Nghiên cứu định lượng đồng thời một số chất nhóm methylxanthines trong chè bằng phổ UV VIS, IR và bước đầu nhận dạng chè xanh

Xuất phát từ các lý do nêu trên, đề tài luận án Tiến sĩ: “Nghiên cứu định lượng đồng thời một số chất nhóm methylxanthines trong chè bằng phổ UV-Vis, IR và bước đầu nhận dạng chè xanh”

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT NHÓM METHYLXANTHINES TRONG CHÈ BẰNG PHỔ UV-VIS, IR VÀ BƯỚC ĐẦU NHẬN DẠNG CHÈ XANH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT NHÓM METHYLXANTHINES TRONG CHÈ BẰNG PHỔ UV-VIS, IR VÀ BƯỚC ĐẦU NHẬN DẠNG CHÈ XANH

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 9440112.03

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Tạ Thị Thảo

2 PGS.TS Nguyễn Văn Ri

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Tạ Thị Thảo và PGS TS Nguyễn Văn Ri Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Trần Thị Huế

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Với lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS

Tạ Thị Thảo và PGS.TS Nguyễn Văn Ri bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài mã số ĐH2018-TN04-03

để tôi có thể hoàn thành tốt luận án này

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

đã luôn động viên, giúp đỡ về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận án này

Tác giả

Trần Thị Huế

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC HÌNH 9

MỞ ĐẦU 10

Chương 1 TỔNG QUAN 14

1.1 Giới thiệu chung về cây chè và sản phẩm chè Việt Nam 14

1.1.1 Phân loại chè Việt Nam 14

1.1.2 Thành phần hóa học trong chè 17

1.2 Giới thiệu về nhóm chất methylxanthines 20

1.2.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất 20

1.2.2.Tác dụng dược lý 22

1.3 Các phương pháp định lượng methylxanthines trong chè 23

1.3.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 23

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 27

1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 28

1.3.4 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 33

1.4 Ứng dụng thống kê đa biến trong phân loại nguồn gốc địa lý chè 34

1.4.1 Các phương pháp nhận dạng và phân loại đối tượng phân tích 34

1.4.2 Phân loại nguồn gốc địa lý chè dựa trên dữ liệu hàm lượng chất phân tích trong mẫu 38

1.4.3 Phân loại nguồn gốc địa lý chè dựa trên phân tích dữ liệu phổ kết hợp thống kê đa biến 41

Chương 2 THỰC NGHIỆM 45

2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 45

2.1.1 Hóa chất 45

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 46

2.2 Đối tượng nghiên cứu 47

2.3 Phương pháp nghiên cứu 48

2.3.1 Phương pháp định lượng đồng thời ba chất TB, TP và CF trong các mẫu chè 48

2.3.2 Phương pháp phân loại nguồn gốc địa lý của các mẫu chè dựa trên dữ liệu phổ UV-Vis, NIR 54

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Phát triển phương pháp HPLC định lượng đồng thời TB, TP, CF trong chè xanh 56

3.1.1.Khảo sát lựa chọn điều kiện tách TB, TP, CF trên hệ HPLC 56

3.1.2 Đường chuẩn xác định TB, TP, CF và giới hạn phát hiện của thiết bị 62

3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết TB, TP, CF ra khỏi nền mẫu 64

3.1.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích TB, TP, CF bằng HPLC 65

3.1.5 Phân tích mẫu thực tế 72

3.2 Nghiên cứu định lượng đồng thời ba methylxanthines trong chè bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 74

3.2.1 Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính 74

3.2.2 Phương pháp thêm chuẩn đa biến sử dụng mô hình SANAS 85

3.3 Nghiên cứu định lượng đồng thời TB, TP, CF trong chè bằng phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 87

3.3.1 Phổ hồng ngoại phản xạ của các mẫu chè 87

3.3.2 Tiền xử lý số liệu 88

3.3.3 Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến tuyến tính 89

3.3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 102

3.4 Phân loại chè theo nguồn gốc địa lý dựa trên dữ liệu phổ và các phương pháp thống kê đa biến 107

3.4.1 Phân loại và nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý bằng phổ hấp thụ phân tử 108

3.4.2 Phân loại và nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý bằng phổ hồng ngoại phản xạ 114 3.4.3 Phân loại và nhận dạng chè bằng cách ghép nối các dữ liệu phổ NIR và phổ UV-Vis 118

KẾT LUẬN 122 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO 125

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 ANN Artificial neural network Mạng nơron nhân tạo

10 EGCG Epigallocatechin gallate Epigallocatechin gallate

12 HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

13 HPLC-DAD High performance liquid

chromatography with diode-array detection

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector mảng diod

14 HPLC-DAD/

MS

High performance liquid chromatography with diode array detection coupled with mass spectrometry

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector mảng diod

và khối phổ

15 HPLC-UV High-performance liquid

chromatography with ultraviolet detection

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector quang phổ

tử ngoại

17 ICP-MS Inductively coupled plasma mass

spectrometry

Quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ

18 ICP-AES Inductively Coupled Plasma atomic

Emission Spectroscopy

Quang phổ phát xạ plasma

20 LC-MS Liquid chromatography coupled to

mass spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ

21 LDA Linear discriminant analysis Phân tích phân biệt tuyến

tính

23 LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

26 MLR Multivariate linear regression Hồi quy đa biến tuyến tính

29 NIR Near infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại gần

31 PCA Principal component analysis Phân tích thành phần chính

32 PCR Principal component regression Hồi quy thành phần chính

34 PLS Partial least squares Bình phương tối thiểu từng

phần

38 RMSE Root mean square error Căn bậc hai sai số toàn

phương trung bình

40 RSDr Relative standard deviation for

44 SNV Standard normal transformation Chuyển dạng thành phân bố

chuẩn

45 SVM Support vector machine Tính hỗ trợ vector

49 UV-Vis Ultraviolet-visible Vùng tử ngoại - khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lá chè xanh 17

Bảng 1.2 Các tiêu chuẩn hóa lý của châu Âu về sản phẩm chè xanh 20

Bảng 1.3 Công thức cấu tạo, danh pháp IUPAC của các methylxanthines 21

Bảng 1.4 Tính chất của một số hợp chất hữu cơ nhóm methylxanthines 22

Bảng 1.5 Một số công trình nghiên cứu xác định các methylxanthines và các chất khác trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC 25

Bảng 1.6 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các methylxanthines và các chất khác chè bằng phương pháp NIR 32

Bảng 1.7 Một số công trình nghiên cứu phân loại chè dựa trên dữ liệu phổ NIR 42

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dung môi pha động đến thông số pic các chất định phân 58

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần pha động đến thông số pic các chất định phân 60

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thông số pic các chất định phân 62

Bảng 3.4 Điều kiện tối ưu cho phép tách TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC 62

Bảng 3.5 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ TB, TP, CF 63

Bảng 3.6 LOD, LOQ của đường chuẩn TB, TP và CF bằng phương pháp HPLC 64

Bảng 3.7 Bảng phân tích dữ liệu phổ MS của methylxanthines 68

Bảng 3.8 Tính thích hợp của hệ thống HPLC đối với TB, TP, CF 68

Bảng 3.9 Kết quả phân tích độ lặp lại trong ngày và khác ngày đối với TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC 69

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại trong ngày và khác ngày đối với TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC 70

Bảng 3.11 Giá trị MDL và MQL đối với TB, TP và CF bằng phương pháp HPLC 71

Bảng 3.12 Hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích trong các mẫu chè 71

Bảng 3.13 Hàm lượng TB, TP và CF trong các mẫu chè xác định bằng phương pháp HPLC (n=3, RSD<2%) 73

