Thu thập và định danh ba loài nấm ký sinh côn trùng metarhizium anisopliae beauveria bassiana và paecilomyces sp ở bốn tỉnh đồng bằng sông cửu long

Phân loại các chủng nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae Metschnikoff Sorokin, Beauveria bassiana Balsamo Vuillemin và Paecilomyces sp.. 6 Nồng độ các nghiệm thức trong thí nghi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

-oOo-

Lê Hữu Phước

THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH BA LOÀI NẤM KÝ

SINH CÔN TRÙNG Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana VÀ Paecilomyces sp Ở

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

-oOo-

LÊ HỮU PHƯỚC

THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH BA LOÀI NẤM KÝ

SINH CÔN TRÙNG Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana VÀ Paecilomyces sp Ở

Cần Thơ, 10 - 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận án

Lê Hữu Phước

Luận án đính kèm theo đây, với tựa đề: “THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH BA LOÀI

NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana VÀ

Paecilomyces sp Ở BỐN TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG

PHƯƠNG PHÁP PCR - THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC CỦA BA CHẾ PHẨM LÊN MỘT SỐ ĐỐI TƯỢNG TRÊN RAU” do Lê Hữu Phước thực hiện và báo cáo và đã

được Hội đồng chấm luận án thông qua

Cần Thơ, ngày 06 tháng 11 năm 2009

Chủ tịch Hội đồng

PGS.TS NGUYỄN VĂN HUỲNH

LÝ LỊCH KHOA HỌC

I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC:

Họ và tên: Lê Hữu Phước Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 19/08/1980 Nơi sinh: An Giang

Quê quán: Chợ Mới – An Giang Dân tộc: Kinh

Chức vụ, đơn vị công tác trước khi đi học tập, nghiên cứu: Giảng viên Bộ môn Khoa học Cây trồng – Khoa Nông Nghiệp & Tài Nguyên Thiên Nhiên – Đại học An Giang

Chổ ở riêng hoặc địa chỉ liên lạc: Khoa Nông Nghiệp & Tài Nguyên Thiên Nhiên – Đại học An Giang

Điện thoại cơ quan: 0766.512684 Điện thoại nhà riêng: 0763.832200 Fax: +84-76-842560 E-mail: lhphuoc@agu.edu.vn

II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO

1 Đại học:

Hệ đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo từ 09/1998 đến 03/2003 Nơi học (trường, thành phố): Đại học Cần Thơ, Tp Cần Thơ

Tên luận văn tốt nghiệp: “Đặc điểm sinh học, sinh thái của bọ xít đỏ hai chấm

(Dysdercus cingulatus (Fabricius) - Pyrhocoridae - Hemiptera) - Thử nghiệm sự ưa

thích của chúng lên một số giống bông vải trong điều kiện nhà lưới”

Ngày và nơi bảo vệ luận án tốt nghiệp: Ngày 15/03/2003 tại Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn: TS Trần Văn Hai

2 Trình độ ngoại ngữ: Tiếng Anh, trình độ C (cấp tại trung tâm ngoại ngữ - Đại học

IV CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ: Chưa có

XÁC NHẬN CỦA CƠ QUAN CỬ ĐI HỌC Ngày 06 tháng 11 năm 2009

(Ký tên, đóng dấu) Người khai ký tên

Lê Hữu Phước

LỜI CẢM TẠ

Thành kính biết ơn,

PGs Ts Trần Văn Hai, Phó Trưởng Bộ môn Bảo vệ thực vật - Khoa Trường Đại học Cần Thơ, đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp

NN&SHƯD-Quý Thầy/Cô Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, Quý Thầy/Cô Trường Đại học Nông Lâm, các nhà khoa học ở Viện Lúa ĐBSCL và Viện Cây Ăn Quả Miền Nam đã tận tình truyền đạt kiến thức khoa học trong suốt khóa học

Hội đồng bảo vệ Luận văn và Phản biện đã đọc và đóng góp ý kiến quý báu để Luận văn của tôi được hoàn chỉnh hơn

Xin chân thành biết ơn,

Cô Phạm Thị Diệu Hương, em Trịnh Thị Xuân, - cán bộ phòng thí nghiệm dự án NEDO đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình tốt nghiệp này

Các em sinh viên ngành Bảo vệ thực vật, Nông Học, Trồng Trọt Khóa 30 và 31 đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án Đặc biệt, em Trần Quốc Thắng, sinh viên Nông Học Khóa 30 đã giúp đở tôi hoàn thành thí nghiệm ngoài đồng ruộng Gia đình anh chị Nguyễn Văn Đỉnh, ở Phường Long Tuyền, Quận Bình Thủy, Thành phố Cần Thơ đã nhiệt tình cộng tác và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các thí nghiệm ngoài đồng phục vụ cho đề tài

Thân ái gửi về,

Các anh chị và các bạn lớp Cao học Bảo vệ thực vật Khóa 13

Lê Hữu Phước

LÊ HỮU PHƯỚC 2009 Thu thập và định danh ba loài nấm ký sinh côn trùng

Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Paecilomyces sp ở 4 tỉnh Đồng

bằng sông Cửu Long bằng phương pháp PCR - Thử nghiệm hiệu lực của 3 chế phẩm lên một số đối tượng trên rau Hướng dẫn khoa học PGS.TS TRẦN VĂN HAI, Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC

Luận án được thực hiện từ tháng 02 năm 2008 đến tháng 03 năm 2009 tại phòng thí nghiệm, nhà lưới Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Công Nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ và ruộng bắp cải ở Phường Long Tuyền, Quận Bình Thủy, Thành phố Cần Thơ

nhằm: 1/ Thu thập và định danh ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsh.) Sorok., Beauveria bassiana (Bals.) Vuill and Paecilomyces sp Bainier ở 4

tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp PCR 2/ Thử nghiệm hiệu lực của

3 chế phẩm từ nấm này lên một số đối tượng gây hại quan trọng trên rau

Kết quả đã phân lập được 6 chủng nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopilae Sorok (nấm xanh), Beauveria bassiana Vuill (nấm trắng) và Paecilomyces sp

Bainier (nấm tím) trên một số loài sâu bị nhiễm bệnh từ 4 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng và Vĩnh Long tại Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ Trong đó, có

5 chủng nấm được kiểm chứng bằng phương pháp PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu Mac

spF-Mac spR (đối với Metarhizium anisopliae) và Bebas spF-Bebas spR (đối với

Beauveria bassiana) Sản phẩm PCR của 3 chủng nấm xanh Ma-AG, Ma-VL, Ma-CT

là những băng màu có kích thước bằng 420 kb và của 2 chủng nấm trắng CT,

Bb-ST là 540 kb Điều này chứng tỏ chúng đều cùng loài Metarhizium anisopliae Sorok

và Beauveria bassiana Vuill

Kết quả khảo nghiệm hiệu lực của 6 chủng nấm trên đối với sâu ăn tạp (Spodoptera

litura) tuổi 2 trong phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ bằng

cách nhỏ 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm có mật số 107 bào tử/ml lên cơ thể sâu

đã cho độ hữu hiệu với các chủng nấm Ma-AG, Ma-VL, Ma-CT, Bb-CT, Bb-CT và Pae-CT lần lượt là 64,71%; 56,47%; 29,41%; 45,88%; 41,18% và 34,12%, vào thời điểm 15 ngày sau khi chủng nấm

Khi phun các chế phẩm sinh học từ 3 chủng nấm Ma-AG, Bb-CT và Pae-CT lên ấu

trùng sâu ăn tạp (Spodoptera litura) tuổi 2 trên cải tùa xại (Brassica rapa var

amplexicaulis) trong nhà lưới theo phương pháp bố trí khối ngẫu nhiên hoàn toàn với

liều lượng 15g/l (nồng độ 1-2x108) đã cho độ hữu hiệu với các chủng nấm Ma-AG,

Bb-CT và Pae-CT lần lượt là 65,21%, 58,48% và 45,09 % sau 12 ngày sau khi phun nấm

Trong điều kiện sản xuất ngoài đồng, dưới áp lực sâu bệnh cao, thời tiết khô nóng, các chế phẩm đã có được một số kết quả nhất định trên cây cải bắp Nghiệm thức phun

chế phẩm Ma-AG có hiệu quả tốt (64,3-68,9%) khi phun trên sâu ăn tạp (Phyllotreta

striolata) và sâu tơ (Plutella xylostella) ở ngoài đồng Không có chủng nấm nào có

hiệu quả cao trên bọ nhảy khi phun trên đồng ruộng Nghiệm thức phun Bb-CT cũng

có hiệu quả khá tốt (56,4% trên sâu ăn tạp và 59,7% trên sâu tơ), tuy nhấp hơn

Ma-AG Nghiệm thức Pae-CT có hiệu quả trên sâu ăn tạp và sâu tơ cao nhất đạt 52,6% trên sâu ăn tạp vào 9 NSKP Nghiệm thức phun thuốc trừ sâu hóa học Proclaim 1.9EC

và nghiệm thức phun kết hợp Ma-AG + ½ Proclaim 1.9EC đạt hiệu quả và năng suất thương phẩm cao hơn các chế phẩm nấm trong thí nghiệm này

