Nghiên cứu sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy nhựa cây tại nhà máy giấy bãi bằng ứng dụng cho sản xuất bột giấy sinh học

Khả năng phân hủy chất trích ly có trong nhựa cây và lignin của các chủng VSV theo thời gian ngâm nguyên liệu gỗ .... Hiện nay, công nghệ sản xuất bột giấy sinh học thân thiện với môi tr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với

TS Phan Thị Hồng Thảo – Trưởng phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm – Bộ môn Sinh thái Môi trường, trường Đại học Khoa học tự nhiên đã hướng dẫn, định hướng và tận tình giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp

Em cũng xin cám ơn các thầy, cô trong Khoa Môi trường và Bộ môn Sinh thái môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng thời gian đào tạo tại đây

Em xin cảm ơn kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học để phân hủy nhựa cây trong dăm mảnh gỗ keo, bạch đàn làm nguyên liệu sản xuất bột giấy thân thiện với môi trường tại Việt Nam”: Mã số:05/HĐ-ĐT.05.18/CNSHCB của TS Phan Thị Hồng Thảo

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2018 Học viên

Trần Anh Tuấn

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG 1

DAN H MỤC HÌN H 1

DANH MỤC VIẾT TẮT 2

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 6

1.1 Nguyên liệu sản xuất giấy và thành phần của nhựa cây 6

1.1.1 Nguyên liệu sản xuất giấy 6

1.1.2.Thành phần của nguyên liệu gỗ 7

1.1.3 Thành phần của nhựa cây 9

1.1.3.1 Axit nhựa 9

1.1.3.2 Axit béo 10

1.1.3.3 Các triglyceride 10

1.1.3.4 Các sterol 11

1.2 Vai trò và ảnh hưởng của nhựa cây trong sản xuất giấy 11

1.2.1 Vai trò của nhựa cây 11

1.2.2 Ảnh hưởng của nhựa cây đến sản xuất giấy 12

1.3 Khái quát về bột giấy sinh học và hiện trạng sản xuất bột giấy sinh học hiện nay 13

1.3.1 Khái quát về bột giấy sinh học 13

1.3.2 Hiện trạng sản xuất bột giấy sinh học hiện nay 15

1.3.2.1 Nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm 15

1.3.2.2.Nghiên cứu trên quy mô công nghiệp 15

1.4 Các phương pháp hạn chế ảnh hưởng của nhựa cây đến sản xuất giấy 18

1.5 Ứng dụng vi sinh vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu gỗ 19

1.5.1 Hệ enzym phân hủy nhựa cây 19

1.5.1.1.Laccase 19

1.5.1.2 Sterol esterase 20

1.5.2 Vi sinh vật phân hủy nhựa cây 21

1.5.2.1 Nấm phân hủy nhựa 22

1.5.2.2 Vi khuẩn phân huỷ nhựa cây 23

1.5.2.3 Xạ khuẩn phân hủy nhựa cây 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.1.2 Hóa chất thiết bị 26

2.1.2.1 Hóa chất 26

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị 26

2.1.3 Môi trường 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 28

2.2.2 Phương pháp phân lập và sàng lọc 28

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzym 28

2.2.3.1 Khả năng sinh tổng hợp các enzym ngoại bào 28

2.2.3.2 Phương pháp nuôi cấy và thu enzym 28

2.2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính lignin peroxidase 29

2.2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính mangan peroxidase 30

2.3.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzym esterase 31

2.3.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính laccase 32

2.3.3.7 Phương pháp xác định cellulase 33

2.3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng các chất trích ly 34

2.3.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 34

2.3.4.1 Quan sát màu sắc của hệ sợi kí sinh 34

2.2.4.2 Quan sát cuống sinh bào tử 35

2.2.4.3 Tách chiết DNA và phân tích trình tự gene 16S rRNA 35

2.2.5 Xác định hàm lượng lignin: TAPPI T 222 om – 02, TAPPI T 222 om- 98 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy lignin và nhựa cây từ các mẫu vật liệu nghiên cứu 37

3.2 Phân lập các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn thường có khả năng phân hủy lignin và nhựa cây 40

3.3 Phân lập các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân huỷ lignin và

nhựa cây 45

3.4 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng VSV tuyển chọn 50

3.4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của chủng VSV sau 14 ngày nuôi cấy 50

3.4.2 Khảo sát dải nhiệt độ và pH sinh trưởng của chủng VSV tuyển chọn 50

3.4.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và pH 50

3.4.2.2 Đặc điểm nuôi cấy trên các môi trường 52

3.5 Định danh chủng VSV tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử 54

3.6 Bước đầu ứng dụng chủng VSV tuyển chọn trong phân hủy nhựa cây và lignin trong nguyên liệu sản xuất giấy 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần chất trích ly trong gỗ bạch đàn và g ỗ keo 8

Bảng 2.1 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính lignin peroxidase 29

Bảng 2.2 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính mangan peroxidase 30

Bảng 2.3 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính esterase 31

Bảng 2.4 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính laccase 32

Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ 19 mẫu mùn đất 38

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra khả năng sinh trưởng trên môi trường Czapek lỏng chứa stigmas sterol 42

Bảng 3.3 Kết quả hoạt tính enzym phân hủy lignin và phân hủy nhựa cây của một số chủng VSV phân lập ở 30 o C 43

Bảng 3.4 Kết quả hoạt tính enzym phân huỷ lignin và nhựa cây trên môi trường lỏng của một số chủng xạ khuẩn tuyển chọn 44

Bảng 3.5 Kết quả khả năng phát triển trên môi trường khoáng chỉ có stigmas sterol 45

Bảng 3.6 Kết quả hoạt tính enzym phân hủy lignin và nhựa cây của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt/ưa nhiệt 48

Bảng 3.7 Kết quả hoạt tính enzym phân hủy lignin và nhựa cây của các chủng xạ khuẩn chịu nhiệt/ưa nhiệt 49

Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào sau 14 ngày nuôi cấy 50

Bảng 3.11 Đặc điểm nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh CX9 trên một số môi trường 52 Bảng 3.11 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng CX9 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự nucleotide của gen16S rDNA 55

Bảng 3.12 So sánh đặc điểm sinh học của chủng CX9 và chủng Streptomycesthermoviolaceusđã công bố 56

Bảng 3.13 Kết quả khả năng loại nhựa cây, lignin và ảnh hưởng của các chủng xạ khuẩn lên khả năng thu hồi cellulose c ủa các mẫu gỗ 57

Bảng 3.14 Khả năng phân hủy chất trích ly có trong nhựa cây và lignin của các chủng VSV theo thời gian ngâm nguyên liệu gỗ 59

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của một axit nhựa (axit abietic) 10

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của axit palmitic, axit stearic và axit oleic 10

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của một triglyceride 11 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của một sterol 11 Hình 3.1 Hình ảnh một số mẫu mùn đât thu nhận tại nhà máy giấy Bãi Bằng 37 Hình 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi trường Czapek có chứa stigmas sterol 37 Hình 3.3 Kết quả phân lập xạ khuẩn và vi khuẩn trên môi trường Czapek có chứa lignin ở 37 o C và 50 o C sau 5 ngày 38 Hình 3.4 Kết quả kiểm tra khả năng phân hủy lignin trên môi trường có bổ sung 500mg/L tanic 41 Hình 3.5 Kết quả kiểm tra khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn trên môi trường stigmas sterol lỏng 41 Hình 3.6 Kết quả khả năng phân hủy cellulase của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập 47 Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn CX9 52 Hình 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn CX9 trên một số môi trường nuôi cấy 53 Hình 3.9 Hình ảnh cuống sinh bào tử chủng CX9 dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần) 54 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR của CX9 trên gel agarose 1% M: Thang DNA chuẩn; 1 và 2 là sản phẩm PCR 54 Hình 3.11 Gỗ keo sau khi được ngâm 14 ngày bằng chủng xạ khuẩn CX9 59

DANH MỤC VIẾT TẮT

Từ viết tắt

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)