Bảng 3.14 Hàm lượng CF, TB, TP trong các mẫu chè sử dụng làm mẫu chuẩn 77

Bảng 3.15 Hàm lượng CF, TB, TP trong các mẫu chè sử dụng làm mẫu kiểm tra 77

Bảng 3.16 Độ chính xác của mô hình PCR xác định TB, TP, CF trong mẫu kiểm tra theo phương pháp UV-Vis 80

Bảng 3.17 Độ chính xác của mô hình PLS xác định TB, TP, CF trong mẫu kiểm tra theo phương pháp UV-Vis 83

Bảng 3.18 So sánh độ chính xác của mô hình PCR và PLS xác định TB, TP, CF trong

mẫu kiểm tra trước và sau khi loại tannin 84Bảng 3.19 Ma trận nồng độ TB, TP, CF được thêm và mẫu chè 85Bảng 3.20 Hàm lượng TB, TP và CF trong các mẫu chè xác định bằng phương pháp UV-

Vis/SANAS 86Bảng 3.21 Độ chính xác của mô hình PCR xác định TB trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm

tra theo phương pháp NIR 90Bảng 3.22 Độ chính xác của mô hình PCR xác định TP trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm

tra theo phương pháp NIR 91Bảng 3.23 Độ chính xác của mô hình PCR xác định CF trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm

tra theo phương pháp NIR 92Bảng 3.24 Độ chính xác của mô hình PLS xác định TB trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm

tra theo phương pháp NIR 97Bảng 3.25 Độ chính xác của mô hình PLS xác định TP trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm

tra theo phương pháp NIR 98Bảng 3.26 Độ chính xác của mô hình PLS xác định CF trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm

tra theo phương pháp NIR 99Bảng 3.27 So sánh hàm lượng TB, TP và CF trong các mẫu chè xác định bằng phương

pháp NIR/PLS với phương pháp HPLC 102Bảng 3.28 Hàm lượng TB, TP và CF trong 75 mẫu chè xác định bằng phương pháp

NIR/PLS 103Bảng 3.29 Kết quả các chỉ số thống kê dữ liệu TB, TP trong các mẫu chè 106Bảng 3.30 Kết quả các chỉ số thống kê dữ liệu CF và tổng ba methylxanthines trong các

mẫu chè 106Bảng 3.31 Số lượng mẫu thuộc các vùng địa lý trong mô hình phân loại 107Bảng 3.32 Độ chính xác của mô hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp

UV-Vis kết hợp với PCA-DA 109Bảng 3.33 Độ chính xác của mô hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp

UV-Vis kết hợp với PLS-DA 111Bảng 3.34 Độ chính xác của mô hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp

NIR kết hợp với PCA-DA 115Bảng 3.35 Độ chính xác của mô hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp

NIR kết hợp với PLS-DA 117

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình ảnh thân cây, lá và hoa chè 14

Hình 1.2 Quy trình sản xuất chè 16

Hình 1.3 Mô hình xử lý số liệu của phương pháp ANN 38

Hình 3.1 Phổ UV-Vis của TB, TP, CF 56

Hình 3.2 Ảnh hưởng dung môi pha động trong phép định lượng đồng thời TB, TP, CF bằng HPLC 57

Hình 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ pha động trong phép định lượng đồng thời TB, TP, CF bằng HPLC 59

Hình 3.4 Ảnh hưởng tốc độ dòng pha động trong phép định lượng đồng thời TB, TP, CF bằng HPLC 61

Hình 3.5 Đường chuẩn xác định TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC 63

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian chiết mẫu đến hàm lượng TB, TP, CF 64

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết mẫu đến hàm lượng TB, TP, CF 65

Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC-UV đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp 66

Hình 3.9 So sánh phổ UV của mẫu thử chè xanh và mẫu chuẩn trên thiết bị HPLC 66

Hình 3.10 Sắc ký đồ trên hệ HPLC detector PDA và hệ HPLC detector DAD ghép nối MS 67

Hình 3 11 Sắc ký đồ mẫu chè (a) - LD5, (b) - TN9, (c) - CTK10 72

Hình 3.12 Phổ UV-Vis của 125 mẫu trong vùng phổ 190-700nm (a), và vùng 240-310 nm (b) 74

Hình 3.13 Phổ UV-Vis của dung dịch chuẩn, mẫu chè và mẫu chè thêm chuẩn 75

Hình 3.14 Sơ đồ tìm ma trận trị số a) và ma trận trọng số b) 78

Hình 3.15 Phương sai tích lũy của mô hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp UV-Vis/PCR 79

Hình 3.16 Biểu diễn cách tìm ma trận trực giao trong PLS 81

Hình 3.17: Phương sai tích lũy của mô hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp UV-Vis/PLS 82

Hình 3.18 Đường thêm chuẩn xác định nồng độ CF(a), TB(b), TP(c) trong mẫu chè xanh Thái Nguyên 86

Hình 3.19 Đường thêm chuẩn xác định nồng độ CF(a), TB(b), TP(c) trong mẫu chè xanh Hà Giang 86

Hình 3.20 Phổ hồng ngoại phản xạ của các mẫu chè 87

Hình 3.21 Phổ hồng ngoại phản xạ của các mẫu chè sau tiền xử lý bằng MC (c) và SNV

(b) 88Hình 3.22 Phương sai tích lũy của mô hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp

IR/PCR 89Hình 3.23 Độ chính xác của mô hình PCR xác định TB (a), TP (b), CF (c) trong mẫu

kiểm tra bằng phương pháp NIR 92 Hình 3.24 Tương quan hàm lượng TB, TP, CF tìm được từ mô hình PCR với hàm lượng

xác định bằng HPLC trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra 94Hình 3.25 Phương sai tích lũy của mô hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp

IR/PLS 96Hình 3.26 Độ chính xác của mô hình PLS xác định TB, TP, CF trong mẫu kiểm tra bằng

phương pháp NIR 99 Hình 3.27 Tương quan hàm lượng TB, TP và CF tìm được từ mô hình PLS với hàm

lượng xác định bằng HPLC trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra 101Hình 3.28 Biểu đồ biểu diễn độ tập trung và phân tán hàm lượng TB, TP, CF trong các

mẫu chè theo khu vực địa lý khác nhau 106Hình 3.29 Phương sai tích lũy của mô hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp UV-

Vis/PCA-DA 108Hình 3.30 Kết quả kiểm tra mô hình PCA-DA/UV-Vis với 25 mẫu kiểm tra 110Hình 3.31 Mô hình ANN trên cơ sở dữ liệu phổ UV-Vis 112Hình 3.32 Số mẫu nhận dạng và độ chính của mô hình phân loại theo ANN trên cơ

sở dữ liệu phổ UV-Vis của mẫu chuẩn 113Hình 3.33 Số mẫu nhận dạng và độ chính xác của mô hình phân loại theo ANN trên

cơ sở dữ liệu phổ UV-Vis của mẫu kiểm tra 114Hình 3.34 Phương sai tích lũy của mô hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp

