So sánh tương đồng gen NSP2 ORF7 giữa một chủng văcxin với các chủng virút HP PRRS thực địa và đánh giá hiệu quả bảo hộ của chủng vắc xin này chống lại HP PRRS dị chủng trên heo cai sữa

TÓM TẮT Đề tài “So sánh tương đồng gen NSP2, ORF7 giữa một chủng vắc-xin với các chủng vi-rút HP-PRRS thực địa và đánh giá hiệu quả bảo hộ của chủng vắc-xin này chống lại HP-PRRS dị chủ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

******************

LÊ THỊ MAI HOA

SO SÁNH TƯƠNG ĐỒNG GEN NSP2, ORF7 GIỮA

MỘT CHỦNG VẮC-XIN VỚI CÁC CHỦNG VI-RÚT HP-PRRS THỰC ĐỊA VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ

BẢO HỘ CỦA CHỦNG VẮC-XIN NÀY CHỐNG LẠI HP-PRRS DỊ CHỦNG

TRÊN HEO CAI SỮA

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 11/2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

******************

LÊ THỊ MAI HOA

SO SÁNH TƯƠNG ĐỒNG GEN NSP2, ORF7 GIỮA

MỘT CHỦNG VẮC-XIN VỚI CÁC CHỦNG VI-RÚT HP-PRRS THỰC ĐỊA VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ

BẢO HỘ CỦA CHỦNG VẮC-XIN NÀY CHỐNG LẠI HP-PRRS DỊ CHỦNG

TRÊN HEO CAI SỮA

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

SO SÁNH TƯƠNG ĐỒNG GEN NSP2, ORF7 GIỮA MỘT CHỦNG VẮC-XIN VỚI CÁC CHỦNG VI-RÚT HP-PRRS THỰC ĐỊA VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ BẢO HỘ CỦA CHỦNG VẮC-XIN NÀY CHỐNG LẠI HP-PRRS DỊ CHỦNG

TRÊN HEO CAI SỮA

LÊ THỊ MAI HOA

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

2 Thư ký: TS NGUYỄN VŨ PHONG

3 Phản biện 1: TS NGUYỄN NGỌC TẤN

4 Phản biện 2: TS HUỲNH VĂN BIẾT

5 Ủy viên: PGS.TS LÊ ĐĂNG ĐẢNH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một phần

trong đề tài “Phân tích đa dạng gen của HP-PRRSV tại Việt Nam và hiệu quả

vaccine chống lại chủng gây nhiễm thực địa” do TS Đỗ Tiến Duy làm chủ nhiệm

Những số liệu trong luận văn được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, Ban Quản lý Bệnh viện Thú y – Khoa Chăn nuôi Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Tất Toàn và TS Đỗ Tiến Duy đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Lê Đình Đôn cùng toàn thể quý thầy cô của Bộ môn Công nghệ Sinh học đã dạy đỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Xin cảm ơn thầy Võ Tấn Đại, cô Nguyễn Thị Thu Năm và các anh, chị tại Bệnh viện Thú y trường Đại học Nông Lâm đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn gia đình và tập thể lớp cao học CNSH 2013 đã luôn chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

TP Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016

LÊ THỊ MAI HOA

TÓM TẮT

Đề tài “So sánh tương đồng gen NSP2, ORF7 giữa một chủng vắc-xin với

các chủng vi-rút HP-PRRS thực địa và đánh giá hiệu quả bảo hộ của chủng vắc-xin

này chống lại HP-PRRS dị chủng trên heo cai sữa” được tiến hành tại Bệnh viện

Thú y -Trường Đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 11/2014 đến tháng 08/2015 nhằm phân tích tương đồng gen giữa một chủng vắc-xin với các chủng HP-PRRS thực địa làm tiền đề để đánh giá khả năng bảo hộ của chủng vắc-xin nhược độc này trên heo con cai sữa được gây nhiễm với vi-rút PRRS chủng độc lực cao (HP-PRRSV)