LÊ HỮU PHƯỚC 2009 Collecting and identifying three entomopathogenic fungi of

Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Paecilomyces sp in 4 provinces of

Mekong Delta by PCR method – Testing the effectiveness of the three biological products on some main pests in vegetable Instructor TRAN VAN HAI, Doctor, Associate Professor, College of Agriculture and Applied Biology, Can Tho University

ABSTRACT

The thesis was carried out from February 2008 to March 2009 at the laboratory and net house of Plant Protection Department, and Biotechnology Institute, Can Tho university, and cabbage field in Long Tuyen Ward, Binh Thuy District, Can Tho city

to aim: 1/ Collecting and identifying three entomopathogenic fungi of Metarhizium

anisopliae (Metsh.) Sorok., Beauveria bassiana (Bals.) Vuill and Paecilomyces sp

Bainier in 4 provinces of Mekong Delta by PCR method 2/ Testing the effectiveness

of the three biological products from these 6 isolates on some main pests in vegetable

Six isolates of entomopathogenic fungi of Metarhizium anisopilae Sorok., Beauveria

bassiana Vuill and Paecilomyces sp Bainier were collected from diseased insects in

An Giang, Can Tho, Soc Trang and Vinh Long provinces which were isolated in the laboratory of Plant Protection Department, Cantho university The five isolates of them were detected by PCR methods with two specific primers Mac spF-Mac spR (for

Metarhizium anisopliae) and Bebas spF-Bebas spR (for Beauveria bassiana) at

Biotechnology Institute, Can Tho University The PCR amplifications were the unique fragments of approximately 420 kb for three isolates of Ma-AG, Ma-VL, Ma-ST and

540 kb for Bb-CT, Bb-ST isolates These demonstrated that they belonged to

Metarhizium anisopliae Sorok and Beauveria bassiana Vuill

The evaluation results of the effectiveness of the six entomopathogenic fungi on the

Armyworm (Spodoptera litura) in the laboratory of Plant Protection Department,

Cantho university by coated dropping with 20µl (approximately 107 conidia/ml) of the entomopathogenic fungi suspension on the second instars larva Armyworm showed that the effectiveness of these isolates of Ma-AG, Ma-VL, Ma-CT, Bb-CT, Bb-CT and Pae-CT were orderly 64,71%; 56,47%; 29,41%; 45,88%; 41,18% and 34,12%, respectively after 15 DAD

The corrected effectiveness of these entomopathogenic fungi of Ma-AG, Bb-CT,

Pae-CT were tested on the second instars larva Armyworm on Chinese cabbage (Brassica

rapa var amplexicaulis) in the net house by Randomized Complete Block Design at

15g/l (approximately 1-2x108 conidia/ml) The results indicated that the effectiveness

of these isolates of Ma-AG, Bb-CT and Pae-CT were 65,21%; 58,48 % and 45,09 %, respectively after 12 DAS

On the cabbage (Brassica oleracea) field, under the high pressure of insects, dry and

hot, the three biology products showed some good results in cabbage Treatment of Ma-AG showed high effectiveness (64,3-68,9%) when spraying on Armyworm

(Spodoptera litura) and Diamondback Moth (Plutella xylostella) in cabbage field

None of the biological products represented to control Yellow Stripped Ground

Flea (Phyllotreta striolata) in field Bb-CT product got 56,4% on Spodoptera litura and 59,7% on Plutella xylostella (lower than Ma-AG) The highest effectiveness on

Spodoptera litura and Plutella xylostella of Pae-CT was 52,6% after 9 DAS The

highest effectiveness and commercial yield showed in Proclaim 1.9EC and combination of Ma-AG + ½ Proclaim 1.9EC treatments

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan ii

Chấp nhận luận án của Hội Đồng iii

Lý lịch khoa học iv

Lời cảm tạ v

Tóm lược vi

Abstract viii

Mục lục x

Danh sách chữ viết tắt xiv

Dánh sách bảng xv

Danh sách hình xvii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .3

1.1 Nấm Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 4

1.1.3 Độc tố diệt côn trùng 6

1.1.4 Cơ chế gây bệnh côn trùng 8

1.1.5 Thành tựu và ứng dụng 8

1.2 Nấm Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 10

1.2.1 Nguồn gốc phân loại và phân bố 10

1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 10

1.2.3 Độc tố diệt côn trùng 11

1.2.4 Cơ chế gây bệnh côn trùng 12

1.2.5 Những thành tựu và ứng dụng 12

1.3 Nấm Paecilomyces sp Bainier 14

1.3.1 Nguồn gốc, phân loại và phân bố 14

1.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 14

1.3.3 Độc tố diệt côn trùng 16

1.3.4 Những nghiên cứu và ứng dụng 16

1.4 Tính an toàn của các chế phẩm sinh học làm từ nấm 16

1.5 Một số đặc điểm của sâu ăn tạp 17

1.5.1 Sự phân bố và kí chủ 17

1.5.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 17

1.5.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại 18

1.5.4 Biện pháp phòng trị 18

1.6 Một số đặc điểm của Bọ nhảy 18

1.6.1 Phân bố và ký chủ 19

1.6.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 19

1.6.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại 19

1.6.4 Biện pháp phòng trị 19

1.7 Một số đặc điểm của Sâu tơ 19

1.7.1 Phân bố và ký chủ 19

1.7.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 20

1.7.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại 20

1.7.4 Biện pháp phòng trị 21

1.8 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 21

1.9 Một số đặc tính của hai loại thuốc trừ sâu dùng trong thí nghiệm .26

1.9.1 Vertimec 1,8 ND 26

1.9.2 Proclaim 1.9 EC 26

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện 28

2.1.1 Dụng cụ, thiết bị 28

2.1.2 Nguồn nấm và ấu trùng sâu ăn tạp 29

2.1.3 Hóa chất 29

2.2 Phương pháp 29

2.2.1 Thu thập, phân lập và định danh mẫu côn trùng bị nhiễm nấm .29

2.2.2 Xác định các chủng nấm bằng phương pháp PCR 30

2.2.3 Thí nghiệm hiệu lực của các chủng nấm phân lập từ 4 tỉnh ở ĐBSCL với sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm 36

2.2.4 Hiệu lực của các chủng nấm phân lập được đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong điều kiện nhà lưới 38

2.2.5 Khảo sát hiệu lực của các chế phẩm nấm ký sinh lên một số đối tượng sâu hại chính trên cải bắp trong điều kiện ngoài đồng .39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopilae (Metschnikoff) Sorokin, Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin và Paecilomyces sp Bainier ở 4 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng và Vĩnh Long 43

3.2 Phân loại các chủng nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin, Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin và Paecilomyces sp Bainier (Pae) bằng phương pháp PCR 48

3.2.1 Kết quả ly trích DNA của các chủng nấm 48

3.2.2 Kiểm tra các chủng nấm bằng kỹ thuật PCR .49

3.3 Thí nghiệm hiệu lực của các chủng nấm phân lập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm 51

3.4 Hiệu lực của chế phẩm sinh học đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong điều kiện nhà lưới 54

3.5 Khảo sát hiệu lực của các chế phẩm nấm ký sinh trong điều kiện ngoài đồng, vụ Đông Xuân tại Phường Long Tuyền – Quận Bình Thủy – Thành Phố Cần Thơ, từ 12/2008 đến 2/2009 57