MỞ ĐẦU Giấy là một trong những nguyên liệu không thể thiếu của ngành công nghiệp không chỉ ở Việt Nam mà còn ở trên toàn thế giới Giấy có thể sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau trong cuộc sống Khoa học công nghệ hiện đại cho phép con người sử dụng nhiều phương tiện để truyền thông tin, tuy nhiên, giấy vẫn là công cụ quan trọng trong việc lưu trữ thông tin, văn bản Ngoài ra, sử dụng giấy gói có thể làm giảm lượng túi nilon, góp phần bảo vệ môi trường Với mục đích sử dụng và lợi ích hiện có, ngành giấy Việt Nam đóng góp vào bình quân mỗi năm 2,5% GDP cho

cả nước

Tuy nhiên, bên cạnh những mặt tích cực, ngành công nghiệp giấy cũng đang phải đối mặt với những vấn đề môi trường trong quá trình sản xuất Trong đó, nhựa cây và lignin là những thành phần không mong muốn của quá trình, là nguyên nhân của việc giảm hiệu quả vận hành thiết bị, giảm năng suất, tiêu tốn nhiên liệu, giảm độ bền sợi giấy Trong các nhà máy sản xuất giấy, nhựa cây phân tán vào nước có xu hướng kết hợp với các thành phần khác của hệ thống tạo các khối đen kết tủa, làm ứ đọng ống, bề mặt, bể chứa thiết bị Cùng với thời gian, kích thước hạt kết tủa sẽ ngày một lớn, có thể làm giảm chất lượng của giấy sản xuất

Hiện nay, công nghệ sản xuất bột giấy sinh học thân thiện với môi trường sử dụng các enzym phân giải lignin và nhựa cây cho phép nâng cao chất lượng giấy và giảm thiểu các nguồn ô nhiễm trong công nghiệp giấy đã được thực hiện ở nhiều quốc gia Các nghiên cứu về công nghệ sinh học để xử lý nhựa cây đang ngày một quan tâm Tuy nhiên, cho tới nay, các nghiên cứu về sản xuất bột giấy sinh học tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Nhằm đánh giá được cơ hội và khả năng sản xuất các enzym phân hủy nhựa cây và lignin cho sản xuất bột giấy sinh học tại Việt Nam,

đề xuất cần thiết phải thực hiện đề tài: Nghiên cứu sàng lọc các chủng vi sinh vật có

khả năng phân hủy nhựa cây tại nhà máy giấy Bãi Bằng ứng dụng cho sản xuất bột giấy sinh học

a Mục tiêu của đề tài:

- Xác định và tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân hủy lignin và nhựa cây phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất bột giấy sinh học thân thiện với môi trường

b Đối tượng nghiên cứu:

- Các mẫu bùn đất, gỗ mục, dăm mảnh, vỏ cây lấy tại nhà máy giấy Bãi Bằng thuộc tổng công ty giấy Việt Nam

c Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy lignin và nhựa cây từ các mẫu vật liệu nghiên cứu

- Phân lập các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn thường có khả năng phân hủy lignin và nhựa cây

- Phân lập các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân huỷ lignin

và nhựa cây

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng VSV tuyển chọn

- Định danh chủng VSV tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử

- Bước đầu ứng dụng chủng VSV tuyển chọn trong phân hủy nhựa cây và lignin trong nguyên liệu sản xuất giấy

d Đóng góp mới của đề tài:

- Có những số liệu mới về các chủng VSV có khả năng phân hủy nhựa cây và lignin phục vụ cho sản xuất bột giấy sinh học tại Việt Nam

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Nguyên liệu sản xuất giấy và thành phần của nhựa cây

1.1.1 Nguyên liệu sản xuất giấy

Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất giấy là gỗ, phổ biến là gỗ thông, vân sam, bạch dương, keo, mỡ, bồ đề, bạch đàn v.v Tuy nhiên, đặc biệt ở các nước nhiệt đới, nguồn nguyên liệu gỗ không đủ đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của sự gia tăng dân số, nâng cao dần chất lượng giấy phục vụ cho giáo dục và cải thiện vệ sinh môi trường chung [47] Do vậy, các nguyên liệu thực vật phi gỗ bao gồm phụ phẩm nông nghiệp và cây trồng phi nông nghiệp như kenaf, cây cao lương hoặc chuối cũng đã

và đang được sử dụng [51]

Gỗ nguyên liệu trong sản xuất giấy công nghiệp được chia làm hai loại: gỗ cứng

và gỗ mềm Hiện nay, có khoảng hơn 12 loài cây có gỗ được sử dụng cho sản xuất bột giấy Những loài cây này được tìm thấy khắp nơi trên các đồn điền trên toàn thế giới, tuy nhiên không phải lúc nào cũng thuận lợi cho việc nâng cao chất lượng sợi giấy, thành phần gỗ và khả năng lai tạo.Eucalyptus camaldulensis (bạch đàn) và Acacia mangium (keo) hiện là những nguyên liệu gỗ rừng chiếm ưu thế trong ngày sản xuất bột giấy tại Đông Nam Á [39] Bạch đàn được biết đến là nguồn nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất bột giấy trên thế giới, với ưu thế về khả năng phát triển tốt, đặc tính của thân cây phù hợp, đặc tính sinh trắc học của hệ sợi cùng với cho chất lượng giấy tốt, là nguyên liệu được sử dụng nhiều nhất tại các khu vực nhiệt đới [56] Cây keo là một trong những loài thân gỗ được trồng phổ biến ở khu vực châu Á và châu Đại Dương, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á và Australia Với khả năng sinh trưởng nhanh cùng sự thích nghi tốt trong môi trường đất đồi, cây keo đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển trong lĩnh vực lâm nghiệp bền vững Nhiều nghiên cứu cho thấy đối với ngành sản xuất giấy, cây keo có tiềm năng sử dụng cao do cho năng suất sợi tốt, thích hợp để thu được bề mặt sợi giấy sáng mịn

và năng suất bột giấy lớn[59] Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lê Đình Kha và Hà

Huy Thịnh (2016) nhận thấy được khả năng cao trong sản xuất bột giấy và cải tạo đất của cây keo lai[46] Theo Trần Văn Độ và cộng sự (2018) cũng nhận định rằng cây keo là nguồn nguyên liệu chính cho ngành sản xuất giấy và bột giấy tại Việt Nam [73]

1.1.2.Thành phần của nguyên liệu gỗ

Gỗ có cấu tạo chủ yếu từ cellulose, hemicellulose và lignin, cùng với tỷ lệ nhỏ hơn các chất các chất trích ly (nhựa cây), chất béo và nước Hàm lượng các chất trong gỗ lần lượt là cellulose (40-50%), hemicellulose (20-30%), lignin (20-35%), chất trích ly (0-10%) [55] Cellulose chiếm phần lớn trong thành phần gỗ, khoảng 42,2 %, là polymer mạch thẳng của các đơn vị cellobiose Hemicellulose chiếm khoảng 20-25% là hỗn hợp các polysacceride phân nhánh được tạo thành bởi các monosacceride Lignin chiếm khoảng 20-25% là polymer của các rượu p- coumaryl,coniferyl và sinapyl [20] Chất trích ly từ gỗ có thành phần cấu tạo lipophilic phi gỗ chủ yếu bao gồm có axit béo, axit nhựa, sáp, rượu, terpen, sterol, este sterol và glyceride[22]

Sản xuất bột giấy là các quá trình hóa học, cơ học, hóa – cơ học hay nhiệt cơ học phân tách các sợi cellulose ra khỏi lignin và hemicellulose từ các nguyên liệu gỗ (hoặc phi gỗ) [36] Trong quá trình sản xuất giấy, cellulose, lignin, hemicellulose là các thành phần được quan tâm chủ yếu Lignin bị đốt cháy phần lớn để trở thành năng lượng được sử dụng trong quá trình sản xuất Khi được nghiên cứu rõ về tính chất hóa học, hiện nay lignin phần lớn được sử dụng như phần chất thải để làm chất đốt, ngoài ra còn là một nguồn nguyên liệu cho các sản phẩm hóa học mới Các quá trình sản xuất bột giấy cần phải loại bỏ càng nhiều lignin càng tốt để có thể giữ lại được độ bền mạch gỗ, giải phóng sợi cellulose và tránh làm đổi màu giấy sản xuất Hemicellulose đóng vai trò quan trọng trong các liên kết sợi của mạch gỗ, là thành phần cần loại bỏ để làm tăng chất lượng sợi giấy Các chất trích ly (ví dụ,

oleoresins và sáp) không có tác dụng trong việc làm tăng chất lượng giấy sản xuấtcũng được loại bỏ[12].