NIR/ PCA-DA 115Hình 3.35 Kết quả kiểm tra mô hình PCA-DA/NIR với 25 mẫu kiểm tra 116Hình 3.36 Kết quả kiểm tra mô hình PLS-DA/NIR với 25 mẫu kiểm tra 118Hình 3.37 Độ chính xác của mô hình PLS-DA trên cơ sở dữ liệu ghép phổ UV-Vis

và NIR 119Hình 3.38 Độ chính xác của mô hình phân loại theo PCA-ANN trên cơ sở dữ liệu

ghép phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b) 120

MỞ ĐẦU

Chè (Camellia sinensis) từ lâu đã là một đồ uống quen thuộc của con người và

được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy lá chè chứa khoảng 2000 hợp chất hóa học, trong đó các polyphenols chiếm khoảng 25-30%, caffeine chiếm khoảng 2-5%; theobromine và theophylline chiếm khoảng 0,2-0,5% lượng chất khô [4, 99] Trong lá chè, caffeine, theobromine và theophyline thuộc nhóm methylxanthines được quan tâm đặc biệt vì có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như: caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, tim và hô hấp; theobromine và theophyline

là các chất có tác dụng làm giãn cơ trơn Thành phần hóa học đặc biệt là hàm lượng của các methylxanthines, polyphenol sẽ quyết định đến chất lượng và giá trị kinh tế của chè thành phẩm Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, bên cạnh yếu tố giống, chế độ canh tác, kĩ thuật chế biến thì điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng có ảnh hưởng rất lớn đến các thành phần hóa học của chè [15, 61, 97] Do vậy, chè thành phẩm ở các vùng địa lý khác nhau sẽ có giá trị kinh tế khác nhau Trong những năm gần đây, một số loại chè đã được đăng ký nhãn hiệu chứng nhận, chỉ dẫn địa lý như: chè Shan tuyết Mộc Châu, chè Tân Cương Thái Nguyên, chè Lâm Đồng, chè Suối Giàng Yên Bái Tuy nhiên, hiện nay vẫn tồn tại nhiều điểm bán chè với thương hiệu nổi tiếng nhưng không có nhãn mác đúng quy chuẩn Trước thách thức trên, việc kiểm soát chất lượng

và truy xuất nguồn gốc sản phẩm dần trở thành nhu cầu tất yếu mang lại những lợi ích thiết thực cho nhà sản xuất và người tiêu dùng

Phương pháp điển hình để định lượng các methylxanthines trong chè là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector UV, khối phổ [48,

65, 84] Tuy nhiên, phương pháp HPLC có nhược điểm quá trình xử lí mẫu phức tạp, chi phí dung môi lớn do đó không phù hợp với thực tế sản xuất hướng đến các phương pháp phân tích nhanh, đồng thời Gần đây, hướng nghiên cứu nhóm các phương pháp phổ như quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) và quang phổ hồng ngoại (IR) kết hợp với các thuật toán thống kê đa biến nhằm mục đích định lượng đồng thời các chất đang phát triển mạnh mẽ [60, 75, 83, 104] So với các phương pháp phân tích hóa học, thì định lượng các chất trong thực phẩm bằng phổ UV-Vis và phổ IR có ưu điểm nổi trội, không phải xử lý mẫu, phân tích nhanh, giá thành rẻ

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp IR vùng gần và trung bình để định lượng đồng thời một số hoạt chất trong thuốc viên nén [2, 3] Trong các nghiên cứu trên, việc xây dựng mô hình hồi quy tuyến tính được thực hiện trên các mẫu chuẩn đã biết trước hàm lượng bằng cách trộn các chất chuẩn

và tá dược theo công thức đã biết Tuy nhiên, không thể tự tạo chính xác mẫu chuẩn theo cách này với nền mẫu tự nhiên như mẫu chè Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào định lượng đồng thời các chất nói chung và nhóm methylxanthines nói riêng trong nền mẫu phức tạp như thực phẩm dựa trên dữ liệu phổ UV-Vis, IR

Để truy xuất nguồn gốc sản phẩm thì hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng các phương pháp thống kê đa biến dựa trên tập số liệu về kết quả phân tích các thành phần hóa học trong mẫu bằng phương pháp HPLC, ICP- OES [13, 64, 71, 107] Tuy nhiên, để phân loại sản phẩm theo cách này đòi hỏi cần rất nhiều dữ liệu phân tích dẫn đến chi phí và thời gian phân tích lớn So với phương pháp trên, phương pháp thống kê đa biến dựa trên dữ liệu quang phổ toàn phần cho lượng thông tin về thành phần hóa học trong mẫu đa dạng hơn nên kết quả phân loại và nhận dạng hiệu quả hơn Mặt khác, trên cùng một tập số liệu phổ IR, UV-Vis có thế đạt được cả mục đích phân loại và định lượng các hoạt chất

Xuất phát từ các lý do nêu trên, đề tài luận án Tiến sĩ: “Nghiên cứu định

lượng đồng thời một số chất nhóm methylxanthines trong chè bằng phổ UV-Vis,

IR và bước đầu nhận dạng chè xanh” hướng đến mục tiêu:

Xây dựng phương pháp định lượng nhanh một số chất nhóm methylxanthines trong chè và nhận dạng nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh Việt Nam dựa trên cùng

dữ liệu phổ UV-Vis và IR (sử dụng kĩ thuật đo phổ IR phản xạ khuếch tán) kết hợp với phân tích đa biến

Để đạt được mục tiêu trên, luận án cần giải quyết các nội dung sau:

1 Phát triển phương pháp HPLC để định lượng đồng thời các chất nhóm methylxanthines trong các mẫu chè và sử dụng các mẫu này làm mẫu chuẩn để xây dựng mô hình hồi quy đa biến khi phân tích phổ UV-Vis và NIR

2 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời các chất methylxanthines trong chè bằng phổ UV-Vis và NIR kết hợp với hồi quy đa biến

3 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân loại có chỉ dẫn (supervised

classification) mẫu chè xanh Việt Nam dựa trên cùng dữ liệu phổ UV-Vis và NIR kết

hợp với phân tích đa biến

4 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để phân tích định lượng các methylxanthines trong chè và nhận dạng nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh Việt Nam đang lưu hành trên thị trường dựa trên dữ liệu phổ UV-Vis và NIR

* Điểm mới về mặt khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

* Điểm mới của luận án

Xây dựng được quy trình xác định đồng thời ba chất nhóm methylxanthines gồm theobromine, theophylline, caffeine trong mẫu chè bằng phổ UV-Vis và NIR kết hợp với hồi quy đa biến (mô hình bình phương tối thiểu từng phần (Partial Least

Square-PLS), hồi qui thành phần chính (Partial Component Regression - PCR) Các

mô hình trên được xây dựng từ dữ liệu hàm lượng ba chất phân tích trong mẫu chè

đã được xác định bằng phương pháp HPLC Quy trình này cho phép phân tích nhanh, đồng thời các chất trong nền mẫu thực mà không cần xử lý mẫu (với phương pháp NIR) và không cần tách chúng ra khỏi nhau (với phương pháp UV-Vis)

Xây dựng được mô hình phân loại nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh đã biết trước trên cơ sở dữ liệu đã dùng định lượng các methylxanthines trong mẫu chè, bằng các thuật toán phân loại có chỉ dẫn (gồm phân tích thành phần chính phân biệt (Principal Component Analysis - Disciminant Analysis – PCA – DA), bình phương tối thiểu từng phần phân biệt (Partial Least Square - Disciminant Analysis – PLS - DA), mạng nơron nhân tạo (Artificial Neural Networks - ANN)) Từ mô hình xây dựng được cho phép nhận dạng được các mẫu chè xanh Việt Nam

* Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Nghiên cứu đã xây dựng và phát triển một số phương pháp định lượng các methylxanthines trong mẫu chè xanh Việt Nam gồm: HPLC, UV-Vis và NIR Các phương pháp UV-Vis và NIR có ưu điểm phân tích nhanh, kỹ thuật đơn giản Đề tài cũng mở ra hướng nghiên cứu sử dụng một cơ sở dữ liệu phổ xác định nhiều hợp chất nếu có bộ số liệu chuẩn từ phương pháp HPLC thay vì phải phân tích rất nhiều mẫu

và nhiều chỉ tiêu

Kết quả định lượng hàm lượng caffeine, theobromine, theophylline trong 50 mẫu chè cho thấy hàm lượng của ba methylxanthines trong các mẫu chè trên là khác nhau giữa tỉnh Thái Nguyên so với tỉnh Phú Thọ và Lâm Đồng