3.5.1 Sâu ăn tạp 55

3.5.2 Bọ nhảy 62

3.5.3 Sâu tơ 67

3.5.4 Năng suất 72

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75

4.1 Kết luận 75

4.2 Đề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO .76 PHỤ CHƯƠNG I

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

M anisopliae Metarhizium anisopliae

B bassiana Beauveria bassiana

6 Nồng độ các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát hiệu lực của các chủng

nấm lên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm

37

7 Nồng độ các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát hiệu lực của các chủng

nấm lên sâu ăn tạp trong điều kiện nhà lưới, Bộ môn Bảo vệ thực vật,

Đại học Cần Thơ

38

8 Nồng độ các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát hiệu lực của 3 chế

phẩm nấm trên cải bắp trong điều kiện đồng ruộng tại Phường Long

Tuyền, Thành phố Cần Thơ, vụ Đông Xuân, tháng 12/2008 – 02/2009

40

9 Danh sách các chủng nấm phân lập và định danh được trong môi trường

SDAY3 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần

Thơ, tháng 02-04/2008

43

10 Một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm phân lập tại phòng thí

nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật

44

11 Xác định nồng độ DNA các chủng nấm bằng máy đo OD 48

12 Độ hữu hiệu (%) của các chủng nấm đối với sâu ăn tạp trong điều kiện

phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng

06/2008

54

13 Tỷ lệ (%) sâu ăn tạp bị chết khi phun các chế phẩm nấm ký sinh và thuốc

trừ sâu trên cải tùa xại trong điều kiện nhà lưới, bộ môn Bảo vệ thực

vật, Đại học Cần Thơ, tháng 08-9/2009

55

14 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với sâu ăn tạp ở các ngày sau khi phun

thuốc lần 1 trên cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần

Thơ, từ 12/2007 đến 2/2008

59

Bảng Tựa bảng Trang

15 Độ hữu hiệu (%) của các chế phẩm đối với sâu ăn tạp sau khi phun thuốc

lần 2 trên cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ

12/2007 đến 2/2008

60

16 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với sâu ăn tạp sau khi phun thuốc lần 3

trên cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ

12/2007 đến 2/2008

61

17 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với bọ nhảy sau khi phun thuốc lần 1

trên cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ

12/2007 đến 2/2008

64

18 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với bọ nhảy sau khi phun thuốc lần 2

trên cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ

12/2007 đến 2/2008

65

19 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với bọ nhảy sau khi phun thuốc lần 3

trên cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ

12/2007 đến 2/2008

66

20 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với sâu tơ sau khi phun thuốc lần 1 trên

cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ 12/2007

đến 2/2008

69

21 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với sâu tơ sau khi phun thuốc lần 2 trên

cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ 12/2007

đến 2/2008

70

22 Độ hữu hiệu của các chế phẩm đối với sâu tơ sau khi phun thuốc lần 3 trên

cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy – TP Cần Thơ, từ 12/2007

DANH SÁCH HÌNH

2 Một dạng cuống sinh bào tử nấm Metarhizium anisopliae 5

3 Cơ chế gây bệnh lên côn trùng của nấm ký sinh 7

11 Chu trình nhiệt của nấm Metarhizium anisopliae 33

12 Chu trình nhiệt của nấm Beauveria bassiana 33

13 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong nhà lưới, Bộ môn bảo vệ thực vật, Đại học

15 Dạng bào tử và cành bào đài của 3 chủng nấm Ma-AG, Ma-VL và Ma-CT,

chụp qua KHV huỳnh quang (x 100)

19 Xác định 3 chủng nấm Metarhizium anisopliae bằng PCR với cặp mồi

chuyên biệt Mac spF và Mac spR Sản phẩm PCR có kích thước 420 bp

49

20 Xác định 2 chủng nấm Beauveria bassiana bằng PCR với cặp mồi chuyên

biệt Bebas spF và Bebas spR Sản phẩm PCR có kích thước 540 bp

50

Hình Tựa hình Trang

21 21a/ Làm tiêu bản trên lame và quan sát bào tử, cành bào đài dưới KHV

chụp ảnh tại PTN Dự án NEDO, Bộ môn Bảo vệ thực vật

21b/ Ghi nhận chỉ tiêu sâu chết trong phòng thí nghiệm, mỗi cá thể được

nuôi riêng, ghi nhận nhiệt độ ẩm độ trong mỗi lần lấy chỉ tiêu

53

22 Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm Ma-AG (a), và nấm Bb-CT (b) không lớn lên

được sau 12 NSKC nấm

53

23 a/ Đặt chậu cải trong lồng lưới riêng để đảm bảo mật số sâu

b/ Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên

56

25 Diễn biến mật số sâu ăn tạp trên cải bắp tại P Long Tuyền – Q Bình Thủy

32 Bọ nhảy bị nhiễm nấm xanh Metarhizium anisopliae 74

33 Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm xanh Metarhizium anisopliae 74

34 Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm tím Paecilomyces sp 74

35 Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm trắng Beauveria bassiana 74

MỞ ĐẦU

Phòng trừ sâu hại là một trong những khó khăn lớn nhất trong nghề trồng rau và là mối quan tâm lo lắng hàng đầu của nông dân Biện pháp phòng trừ của nông dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp khác Nông dân đã sử dụng tới hơn 30 loại thuốc trừ sâu trên rau, trong đó có nhiều loại đã

bị cấm hoặc hạn chế sử dụng (Nguyễn Quí Hùng và ctv., 1999) Sâu ăn tạp (Spodoptera litura), sâu tơ (Plutela xylostella) và bọ nhảy (Phyllostreta striolata) là

những đối tượng gây hại quan trọng và thường xuyên nhất trên cây rau tại Đồng bằng sông Cửu Long (Trần Thị Ba, 1999)

Sự phát triển tính kháng thuốc của sâu hại cũng như cũng như ảnh hưởng của thuốc hóa học lên sức khỏe con người và môi trường đã tạo áp lực mạnh cho sự phát triển của các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại Các vi sinh vật được được sử dụng phổ biến để phòng trừ sâu hại bao gồm virus, vi khuẩn truyến trùng và nấm Trong đó, nấm ký sinh côn trùng được quan tâm phát triển và ứng dụng thuộc lớp Hyphomycetes, ngành phụ lớp nấm bất toàn Deteromycotina Loài nấm ký sinh phổ biến nhất của lớp Hyphomycetes thường tìm thấy ở côn trùng gây hại nông

nghiệp là Metarhizium, Beauveria, Paecilomyces, Hirsutella, Nomuraea; trong đó, các loài nấm bệnh côn trùng phổ biến như Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana,

Paecilomyces sp đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brazil,

Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ tổng hợp các loài sâu gây hại một cách hợp lý đã mang lại hiệu quả khá cao (Burges, 1998; Butt và Copping, 2000) Ở Châu Á, tại Malaysia, đã

nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,57% sau 14 ngày Philippines đã nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt

rầy nâu hại lúa, hiệu lực đạt 60% sau 10 ngày Tại Úc, năm 1991 Milner đã nghiên

cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% Tại Nhật Bản, năm 1988, một số nhà khoa học đã sử dụng nấm Beauveria bassiana để

phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70% sau 10 ngày Tại Trung Quốc, Am và

Wu đã sử dụng chủng nấm Paecilomyces sp và Beauveria bassiana để phòng trừ sâu

róm thông qua đông đạt hiệu quả cao

Ở trong nước, đã có một số nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật phân lập được các chủng nấm ký sinh trên rầy nâu hại lúa, châu chấu hại bắp, sâu đo xanh hại đay, bọ hại dừa, sùng đất hại đậu phộng và sử dụng đạt được hiệu quả rất cao Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng sử dụng các chủng nấm trên rầy nâu đạt hiệu quả rất tốt, hơn 67% sau 10 ngày

Tuy nhiên, việc sử dụng các chủng nấm này trong quá trình quản lý và phòng trừ tổng hợp còn hạn chế do các chủng nấm giảm dần độc tính qua một thời gian sử dụng Việc thu thập, phân lập, định danh và thử nghiệm các chủng nấm có khả năng diệt sâu hại cao là yêu cầu thường xuyên và cấp thiết, làm cơ sở để ứng dụng vào thực tế sản xuất nông nghiệp, tạo ra sản phẩm rau an toàn cho người dân và duy trì một nền nông

nghiệp bền vững Đề tài: “Thu thập và định danh ba loài nấm ký sinh côn trùng

Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin, Beauveria bassiana (Balsamo)

Vuillemin và Paecilomyces sp Bainier ở bốn tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

bằng phương pháp PCR – Thử nghiệm hiệu lực của ba chế phẩm từ nấm này lên một số đối tượng gây hại quan trọng trên rau” được thực hiện đáp ứng các yêu cầu

trên

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Nấm Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và phân bố

Năm 1878, khi nghiên cứu về loài sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì Anisoplia

austriaca, nhà khoa học người Nga I I Metschnikoff đã phát hiện thấy một loài nấm

có bào tử màu lục và khả năng gây chết hàng loạt sâu này Ông xác định loại nấm này

có tên khoa học là Entomophthora anisopliae Về sau, Sorokin kiểm tra lại và thấy loài nấm này không thuộc giống Entomophthora mà thuộc giống Metarhizium

(Nguyễn Lân Dũng, 1981)

Vào những năm 1890 – 1897 nhà khoa học Koben người Đức đã thu thập được nấm

Metarhizium ký sinh trên sâu hại từ Hawaii mang về Đức để nghiên cứu (Phạm Thị

Thùy, 2004)