0

0

0 229,0

1379,9 40,6

0 64,7 221,2

0 1706,4 Hợp chất thơm

Axit cinnamic

Hợp chất khác

Tổng

0 38,1 38,1

7,5

0 7,5 Rượu béo mạch dài

>C20

Tổng

0 38,9

1616,8 1625,97

1.1.3 Thành phần của nhựa cây

Chất trích ly, hay còn gọi là nhựa cây, là các hợp chất hữu cơ trong gỗ có hàm lượng phân tử thấp, bao gồm axit béo, axit nhựa, sáp và terpen [6] Các chất trích ly xuất hiện trong ruột gỗ nhiều hơn trong dác gỗ, ngoài ra còn có thể tìm thấy

ở trong các tia gỗ, thớ gỗ, mạch gỗ Các thớ gỗ ở càng ngoài lõi thì sự xuất hiện của các chất trích ly càng cao Các chất trích ly cũng có thể hình thành như một lớp phủ trên thành tế bào nên chúng có ảnh hưởng đến một số tính chất bề mặt của gỗ Ngoài ra, trong các mao mạch gỗ cũng có sự xuất hiện của chất trích ly, chiếm khoảng từ 2-6 nm kích thước mao mạch Trong gỗ hàm lượng nhựa chiếm từ 1,6– 3,1 % trọng lượng gỗ khô [ 35 ]

1.1.3.1 Axit nhựa

Các axit nhựa có cấu trúc bao gồm một nhóm cacbon ưa béo và một nhóm carboxyl ưa nước, có cấu trúc 3 vòng và cấu trúc này điển hình cho tất cả các axit béo khác Cấu trúc vòng này cùng dạng với abietan hoặc primaran Hàm lượng lớn axit nhựa là nguyên nhân của các quá trình lắng đọng trong hệ thống sản xuất giấy.[23]

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của một axit nhựa (axit abietic)

1.1.3.2 Axit béo

Axit béo là một chuỗi axit monocacbon béo có độ dài từ 10-24 nguyên tử cacbon, có thể là bão hòa hoặc không bão hòa Các axit béo bão hòa có tính chất hóa học rất ổn định trong khi các liên kết đôi trong axit béo không bão hòa thường

dễ bị oxi hóa trong các phản ứng cộng.[23]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của axit palmitic, axit stearic và axit oleic

1.1.3.3 Các triglyceride

Triglyceride là một loại chất béo được tạo thành bởi một phân tử glycerol và

ba axit béo Các liên kết este được hình thành khi các nhóm cacboxyl của các axit béo kết nối với các nhóm hydroxyl của glyxerol Một lượng lớn các chất này được

tìm thấy trong lõi gỗ và rất có khả năng một số các axit béo này chuyển hóa thành các hợp chất phenol như pinosylvin và pinosylvin monomethylether.[23]

Hình 1.3.Cấu trúc phân tử của một triglyceride

1.1.3.4 Các sterol

Sterol là hợp chất oxy phổ thông, với cấu trúc bao gồm các nhóm hydroxyl tạo thành Sterol rất khó thể loại bỏ trong quá trình sản xuất bột giấy do cấu tạo hóa học rất bền vững Sterol phổ biến nhất trong gỗ là β-sitosterol [23]

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của một sterol 1.2 Vai trò và ảnh hưởng của nhựa cây trong sản xuất giấy

1.2.1 Vai trò của nhựa cây

Chất trích ly, hay nhựa cây là chất chuyển hóa thứ cấp, đóng vai trò quan trọng trong nhiều khía cạnh, chức năng của đời sống thực vật Độ bền tự nhiên của gỗ có liên quan mật thiết đến độc tính của các chất trích ly Các chất trích ly có thể bảo vệ

gỗ cây trước sự tấn công của các sinh vật phân hủy, cũng như tăng tính vững chắc của độ bền gỗ tự nhiên, ngoài ra còn có thể chống nấm và các phản ứng oxi hóa kép

có liên quan Độ bền của gỗ tự nhiên có thể bị giảm xuống và dễ dàng bị mốc thối nếu loại bỏ thành phần chất trích ly [52]

Chất trích ly là nhân tố chính góp phần tạo ra màu sắc, mùi hương của gỗ Một

số chất trích ly còn có hoạt tính sinh học nên từ lâu nhiều loại gỗ đã được dùng làm dược liệu hoặc làm thuốc Trong công nghiệp chế biến đồ dùng từ gỗ, chất trích ly

có ảnh hưởng đến quá trình sấy khô, khả năng kết dính, tính hút ẩm và âm thanh của gỗ [43] Trong ngành sản xuất vật liệu từ chất dẻo, ngành xây dựng, công nghiệp ô tô, gỗ được sử dụng như một thành phần gia cố, tuy nhiên, hàm lượng nhựa trong gỗ cao có thể dẫn đến những tính chất không mong muốn của vật liệu composite [57]

1.2.2 Ảnh hưởng của nhựa cây đến sản xuất giấy

Đối với sản xuất bột giấy, nhựa cây và lignin là thành phần không mong muốn

và phải được loại bỏ càng triệt để càng tốt Nhựa cây chứa các lực London-Van der Wahl, do đó chúng chỉ đóng góp khoảng 20% năng lượng trong các liên kết hydro

mà cellulose tạo ra Lượng nhựa cây càng lớn, tổng lực liên kết giữa các lớp cellulose tạo ra càng yếu, sản phẩm giấy có chất lượng càng giảm [25] Ngoài ra, nước thải của quá trình sản xuất bột giấy trong chu trình Kraft chứa hỗn hợp phức tạp các hợp chất clo hóa và không clo hóa của lignin và các hợp chất trích ly từ gỗ,

là nguyên nhân dẫn đến màu đen của nước thải Nước thải này có thể ảnh hưởng đến chất lượng về mặt sinh học của nước tiếp nhận, là nguyên nhân của một số bệnh gây chết cho động vật thủy sinh trong môi trường nước [13] Phần cặn trong nước thải của quá trình tẩy mực trong hệ thống chủ yếu là các hợp chất trích ly và rất khó xử lý [50]

Ngoài ra, rất nhiều tác hại gây ra bởi các hợp chất có liên quan tới nhựa cây đã được nghiên cứu Việc làm sạch không hoàn toàn các chất trích ly có thể gây ra sự

hư hại của hệ thống, ảnh hưởng đến chất lượng của giấy và giảm sản lượng, tổn hại đến kinh phí sản xuất Chúng có thể lắng đọng trên nhiều bộ phận của hệ thống làm giấy như dây điện, cuộn giấy, các hệ thống xi lanh, tua bin Do một số điều kiện

nhiệt độ và áp suất, các hợp chất trích ly có thể dính trên bề mặt giấy, làm ảnh hưởng đến đến chất lượng giấy khi in ấn.[13]

1.3 Khái quát về bột giấy sinh học và hiện trạng sản xuất bột giấy sinh học hiện

nay

1.3.1 Khái quát về bột giấy sinh học

Trong phương thức sản xuất giấy, gỗ nguyên liệu đầu tiên được chuyển hóa thành dạng bột Sản xuất bột giấy là quá trình xử lý gỗ nguyên liệu thành các sợi cellulose Hệ thống sản xuất bột giấy hiện nay có thể chia ra làm hai loại phổ biến: sản xuất bột giấy hóa học và sản xuất bột giấy cơ học Quá trình sản xuất bột giấy hóa học có liên quan đến việc sử dụng hóa chất hòa tan lignin trong thành mạch gỗ

để giải phóng các sợi cellulose Sản xuất bột giấy hóa học có hiệu suất sản xuất thấp (khoảng 50%) với chi phí xử lý chất thải và tái chế hóa học cao; tuy nhiên, chất lượng bột giấy lại tốt Sản xuất bột giấy cơ học liên quan đến các tác động vật lý để tách các sợi cellulose Quá trình sản xuất bột giấy cơ học có hiệu suất cao (trên 95%) nhưng thành phần bột giấy không bền, độ đổi màu cao và độ sáng thấp Do

