận rằng

khi áo hạt giống cà chua với huyền phù xạ khuẩn cho hiệu quả kiểm soát bệnh

ở 42 và 63 ngày sau khi gieo tốt hơn so với xử lý tưới trong đất 7 ngày trước khi gieo và ngâm hạt giống với dịch trích xạ khuẩn Bên cạnh đó, biện pháp áo hạt còn giúp cho sự phát triển của cà chua tốt hơn

Bằng các phương pháp xử lý khác nhau và ba loại môi trường khác nhau, Baskaran (2001) đã phân lập các chủng xạ khuẩn có các hoạt tính phòng trừ sinh học từ trầm tích thuộc rùng ngập mặn của quần đảo Andaman và Nicobar,

Ấn Độ Trong số 42 mẫu phân lập được thử nghiệm thì có 22 mẫu đã cho kết

quả đối kháng tương đối tốt đối với các dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis, Salmonella typhi và Klebsiella pneumoniae Đặc biệt, các

chủng xạ khuẩn như A101, A102, A107, A116, A121, A125, A130, F101, F102, F104, F106, De101 và De102 cho thấy sự ức chế đáng kể đến sự phát triển của tất các vi khuẩn trên Trong đó, chủng A107 đã được xác định là

Streptomyces spp Chủng này cho kết quả đối kháng mạnh nhất đối với tất cả

các dòng vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm

Khi xử lý hạt giống bằng dịch trích Streptomyces padanus PMS - 702 có hiệu quả giảm tỷ lệ mắc bệnh héo rủ trên cây cải bắp do nấm Rhizoctonia solani AG-4 (Shih et al., 2003)

Trong 50 chủng xạ khuẩn khác nhau phân lập từ các mẫu đất chuyên sản xuất nông nghiệp ở tỉnh Manisa và các vùng lân cận, đã cho kết quả rất tốt về khả năng chống lại 4 loại bệnh dịch trong kiểm dịch thực vật và 6 vi khuẩn gây bệnh Kết quả cho thấy 34% các mẫu phân lập có đối kháng tốt với

Agrobacterium tumefaciens, Erwinia amylovora, Pseudomonas viridiflova, Clavibacter michiganensis subsp Michiganensis, Bacillus subtilis ATTC

6633, Klebsiella pneumoniae ATTC 10031, Enterococcus feacalis ATCC

10541, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Esherichia coli ATCC 29998 và

Sarcina lutea ATCC 9341 Bảy trong số các chủng phân lập cho hiệu quả đối

kháng phổ rộng Các mẫu phân lập trên thể hiện tiềm năng là những loại thuốc kháng sinh mới (Oskay, 2004)

Theo nghiên cứu gần đây của Prapagdee et al (2008) phân lập và xác định chủng SRA14 là Streptomyces hygroscopicus có khả năng kháng lại

Colletotrichum gloeosporioides và Sclerotium rolfsii gây bệnh thán thư và

bệnh cháy lá, thối gốc trong nhiều loại cây trồng nông nghiệp Chủng SRA14 thể hiện khả năng ức chế nấm bằng cách tiết ra các enzyme ngoại bào như chitinase và β -1.3- glucanase, còn có khả năng làm biến dạng các sợi nấm

Ceylan et al (2008) đã thu thấp các mẫu đất từ nhiều địa điểm trong tỉnh

Mugla, Thổ Nhĩ Kỳ từ năm 2006 đến 2007 Một số thí nghiệm đã được tiến

hành để đánh giá khả năng kháng khuẩn của Streptomyces trong phòng thí

nghiệm, loài xạ khuẩn này thường được biết đến với khả năng tiết ra các chất

kháng sinh Các chủng Streptomyces phân lập sẽ được đánh giá khả năng đối

kháng đối với 7 VSV, bao gồm cả những VSV kháng được chất kháng sinh là

Staphylococcus aureus và Stenotrophomonas maltophilia, 15 chủng Streptomycetes cho thấy khả năng đối kháng tốt với ít nhất 2 trong số những