Nấm Metarhizium anisopliae (Sorok, 1883) là loại nấm có màu lục hoặc xanh nên

người ta thường gọi là nấm lục cương (chết cứng có màu xanh lá cây), chúng được tìm thấy trên hơn 200 loài côn trùng khác nhau (Ferron P, 1978)

Nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, giống Metarhizium (theo hệ thống phân loại nấm của G C Ainsworth, 1996, 1970, 1971) Một tác giả khác lại cho rằng nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm túi Ascomycotia, lớp Pletomyces và giống Metarhizium Tuy nhiên, phân loại theo Ainsworth được nhiều tác giả chấp nhận hơn cả (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Metarhizium anisopliae thường xâm nhiễm trên rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và

nhiều loại sâu hại khác Sau khi xâm nhiễm chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn màu xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng (Alaoui Abdelaziz and Elmeziane Abdellatif, 2008)

Nấm Metarhizium anisopliae được tìm thấy trên khắp các châu lục với hơn 200 loài

côn trùng khác nhau như rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và rất nhiều loại sâu hại khác rau màu khác Sau khi xâm nhiễm chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn

màu xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng (Ferron, 1978)

Nấm Metarhizium anisopliae là nấm hại côn trùng, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên,

có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất Ở những nơi

không có côn trùng, người ta cũng phân lập được Metarhizium anisopliae ngay cả

trong điều kiện thời tiết rất khắc nghiệt (như ở Đức), trên những khu đất ở rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm) hoặc trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây đước, hoặc trong tổ của một số loài

chim và cả trong rễ của cây dâu tây cũng có thể phân lập được nấm Metarhizium

anisopliae (Bennasar, A., C Guasp and J Lalucat 1998a)

1.1.2 Đặc điểm hình thái và học

Hình thái: Sợi nấm phát triển trên côn trùng có màu trắng đến hồng, cuống sinh bào

tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dầy đặc Bào tử trần hình que có kích thước 3,5x6,4x7,2 μm, màu từ lục xám đến ôliu-lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường người ta có thể thấy bào từ được tạo trên bề mặt côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục (Bocias D.G, J C Penland and J P Latge, 1991)

Nấm M anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn, đường kính 3 – 4 μm Sợi

nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc Bào tử trần hình trụ, ovan hoặc hình que

có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 μm, màu từ lục xám đến ôliu - lục (Rombach, et al.,

1994) Bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào

tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 μm, dài khoảng 20

μm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ (Cerenius L., A Balows, and M Sussman,1998)

Nấm M anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, hình bầu dục, khuẩn lạc màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế Loài M anisopliae có 2 dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var anisopliae có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 μm, dạng bào tử lớn là Metarhizium anisopliae var

major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 μm (Chernaki Leffer AM et al., 2007)

Theo mô tả của Trần Văn Mão (2002), nấm Metarhizium anisopliae có cuống bào tử

thẳng, đơn nhánh, phân nhánh, hoặc dạng cây, cuống nhỏ, mọc bào tử dạng sợi hoặc dạng bình, mọc đơn hoặc vòng Bào tử phân sinh đơn bào, mọc trên đỉnh cuống nhỏ thành chuỗi, dính liền nhau bằng dịch nhầy, hình trứng hoặc hình bầu dục dài Một số loài có cuống bào tử hoặc chất đệm

Hình 1: Bào tử của nấm Metarhizium anisopliae (ảnh của Ihara)

Hình 2 Một dạng cuống sinh bào tử nấm Metarhizium anisopliae

(Marta G Yasem de Romero, 2008)

Nấm Metarhizium anisopliae là loại nấm ký sinh trên côn trùng xuất hiện rất phổ biến

trong tự nhiên có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất Ở

những nơi có côn trùng, người ta cũng phân lập được nấm Metarhizium anisopliae

ngay cả trong điều kiện thời tiết khắc nghiệt (ở Đức) trên những khu đất ở rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm) hoặc trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây đước,…cũng phân lập được nấm

Metarhizium anisopliae (Dwayne D Hegedus and George G Khachatourians,1993)

Sinh lý – sinh hóa: Nấm M anisopliae không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất

không có kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, có biên độ về độ ẩm rộng ở nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày Ở nhiệt độ dưới 00C

và trên 450C thì nấm không hình thành bào tử Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 250C - 300C và sẽ bị chết 490C và nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển tốt nhất là 250C pH thích hợp là 6 và có thể dao động trong khoảng 3,3 – 8,5 Nấm M

anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, xenlulozơ và kitin (lông và da của côn

trùng) (Tamerler C, Ullah M, Adlard MW, and Keshavarz T, 1998)

1.1.3 Độc tố diệt côn trùng

Destruxin

Độc tố của nấm M anisopliae gồm một số ngoại độc tố có tên là Destruxin A, B, C

hay D Các ngoại độc tố đó là các sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L-proline, L-leucine, anhydride và Desmethyl Destruxin B Cấu trúc cơ bản của chúng gồm 5 aminoacid và α-hytroxy acid Destruxin gây chán ăn và gây độc cho côn trùng khi chúng hấp thu

vào da, một số Destruxin gây tê liệt côn trùng (Amiri et al., 1999; Dumas et al., 1996) Một số Destruxin khác ức chế miển dịch rất mạnh mẽ (Cerenius et al., 1990)

Các sản phẩm thứ cấp đó thường được tích lũy vào cuối giai đoạn sinh trưởng của nấm, khi các nguồn thức ăn và năng lượng cạn kiệt (Phạm Thị Thùy, 2004)

Theo Suziki ctv., (1971)

Destruxin A có công thức nguyên là: C29H47 N5O7, có điểm sôi là 188 0C

Destruxin B có công thức nguyên là: C30H51O7N5, có điểm sôi là 2340C

Gần đây, Alexander Jegorov et al., (1998) đã ly trích thành công được độc tố có tên là

Destruxin Ed1, một Cyclopeptide từ nấm này

Tính mẫn cảm của côn trùng với các loại Destruxin khác nhau thì khác nhau Côn

trùng thuộc bộ cánh vẩy có thể mẩn cảm cao nhất (Keshaw et al., 1999) LD50 khi

tiêm vào ấu trùng tằm là 0,015 – 0,03mg/g ở 24 giờ sau khi tiêm (Suzuki et al., 1971)

LC50 của nấm Metarhizium anisopliae đối với ấu trùng rầy nâu Nilaparvata lugens là

1,86 x 106 bào tử/ml ở 4 ngày sau khi chủng ở điều kiện 250C (Gillespie, 2002) Một

thí nghiệm khác của Chernaki et al., (2007) đã xác định LD50 của nấm Metarhizium

anisopliae từ 1,8x106-4,3x106 bào tử/ml

Bào tử nấm Metarhizium anisopliae có LT50 và LD50 đối với một số loài sâu bộ cánh

vẩy như ấu trùng tằm, sâu xanh da láng Spodoptera exigua, sâu xanh Heliothis

armigera là 48 giờ và 105 bào tử/ml (Tạ Kim Chỉnh và Lý Kim Bản, 1995)

Destruxin cũng gây độc cho động vật nhỏ có vú LD50 của Destruxin A và B sau khi tim vào bụng chuột là 1-1,35mg/kg tương ứng với 13,2 đến 16,9mg/kg trong 1 giờ (Kodaira, 2000)

Trái lại, Destruxin ít độc với cá và các động vật lưỡng cư, không làm chết, không gây

quái thai hay trì hoãn sự xuất hiện phôi cá Brachydaniorerio (Lewis et al., 1996)

1.1.4 Cơ chế gây bệnh côn trùng

Khi bào tử nấm Metarhizium anisopliae bám trên bề mặt côn trùng sẽ nảy mầm tạo

thành ống mầm xuyên qua biểu bì bên ngoài Bào tử bám chặt vào da và tấn công theo

cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước của vách tế bào (Bocias et

al., 1991) Khi tiếp xúc với da côn trùng và với điều kiện thích hợp bào từ sẽ mọc

mầm có thể tạo ra các cấu trúc xâm nhiễm như tạo ra các ống mầm, túi ngoại bào hoặc túi áp suất, từ đó xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp kitin Sự xâm nhập của nấm vào trong biểu bì thường là do sự phối hợp của enzyme và cơ chế cơ học Nấm tiết ra các loại men làm mềm lớp vỏ kitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases, esterases, lipases, chitinases và chitobiases (Boucias và Penland, 1998; Butt and Copping, 2000)