đó, các hệ thống sản xuất bột giấy phổ biến hiện nay đều gặp các vấn đề liên quan đến độ bền của bột giấy và hiệu suất hệ thống Các công nghệ sản xuất bột giấy thường phối hợp sử dụng cả hai quá trình cơ học và hóa học [11]

Bột giấy sinh học là quá trình sử dụng các chủng VSV để tiền xử lý dăm mảnh

gỗ nguyên liệu dùng cho sản xuất bột giấy cơ học hoặc bột giấy hóa học Khái niệm này dựa trên khả năng phân hủy lignin có chọn lọc trong gỗ của các chủng VSV để

có thể giữ lại tương đối nguyên vẹn mạch cellulose Quá trình sản xuất bột giấy sinh học là một công nghệ thân thiện với môi trường, làm tăng đáng kể thông lượng của máy nghiền hoặc giảm năng lượng tiêu thụ của hệ thống Ngoài ra, sản xuất bột giấy theo phương pháp sinh học còn làm tăng chất lượng và độ sáng của giấy, giúp giảm lượng bột giấy Kraft nguyên liệu đưa vào hệ thống [13]

Một số ưu điểm của quá trình sản xuất bột giấy sinh học bao gồm [68]:

- Tốc độ tăng trưởng của VSV nhanh

- Khả năng phát triển đồng đều của VSV trên cả gỗ cứng lẫn gỗ mềm

- VSV ưu tiên phân hủy hemicellulose và lignin đầu tiên và giữ nguyên vẹn sợi cellulose

- Đảm bảo sức khỏe cho người công nhân trong xí nghiệp bột giấy, không gây dị ứng bởi hóa chất

Việc sử dụng phương pháp sản xuất bột giấy sinh học chịu ảnh hưởng bắt buộc bởi các yếu tố như chủng VSV, thành phần dinh dưỡng, độ ẩm, độ sục khí, pH và nhiệt độ Ngoài ra, các yếu tố cơ học như bóc vỏ và đánh thành dăm mảnh gỗ, khử trùng, làm mát và bổ sung dung dịch có chứa VSV ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất quá trình Kích thước của dăm mảnh gỗ ảnh hưởng đến hiệu suất của VSV tiền xử

lý Kích thước gỗ quá lớn có thể ngăn cản sự xâm nhập của VSV vào khối cellulose cũng như ngăn cản sự khuếch tán của không khí, nước và chất chuyển hóa trung gian trong gỗ nguyên liệu Kích thước mảnh gỗ quá bé sẽ ngăn cản đến sự lưu thông không khí giữa các dăm mảnh với nhau Trong khi đó, khử trùng dăm mảnh

gỗ bằng hơi nước là quá trình loại bỏ tự nhiên các VSV cạnh tranh Gỗ chỉ cần khử trùng trong thời gian ngắn là các VSV lựa chọn có thể vượt trội hơn so với sinh vật ban đầu trong gỗ Ngoài ra, việc khử trùng sẽ giảm việc tốn kém hóa chất, như natri biosulfite, natri meta-bisulfite và natri hydrosulfite Tiệt trùng và làm mát sinh khối

gỗ là quá trình quan trọng thực hiện trước khi cấy các VSV lên gỗ Các chủng VSV chọn lọc thường không có khả năng sinh trưởng trực tiếp trên gỗ Vì vậy, một mức tối thiểu sinh khối cung cấp cần được sử dụng thông qua các môi trường lỏng hoặc agar Dăm mảnh gỗ khi ủ từ 7 đến 14 ngày cần bổ sung thêm một số chất hỗ trợ như

Mn 2+ , H 2 O 2 và các hợp chất thơm, có khả năng kích thích sinh tổng hợp các hệ

enzym phân hủy Các dăm mảnh được xử lý này dễ bị tách rời ra trong quá trình tiếp theo và tạo ra các sợi cellulose nguyên vẹn [68]

1.3.2 Hiện trạng sản xuất bột giấy sinh học hiện nay

1.3.2.1 Nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm

Các nghiên cứu trong quy mô phòng thí nghiệm tập trung vào các chủng nấm mốc trắng Chúng không chỉ cung cấp đầy đủ các enzym có khả năng phân hủy lignin mà chúng còn có tác dụng vận chuyển các enzym này đi sâu vào thành mạch

gỗ một cách dễ dàng thông qua hệ thống sợi nấm và tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứngenzym [12] Các chủng VSV có khả năng phân hủy lignin có thể dễ dàng phát triển nhanh chóng trên bề mặt dăm mảnh gỗ

Nghiên cứu đầu tiên về việc phân lập các chủng nấm được thực hiện bởi Eriksson (1980) [24] và Barlev (1992) [14][42] xác định được chủng Rigidoporus ulmaris có hiệu quả trong việc xử lý dăm mảnh gỗ Sau nhiều năm tiếp theo, nhiều chủng nấm đã được sàng lọc bao gồm Hypodontia setulosa, Phlebia brevispora, Phlebia subserialis, Phlebia tremellosa và Ceriporiopsis subvermispora Cho đến nay, khoảng 200 chủng VSV đã được phân lập có khả năng tham gia vào quá trình sản xuất bột giấy sinh học

1.3.2.2 Nghiên cứu trên quy mô công nghiệp

Việc sử dụng nấm để phân hủy lignin trong gỗ được thực hiện đầu tiên trong công nghiệp tại Công ty giấy Tây Virginia vào những năm 1950 [45] Họ đã công bố kết quả bao gồm 72 chủng nấm có khả năng phân hủy lignin, sơ lược về những kiến thức liên quan đến sự suy giảm lignin bởi các chủng nấm Các chủng nấm được sử dụng với ứng dụng đầu tiên như một “chất khử mùi gỗ” hiệu quả trong quá trình nghiền Các nghiên cứu trong những năm tiếp theo hướng tới các biến đổi có chọn lọc hơn trong sự phân hủy lignin của các chủng nấm khác nhau

Hiệp hội Biopulping Consortium đã tiến hành thử nghiệm thành công sản xuất bột giấy sinh học trong quy mô lớn hơn 100 tấn dăm mảnh gỗ ngoài trời tại FPL- USDA, Madison, WI [11].Việc sử dụng chủng nấm chọn lọc trong quy trình sản xuất bột giấy giúp tiết kiệm 32% năng lượng điện[7][8 ] Sự nhiễm VSV trên bề mặt dăm mảnh được kiểm soát bằng cách tiếp xúc ngắn thông qua quá trình đưa dăm mảnh qua hệ thống hơi nước trước khi bổ sung các chất cấy nấm dựa trên nghiên cứu của Scott (1997) [63] Phân tích lợi ích kinh tế của nghiên cứu cho thấy một thiết kế nhà máy được đề xuất thực hiện có thể tiết kiệm khoảng 10 USD/tấn và 25% lợi nhuận ròng

Loại bỏ hàm lượng chất trích ly là một vấn đề quan trọng trong sản xuất giấy

và bột giấy, và là ví dụ đầu tiên của việc ứng dụng công nghệ VSV cung cấp các giải pháp thành công trong lĩnh vực công nghiệp này [31] Các nghiên cứu về khả năng loại bỏ nhựa cây trong hệ thống sản xuất bột giấy bằng phương pháp sinh học cũng được tiến hành đồng thời Guerra và đồng nghiệp (2005) [27] nghiên cứu xử lý dăm

gỗ bạch đàn bằng nấm mục trắng C Subvermispora trong nồi hấp dung lích 100L trong vòng 15 ngày Việc xử lý sinh học một cách có chọn lọc cho kết quả giảm được một lượng 7,6% lignin và đặc biệt loại bỏ đồng thời cả nhựa cây lên tới 17,7% Nghiên cứu của Bajpal và cộng sự (2004) [10] sử dụng chủng C subvermispora và