VSV thử nghiệm Kết quả cho thấy 5 chủng phân lập có khả năng đối kháng

rất mạnh với S.Aureus, 12 chủng Streptomyces phân lập có khả năng chống lại

Candida albicans Hầu hết các chủng điều thể hiện khả năng ức chế sự phát

triển của vi khuẩn gram âm Tám chủng phân lập có khả năng kháng đối với

S.Mantophilia MU64

Theo Malik et al (2008), chủng xạ khuẩn Streptomyces fulvissimus có khả năng đối kháng với chủng Staphycoccus aureus Do chủng xạ khuẩn trên có

khả năng tiết ra một số protein có khả năng kháng khuẩn như các loài vi

khuẩn: Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, B.cereus và kháng sinh

Methicillin

Usha (2010) đã phân lập các chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất thu thập tại vùng

rễ của các loài thực vật ở rừng ngập mặn Pichavaram tại Tamilnadu, Ấn Độ Kết quả cho thấy chủng KUAP 106 có khả năng kháng khuẩn rất rộng Sau khi tiến hành định danh đã xác định đó là một chủng xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces Tác giả đã phân lập được các hợp chất cho thấy khả năng chống

lại các vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm đơn bào dạng sợi trong điều

kiện in vitro Các dữ liệu thu thập được nhấn mạnh rằng các hợp chất hoạt tính tinh chế từ chủng xạ khuẩn Streptomyces parvulus KUAP106 có khả năng

kháng một loạt các sinh vật gây bệnh trên thực vật và có tính chống tạo mạch

Chủng Streptomyces cavourensis SY224 được phân lập đã cho thấy khả năng đối kháng với nấm Collectotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên ớt

SY244 đã tiết ra các enzym lytic như chitinase, β-1,3-glucanase, lipase và

protease trong các thí nghiệm tương ứng Chủng Streptomyces còn có khả

năng tiết ra hợp chất kháng nấm, làm ức chế sự nảy mầm của bào tử và biến đổi hình thái sợi nấm Những kết quả trên còn mở ra triển vọng cho thấy rằng SY244 có tiềm năng cao trong phòng trừ sinh học bệnh thán thư trên tiêu (Lee

et al., 2012)

Hastuti et al (2012) ba chủng Streptomyces spp (PS4-16, LBR-02 và

LSW-05) có khả năng làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh cháy bìa lá lúa do

nấm Xanthomonas oryzae pv Oryzae ở Indonesia, đồng thời Streptomyces

spp PS4-16 còn có khả năng làm kích thích tăng tưởng và tăng năng suất

2.5 ĐẶC TÍNH CỦA THUỐC HÓA HỌC MATAXYL 500WP ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM ĐỐI CHỨNG PHUN THUỐC HÓA HỌC

Tên hoạt chất: Metalaxyl

Công ty sản xuất: Công ty TNHH Map Pacific Việt Nam

Tên hóa học:methyl N-(methoxyacetyl)-N-(2,6-xylyl)-DL-alaninate

Công thức: (C15H21NO4)x

Đặc tính: thuộc nhóm độc III, LD50 qua miệng: 669mg/kg, LD50 qua da: 3100/kg, ADI: 0,03mg/kg (Trần Văn Hai, 2005)

Thuốc trừ nấm nội hấp có tác dụng phòng và trừ bệnh Dùng để trừ nhiều loại

nấm bệnh thuộc bộ sương mai Peronosporales trên các cây trồng nhiệt đới và

á nhiệt đới Hỗn hợp với thuốc trừ nấm bảo vệ phun lên cây để trừ bệnh sương

mai trên cây hoa cúc do Pseudopernospora humuli; mốc sương cà chua, khoai tây do Phytophthora insfestans; sương mai thuốc lá do Peronospors tabaci và

Plasmopara vitticola hại nho (Phạm Văn Kim, 2000)

Theo nghiên cứu của Trần Thanh Trang (2015), nấm P colocasiae tương đối

mẫn cảm với hoạt chất Metalaxyl (hoạt chất của thuốc Mataxyl 500WP) Ngoài ra hoạt chất Metalaxyl cũng có khả năng ức chế cao đối với nấm

P.infestans trên khoai tây (Emil Rekanovic, 2012)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Vật liệu thí nghiệm: Chậu nhựa, đĩa Petri, kéo, kẹp, đũa cấy, giấy thấm, micropipette, ống Eppendorf, ống Falcon 50 ml, tủ thanh trùng khô, tủ thanh trùng ướt, tủ cấy vi sinh, đèn cồn, kính hiển vi, lame, lammelle, kính nhìn nổi, cân điện tử, bếp điện từ, máy đo pH, đĩa petri và một sô dụng cụ khác

Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy, phân lập, bố trí thí nghiệm gồm: môi trường PDA, môi trường thạch agar (WA), môi trường MS, môi trường ISP4:

* Môi trường nước trích khoai tây (PDA) (Shurfleff & Averre III, 1997)

* Môi trường Manitol Soya Flourmedium (MS) (Hobbs & cs., 1989) Bột đậu nành 20 g

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh cháy lá trên cây khoai môn

 Cách thu mẫu bệnh

Khảo sát và thu mẫu bệnh ngoài đồng tại các ruộng khoai môn ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Ruộng khoai môn thu mẫu phải có diện tích từ

1000 m2 trở lên

Mẫu bệnh được thu vào khoảng 9 – 10 giờ sáng khi trời bắt đầu có nắng, vết

bệnh có triệu trứng điển hình của bệnh cháy lá do nấm Phytophthora sp gây

ra Vết bệnh phải còn mới và phân biệt được mô bệnh và mô khỏe, sau đó mẫu bệnh được cho vào túi giấy báo mang về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập

và giám định bệnh Mẫu bệnh sau khi thu được đặt trong các túi nylon riêng biệt ứng với mỗi ruộng trồng khoai môn

 Cách phân lập

Mẫu bệnh được thu về và phân lập ngay trong ngày Bước đầu quan sát bằng mắt thường sau đó cạo và quan sát sợi nấm dưới kinh hiển vi trước khi tiến hành phân lập Sau đó thực hiện các bước tiếp theo:

Bước 1: Sát trùng bề mặt vết bệnh bằng cồn 700

Bước 2: Chọn vết bệnh điển hình và cắt nơi tiếp giáp giữa mô bệnh và

mô khỏe thành từng khoanh nhỏ Sau đó, đặt vào vải lượt và ngâm chúng trong cồn 700 trong 30 giây

Bước 3: Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần, sau đó đặt ra giấy thấm cho khô mẫu, dùng kẹp chuyên dụng đã thanh trùng đặt mẫu vào môi trường

WA trong 24 giờ

Bước 4: Tiến hành cắt nhỏ mẫu bệnh, đặt phần mô bệnh lên môi trường thạch agar Theo dõi từ 24 - 48 giờ tiến hành tách ròng và nuôi nấm trên môi trường PDA Sau khi nấm đã thuần chủng tiến hành chuyển vào ống nguồn chứa PDA để mặt phẳng nghiêng, nuôi và để vào ngăn mát tủ lạnh bảo quản

và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

3.2.2 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây hại của các chủng nấm

Phytophthora sp gây bệnh cháy lá khoai môn

 Mục tiêu: Tìm ra chủng nấm Phytophthora sp có khả năng gây hại nặng

nhất trong các chủng nấm phân lập được trên cây khoai môn làm nguồn cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 5 lần lặp lại, mỗi chủng nấm là 1 nghiệm thức, mỗi lần lặp lại là 1 chậu trồng 5 bụi khoai môn

 Chuẩn bị cây khoai môn

Giống khoai môn là giống khoai lùn, sạch bệnh, củ giống đường kính 3- 4 cm

có khối lượng 20- 30 gram không thối hoặc khô ở đít, lớp vỏ ngoài có nhiều lông Ngâm củ giống trong thau nước ngập xâm xấp, có xử lý thuốc trừ nấm Rovral trong vòng 12 giờ, sau đó rữa cho sạch, trải bao bố nơi mát tránh bị mưa rồi trùm bao lên củ giống thời gian 1- 3 ngày

Chuẩn bị liếp ươm, rải tro trấu, rải củ đều lên mặt liếp sau đó phủ lớp tro trấu trên mặt (tro trấu và đất đã được thanh trùng từ trước) Sau 15- 20 ngày lấy ra trồng vào chậu Mỗi chậu trồng 5 bụi

 Chuẩn bị nguồn nấm bệnh:

Các chủng nấm Phytophthora sp được nuôi cấy trên môi trường PCA để tạo

bọc bào tử Thu bọc bào tử và chuẩn bị huyền phù bọc bào tử với mật số 5 x

104 bọc bào tử/ml Cách nuôi bọc bào tử:

- Cấy nấm từ nguồn lên môi trường PDA

- Sau 3 ngày cấy chuyền nấm sang môi trường PCA