Hình 3 Cơ chế gây bệnh lên côn trùng của nấm ký sinh

(Nguồn: Matthew B Thomas và Andrew F Read, 2007)

Sau đó, tiếp tục phân nhánh tạo nên một mạng sợi nấm chằng chịt bên trong cơ thể

côn trùng Nấm M anisopliae đã tiết ra các độc tố Destruxin A, B và chính các độc tố

này đã gây chết côn trùng (Amiri B, L Ibrahim and T M Butt (1999)

Hình 4 Sự xâm nhiễm và giết chết côn trùng (Cheah, 2004)

Nấm M anisopliae có thể cần các điều kiện thích hợp như nhiệt độ, ẩm độ, quá trình

bệnh lý và hình thành các độc tố trong quá trình phát triển (Phạm Thị Thùy, 2004)

1.1.5 Thành tựu và ứng dụng

Metschnikoff (1880-1886) đã thử nghiệm nấm Metarhizium anisopliae ngoài đồng,

cho thấy sau 10-14 ngày cả sâu non và sâu trưởng thành của bọ đầu dài hại củ cải

đường chết vởi tỷ lệ 55-80% (trichs dẫn Phạm Thị Thùy, 2004) Nấm Metarhizium

anisopliae có thể giết 70-100% ấu trùng tuổi 2 và thành trùng của loài Cerotoma arcuata khi nuôi nhốt trong một lồng lớn được cho ăn đậu xay nhuyễn trong thí

nghiệm của Maria Lucia Franca Teixeira năm 2001

Để nhận được lượng sinh khối và bào tử nấm, Dangar et al, đã nuôi cấy nấm

Metarhizium anisopliae trên vài môi trường và đã xác định môi trường Czapek - Dox

là phù hợp nhất Các tác giả cũng đã nhận thấy trong số các loại ngũ cốc sử dụng làm

nguồn carbon thì gạo là phù hợp hơn cả Basto Cruz và ctv., khi nuôi cấy nấm

Metarhizium anisopliae để sản xuất chế phẩm nhận thấy, trên môi trường gạo có số

lượng bào tử hình thành nhiều gấp 3 lần và thời gian hình thành bào tử cũng nhanh hơn so với môi trường đậu tương ngâm Các tác giả còn sử dụng các loại cám, trấu,

nước dừa và cùi dừa để sản xuất ra sinh khối nấm Metarhizium anisopliae

Tại Cuba những năm 1970 - 2002, Viện Công nghệ sinh học Lahabana đã nghiên cứu

công nghệ sản xuất chế phẩm nấm M anisopliae trên môi trường tấm gạo với dung

dịch carbonat canxi 0,5%, bằng phương pháp luộc tấm gạo rồi sấy khô sau đó nhân giống thuần Phương pháp này đã đạt được kết quả bước đầu trong việc ứng dụng nấm trừ một số loài sâu hại cây trồng Hiện nay nền công nghệ sinh học ở Cuba đã phát triển rất nhanh, phương pháp nhân giống nấm trên tấm hoặc gạo đã phát triên với quy

mô lớn Phương pháp này đã được thử nghiệm ở Viện Bảo Vệ Thực Vật năm 2002, song kết quả thu được không ổn định, mất nhiều thời gian, tốn công cho luộc và sấy tấm và khi sản xuất trong túi nilon dễ bị tạp nhiễm, chất lượng thấp và không ổn định,

vì sản xuất rất phức tạp, năng suất không cao 107 - 108 bào tử So với phương pháp lên men xốp của Viện Bảo vệ thực vật (1996) thì phương pháp của Cuba cho hiệu quả thấp hơn và thời gian nuôi cấy lâu hơn, giá thành đắt hơn mặc dù có cải tiến nhân giống bằng môi trường dịch thể sau đó nuôi cấy nấm trong túi polyethylene, nhưng điều quan trọng nhất là phải đảm bảo là phân loại và xác định đúng chủng, giống Nếu sai chủng nấm sẽ không có hiệu quả Vì vậy, không nên làm lại phương pháp này một khi tác giả đã thử nghiệm (Trần Văn Hai, 2008)

Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Thùy (1992) đã xác định được môi trường nhân giống cấp 1 chính là môi trường Sabouraud bổ sung thêm khoáng chất và môi trường

sản xuất nấm M anisopliae có thành phần 50% cám gạo, 20% bột ngô, 20% bột đậu, 10% trấu với tỷ lệ nước/môi trường sản xuất là 50%, cấy chủng nấm M anisopliae

được phân lập trên bọ hại dừa Phú Quốc, chất lượng chế phẩm nấm đạt cao 3x1010

bào tử/g

Ở Việt Nam, nấm Metarhizium anisopliae được ứng dụng trừ các loại mối hại cây

công nghiệp, cây ăn trái, hoa cảnh; quản lý sâu rầy hại lúa, bọ cánh cứng hại dừa

Brontispa sp đạt 71,6-79,1% (Trần Văn Hai, 2008)

Hiện nay, trên thế giới, đã có nhiều nước sản xuất ra nấm Metarhizium anisopliae có

khả năng thương mại hóa trên thị trường (Yasuhisa Kunimi, 1998)

- Bio-Path® được sử dụng trừ mối tại Mỹ

- Biotrol® FMA do hãng Nutrilite (Mỹ) sản xuất với công dụng diệt muỗi

- BioGreen® được khuyến cáo trừ bọ hung đầu đỏ, Adoryphorus couloni ở Úc

- Metaquino dùng trừ muỗi sốt rét Lubilose, châu chấu Schistocerra gregaria, bọ

hung

1.2 Nấm Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin

1.2.1 Nguồn gốc phân loại và phân bố

Trong suốt thời gian từ 1885 - 1890, tại trại trung tâm nuôi tằm ở Pháp, nhà bác học Louis Paster đã phát hiện ra các vi sinh vật gây bệnh trên tằm

Xếp theo số hệ thống phân loại chung của G C Ainsworth, 1966, 1970, 1971 thì nấm

Beauveria bassiana thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes và giống

Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, được tìm thấy trên và

trong đất cũng như ký sinh trên rất nhiều loài côn trùng hại bông, khoai tây, lúa mì, đậu và ngô ở Mỹ (Alaoui Abdelaziz và Elmeziane Abdellatif,2008)

Đây là loại nấm hại côn trùng thuộc bộ Cánh vẩy và Cánh nửa cứng là chủ yếu, phân

bố trên khắp thế giới, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập dễ dàng từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất (Liang, 1993)

1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học

Côn trùng chết do nấm Beauveria bassiana có biểu hiện bề ngoài là khô cứng (chết

cứng trắng), có màu trắng do tơ nấm đã bao phủ toàn bộ bề mặt Người Trung Quốc

và người Việt thường gọi là nấm bạch cương (hay nấm trắng) Trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng, nấm bạch cương có sợi từ màu trắng đến màu kem có pha một

ít màu đỏ, da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn ngang,

có chiều dài khoảng 3-5 μm phát triển dày đặc trên môi trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử (Yasuhisa Kunimi, 2005)

Đường kính khuẩn lạc từ 1-3 cm khi nuôi cấy trong môi trường PGA (potato glucose agar) ở 250C, mặt ngoài từ màu trắng đến vàng nhạt, bề mặt nhẵn, ban đầu sợi nấm mọc khá xốp, về sau rất mịn (Collier, L., A Balows, và M Sussman, 1998; Larone, D

H 1995) Sợi nấm trong suốt, mỏng, có vách ngăn, rộng 2-8 µm Cuống bào tử trần đứng riêng lẽ, hay tụ lại thành từng đám, không phân nhánh hoặc phân nhánh, hình ống hoặc hình bình với chiều dài không đều nhau Trên cuống có những nhánh ngang bào tử trần (St-Germain, G., and R Summerbell, 1996)

Theo Phạm Thị Thùy (2004), nấm Beauveria bassiana có bào tử dạng hình cầu hoặc

hình trứng, có kích thước 2,5-3,5 µm, mọc trên cuống sinh bào tử hướng gốc và tụ lại thành những đám dày đặc trên các sợi nấm vươn khỏi lớp khuẩn ty Cuống sinh bào tử

có phần gốc hình cầu hoặc hình lọ tam giác (2-3 × 2-4 µm) gắn trên cành bào tử hình zic zac, dài tới 20 µm

Hình 5 Bào tử của nấm Beauveria bassiana

Beauvericin Công thức phân tử: C45H57N3O9

Trọng lượng phân tử: 783.95 g/mol

Về mặt hóa học, beauvericin có danh pháp là xyclo (N- metyl L – phenin alanin – D -

α – hydroxy - izovaleri)3 Đó là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng

93-940C Từ một lít môi trường cấy nấm B bassiana các nhà khoa học Trung Quốc ở

trường Đại học tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách ra được 1,5g độc tố beauvericin và từ một kg môi trường đặc các tác giả tách ra được 3,8g beauvericin (Butt T M and Copping L (2000)

1.2.4 Cơ chế gây bệnh côn trùng

Khi bào tử nấm dính vào côn trùng gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm xuyên qua lớp vỏ kitin Chúng phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện các tế bào nấm đầu tiên (có dạng chuỗi ngắn như nấm men), côn trùng phải huy động hết các tế bào bạch huyết (lympho-cyte) để chống đỡ, nhưng nấm bạch cương đã sử dụng những vũ khí hóa học rất lợi hại là độc tố Beauvericin, proteaza và một số chất khác làm cho tế bào bạch huyết của tằm không chống đỡ nổi nên lần lượt bị hủy diệt Khi độc tố nấm đã tiêu diệt các tế bào bạch huyết cũng là lúc côn trùng bị chết, cơ thể côn trùng bị cứng lại là do các sợi nấm đan xen lại với nhau (Phạm Thị Thùy, 2004)

1.2.5 Những thành tựu và ứng dụng

Năm 1988 tại Nhật Bản một số nhà khoa học đã phòng trừ dòi hại rễ củ cải đường

bằng nấm Beauveria bassiana, ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm từ nấm Beauveria bassiana Lobo Lima đã tiến hành thử nghiệm sinh học của nấm Beauveria bassiana phòng trừ dạng trưởng thành của bọ hà khoai tây (Cylas puncticollis) Ở Trung Quốc, các tác giả Am và Wu đã sử dụng chủng nấm

Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông (Dendrrolinmmus tabulaformis) qua

đông đạt hiệu quả cao Cerenius L., A Balows, and M Sussman, 1998)

Ignofo et al., 1979 đã thử nghiệm thuốc trừ sâu Boverin (sản xuất từ nấm Beauveria

bassiana) trên sâu tơ và cho thấy LC50 đối với ấu trùng sâu tơ 3 ngày tuổi là 2,7 x 108

bảo tử/ml tương đương với 1,5 x 106 bào tử/cm2 bề mặt lá Vandenberg đã tiến hành thí nghiệm trong phòng và cho thấy tất cả các giai đoạn của ấu trùng sâu tơ đều bị mẫn cảm với của nấm này nhưng ấu trùng sẽ chết nhanh hơn ở ẩm độ trung bình và bào tử

nấm cao Vanderberg et al., (1999) cũng đã thử nghiệm chế phẩm từ nấm này ở điều

kiện ngoài đồng bằng cách sử dụng Mycotrol® phun định kỳ 1 tuần/lần hoặc 2 tuần/lần

đã làm giảm mật số và sự gây hại của sâu tơ một cách có ý nghĩa so với thuốc hóa học

trên cây giống (Frank, 2000) Nấm Beauveria bassiana có khả năng phòng trừ sâu đục thân bắp ở Châu Âu khi được phun lên tán lá cây bắp (Hsiu et al., 1973); Lewis và Bing, 1991; Lewis et al., 1996) Dòng nấm trắng trích từ rầy nâu hại lúa ở Pantagar

(Ấn Độ) có khả năng gây chết cao đối với rầy nâu (88,35-91,25%), rầy lưng trắng (86,59-92,44%), rầy xanh đuôi đen (96,12%) và sâu cuốn lá (74,45%) (Nguyen Thi

Loc et al., 2004) Salmeida et al., (1998) cho thấy rằng dùng bào tử nấm Beauveria

bassiana trong bả mồi cùng với thuốc trừ sâu đã ngăn chặn tốt mối hại mía đường ở

Brasil Gần đây, chế phẩm nấm Beauveria bassiana (dòng GHA), phân lập tại Mỹ đã

được đăng ký để phòng trừ bọ trĩ, rầy mềm và một số bọ cánh cứng khác (Dwayne và

G G Khachatourians, 1995)

Thuốc vi nấm Beauveria bassiana được rất nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Canada,

Anh, Úc, Philippin và Trung Quốc… ứng dụng trên nhiều loại cây trồng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh thẳng Orthopterra, bộ cánh bằng Isoptera… đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loại sâu hại cây rừng như sâu róm thông, bọ hại dừa, châu chấu… (Rombach và Agudu, 1988; Milner, 1991)

Ở Việt Nam, sử dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana đã được tiến hành từ 1979

đến nay vẫn tỏ ra có tác dụng đối với sâu róm hại thông và một số loài sâu hại nông nghiệp (Trần Văn Mão, 2002) Các nhà khoa học của Viện Bảo vệ thực vật đã tiến

hành sử dụng nấm trừ sâu róm thông Dendrolimus punctatus ở Thanh Hóa và Sơn La

Phạm Thị Thùy cũng đã sử dụng nấm này với nồng độ 9 x 108 bào tử/ml để trừ sâu tơ đạt hiệu quả rất cao ở 8 ngày sau khi phun (81%) (Trần Văn Hai, 2008)

Công nghệ nuôi cấy và sản xuất nấm Beauveria bassiana

Lần đầu tiên vào năm 1892, F Tang đã nuôi cấy nhân tạo nấm bạch cương Beauveria

bassiana rồi dùng bào tử của chúng để thử nghiệm diệt sâu róm (Porthetria disper)

Sau đó Hamill R L (1869) đã sử dụng có kết quả bào tử của nấm Beauveria để tiêu diệt loài rệp Blissus leucoplerus Trên cơ sở tiến hành các thí nghiệm tại trường Đại

học tổng hợp Kanzas của Mỹ các nhà khoa học đã tổ chức một cơ sở sản xuất để ứng

dụng vi nấm trong công tác bảo vệ thực vật Nấm Beauveria bassiana đã được nghiên

cứu trong những giai đoạn phát triển từ khuẩn lạc đến sự hình thành bào tử Nấm

Beauveria bassiana được nuôi cấy nhân tạo theo phương pháp lên men chìm được

thực hiện lần đầu bởi J Maran (1948) với loài nấm Beauveria brumpli và gần đây

công nghệ sản xuất nấm đã phát triển rất mạnh ở một số nước có nền kinh tế phát triển (Roberls D W, 1981)

Theo Milner (1991), nấm Beauveria bassiana đã được rất nhiều nước trên thế giới sử

dụng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera,

bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng Hymenoptera, và cả bộ cánh nửa cứng Hemiptera, bộ hai cánh Diptera, bộ cánh thẳng Orthoptera, bộ cánh bằng Isoptera,…đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loài như sâu róm thông, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại cây ăn quả, sùng hại mía (trích dẫn bởi Phạm Thị Thuỳ,

2004) Ở Nhật Bản, các nhà khoa học đã sử dụng nấm Beauveria bassiana để phòng trị sâu tơ Plutella xylostella bước đầu đạt kết quả rất tốt (Yasuhisa Kunimi, 2005)

Đến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất nấm Beauveria bassiana có khả năng

thương mại hóa trên thị trường như:

- Boverin do công ty Glavmikrobioprom (Nga) sản xuất với công dụng diệt bọ hại khoai tây

- Biotrol FBB do công ty Nutrilite (Mỹ) sản xuất với công dụng diệt bọ hại khoai tây (Yasuhisa Kunima, 1998)

Theo phân loại nấm của G C Ainsworth (1966, 1970 và 1971) thì nấm Paecilomyces

sp thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống Paecilomyces (Phạm

Thị Thùy, 2004)

Nấm Paecilomyces sp tựa như nấm mốc xanh (Penicillin) và nấm chồi (Gliocladium),

có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới, bao gồm rất nhiều loài (Trần Văn Mão, 2002)

Nấm Paecilomyces sp dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bả

hữu cơ, dư thừa thực vật Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:

- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng

- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất

- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng

- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở côn trùng chết,

rừng cao su (Crop Protection Compennium, 2002)

1.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh học

Nấm Paecilomyces sp có khuẩn lạc dạng thảm nhung, bó sợi, có màu trắng, hồng nhạt

đến tím đinh hương, có khi màu nâu vàng hoặc nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt (Dwayne D Hegedus and George G Khachatourians, 1993)

Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh lớn, gốc cuống dạng phình

to, phía trên nhỏ và uốn cong Cuống bình sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002)

Hình 6 Bào tử của nấm Paecilomyces sp

Hình 7 Dạng cành bào đài nấm Paecilomyces sp (Stathers et al., 2000)