P chrysosporium có thể loại bỏ được lượng nhựa cây từ 33,4 - 40% đối với nguyên liệu gỗ thông, vân sam và gỗ keo sau 4 tuần Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2002) [78] sử dụng hệ enzym laccase sản xuất từ chủng nấm mục trắng Trametes versicolor cho hiệu quả giảm lượng chất trích ly có trong nước tẩy trắng bột giấy và nước thải đầu ra lần lượt là 50% và 40% Nghiên cứu của Widsten (2004) [76] cũng cho thấy sử dụng hệ enzym laccase kết hợp với các biện pháp sinh học khác có thể giảm tới 82% lượng chất trích ly và lignin có trong nước thải sản xuất bột giấy

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về ứng dụng công nghệ sinh học vào trong ngành sản xuất giấy tập trung vào sản xuất một số hệ enzym đặc thù từ một số chủng VSV chọn lọc Một số nghiên cứu tiêu biểu bao gồm: tạo ra chế phẩm enzym laccase từ chủng Treames Versicolor Mn-Peroxidase từ nấm sợi FBH 11, ứng dụng cho tách loại lignin trong gỗ cứng của Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Phân lập và tuyển chọn ligninase từ chủng Aspergillus flavus mannanase ứng dụng cho tẩy trắng bột giấy của Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội [1]… Nghiên cứu của

Vũ Văn Lợi (2013) xác định được chủng xạ khuẩn Streptomyces Chartreusis CP23X9 sinh xylanase có thể ứng dụng cho ngành sản xuất giấy [5] Nghiên cứu của Lê Quang Điển (2013) sử dụng sản phẩm enzym thương phẩm FibreZyme LBR của hãng Dyatic International dùng cho việc hỗ trợ nghiền hỗn hợp bột giấy cho kết quả giảm thời gian nghiền bột, cải thiện một số tính chất của cơ lý học của bột giấy [4] Năm 2014, Viện Công nghiệp Giấy và Xenluylo được Bộ Công thương giao thực hiện nhiệm vụ khoa học cùng với thạc sỹ Đỗ Thanh Tú thực hiện đề tài: “Nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật để giảm hàm lượng nhựa cây có trong nguyên liệu gỗ cứng dùng cho sản xuất giấy” Qua thời gian nghiên cứu, kết quả cho thấy sử dụng chế phẩm sinh học nấm Cartapip 97 với mức dùng là 5g nấm/ 1 tấn nguyên liệu khô tuyệt đối để bảo quản nguyên liệu trong vòng 14 ngày giảm hàm lượng nhựa trên bạch đàn là 51% và keo là 48%, độ trắng của bột giấy đạt chất lượng hơn 84% so với chuẩn ISO Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học thương phẩm để phân hủy nhựa cây trong dăm mảnh gỗ nguyên liệu ở quy mô công nghiệp” được Viện Công nghiệp Giấy và Xenluylo được Bộ Công thương giao thực hiện với mục tiêu là xác lập được quy trình công nghệ xử lý dăm mảnh gỗ (keo, bạch đàn) bằng chế phẩm sinh học thương phẩm để giảm hàm lượng nhựa ở quy mô công nghiệp [3] Kết quả của đề tài cho thấy hàm lượng nhựa nguyên liệu giảm 17,70% so với mẫu đối chứng, 34,10% so với nguyên liệu ban đầu (mùa Xuân) và giảm 22,04% so với

mẫu đối chứng, 34,98% so với nguyên liệu ban đầu (mùa Thu) Quá trình xử lý chế phẩm sinh học hoàn toàn không có tác động lớn đến vấn đề môi trường Các chỉ tiêu nước thải, vi sinh trong nước thải hầu như tương đương so với mẫu đối chứng [2] 1.4 Các phương pháp hạn chế ảnh hưởng của nhựa cây đến sản xuất giấy

Hiện nay, biện pháp để hạn chế lượng nhựa cây (chất béo và axit nhựa) trong các hệ thống sản xuất giấy thông qua việc gia tăng nhiệt độ hệ thống trong chu trình Kraft, được gọi là nhiệt độ Kraft hoặc điểm Kraft Tại nhiệt độ này, các axit béo tồn tại chủ yếu ở dạng monomer, độ hòa tan của các axit béo sẽ tăng lên đáng kể Chiều dài phân tử của các axit béo cũng sẽ bị giảm xuống trong khi các liên kết đôi được hình thành ngày một gia tăng (làm tăng độ hòa tan trong nước của các axit béo) Các mixen sẽ được hình thành, được mô tả với cấu trúc bao gồm tổng hợp bởi số lượng lớn các anion xà phòng, các chuỗi cacbon kị nước sắp xếp dưới dạng hình cầu, trong khi nhóm cacboxyl ưa nước được tiếp xúc với bề mặt chất lỏng Phương pháp này có thể giảm được một lượng khoảng 18% cả axit abietate vàaxit oleate, trong khi với hỗn hợp axit abietate vàaxit oleate có tỉ lệ 1:1, lượng giảm có thể lên đến 40% [49]

Trong quá trình nấu bột giấy Kraft, các axit béo tự do và nhựa có thể một phần

bị loại bỏ trong điều kiện nhiệt độ cao Thành phần của nhựa cây (chủ yếu là axit béo) bị thay đổi, chuyển thành đồng phân của axit levopiravic và axit abietic Hiện nay, trong quá trình nấu, hệ thống không nhất thiết phải loại bỏ các axit béo do chúng bị đốt cháy trong điều kiện nấu vào khoảng 110 o C Trong trường hợp này, các ion như canxi, sau đó là kali, đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát hàm lượng nhựa cây trong quá trình làm bột giấy Các ion canxi liên kết với các nhóm trao đổi ion (các nhóm axit béo) để tạo thành hợp chất muối giữa canxi và gốc axit béo Khả năng để tạo thành hợp chất muối này phụ thuộc vào độ dài và số lượng liên kết đôi trong mạch cacbon của axit béo Các axit béo không bão hòa có khả

năng tạo thành hợp chất muối canxi-axit béo khó tan nhất Mạch cacbon của axit béo càng ngắn thì nhiệt độ phân hủy của axit béo đó càng cao Trong suốt quá trình rửa bột giấy, các axit nhựa không có khả năng tạo muối với gốc canxi để tạo thành muối, bị loại bỏ hiệu quả Lignin hòa tan trong chu trình Kraft cũng có ảnh hưởng đến sự khử, đóng vai trò hoạt động như một chất phân tán Nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã chỉ ra được khả năng ức chế tạo thành muối canxi-axít béo bằng việc bổ sung thêm Kraft lignin.[49]

Ngoài ra, để cải thiện khả năng giảm hàm lượng nhựa cây, hệ thống sản xuất

áp dụng thêm các phương pháp như (1) oxy hóa nhựa cây, chủ yếu thông qua quá trình tự oxi hóa và một phần do trao đổi chất (2) thủy phân glyceride và các este (3)

sử dụng hệ VSV để làm giảm nhựa cây Quá trình oxi hóa các axit béo không bão hòa giúp cho thành phần nhựa gỗ ưa nước hơn, trong khi việc thủy phân glyceride

và các este do sự hoạt động của một số loại enzym, chủ yếu là lipase

1.5 Ứng dụng vi sinh vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu gỗ

1.5.1 Hệ enzym phân hủy nhựa cây

1.5.1.1 Laccase

Laccase (p-benzonediol: oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) là nhóm enzym oxi hóa có trong nhiều loại thực vật, nấm và VSV Các enzym này có thành phần 15- 30% carbohydrate và khối lượng phân tử từ 60–90 kDa Cấu trúc của laccase bao gồm các glycosyl hóa polyphenol oxidase chứa 4 ion đồng trên mỗi phân tử để thực hiệnquá trình oxy hóa điện tử phenolic và hợp chất có liên quan của nó Enzym laccase hoạt động tốt ở phổ pH từ 4-6, bền ở nhiệt độ 30 o C-50 o C và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ 60 o C Chúng đã được nghiên cứu từ các chủng Ascomyceteous, Deuteromycteous và nấm Basidiomycetous[66] Laccase đóng vai trò sinh tổng hợp và phân hủy lignin, sắc tố, Chúng có nhiều ứng dụng quan trọng bao gồm tẩy trắng bột giấy, xử lý sinh học, và công nghệ cảm biến sinh học[75]