Từ dữ liệu phổ UV-Vis, IR của 125 mẫu chè thuộc các tỉnh Thái Nguyên, Phú Thọ, Lâm Đồng (trong đó có 50 mẫu đã dùng định lượng các methylxanthines) xây dựng mô hình nhận dạng nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây chè và sản phẩm chè Việt Nam

1.1.1 Phân loại chè Việt Nam

Chè hay trà có tên khoa học Camellia sinensis, là loài cây từ Đông Á, Nam

Á và Đông Nam Á, nhưng ngày nay chè được trồng phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới Chè là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các

cây nhỏ, thông thường được cắt tỉa để thấp hơn 2 mét khi được trồng để lấy lá Do đặc

điểm sinh trưởng, chiều cao, thân cây chè có ba dạng chính là thân gỗ (1), thân bán gỗ (2) và thân bụi (3) (hình 1.1)

Hình 1.1 Hình ảnh thân cây, lá và hoa chè [4]

Cây chè thường được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có lượng mưa tối thiểu là 127 cm mỗi năm Cây chè sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ 15-230C, độ cao so với mực nước biển trên 1000 mét Tùy theo giống chè, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, kĩ thuật chăm bón, canh tác, chế biến thì thành phần hóa học và giá trị kinh tế của chè sẽ khác nhau do đó có thể có các cách thức phân loại chè khác nhau [4]

1.1.1.1 Phân loại theo nguồn gốc thực vật

Theo phân loại của nhà phân loại thực vật Hà Lan Cohen Stuart (1918) và nhà nông học Pháp Du Pasquier (1923), giống chè có ở Việt Nam chia thành 4 loại:

a Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var Macrophylla)

b Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var Bohea)

c Chè Shan (Camellia sinensis var Shan)

d Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var Assamica)

Bốn loại chè trên được trồng ở Việt Nam nhưng phổ biến nhất là 2 loại chè: Camellia sinesis var Macrophylla và Camellia sinesis var Shan

- Camellia sinensis var Macrophylla được trồng nhiều nhất ở các tỉnh trung

du với các tên gọi của địa phương (theo màu sắc lá) như: trung du lá xanh, trung du

lá vàng, v.v

- Camellisa sinensis var Shan được trồng ở miền núi các tỉnh miền bắc và ở miền nam Tây Nguyên (Lâm Đồng) Ở mỗi địa phương có các giống khác nhau như: Shan Mộc Châu, Shan Tham Vè [4]

Ngoài các giống chè trên, ở Việt Nam hiện nay có các giống chè cho năng suất cao như A1, LDP, Kim Tuyên, TRI777…

1.1.1.2 Phân loại theo cách thức chế biến

Dựa vào mức độ lên men, chè được chia thành ba loại chính là chè xanh, chè Oolong

và chè đen Mỗi loại chè có những tính chất cảm quan đặc trưng riêng về màu sắc, mùi

vị Quy trình sản xuất chè được mô tả theo sơ đồ hình 1.2 [14]

Hình 1.2 Quy trình sản xuất chè

Quá trình chế biến chè xanh không có quá trình lên men và các enzyme bị tiêu diệt ngay từ giai đoạn đầu tiên bằng cách sấy nên hàm lượng tannin trong chè xanh biến đổi không đáng kể so với chè tươi

Trong quá trình chế biến chè đen có sử dụng hoạt tính của enzyme để oxi hóa các hợp chất catechine Vì thế trong chè đen thành phẩm hàm lượng của các hợp chất catechine rất thấp, khoảng 2 - 3 % hàm lượng khô Màu đỏ đặc trưng của nước chè đen là do các sản phẩm oxy hóa như theaflavin và thearubigin gây ra

Chè Oolong là một sản phẩm trung gian giữa chè xanh và chè đen, hàm lượng catechine chiếm khoảng 10 - 20 % chất khô, tức khoảng 50 % so với chè nguyên liệu ban đầu Trong quá trình chế biến chè Oolong, quá trình lên men được kiểm soát theo mục đích tạo sản phẩm của người sản xuất, khi quá trình chuyển hóa catechine trong chè nguyên liệu đạt mức độ mong muốn, enzyme sẽ bị làm mất hoạt tính, quá trình oxy hóa dừng lại [14]

1.1.1.3 Phân loại chè theo nguồn gốc địa lý

Chè tươi nguyên liệu

Cây chè thường được trồng ở các vùng có khí hậu ở nền nhiệt trung bình

(20-230C) Việt Nam có 2 vùng trồng chè chiếm sản lượng lớn nhất là vùng Trung du miền núi phía bắc (bao gồm các tỉnh như Thái Nguyên, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Giang,…) chiếm 73% sản lượng chè của cả nước và vùng Lâm Đồng chiếm hơn 20 % tổng sản lượng, phần còn lại thuộc các tỉnh khác nằm ở Tây Bắc Bộ và Nam Trung Bộ (như Sơn

La, Lai Châu, Nghệ An,…) Do ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, kĩ thuật canh tác nên chè ở hai vùng trung du miền núi phía bắc và Lâm Đồng có những hương vị khác biệt rõ rệt

Ở vùng trung du miền núi phía bắc, cây chè được trồng trên nền đất feralit đá vôi cách đây khoảng 500 năm Mặt khác, các tỉnh trung du miền núi phía bắc nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa Mùa nóng từ tháng 5 đến tháng 10, nhiệt độ trung bình khoảng 23-280C và lượng mưa chiếm 90% lượng mưa cả năm Mùa đông kéo dài từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau Với nền nhiệt thấp trong mùa đông, cây chè phát triển tương đối chậm nên chè ở vùng trung du miền núi phía bắc luôn có vị đậm

1.1.2 Thành phần hóa học trong chè

Chất lượng chè thành phẩm được quyết định bởi những thành phần hóa học của nguyên liệu và kỹ thuật chế biến Thành phần hóa học của chè biến đổi phức tạp phụ thuộc vào giống, tuổi chè, điều kiện thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác, kĩ thuật chế biến [7,15] Trong thành phần lá chè xanh chứa khoảng 25% tannin (hỗn hợp các catechine và dẫn xuất của chúng), 3-4% caffeine, và hàm lượng các chất khác (bảng 1.1) [99]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lá chè xanh

(tính theo chất khô)

Nhóm các hợp chất polyphenols là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong

lá chè Các hợp chất polyphenols chiếm đa số là các catechine (C, EC, EGCG, EGC, ECG…) trong đó EGCG và EGC chiếm hơn 70% tổng lượng catechine Ngoài ra, trong thành phần polyphenols của chè còn có một số chất khác tỉ lệ thấp như các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin ), các dẫn xuất glucoside như myricetin - 3 - glucoside, kaempferol-3 rhamnodiglucoside , các leucoanthocyanin, các hợp chất poliflavonoid như theaflavin, thearubigin Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ rất thấp trong búp chè và lá chè non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá chè già hơn [99]

b Methylxanthines

Methylxanthines là nhóm hợp chất vòng hữu cơ có chứa nitrogen trong phân

tử Phần lớn các methylxanthines là những chất không màu, có vị đắng Trong lá chè, người ta tìm thấy các methylxanthines chủ yếu là caffeine, theobromine và theophylline Trong đó, caffeine chiếm khoảng 3 - 4% lượng chất khô; theobromine

và theophylline với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng của caffeine, chiếm khoảng 0,2-0,5% khối lượng chất khô Tuy vậy, vai trò của theobromine và theophylline trong cây chè quan trọng hơn so với caffeine [99, 63]

c Acid hữu cơ và vitamin

Trong lá chè chứa các oxalic acid và malic acid, citric acid, isocitric acid và succinic acid Ngoài ra, chè cũng chứa shikimic là một trong những chất có vai trò quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp các polyphenols Vitamin C (ascorbic acid) cũng đã được phát hiện trong chè xanh và đen [99]

d Đường và chất xơ

Trong lá chè các polysaccharides (saccarose, glucose, fructose, raffinose, stachyose) chiếm 14 - 22 % lượng chất khô, chất xơ (cellulose, hemicellulose, lignin) chiếm 4 -7 % lượng chất khô Chất xơ trong chè xanh giúp chống táo bón, kích thích nhu động ruột, thúc đẩy hệ tiêu hóa làm việc hiệu quả và khỏe mạnh hơn

Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng chè xanh dựa trên tổng hàm lượng các methylxanthines, catechine, chất xơ …trong chè được trình bày trong bảng 1.2 [113]

Bảng 1.2 Các tiêu chuẩn hóa lý của châu Âu về sản phẩm chè xanh

Tiêu chuẩn (% khối lượng)

Tiêu chuẩn kiểm tra

2 Hàm lượng tro có thể bị hòa tan trong nước ≥45 ISO1576

3 Độ kiềm khi tro tan vào trong nước, (được quy

4 Hàm lượng tro không tan trong acid ≤ 1 ISO1577

9 Tỷ lệ hàm lượng Catechine/Polyphenols 0.5

Đối với chè xanh Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng cũng áp dụng theo tiêu chuẩn châu Âu và công bố ở TCVN 9740:2013

1.2 Giới thiệu về nhóm chất methylxanthines

1.2.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất

1.2.1.1 Đặc điểm cấu tạo

Xanthine là một purine cơ sở được tìm thấy trong hầu hết các mô và chất của con người và các sinh vật khác Methylxanthines là dẫn xuất methyl hóa của xanthine, chúng là các hợp chất hữu cơ dị vòng được xây dựng từ các vòng pyrimidinedione và imidazole Methylxanthines bao gồm caffeine, theobromine, theophylline, aminophylline, paraxanthine, pentoxifylline, IBMX Các methylxanthines thường được dùng là chất kích thích nhẹ, giãn phế quản và điều trị các triệu chứng hen suyễn Trong chè, cà phê, ca cao thường chỉ tìm thấy ba methylxanthines là caffeine (1,3,7-trimethylxanthine), theophylline (1,3-dimethylxanthine) và theobromine (3,7-dimethylxanthine) Công thức cấu tạo của các methylxanthines được thể hiện trong bảng 1.3 [63]

Bảng 1.3 Công thức cấu tạo, danh pháp IUPAC của các methylxanthines

1,3,7-Trimethyl-1 H -purine-2,6 (3 H, 7 H) -dione

Cà phê, chè, cacao, …

3,7Dihydro3,7dimethyl1 H purine-2,6-dione

-Cà phê, chè, cacao, …

1,3-Dimethyl-7 H dione

-purine-2,6-Cà phê, chè, cacao, …

1,7-Dimethyl-3H-purine-2,6-dione

Động vật tiêu thụ caffeine

1-Methyl-3-(2-7H-purine-2,6-dione

methylpropyl)

Aminophylline C16H24N10O4

1,3-Dimethyl-7H-purine-2,6-dione;

diamine

ethane-1,2

Pentoxifyllin C13H18N4O3

3,7-Dimethyl-1-dihydro-1H-purine-2,6-dione

một lít nước sôi hoà tan 700g caffeine Một số tính chất lý hóa của caffeine, theobromine, theophylline được thể hiện ở bảng 1.4 [63]

Bảng 1.4 Tính chất của một số hợp chất hữu cơ nhóm methylxanthines

Hợp chất Công thức

phân tử

Khối lượng mol phân tử (g/mol)

Khối lượng riêng ở

25 0 C (g/cm 3 )

Nhiệt độ nóng chảy ( 0 C)

Giá trị pKa

Giá trị logP

Theobromine C7H8N4O2 180,164 0,94 345-350 9,9 -2,08 Theophylline C7H8N4O2 180,164 1,05 270-274 8,8 -0,17 Caffeine C8H10N4O2 194,19 1,21 235-240 14,0 -0,13 Các methylxanthines là các bazơ yếu, trong đó caffeine chỉ thể hiện tính bazơ, theobromine và theophylline là các hợp chất lưỡng tính

1.2.2.Tác dụng dược lý

Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định methylxanthines có mặt trong khoảng

100 loài thực vật và phổ biến nhất là cà phê, chè, ca cao [27, 28, 29] Trong thực vật, methylxanthines tồn tại chủ yếu là caffeine, theobromine và theophylline Hiện tại, paraxanthine được xác định là không có mặt trong bất kì loài thực vật nào [32] Trong

ba methylxanthines (caffeine, theobromine và theophylline), caffeine chiếm khối lượng lớn nhất, theobromine và theophylline chiếm lượng nhỏ hơn Ví dụ: caffeine ước tính chiếm 0,4-2,4% trọng lượng khô trong cà phê và 2-5% trong chè; theobromine và theophylline chỉ chiếm khoảng 0,33% trọng lượng khô trong chè

Methylxanthines có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, làm cho tinh thần minh mẫn Một số nghiên cứu chỉ ra rằng methylxanthines ở hàm lượng trung bình sẽ phản ứng lên hệ thần kinh dẫn đến tăng khả năng tiếp nhận các adenosine cho

tế bào thần kinh Bên cạnh đó, methylxanthines kích thích quá trình tiết ra serotonine

ở vỏ não, góp phần làm tăng sự minh mẫn của bộ óc, làm giảm các cơn đau đầu

Methylxanthines được sử dụng là chất kích thích cơ năng và tăng cường hoạt động của tim do đó cơ thể không còn cảm giác mệt mỏi, tăng cường hiệu suất làm

việc và sự dẻo dai Tuy nhiên, đối với những người có bệnh về tim mạch thì việc tăng hoạt động của cơ tim và tốc độ dẫn truyền máu sẽ làm tăng huyết áp và nguy cơ vỡ động mạch

Ngoài ra, methylxanthines có tác dụng kích thích hoạt động của thận giúp cơ thể nhanh chóng đào thải ra ngoài những sản phẩm thừa của quá trình trao đổi chất Methylxanthines làm tăng cường tốc độ máu đến thận, tăng tốc độ lọc của thận và tăng cường sự tiết renin ở thận

Các methylxanthines làm tăng hiệu quả diệt tế bào ung thư của các thuốc chống ung thư Methylxanthines có khả năng ức chế sự tạo liên kết các chất chuyển hóa của các chất gây ung thư đối với chuỗi AND, ức chế sự tăng doxorubicin từ các

tế bào u [53]

1.3 Các phương pháp định lượng methylxanthines trong chè

Trong vòng bốn thập kỉ trở lại đây đã có nhiều phương pháp kỹ thuật khác nhau được sử dụng để xác định đồng thời các methylxanthines trong thực phẩm, đồ uống và các mẫu sinh học Để phân tích đồng thời hàm lượng các chất theobromine, theophylline và caffeine trong mẫu phân tích chủ yếu phải dùng các kĩ thuật tách, định lượng như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [16, 19, 25, 72, 84] Đối với các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ hấp thụ phân tử (UV- Vis), muốn định lượng các chất theobromine, theophylline và caffeine buộc phải sử dụng các thuật toán hồi quy đa biến do sự tương đồng về phổ hấp thụ[59, 60, 80, 104]