Gần đây Stathers et al đã cho công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp và xác định nấm Paecilomyces

sp thích hợp ở nhiệt độ 280C và ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ 24-260C, ẩm độ cao thì thuận lợi cho sự nẩy mầm và sinh trưởng của nấm và ngược lại ẩm độ thấp sẽ thuận lợi cho việc duy trì sự sống của nấm (Trần Văn Mão, 2002)

Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm

độ từ 0 – 34% hơn là khi ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002)

là proteaza, lipoaza và kitinaza (Stathers et al., 2000)

Khả năng ký sinh của nấm Paecilomyces sp rất rộng, trên rất nhiều loài thuộc bộ cánh

nửa cứng, cánh cứng, cánh màng, cánh vẩy và hai cánh (Ferron P., 1978)

Năm 1998, Collier, L., A et al., đã phân lập thành công độc tốc của nấm

Paecilomyces sp là Paecilotoxin, có trọng lượng phân tử: 1147,49 g/mol và công thức

phân tử là C58H102N10O13 (Ferron P., 1978)

1.3.4 Những nghiên cứu và ứng dụng nấm Paecilomyces sp Bainier

Năm 1981, Liang đã phân lập được nấm Paecilomyces sp nấm này có thể ký sinh

nhiều loại thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh nửa cứng (Hemiptera), bộ cánh màng (Hymenoptera), bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và bộ hai cánh (Diptera) Người ta

đã sản xuất ra chế phẩm Pelomin để phòng trừ Ngài đục quả táo, sâu róm thông (Trần Văn Mão, 2002)

Ở Trung Quốc, các tác giả Am và Wu đã sử dụng chủng nấm Paecilomyces sp để phòng trừ sâu róm thông (Dendrolimus tabulaformis) qua đông đạt hiệu quả cao

(Phạm Thị Thùy, 2004)

Đến nay Nhật Bản, Mỹ, Ấn Độ và Bỉ đã sản xuất nấm Paecilomyces fumosoroseus có

khả năng thương mại hóa trên thị trường và có tên thương mại là: PreFeRal, Priority, Pae-Sin để phòng trị rệp sáp và rầy mềm (Yasuhisa Kunimi, 2005)

1.4 Tính an toàn của các chế phẩm sinh học làm từ nấm

Pian (1991) đã chứng minh rằng các loại chế phẩm nấm ký sinh côn trùng đều rất an toàn với động vật máu nóng và con người Dù ở điều kiện nhiệt độ và ẩm độ nào, chúng đều ngừng phát triển sau 28 ngày và mất khả năng gây hại nên rất an toàn Cho

đến nay, chỉ có nấm mốc Aspergillus là có khả năng gây hại và tích lũy trong cơ thể

người được nhắc đến nhiều hơn cả

Đối với nấm Beauveria bassiana, nhiều nhà khoa học đã thử nghiệm tiêm dung dịch

bào tử lên chuột, lợn và cho chúng ăn Kết quả là sau 2 tháng chúng vẫn không có

phản ứng Điều này chứng tỏ nấm Beauveria bassiana không có ảnh hưởng xấu đến

người và động vật máu nóng Các thí nghiệm độc tính cho thấy chúng có độ độc khá thấp LD50 > 2500 mg/kg Tuy nhiên, người sản xuất chế phẩm nấm thường phản ứng nhạy cảm với bụi khi xay nhuyển chế phẩm, biểu hiện hắc hơi, ho, chóng mặt nhẹ, nhưng chỉ xảy ra trong thời gian rất ngắn và biểu hiện khỏe hẳn sau khi ra khỏi khu vực sản xuất Do vậy, khuyến cáo của nhà sản xuất là phải mặc quần áo bảo hộ, khẩu trang trong lúc làm việc trong không khí chỉ nên giữ nồng độ bào tử dưới 1mg/1m3không khí là có thể tránh được hiện tượng dị ứng (Pian, 1991)

1.5 Một số đặc điểm của sâu ăn tạp

Tên khoa học: Spodoptera litura Fab

Họ: Noctuidae, Bộ: Lepidoptera

1.5.1 Sự phân bố và kí chủ

Sâu ăn tạp là loài có phổ kí chủ rộng phân bố hầu hết các nước trên thế giới như: Châu

Á, Châu Úc và cả những vùng đảo thuộc Thái Bình Dương Ở vùng Đông Nam Á, sâu

ăn tạp được xác định là một trong những loài gây hại chủ yếu, xuất hiện nhiều ở Malaysia, Myanma và Việt Nam Ở Việt Nam, sâu gây hại nhiều trên đậu xanh, bắp, khoai lang, rau cải,…(Nguyễn Thị Thu Cúc, 2005)

1.5.2 Đặc điểm hình thái và sinh học

Bướm có chiều dài thân khoảng 20 – 25 mm, sải cánh rộng từ 35 – 45 mm Cánh trước có màu nâu vàng, giữa cánh có vân trắng, cánh sau màu trắng óng ánh Bướm có đời sống trung bình từ 1 – 2 tuần tùy điều kiện thích hợp có thể đẻ từ 900 – 2000 trứng (Lê Thị Sen, 1999) Ở Đồng bằng sông Cửu Long, khả năng đẻ trứng của một bướm cái khoảng 510 trứng trên cặp nhưng có trường hợp đặc biệt lên đến 1440 trứng Khi trứng phát triển từ màu vàng trắng chuyển sang vàng tro đến nâu đậm là giai đoạn trứng sắp nở, trứng sâu nở sau khi đẻ khoảng 2 – 3 ngày (Phạm Huỳnh Thanh Vân và

Lê Thị Thùy Minh, 2001)

Thời gian phát triển của ấu trùng kéo dài từ 20 – 25 ngày, sâu có 5 tuổi hoặc 6 tuổi tùy điều kiện môi trường Nếu điều kiện thuận lợi ấu trùng có thể dài từ 35 – 53 mm hình ống tròn, tuổi nhỏ sâu có màu lục, càng lớn sâu càng chuyển về màu nâu sậm Trên cơ thể có hai sọc vàng chạy dọc hai bên hông từ đốt thứ nhất đến đốt cuối bụng, mỗi đốt có một chấm đen nhỏ nhưng hai chấm đen ở đốt thứ nhất là rõ nhất (Lê Thị Sen, 1999) Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), khi mới được hình thành, nhộng sâu ăn tạp có màu xanh đọt chuối rất mềm, sau đó chuyển sang màu

xanh, cuối cùng có màu nâu đen, các đốt cuối cùng của bụng có thể cử động được, thời gian nhộng kéo dài khoảng 7 – 10 ngày

Sâu ăn tạp có vòng đời tương đối ngắn, trung bình 30,2 ngày, bao gồm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng, thành trùng trong đó giai đoạn ấu trùng chiếm trung bình khoảng 21,7 ngày, đây là giai đoạn gây hại quan trọng của sâu ăn tạp Khả năng sinh sản mạnh và thời gian phá hại kéo dài, vì thế sâu ăn tạp là đối tượng gây hại quan trọng trên rau màu (Đỗ Thị Hồng, 2006)

1.5.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại

Bướm thường vũ hóa vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối cho đến nửa đêm, ban ngày bướm đậu ở mặt sau lá hoặc trong những bụi cỏ Bướm có thể bay xa vài chục mét và cao đến 6 – 7 m Sau khi vũ hóa được vài giờ bướm có thể bắt cặp và một ngày sau đó có thể đẻ trứng (Lê Thị Sen, 1999)

Nguyễn Thị Thu Cúc (2005), cho rằng sâu non ăn lá còn lại biểu bì và gân lá, ăn cả nụ bông, đậu, bắp cải mới ra lá, sâu ăn thủng lá có khi ăn cả ngọn làm cây còi cọc

Sâu non phát triển thích hợp vào lúc có nhiệt độ và ẩm độ cao, sâu cắn phá mạnh vào lúc ban đêm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống đất hoặc dưới tán lá khô và cỏ dại

để ẩn nấp (Đỗ Thị Hồng, 2006)

1.5.4 Biện pháp phòng trị

Biện pháp canh tác: Đất trước khi trồng cần phải được cày, xới và xử lý thuốc trừ sâu

và cho ruộng ngập nước 2 – 3 ngày để diệt nhộng và sâu non có trong đất, phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu, ngắt bỏ ổ trứng hoặc tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phân tán xa (Lê Thị Sen, 1999)

Biện pháp hoá học: Sâu ăn tạp có khả năng kháng thuốc rất cao, do đó khi sử dụng thuốc hoá học trong phòng trị cần thay đổi thuốc thường xuyên và nên phun vào giai đoạn trứng sắp nở có hiệu quả hơn Các loại thuốc thường dùng như Cyperan 10EC, Karate 2,5EC, Regent 800WG,…(Trần Thị Ba, 1999) Nên phun lúc chiều mát và phun lúc còn nhỏ để tránh khả năng kháng thuốc (Dương Minh, 1999)