Laccase có thể phá hủy các axit béo, nhựa cây bằng cách phá vỡ một vài liên kết đôi và các axit nhựa chứa trong cấu trúc liên hợp Zhang và cộng sự (2002)[78] đưa ra kết quả sử dụng enzym laccase có thể giảm 20-35% lượng trilinolein sau 3 giờ Nghiên cứu của Karlsson (2001) [40] cho thấy sử dụng enzym laccase có khả năng gây ra sự phân hủy 20% lượng axit béo đa không bão hòa sau 4 giờ và 29% lượng axit nhựa liên hợp.Trong phản ứng của trilonolein, các sản phẩm chủ yếu gồm có monohydroperoxide, bishydroperoxide và epoxit Báo cáo c ủa Gutiérrez (2006)[30] cho thấy hiệu quả cao của hệ thống sử dụng laccase hỗ trợ cho việc loại

bỏ nhựa cây có trong bột giấy có nguồn gốc khác nhau trong hầu hết các quá trình như nghiền, tạo nguyên liệu Laccase từ chủng vi khuẩn Pycnoporus cinnabarinus cùng với sự xuất hiện của chất nền là HBT (-1-hydroxybenzotriazole) rất có hiệu quả trong việc xử lý các sterol tự do liên hiệp (giảm từ 95-100%) trong chu trình Kraft từ gỗ bạch đàn, axit nhựa và sterol giảm từ 65-100%, rượu béo, ankan và sterol giảm 45-100%.Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy laccase kết hợp với một số chất khử như hydrobenzotriazole,syringaldehyde, acetosyringone và p -coumaric có thể loại bỏ tốt một số chất có trong nhựa cây Tuy nhiên, Laccase không có phản ứng với axit abietic, axit linoleic.Một số hợp chất (cụ thể là octadecane, 1- hexadecanol, axit palmitic và triheptadecanoin) không biểu hiện bất kỳ phản ứng nào với laccase, mặc dù chúng có thể được biến đổi trong hỗn hợp với chất béo không no [48]

1.5.1.2 Sterol esterase

Sterol esterase (steryl-este acylhydrolase, E.C3.1.13) là nhóm enzym thủy phân

có tính đặc hiệu thấp hơn, cũng được cho là có vai trò quan trọng để kiểm soát hàm lượng nhựa cây Enzym này được tìm thấy trong mô động vật có vú, một số loại nấm

và vi khuẩn, có đặc điểm là độ bền cao và khả năng tồn tại trong điều kiện nấu Các

nghiên cứu cho thấy sterol esterase có khả năng thủy phân thấp hơn laccase, cho nên sản xuất quy mô công nghiệp còn hạn chế

Trong dung dịch, enzym esterase có thể dễ dàng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách este thành axit và rượu Ngoài ra, esterase có khả năng thủy phân chuỗi acylglycerol dài thành những đoạn ngắn hơn Feruloyl esterase, một hợp chất quan trọng trong nhóm các enzym từ họ esterase, có khả năng phá vỡ liên kết este giữa axit ferulic và các polysaccharide khác nhau trong thành tế bào thực vật [58] Một

số loại enzym esterase được nghiên cứu có khả năng phá vỡ cấu trúc của một số loại chất béo, với khối lượng loại có thể loại bỏ trên 50%-60% đối với những lượng từ 100-250 ppm, độ sáng của giấy khi có sự tham gia của enzym esterase tăng lên 35% trong bột gỗ, và tăng lên 15-20% trong giấy thành phẩm [37] Nghiên cứu của Jorge Barriuso (2014) về sử dụng sterol esterase từ hai chủng nấm túi là Ophiostoma piceae và Melanocarpus albomyces cho thấy khả năng phân hủy được các chất béo như axit béo mạch dài, ester nhựa, triglyceride và cholesteryl oleate lên tới 57- 75%[15] Nghiên cứu của Dorado và cộng sự (2000) cũng cho kết quả tương tự với tổng hàm lượng nhựa cây bị phân hủy đạt được từ 50-60% trong 6 tuần, bao gồm có triglyceride, diglyceride và axit béo tự do Trong quy mô phòng thí nghiệm, sử dụng kết hợp esterase / lipase tiết ra bởi O piceae cho kết quả phù hợp để phân hủy chất béo trung tính và sterol este có trong bột gỗ cứng và gỗ mềm, và được cấp bằng sáng chế để giảm các vấn đề về sân trong quá trình sản xuất giấy [21] Nghiên cứu của Kontkanen (2004) [34] cho thấy hơn 80% lượng steryl este bị phá hủy trong nước nhờ sự có mặt của enzym esterase Sự phân hủy này được diễn ra trong điều kiện

pH từ 6-10 và nhiệt độ lên tới 70 o C

1.5.2 Vi sinh vật phân hủy nhựa cây

Trong tự nhiên, VSV phân hủy gỗ bao gồm nấm mốc, nấm đảm (basidiomycetes), nấm dát gỗ (sapstain fungi) và một số loại khác

1.5.2.1 Nấm phân hủy nhựa

+ Nấm mốc (molds): Nấm mốc phát triển trên gỗ chủ yếu thuộc các chi Penicillium, Trichodenrma, Rhizopus và Aspergillus Chúng thường phát triển trong

gỗ rất ướt hoặc gỗ lưu giữ ở độ ẩm cao trong thời gian dài Đối với gỗ mềm, nấm mốc phát triển chủ yếu trên bề mặt, còn đối với gỗ cứng, nấm mốc có thể xâm nhập

ở chỗ mô mềm hở hoặc tế bào vỡ, rồi phát triển trong khối gỗ Mặc dù có khả năng phân hủy các chất trích ly trong nguyên liệu gỗ nhưng sự phát triển của nấm mốc trên gỗ cũng làm giảm chất lượng của nguyên liệu do chúng phân hủy đồng thời cellulose.[44]

+ Nấm dát gỗ (Sapstain fungi): Một số loài nấm túi, gọi là nấm dát gỗ, phát triển chủ yếu ở các tế bào parenchyma và kênh dẫn nhựa, phân hủy hạn chế các thành phần chính của nhựa trích ly và các hợp chất tan trong nước Chúng làm xẫm màu mô gỗ do có chất màu giống melanin trong sợi nấm Các loài nấm dát gỗ, đại diện là Ophiostoma, Ceratocystis, Leptographium và Sphareopsis, sử dụng axit béo, triglyceride, carbohydrat đơn giản, và các thành phần khác của gỗ Một sản phẩm sử dụng nguyên liệu nấm để giảm lượng chất trích ly được sản xuất từ năm

1991 (Cartapip) [29] Chế phẩm Cartapip 28 và Cartapip 58 làm giảm đáng kể hàm lượng axit béo và các hợp chất không xác định, trong đó bao gồm các loại sáp, rượu béo và sterol trong cây thông vàng[31] Đặc biệt Cartapip 58 làm giảm 60% hàm lượng este của các axit béo Ngoài ra, xử lý bằng Cartapip chỉ loại được 60 – 70% các axit nhựa từ gỗ thông trong khi một số loài nấm mục trắng có thể loại được hoàn toàn các hợp chất này[29] Chế phẩm Cartapip 97 được tạo thành từ các chủng bạch tạng của Ophiostoma piliferum, hiện nay là sản phẩm của công ty Parrac Ltd (New Zealand) dùng để xử lý nguyên liệu gỗ mềm (thông) Chúng tách loại các chất trích ly theo cơ chế trao đổi chất Cartapip được sử dụng dưới dạng dung dịch 1 – 3%, được phun lên dăm mảnh, nấm nhanh chóng sinh trưởng lan dần

trên dăm mảnh và tách phân hủy các chất nhựa trong vòng 4 – 10 ngày Chế phẩm này dùng để xử lý nguyên liệu gỗ mềm (thông) làm giảm hàm lượng các chất trích ly trong DCM sau 2 tuần là 25% với gỗ vân sam và 35% ở 4 tuần với dăm mảnh thông

và làm giảm 36% hàm lượng chất trích ly trong axeton của mảnh gỗ dương tươi khi

ủ trong 3 tuần và giảm 13% khi không ủ[] Cartapip phân hủy rất hiệu quả triglyceride trong gỗ thông trong sản xuất bột giấy cơ và bột giấy sunfat Các chủng nấm trong Cartapip phân hủy axit béo tự do và triglycerid, nhưng hiệu quả phân hủy sterol este và axit resin chưa rõ ràng do có những số liệu không nhất quán trong các công bố khác nhau Thậm chí có tác giả kết luận là Cartapip dường như không phân hủy hiệu quả sterol este, sterol, terpene và axit nhựa [31][32]