Ngoài các phương pháp trên, phương pháp phổ Raman và phương pháp điện hóa cũng được dùng để xác định các hợp chất methylxanthines nhưng chỉ dừng lại ở việc phân tích định tính hoặc định lượng một trong ba methylxanthines [69, 78, 105, 106]

1.3.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Phương pháp HPLC là phương pháp có độ chính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác định các methylxanthines trong thực phẩm, đồ uống

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC nhằm định lượng các methylxanthines và các hợp chất khác trong thực phẩm, đồ uống Trong đó, có những nghiên cứu định lượng ba methylxanthines trong chè, có nghiên cứu thực hiện phân tích nhiều thành phần khác nhau Với mục tiêu khác nhau nên điều kiện xử lý mẫu, điều kiện phân tích sắc ký áp dụng trong các nghiên cứu cũng khác nhau Thông thường, đối với các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC nhằm định lượng các methylxanthines hầu hết các tác giả sử dụng nước ở các nhiệt độ 800C,

900C, 1000C để chiết methylxanthines ra khỏi nền mẫu [16, 24, 48, 84] Đối với nghiên cứu định lượng đồng thời methylxanthines và các hợp chất hữu cơ khác như catechine, amin các tác giả thường dùng các dung môi hữu cơ như: acetonitrile, methanol và ethanol…[40, 66, 72]

Sau quá trình xử lý, mẫu phân tích được tiêm vào hệ thống HPLC với nhiều chế độ pha động và detector khác nhau Theo các nghiên cứu, pha tĩnh được sử dụng phổ biến nhất là C18 với kích thước cột khác nhau Pha động thường là các dung môi phân cực như H2O, MeOH, ACN…hay hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi này theo những

tỷ lệ nhất định Một số loại detector đã được sử dụng như: detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), detector khối phổ (MS) …Trong đó detector UV-Vis được sử dụng phổ biến nhất trong phép xác định các methylxanthines Các nghiên cứu xác định hợp chất methylxanthines và các chất khác trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC được tổng hợp trong bảng 1.5

Bảng 1.5 Một số công trình nghiên cứu xác định các methylxanthines và các chất khác trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC

Lá chè - nước

900C, Chocolate - acetic acid

cà phê

Nước 1000C Zorbax Eclipse

XDB-C8 (150 mm × 4.6 mm × 5 µm)

lỏng-C18 (150 mm × 4,6

mm × 5 µm)

MeOH: đệm phosphate pH=3 (14:86, v/v) 1,0 275 25

10 Caffeine, theobromine,

theophylline

Cô-Ca và cupuacu Acetic acid

C18 (250 mm × 4,6 mm × 5 µm)

Nước: MeOH: AcH (80:19:1, v/v/v) 1,0 275 34

C18 (150 mm × 4,6

mm × 5 µm)

- Kênh A: ACN: acetic acid: nước (6:1:193, v/v/v)

- Kênh B: ACN: acetic acid:nước

(60:1:139, v/v/v) gradient

13 Caffeine, theobromine,

theophylline, Catechin Hạt cacao

MeOH, acetic acid 0,1%

C18(150 mm × 4,6

mm × 5 µm)

MeOH, acetic acid 0,1%

Ở Việt Nam, theo TCVN chưa có quy định về định lượng đồng thời các methylxanthines trong chè, chỉ có quy định về định lượng caffeine trong chè bằng phương pháp HPLC Theo TCVN 9744:2013 qui định phương pháp HPLC để xác định hàm lượng caffeine của chè xanh như sau: caffeine trong mẫu chè xanh được chiết bằng cách cho hồi lưu với nước có magie oxit Sau khi lọc, hàm lượng caffeine được định lượng bằng HPLC với điều kiện: detector UV-273nm, cột tách C18 Partisphere kích thước 110 mm x 4,6 mm với hệ thống HPLC của hãng Whatman, dung môi pha động methalnol:nước (30:70, v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút

Tác giả Đoàn Thị Bích Ngọc và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC detector UV-Vis để định lượng đồng thời hàm lượng theobromine, theophylline và caffeine trong sản phẩm chè ở 4 tỉnh gồm có Phú Thọ, Thái Nguyên, Lào Cai và Nghệ An Quá trình tách được thực hiện với cột LiChrospher 100 RP - 18 (250 mm × 4,6 mm × 5 µm) sử dụng pha động (15/85) = (ACN/ nước cất) với tốc độ 0,8ml/phút và bước sóng phát hiện 271nm Nghiên cứu đã khảo sát bốn loại dung môi chiết mẫu là nước deion, acetonitrile, methanol và ethanol, kết quả cho thấy nước deion cho hiệu quả chiết là tốt nhất Hàm lượng ba methylxanthines trong các mẫu chè được xác định cụ thể như sau: theobromine nằm trong khoảng 0,14-0,68 %, theophylline 0,09-0,25% và caffeine 2,54-4,24% Tuy nhiên số lượng mẫu phân tích còn hạn chế và chỉ tập trung ở một số vùng miền bắc Việt Nam [9]

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

LC-MS/MS là một trong những phương pháp phân tích được sử dụng trong định lượng các chất do có độ chính xác cao Ngoài ra, LC-MS/MS còn cung cấp các thông tin về dữ liệu phổ khối của các tín hiệu chất phân tích, từ tín hiệu này có thể đánh giá về độ tinh khiết pic, có thể dự đoán được cấu trúc hóa học của tín hiệu chất phân tích Đã có một số nghiên cứu áp dụng LC-MS/MS hoặc LC-MS phân tích các methylxathines trong các mẫu chè, cà phê, huyết tương [74, 91]

Với đối tượng là đồ uống, nhóm tác giả Fouad F Al-Qaim và cộng sự [74] đã

nghiên cứu xác định nồng độ theobromine và caffeine trong các mẫu chè, cà phê, milo, pepsi… bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao ((LC-TOF-MS) Quá trình xử lý mẫu chè được thực hiện đơn giản: cho 1 gam chè vào 50 ml nước ở

950C-1000C và duy trì nhiệt độ trong 5 phút Quá trình sắc ký được tiến hành ở 25ºC trên cột Thermo Scientific C18 với chương trình gradient sử dụng dung môi A (dung dịch ACN-MeOH (3:1, v/v)) và dung môi B ( dung dịch acid formic 0,1% trong nước) với tốc độ dòng 0,3 ml/phút Phương pháp xây dựng được xác nhận giá trị sử dụng thông qua các đánh giá về độ nhạy, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng Các phương trình hồi quy tuyến tính thu được với kết quả R>0,979 Độ chính xác lặp lại trong ngày và giữa các ngày với RSD < 13,22%; độ thu hồi nằm trong phạm vi từ 94-

110 % Phương pháp xây dựng đã được áp dụng để định lượng 09 mẫu chè và 13 mẫu đồ uống Kết quả cho thấy, nồng độ caffeine trong các mẫu phân tích nằm trong khoảng 30,4-159,1 mg/l, nồng độ theobromine nằm trong khoảng 16,2-255,8 mg/l

Với mục tiêu định lượng, nhóm tác giả [91] đã xây dựng được phương pháp UHPLC-MS để định lượng nhanh theobromine, theophylline, caffeine trong chè Quá trình sắc ký được tiến hành với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi pha động ACN-nước (90:10, v/v), tốc độ dòng 0,5 ml/phút Các phương trình hồi quy tuyến tính thu được với kết quả R>0,995 Giới hạn phát hiện trong khoảng 0,010-0,025µg/ml Phương pháp xây dựng đã được áp dụng để định lượng 30 mẫu chè Kết quả cho thấy, hàm lượng caffeine trong các mẫu phân tích nhỏ hơn 32,6mg/g và hàm lượng theobromine nhỏ hơn 2,72mg/g