Biện pháp sinh học: Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001) ghi nhận trong điều kiện tự nhiên tại Đồng bằng sông Cửu Long, sâu ăn tạp bị bốn nhóm

ký sinh: Côn trùng ký sinh, siêu vi khuẩn gây bệnh NPV, Protozoa và vi sinh vật kí sinh

1.6 Một số đặc điểm của Bọ nhảy

Tên khoa học: Phyllotreta striolata Fabricius

Họ ánh kim (Chrysomelidae), Bộ cánh cứng (Coleoptera)

1.6.2 Đặc điểm hình thái và sinh học

Thành trùng có chiều dài thân từ 1,8 – 2,4 mm hình bầu dục, toàn thân màu đen bóng Trên cánh trước có 8 hàng chấm đen lõm dọc theo hai cánh Đốt đùi chân sau to khỏe giúp thành trùng nhảy xa Một thành trùng cái đẻ từ 25 – 200 trứng Đời sống của thành trùng rất dài, có thể đến một năm Trứng màu trắng sửa, hình bầu dục, dài khoảng 3mm Ấu trùng hình ống tròn Mình màu vàng nhạt, 3 đôi chân ngực rất phát triển Ấu trùng có 3 tuổi và phát triển từ 3 đến 4 tuần (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004) Theo Nguyễn Thị Thu Cúc (2003), ấu trùng hình giun đất, màu trắng hoặc vàng tươi, sống lột xác và làm nhộng dưới đất, thời gian phát triển của ấu trùng khoảng 4 –5 tuần

1.6.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại

Thành trùng thường ẩn nấp vào nơi râm mát, mặt dưới các lá gần mặt đất Khi trời nắng, có khả năng nhảy xa và bay rất nhanh Thường bò lên mặt lá, ăn phá lúc sáng sớm và chiều tối, cắn thủng lá cải thành những lổ đều đặn trên khắp mặt lá Thành trùng đẻ trứng chủ yếu trong đất, cách rễ chính khoảng 3 cm, đôi khi đẻ trứng ngay trên thân cây, gần sát mặt đất, ấu trùng ăn rễ cây làm cây bị còi cọc (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

1.6.4 Biện pháp phòng trị

Theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004) nên vệ sinh ruộng trồng cải sau khi thu hoạch, thu gom các cây cải hoặc lá cải hư vào một nơi để tiêu diệt Luân canh với các loại cây trồng khác không phải là ký chủ của sâu cũng hạn chế phần nào thiệt hại

ở vụ sau Khi cần thiết có thể dùng thuốc nhóm gốc cúc thực vật kết hợp với gốc lân hữu cơ theo khuyến cáo

1.7 Một số đặc điểm của Sâu tơ

Tên khoa học: Plutella xylostella Curtis

Họ: (Yponomeutidae), Bộ Cánh Vảy (Lepidoptera)

1.7.1 Phân bố và ký chủ

Sâu tơ có nguồn gốc Địa Trung Hải và đã được ghi nhận từ năm 1746 Hiện nay sâu tơ

đã có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới Ở Việt Nam sâu tơ gây hại vào khoảng thời

gian những năm 40 Hiện nay, sâu tơ được tìm thấy ở hầu hết các vùng trồng rau cải

từ biên giới phía Bắc đến tận vùng Minh Hải (Nguyễn Thị Thu Cúc, 2005)

Sâu ghi nhận là phá hại trên rất nhiều loại rau cải khác nhau như cải bắp, cải bẹ xanh, cải bẹ trắng, cải ngọt, cải bông, cải rổ, nhưng trầm trọng nhất là trên cải bắp và cải bông Ngoài ra, sâu tơ còn gây hại trên một số loại cây họ cà như khoai tây, cà chua

… (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

1.7.2 Đặc điểm hình thái và sinh học

Bướm sâu tơ dài từ 6 – 10 mm, sải cánh rộng từ 10 – 15 mm Cánh trước có màu nâu xám, trên có nhiều chấm nhỏ màu nâu; từ chân cánh ra đến cạnh ngoài của cánh trước

có một dãi hình răng cưa màu trắng trên bướm đực và màu vàng trên bướm cái, hai cạnh của cánh sau có rìa lông rất dài Râu dài 3 – 3,5 mm luôn đưa về trước rất linh hoạt Bướm có thể sống 4 – 17 ngày tùy giống cái hay đực và tùy điều kiện sống Bướm đẻ trung bình 90 trứng và đẻ cao điểm vào đêm thứ nhất và thứ nhì (Lê Thị Sen, 1999)

Trứng sâu tơ hình bầu dục, dẹp, màu vàng nhạt, đường kính 0,3 – 0,5 mm Thời gian ủ trứng từ 3 – 8 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen 2004)

Sâu có 4 tuổi phát triển 7 – 15 ngày tùy điều kiện thức ăn và thời tiết Mình sâu phình

to chính giữa, 2 đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng, mỗi đốt có nhiều lông mọc thẳng đứng Sâu có 3 cặp chân giả từ đốt bụng thứ 5 Chi tiết từng giai đoạn tuổi như sau: Tuổi 1: thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm phát triển 2 – 4 ngày

Tuổi 2: cơ thể sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục, chiều dài khoảng 1,5 – 3,5 mm và phát triển trong thời gian 1 – 3 ngày

Tuổi 3: mình sâu có màu xanh lục tươi, dài từ 3,5 – 5,5 mm và phát triển từ 1 – 3 ngày

Tuổi 4: sâu có màu xanh lục sậm hơn, dài 5,5 – 9 mm, phát triển 1 – 4 ngày, ở cuối tuổi 4 sau khi nhả tơ xong, sâu lột xác lần cuối cùng để thành nhộng

Nhộng: chiều dài 5 – 6 mm, lớn gấp 4 lần chiều rộng Đầu tiên màu trắng hồng đến vàng hồng, với các sọc màu hơi đen gần lưng và gần lỗ thở, đốt bụng thứ 10 có lông hình móc (Nguyễn Quí Hùng, 1995)

1.7.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại

Bướm thuộc họ bướm đêm nhưng ít bị quyến rũ bởi ánh sáng đèn Ban ngày bướm ẩn dưới mặt lá, chiều tối bướm bay ra bắt cặp và đẻ trứng Trứng được đẻ phân tán hay thành từng khóm từ 3 – 5 trứng ở mặt dưới lá, gần gân lá hay chỗ lõm trên lá (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Sâu non mới nở bò lên mặt lá gặm biểu bì tạo thành những đường rãnh nhỏ ngoằn ngoèo Từ tuổi 2, sâu ăn thịt lá để lại lớp biểu bì tạo thành những vết trong mờ Sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì lá làm lá thủng lỗ chỗ, giảm năng suất và chất lượng rau Khi mật độ sâu cao, ruộng rau bị hại xơ xác, chỉ còn trơ lại gân lá Khi bị động sâu thường nhả tơ buông mình xuống đất nên còn được gọi là "sâu dù" (Trần Văn Hai, 2000)

Biện pháp hóa học: Ở nước ta sử dụng thuốc hóa học phòng trị sâu tơ là phổ biến dù rất khó khăn vì sâu kháng thuốc mạnh, do đó phải thay đổi hay pha nhiều loại thuốc với nhau mới diệt được (Trần Thị Ba, Trần Thị Kim Ba và Phạm Hồng Cúc, 1999)

Có thể sử dụng các loại thuốc như: Sherpa 20EC, Regent 800WG, Pegasus 500SC (Trần Khắc Thi và Trần Ngọc Hùng, 2005)

Biện pháp sinh học: Sử dụng các loại thuốc sinh học như: BT, MVP, Dipel 3,2 WP, Aztron 700 DBMU, Xentany 35 WDG (Trần Thị Ba, Trần Thị Kim Ba và Phạm Hồng Cúc, 1999)

1.8 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

* Nguồn gốc, định nghĩa và nguyên lý

Kỹ thuật PCR do Mullis phát minh vào năm 1985 được sử dụng rộng rãi nhất (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ

enzyme polymerase) là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro,

không cần sự hiện diện của tế bào; chỉ với sự hiện diện của một cặp mồi (primers pair) chuyên biệt, enzyme DNA polymerase, các nucleotid tự do, dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002; Phạm Thành Hổ, 2005)

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân Đoạn trình tự DNA đặc trưng sẽ được khuếch đại với số lượng là

2n-1 với n: số chu kỳ phản ứng Theo tính toán sau 30 chu kỳ, số đoạn DNA đặc trưng được khuếch đại là 229