+ Nấm đảm (Basidiomycete): Nấm đảm, bao gồm nấm mục trắng (white-rot fungi), nấm mục nâu (brown-rot fungi) và nấm mục mềm (soft-rot fungi) Nấm mục nâu và nấm mục mềm không được quan tâm ứng dụng trong xử lý lignin và nhựa

do chúng phân hủy lignin không hiệu quả mà còn phân hủy cellulose [32]

1.5.2.2 Vi khuẩn phân huỷ nhựa cây

Nghiên cứu các chủng vi khuẩn được phân lập từ các dăm mảnh gỗ vân sam

đã cho thấy khả năng giảm hàm lượng chất trích ly từ gỗ Nghiên cứu của Kallioinen và cộng sự (2003) [38] cho kết quả có thể giảm đáng kể lượng chất trích lytrong môi trường lỏng và giảm lượng chất béo trung tính, este steryl và tổng các chất trích ly lần lượt là 100%, 20% và 39% Ván gỗ vân sam đã được xử lý trong các điều kiện kiểm soát với vi khuẩn được chọn để kiểm tra tác dụng của chủng vi khuẩn trên các dăm mảnh gỗ Tất cả các vi khuẩn phát triển tốt trên các dăm mảnh Hiệu quảquá trình phản ứng của vi khuẩn đối với nhựa gỗ rất đáng kể Xử lý bằng

vi khuẩn làm giảm lượng chất trích ly 16% - 38% trong 1 tuần và tới 67% trong 2 tuần.Hàm lượng triglyceride, este steryl và axit nhựacó trong hợp chất trích ly loại

bỏ hiệu quả nhấtđược ghi nhận tương ứng 90%, 66% và 50%trong 2 tuần Những

kết quả này chỉ ra rằng vi khuẩn có thể là một nguồn nguyên liệu đầy hứa hẹn cho việc loại bỏ các chất trích ly, cải thiện quá trình nghiền và làm giấy Nghiên cứu của Burnes và cộng sự (2000) cũng cho kết quả tương tự khi xử lý dăm mảnh gỗ thông với độ ẩm của gỗ nguyên liệu mất đi chỉ khoảng 11%[18 ].

Nghiên cứu của Widhalm (2016) về xử lý β-pinene (terpenes) cho thấy, chủng

vi khuẩn được lựa chọn cho khả năng chuyển hóa sử dụng α-pinene là nguồn cacbon đơn trong môi trường lỏng Các chủng thuộc chi Pseudomonas cho thấy kết quả xử lý tốt nhất (98% phân hủy sau 72 giờ) Kết quả xử lý nhựa cây tốt nhất đạt được với chủng Bacillus pallidus (phân hủy 90%) ở 55°C Hơn nữa, thí nghiệm sử dụng hỗn hợp của các loài Pseudomonas đã được xử lý trên các dăm mảnh gỗ thông

và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Các aldehyde và β-pinene đượcloại bỏ hoàn toàn (100%) , cho thấy tiền năng ứng dụng trong công nghiệp xử lý nhựa cây bằng

vi khuẩn[16]

1.5.2.3 Xạ khuẩn phân hủy nhựa cây

Hoạt động của các enzym ngoại bào được tìm thấy phổ biến, song chỉ có một

số chủng xạ khuẩn được xác định là có hoạt tính cao Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc nhánh Streptomycetaceae Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là hệ xạ khuẩn Gram dương, có bộ gen với tỉ lệ GC% cao Chủng xạ khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất trong họ xạ khuẩn Chủng VSV này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới, là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế Đối với việc phân hủy nhựa cây sử dụng chủng xạ khuẩn, các nghiên cứu vẫn còn hạn chế Một

số nghiên cứu chỉ ra rằng các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm Streptomyces có khả năng tiết ra enzym laccase; enzym quan trọng cho việc loại bỏ các hợp chất trích ly trong gỗ Polyphenoloxidase được tìm thấy trong Streptomyces lavendulae có đặc tính đặc hiệu đối với một số hợp chất thơm khác nhau, ngoài ra còn có khả năng oxi

hóa được syringaldazine, một chất nền của laccase [67].Laccase từ Streptomyces lavendulae có khả năng tồn tại ổn định ở 70°C Các laccase từ Streptomyces cyaneusđược mô tả lần đầu tiên có khả năng oxy hóa nhiều hợp chất khó phân hủy [9] Nghiên cứu Schöller (2002) [65] về 26 chủng thuộc nhóm Streptomyces cho thấy

xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhiều loại este và các hợp chất của este trong nhựa cây Xạ khuẩn có hệ enzym phân hủy giúp làm giảm các hợp chất hữu cơ có trong thực vật (axit nhựa, lignin) và chitin Xạ khuẩn có khả năng sinh enzym phân hủy nhựa cây như esterase, lipase; một số chủng xạ khuẩn như Streptomyces griseus, Streptomyces cyaneus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces ipomoea, Streptomyces sviceus, Streptomyces sp.còn có khả năng sinh laccase phân hủy các hợp chất vòng nhân thơm, cắt đứt các liên kết este có trong nhiều thành phần nhựa cây

Tóm lại: Nhìn chung, vai trò của nấm trong phân hủy lignin và các hợp chất hữu cơ trong nhựa cây đã được nghiên cứu từ nhiều thập kỷ và ứng dụng có hiệu quả Vi khuẩn, xạ khuẩn tuy không có hệ enzym peroxidase thông thường như ở nấm, nhưng lại có hệ enzym rất phong phú và đa dạng, bao gồm những enzym đã biết như DyP, laccase, etherase, dismutase, dioxygenase, và còn nhiều enzym chưa được phát hiện Tất cả đều tham gia vào quá trình biến đổi phân tử lignin và phân hủy các axit béo, axit nhựa và các hợp chất hữu cơ khó phân hủy khác trong nhựa cây Vi khuẩn có lợi thế hơn nấm mục trắng do có thể nhanh chóng phát triển sau khi cấy vào nguyên liệu gỗ nên giảm nguy cơ gỗ bị nhiễm các VSV không mong muốn khác Bên cạnh đó, vi khuẩn và xạ khuẩn có thể phát triển trong điều kiện có nồng độ oxy thấp mà nấm không phát triển được Cộng đồng hỗn hợp vi khuẩn – xạ khuẩn sẽ có khả năng phân hủy lignin và các hợp chất trong gỗ tốt hơn các loài riêng lẻ [60] Do đó, việc tìm kiếm và phối hợp các chủng VSV trong tiền xử lý dăm mảnh nguyên liệu gỗ sản xuất bột giấy và giấy sẽ khiến cho giải pháp này càng trở nên khả thi và hiệu quả hơn trong thực tiễn sản xuất Đây là một hướng giúp cho sản xuất an toàn mà không cần đầu tư lớn cho các nhà máy hiện hành

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu mùn, đất, dăm gỗ được thu thập xung quanh nhà máy giấy Bãi Bằng - Tổng Công ty Giấy Việt Nam, huyện Phù Ninh, tỉnh Phú Thọ

- Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone (Merck), agar, tinh bột tan, casein, Guaialcol (2-Methoxyophenol), Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Sodium Carboxymethyl Cellulose (CMC) của Nhật Bản, Trung Quốc

- Các hóa chất khác được sử dụng trong thí nghiệm có độ tinh khiết cao và đảm bảo

sử dụng trong phân tích

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Kính hiển vi quang học Olympius (Model CHD, Nhật Bản)

- Máy đo pH (Metter Toledo, Thụy Sỹ)

- Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản)

- Tủ ấm vô trùng, tủ sấy Memmert (Trung Quốc)

- Cân điện tử (Metteler Toledo, Thụy Sỹ)

- Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc)

- Bốc vô trùng Nuaire (Mỹ)

- Máy ly tâm Hettich (Đức)