1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

1.3.3.1 Nguyên tắc của phương pháp đo phổ hồng ngoại

* Sự xuất hiện của phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là phổ của các phân tử và nhóm phân tử xuất hiện dưới tác dụng của chùm sáng kích thích có năng lượng phù hợp (tương tác không đàn hồi) nằm trong vùng hồng ngoại (IR), làm cho các điện tử hóa trị trong các liên kết п và

σ của các nguyên tử trong phân tử bị kích thích, chuyển lên mức năng lượng cao E1 Đồng thời, khi đó phân tử, các nhóm phân tử, nguyên tử quay và dao động Ba quá trình đó sinh ra phổ hấp thụ hồng ngoại của chất dưới tác dụng của chùm sáng kích thích

Phổ hồng ngoại này được chia làm 3 miền nhỏ: hồng ngoại gần (12000- 4000

cm-1 (800-3000nm)), hồng ngoại trung bình (4000 - 200 cm-1 (3000- 28000 nm)) và hồng ngoại xa (200- 10 cm-1 (28000- 40000 nm))

* Các kỹ thuật đo phổ cận hồng ngoại

Có ba kỹ thuật đo phổ cận hồng ngoại: truyền qua, phản xạ toàn phần suy giảm

và phản xạ khuếch tán

Kỹ thuật đo truyền qua dựa trên việc xác định tỷ lệ cường độ của chùm bức xạ trước (I0) và sau khi truyền qua mẫu phân tích (I) Khi bức xạ đi qua mẫu, tỷ lệ này phụ thuộc vào độ hấp thụ riêng của phân tử, nồng độ chất phân tích, quang trình và tuân theo định luật Lambert-Beer Kỹ thuật đo truyền qua có ưu điểm là cố định được quang trình của mẫu đo, do đó cường độ phổ sẽ ổn định Tuy nhiên, kỹ thuật đo phản

xạ truyền qua có các nhược điểm như: phải lựa chọn được quang trình và tỷ lệ chất phân tích thích hợp cho các mẫu đo, phải khảo sát điều kiện đo và xây dựng được quy trình phân tích riêng cho từng chất phân tích Ngoài ra, khi đo phổ hồng ngoại bằng kỹ thuật truyền qua công tác chuẩn bị mẫu và căn chỉnh thiết bị rất phức tạp dẫn đến tốn thời gian

Kỹ thuật đo phản xạ suy giảm toàn phần là kỹ thuật mẫu đo được đặt lên bề mặt một dụng cụ có cấu tạo từ các tinh thể phản xạ toàn phần suy giảm Khi bức xạ cận hồng ngoại đi vào lòng các tinh thể sẽ phản xạ nhiều lần qua mẫu đo Sau mỗi lần phản xạ qua mẫu đo, các bức xạ thích hợp sẽ bị hấp thụ dần và làm suy giảm cường độ bức xạ sau khi ra khỏi mẫu phân tích So sánh cường độ đầu vào với cường

độ đầu ra sẽ thu được phổ hồng ngoại của mẫu phân tích Kỹ thuật này có ưu điểm hơn so với kỹ thuật đo truyền qua là phân tích trực tiếp mẫu đo, ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện trang thiết bị, quang trình… Tuy nhiên, các tinh thể phản xạ toàn phần suy giảm thường rất đắt dẫn đến giá thành của thiết bị cao

Kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán là kỹ thuật đo phổ trực tiếp và đơn giản nhất

trong các kỹ thuật đo phổ NIR Bức xạ cận hồng ngoại được chiếu trực tiếp vào mẫu

đo, detector sẽ được bố trí hợp lý để thu được tín hiệu khuếch tán Trong kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán, phổ đồ được xây dựng dựa trên tỷ lệ của cường độ ánh sáng sau khi phản xạ qua mẫu đo với cường độ ánh sáng phản xạ qua bề mặt nền chuẩn So với

các kỹ thuật đo truyền qua thì kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán có nhiều ưu điểm nổi trội là phép đo không phụ thuộc vào độ dày, quang trình của chất phân tích mà chỉ phụ thuộc vào bản chất và tỷ lệ của chất phân tích trong mẫu [1, 10]

1.3.3.2 Định lượng các chất bằng phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là phổ dao động của các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học nên việc định lượng các chất phân tích dựa trên phổ hồng ngoại gặp rất nhiều khó khăn đặc biệt là đối với mẫu thực

Vào cuối thế kỷ 20, sự phát triển của phân tích thống kê đã góp phần đưa phương pháp phổ hồng ngoại tham gia vào các quá trình định lượng chất phân tích trong mẫu So với phương pháp phân tích truyền thống HPLC thì định lượng các chất bằng phổ hồng ngoại có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, chi phí thấp do đó có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu Phương pháp phổ hồng ngoại nhanh chóng được áp dụng để định lượng chất phân tích trong các mẫu thực phẩm, dược phẩm, hóa dầu, dệt may và đặc biệt là việc sử dụng trong phân tích chất lượng của nông sản [18, 21, 52, 57, 75, 80, 83]

Trong ngành công nghiệp dược phẩm, NIR được ứng dụng rộng rãi để kiểm tra chất lượng dược phẩm Trong vòng hai thập kỷ trở lại đây đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc định lượng nhanh các hoạt chất kháng sinh như cephazoline, aminoglycosides, ceftizoxime, ….trong thuốc bằng phép đo hồng ngoại [52, 57, 73, 81, 88] Mẫu thuốc thương mại có chứa hoạt chất và tá dược được đo phổ hồng ngoại với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier So sánh kết quả hàm lượng các hoạt chất được xác định bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến với hàm lượng thực có sai số thấp [82, 86, 89]

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, các tác giả đã nghiên cứu phát triển phương pháp NIR kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến nhằm mục đích định lượng caffeine và một số chất nhóm catechine trong hạt đậu tương [18], bánh mì [21] và cà phê [46] Các mẫu phân tích được đo phổ NIR trong vùng số sóng 10.000 - 4000 cm-

1 Kết quả sự tương quan giữa hàm lượng chất phân tích xác định bằng phương pháp NIR so với phương pháp đối chứng HPLC đạt R ≥0,85

Chè được coi như một loại thảo dược sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học có giá trị Vì vậy, trong vòng hai thập kỉ trở lại đây đã có rất nhiều công trình nghiên cứu định lượng các hợp chất trong chè Các mẫu chè thường được đo bằng phổ hồng ngoại phản xạ trong vùng số sóng 10.000 - 4000 cm-1 Các thuật toán tiền xử lý số liệu như SNV, MSC, MC cũng đã được ứng dụng để thu được kết quả tốt hơn Dữ liệu phổ hồng ngoại kết hợp thuật toán hồi quy đa biến PLS đã định lượng thành công các caffeine và một số chất nhóm polyphenols trong các mẫu chè Tuy nhiên chưa có công trình nào nghiên cứu định lượng đồng thời theobromine, theophylline và caffeine trong chè dựa trên dữ liệu phổ NIR Một số công trình nghiên cứu xác định các hợp chất hữu ích trong chè sử dụng phương pháp phổ NIR kết hợp thuật toán hồi quy đa biến được chỉ ra trong bảng 1.6

Bảng 1.6 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các methylxanthines và các chất khác trong chè bằng phương pháp NIR

TT Chất phân tích

Mẫu

Số lượng mẫu

Phương pháp phân tích

Vùng số sóng (cm -1 )

Phương pháp tiền

xử lý số liệu

Phương pháp xử

lý số liệu

5 Caffeine, catechin (gallic

10 Amino acids, caffeine,

theaflavins

Ở Việt Nam, trước đây phổ NIR thường chỉ được sử dụng để định tính các chất Trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng phổ IR kết hợp hồi quy đa biến với mô hình đường chuẩn đa biến được xây dựng từ bộ mẫu chuẩn rắn tự tạo để định lượng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc Tuy nhiên, đối với các đối tượng phức tạp như chè, cà phê, ca cao… thì việc xây dựng bộ mẫu chuẩn

tự tạo là rất khó khăn

Tác giả Đoàn Thị Huyền đã phát triển thành công phương pháp định lượng đồng thời một số hoạt chất trong thuốc kháng sinh bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp hồi quy đa biến Kết quả cho thấy hai thuật toán hồi quy đa biến PCR và PLS đã được sử dụng thành công để xác định đồng thời một số chất kháng sinh trong cùng nhóm chất với hệ số tương quan R biểu thị hàm lượng tìm được và hàm

lượng biết trước trong mẫu chuẩn kiểm tra đạt từ 0,83 đến 0,99 [2, 3]

1.3.4 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis dựa trên phép đo độ hấp thụ ánh sáng Sau khi chiếu chùm sáng đi qua dung dịch chứa chất phân tích, các phân tử chất phân tích hấp thụ một phần ánh sáng Độ hấp thụ này phụ thuộc vào bước sóng chùm sáng tới và tỉ lệ thuận với nồng độ chất trong dung dịch Dựa vào đó có thể định tính và định lượng chất phân tích

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis có ưu điểm rõ nét so với các phương pháp phân tích công cụ khác là thiết bị nhỏ gọn, kinh tế dễ trang bị cho các phòng thí nghiệm và có thể phân tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp là giới hạn phát hiện đạt khoảng 10-6M đối với các chất có hệ

số hấp thụ mol phân tử cỡ 104 Phương pháp cũng gặp khó khăn khi xác định đồng thời nhiều chất, đặc biệt là trong trường hợp các mẫu thực có nền mẫu phức tạp thì việc định lượng các chất càng trở nên khó khăn UV-Vis đòi hỏi dung dịch đem đo phải có độ bền cao, ít phân ly, có thành phần xác định, ổn định theo thời gian [1, 8, 10] Mặt khác, cũng giống như phương pháp IR, do sự tương đồng về phổ hấp thụ của ba chất CF, TB, TP trong chè nên để định lượng ba hợp chất này cần phải kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển phương pháp Vis với mục đích định lượng các methylxanthines trong các nền mẫu phức tạp như chè, cà phê [49, 60, 76, 94] Để loại bỏ tannin trong nền mẫu, các mẫu chè sau khi ủ trong nước nóng ở 900C sẽ được loại bỏ tannin bằng cách thêm dung dịch lead acetate, lượng lead acetate dư được loại bỏ bằng dung dịch sodium carbonate Dung dịch sau khi loại tannin sẽ đo phổ hấp thụ UV-Vis trong khoảng bước sóng 200-400 nm Ma trận dữ liệu phổ được xử lý bằng mô hình hồi quy tuyến tính PLS [59] hoặc mô hình hồi quy phi tuyến tính ANN [49] trong đó nồng độ caffeine, theobromine đã được xác định bằng phương pháp HPLC Tuy nhiên, với phương pháp trên các nghiên cứu mới chỉ dừng lại trong việc xác định nồng độ caffeine trong các mẫu chè, theobromine

UV-và theophylline với hàm lượng rất nhỏ nên không thể định lượng

Để khắc phục ảnh hưởng của nền mẫu phức tạp, H Bahram và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến trên nền mẫu thực để xác định lượng chất phân tích bằng dữ liệu phổ UV-Vis Các tác giả đã thiết lập một dãy dung dịch thêm chuẩn trên nền mẫu thực chứa đồng thời n chất với ma trận nồng độ của chất phân tích ở các mức khác nhau, dữ liệu độ hấp thụ quang ghi lại dưới dạng ma trận Trong phương pháp thêm chuẩn đa biến, nồng độ của chất phân tích trong mẫu chưa biết được thay đổi lặp đi lặp lại cho đến khi sự đóng góp của chất phân tích trong ma trận dữ liệu dần tiến tới 0 [76]

Nhìn chung, phương pháp UV-Vis có độ chọn lọc và độ nhạy thấp, giới hạn phát hiện cao Quy trình xử lý mẫu khá phức tạp, trước khi đưa vào phân tích đều cần

có quá trình tiền xử lý mẫu như chiết, tách, làm giàu sử dụng dung môi độc hại

1.4 Ứng dụng thống kê đa biến trong phân loại nguồn gốc địa lý chè

1.4.1 Các phương pháp nhận dạng và phân loại đối tượng phân tích

Phương pháp phân tích thống kê đa biến là tìm mối quan hệ giữa các biến trong tập số liệu Trên cơ sở bộ số liệu xây dựng mô hình chứa các dữ liệu về thành phần hóa học của mẫu phân tích, các phương pháp thống kê đa biến sẽ tìm

ra điểm giống nhau và khác nhau giữa các mẫu, từ đó phân loại chúng vào các nhóm khác nhau Với một mẫu bất kỳ khi sử dụng thống kê đa biến hoàn toàn có thể nhận dạng xem chúng thuộc nhóm nào trong các nhóm đã được phân loại [11, 12]

Thống kê đa biến được chia thành hai nhóm chính là phương pháp phân loại

không chỉ dẫn (phân tích nhóm (cụm) (cluster analysis - CA), phân tích thành phần chính (principal component analysis - PCA)) và phân loại có chỉ dẫn (phân tích biệt thức (discriminant analysis - DA), phân tích biệt thức sử dụng bình phương tối thiểu từng phần (Partial Least Square - Discriminant Analysis-PLS-DA), phân tích biệt thức sử dụng phân tích thành phần chính (PCA-DA), mạng nơron nhân tạo (Artificial

neuron network - ANN)

1.4.1.1 Phương pháp phân loại không chỉ dẫn (unsupervised classification)

* Phân tích nhóm (cluster analysis - CA)

Phân tích nhóm (CA) là kỹ thuật phân tích đa biến nhằm phân loại số liệu

thành các nhóm nhỏ hơn có tính chất giống nhau (còn gọi là các cụm) (cluster)

Hai loại phân tích nhóm thường được sử dụng là nhóm theo bậc (hierarchical

clustering) và nhóm k- trungbình (k-mean clustering)

- Nhóm theo bậc nhằm tìm ra các nhóm trong tập số liệu bằng cách tạo ra cây

phân nhóm (cluster tree) Theo phương pháp này, tập số liệu lớn được chia thành các

tập số liệu nhỏ hơn cho đến khi mỗi tập số liệu nhỏ chỉ còn một phần tử Cây phân nhóm gồm nhiều bậc trong đó nhóm ở một mức được nối với với nhóm bên cạch ở mức cao hơn Điều đó cho phép quyết định mức hoặc thang chia nào của nhóm là phù hợp hơn Việc chia nhóm là vấn đề quan trọng thường được dùng trong phân tích nhận dạng, phân tích hình ảnh và các đối tượng khác trong lĩnh vực khoa học và công nghệ

-Nhóm theo k-trung bình: các phần tử trong tập số liệu được tách vào k nhóm, các phần tử cùng nhóm được kết hợp với nhau và các nhóm khác nhau được tách ra khỏi nhau

Phương pháp phân tích nhóm có nhược điểm là không giả thiết có phân phối chuẩn giữa các biến Phân tích nhóm giả thiết phép đo khoảng cách thích hợp giữa các cặp được lựa chọn Kết quả của phân tích nhóm tuỳ thuộc vào khoảng cách này được tính thế nào Vì vậy có thể có những mô hình khác nhau tuỳ theo cách tính khác nhau về khoảng cách giữa các cặp biến [11, 12]