- Pipet, máy sấy, đĩa petri, ống đong, bình thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, ống falcon, ống eppendorf 1,5 ml

- Các dụng cụ khác

2.1.3 Môi trường

MT1(g/l) - Môi trường sàng lọc (môi trường Bennety): Cao nấm men: 1g, Cao thịt: 1g, Casein thủy phân: 2g, Glucoza: 10g, COCl2.6H2O: 0.01g, Agar: 18g, pH=7 Bổ sung 100mg acid tannic

MT2(g/l): Môi trường kích thích sinh enzym (môi trường Czapek) NaNO 3 : 3g,

K 2 HPO 4 : 1g, MgSO 4 7H 2 O: 0,5g, KCl: 0,5g, FeSO 4 7H 2 O: 0,01g pH=7 Bổ sung 0.5% alkaline lignin

MT3(g/l): Môi trường nhân giống và xác định đặc điểm sinh học (môi trường ISPII) Glucoza: 10g, Cao nấm men: 4g, Cao Malt: 4g, pH=7

ISP2: Cao nấm men 4g, dịch chiết Malt 10g, glucose 4g, Agar 20g, pH = 7,3

ISP3: Bột yến mạch 20g, Agar 20g, dung dịch muối vi lượng 1,0 ml, pH = 7.0) ISP4: Tinh bột 10g, K 2 HPO 4 1g, MgSO 4 .7H 2 O 1g, NaCl 1g, (NH4 ) 2 SO 4 2g, CaCO 3 2g, dung dịch muối vi lượng 1.0 ml, Agar 20g, pH = 7,0)

ISP5: L - asparagin 1g; glyxerin 10g; K 2 HPO 4 1g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; agar 20g, pH = 7,0

ISP6: - Peptone 10g, cao nấm men 1g, xitrat sắt 0,5g, agar 20g, pH = 7.0

Các môi trường được tính pha cho 1 lít dung dịch

2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu mùn, đất, dăm mảnh gỗ tại nhà máy nguyên liệu - nhà máy giấy Bãi Bằng - Tổng công ty giấy Việt Nam, được giữ trong các túi nylon vô trùng, ghi tên mẫu, đánh số thứ tự và vị trí lấy Tại phòng thí nghiệm, các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C Thời gian phân tích mẫu tập trung trong khoảng 1 tuần

2.2.2 Phương pháp phân lập và sàng lọc

Mẫu mùn, đất, dăm mảnh gỗ thu thập từ nhà máy giấy Bãi Bằng được pha loãng đến nồng độ thích hợp theo phương pháp pha loãng tới hạn và trang đĩa trên môi trường khoáng có bổ sung alkalin lignin và sterol ester làm nguồn cơ chất Các đĩa phân lập được ủ ở 37 o C và 45ºC trong 3 ÷ 5 ngày Tách và làm sạch các chủng VSV xuất hiện trên đĩa

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzym

2.2.3.1 Khả năng sinh tổng hợp các enzym ngoại bào

Khả năng sinh tổng hợp các enzym ngoại bào của các chủng VSV được khảo sát trên môi trường khoáng, có bổ sung 1% các nguồn cơ chất khác nhau như: tinh bột tan, casein, carboxy methyl celluose (CMC), Remazol Brilliant Blue R (RBBR)

và Tannic, nuôi ở nhiệt độ thích hợp Khả năng sinh enzym ngoại bào được quan sát

và đo đường kính vòng phân hủy xung quanh khuẩn lạc

2.2.3.2 Phương pháp nuôi cấy và thu enzym

Nuôi cấy trong môi trường lỏng: Thí nghiệm được thực hiện trên bình nón dung tích 250 ml với 75 ml môi trường khoáng Czapek có chứa 0,2% pepton và 0,5% glucose Các bình môi trường được khử trùng ở 121 o C trong 30 phút, sau đó làm nguội về nhiệt độ phòng, tiến hành bổ sung 0,5 % (w/v) chất chiết nhựa thu nhận từ

gỗ keo và 2% (v/v) giống VSV Các bình được nuôi cấy ở tốc độ lắc 150 vòng/phút

Sau 3-5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, các bình được lấy ra để tiến hành xác định hoạt tính các enzym

Phương pháp nuôi cấy trên dăm gỗ: Dăm keo thu nhận tại nhà máy có kích thước từ 1-2 cm 2 , được làm ẩm đến 60% (v/w) và khử trùng 121 o C trong vòng 15 phút 100 gram gỗ được bổ sung 2 ml giống VSV chọn lựa có chứa 10 7 tế bào/ml, bọc trong túi nylon vô trùng có đậy nút kín Các túi thí nghiệm được ủ trong 7 ngày,

14 ngày và 21 ngày Mẫu đối chứng được xử lý tương tự, thay dung dịch VSV bằng dung dịch nước khử trùng

Phương pháp thu nhận enzym thô: 10 gram dăm mảnh gỗ được ủ với VSV được lấy ra cho vào trong 100ml dung dịch Tris-HCl pH 7,0 và lắc trên máy có tốc

độ vòng 150 vòng/ phút trong vòng 2 giờ Dịch được thu lại và tiến hành xác định hoạt độ các enzym (laccase, Lignin peroxydase, sterol esterase)

2.2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính lignin peroxidase

Nguyên tắc:Phương pháp xác định hoạt tính lignin peroxidase dựa trên sự oxy hóa O-Dianisidine biểu hiện bằng sự gia tăng hấp thụ ở bước sóng 460 nm [53] Một đơn vị hoạt độ Lignin peroxidase là lượng enzym cần thiết để oxy hóa 1μM O- Dianisidine trong 1 phút hấp thụ cực đại tại bước sóng 460 nm ở 30 o C.

Bảng 2.1 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính lignin peroxidase

Hoạt tính lignin peroxidase được xác định bằng công thức sau:

Công thức tính: Hoạt tính (nkat/L) =



.

10

510

v V

Nguyên tắc:Phương pháp xác định hoạt độ mangan peroxidasedựa trên sự oxy hoá

Mn 2+ thành Mn 3+ trong phản ứng do mangan peroxidase xúc tác, biểu hiện bằng sự gia tăng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 610 nm sau 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [53]

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ MnP là lượng enzym cần thiết để oxy hoá phenol đỏ tạo thành 1 µM sản phẩm hấp thụ bước sóng 610 nm trong thời gian 1 phút, ở điều kiện phòng thí nghiệm

Bảng 2.2 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính mangan peroxidase

Phản ứng được thực hiện ở 30 o C, bắt đầu khi bổ sung dung dịch H 2 O 2 2 mM trong đệm Sodium Succinate 0,2M pH=4,5 Sau 5 phút dừng phản ứng bằng cách cho 40 µl NaOH 5M Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 610 nm

OD M : Giá trị OD đo được của mẫu thí nghiệm;

OD C : Giá trị OD đo được của mẫu đối chứng;

D f : Độ pha loãng;

T pư : Thời gian phản ứng

2.3.3.5.Phương pháp xác định hoạt tính enzym esterase

Nguyên tắc:Phương pháp xác định hoạt tính enzym esterase dựa trên sự thuỷ phân của pNBP thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bước sóng 410nm [31] Dung dịch phản ứng bao gồm pNBP pha trong đệm Tris-HCl (pH 7) và dịch enzym Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch pNBP Giá trị hấp thụ ánh sáng được ghi nhận tại bước sóng 410nm

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ (U) esterase được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để oxy hóa 1 µmol pNBP trong một phút ở nhiệt độ phòng

Bảng 2.3 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính esterase

2.3.3.6.Phương pháp xác định hoạt tính laccase

Nguyên tắc:Phương pháp xác định hoạt tính laccase dựa trên sự oxy hoá bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bước sóng 460nm Dung dịch phản ứng bao gồm đệm acetat 50 mM pH 4.8, ABTS và dịch enzym Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch ABTS 0,4mM Giá trị hấp thụ ánh sáng được ghi nhận ở bước sóng 460nm [17]

2,2'-azino-Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase được định nghĩa là lượng enzym cần thiết

để oxy hóa 1 µmol ABTS trong một phút ở điều kiện phản ứng

Bảng 2.4 Tỷ lệ các thành phần trong xác định hoạt tính laccase