34 chủng PRRSV thực địa có đặc trưng đột biến mất đoạn 30 axít amin ở

NSP2 Kết quả tương đồng nucleotit giữa chủng vi-rút vắc-xin, chủng gây nhiễm,

chủng Lelystad, VR2332, CH-1a và JXA1 so với các chủng HP-PRRSV thu thập thực địa trong nghiên cứu ở gen NSP2 lần lượt là 72,71%, 99,25%, 37,12%, 66%, 77,01% và 96,89% và ở gen ORF7 lần lượt là 94,48%, 97,11%, 63,63%, 94,35%, 94,83% và 97,37% Chủng vắc-xin P129 và chủng gây nhiễm MB6 tương đồng gen thấp ở đoạn gen NSP2 (72,7 % ) và tương đồng gen cao ở ORF7 (94,8 %)

Tổng số 21 heo con ở 3 tuần tuổi, khỏe mạnh, âm tính với vi-rút PRRS được chọn và phân bố ngẫu nhiên vào 2 lô thí nghiệm (lô tiêm phòng vắc-xin:12 con và

lô không tiêm phòng vắc-xin: 9 con) Sau 35 ngày tiêm vắc-xin (ngày 0 của thí nghiệm gây nhiễm), tất cả heo được gây nhiễm với 3ml huyễn dịch vi-rút HP-PRRS chủng MB6, 105 TCID50/ml Heo thí nghiệm được đánh giá dấu hiệu hô hấp lâm sàng, bệnh tích đại thể, vi thể, nhiệt độ trực tràng, đáp ứng kháng thể, nồng độ vi-rút huyết và hàm lượng phân bố kháng nguyên tại mô

Đáp ứng kháng thể IgG trên lô heo được tiêm vắc-xin khác biệt so với lô heo không tiêm vắc-xin ở ngày thứ 28 (P<0,05) và ngày thứ 35 (P<0,01) sau tiêm phòng Sau gây nhiễm, hàm lượng kháng thể IgG ở lô heo tiêm vắc-xin cao hơn rất

có ý nghĩa vào các thời điểm 3, 5, 7 và 10 so với lô heo không tiêm vắc-xin

(P<0,01) Ở giai đoạn tiêm phòng, hàm lượng kháng thể trung hòa không có sự khác biệt giữa lô heo được tiêm vắc-xin và lô heo không được tiêm vắc-xin Nhưng hàm lượng kháng thể trung hòa này ở lô tiêm vắc-xin cao hơn rất có ý nghĩa (P<0,05) so với lô không tiêm vắc-xin vào các thời điểm 7, 10, 14 sau gây nhiễm Số lượng tế bào chế tiết IFN--SC trên lô heo tiêm vắc-xin cao hơn có ý nghĩa so với heo không tiêm vắc-xin vào ngày 21, 28 và 35 (P<0,05) sau khi tiêm phòng và vào thời điểm 7,

10 (P<0,05) và 14 (P<0,001) ngày sau gây nhiễm

Lô heo được tiêm vắc-xin có dấu hiệu hồi phục khi nhiệt độ trực tràng thấp khác biệt so với lô heo không tiêm vắc-xin từ ngày 4 đến ngày 10 (P<0,05) Tương

tự, nồng độ vi-rút huyết sau gây nhiễm có sự khác biệt có ý nghĩa giữa lô tiêm phòng so với lô không tiêm phòng ở ngày 10 (P<0,05) Sự khác biệt điểm hô hấp trung bình giữa lô tiêm phòng và không tiêm phòng có ý nghĩa ở ngày 5 (P<0,01) Điểm bệnh tích đại thể khác biệt giữa lô tiêm phòng so với lô không tiêm phòng ở ngày 7 (P<0,05), ngày 10 và ngày 14 (P<0,01); bệnh tích vi thể cũng có khác biệt ở ngày 7, 10, 14 (P<0,05) và điểm phân bố kháng nguyên tại mô phổi có khác biệt ở ngày 7, 10 (P<0,05) và ngày 14 (P<0,01)

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tiêm vắc-xin đã tạo kháng thể (dịch thể và

tế bào) giúp heo con giảm thiểu đáng kể các triệu chứng lâm sàng, bệnh lý phổi, hàm lượng vi-rút huyết và mật độ vi-rút tại mô phổi so với heo không được tiêm vắc-xin sau khi gây nhiễm nhưng hiệu quả bảo hộ của vắc-xin chưa đầy đủ để chống lại sự nhiễm trùng của vi-rút HP-PRRS (MB6) dị chủng qua gây nhiễm thực nghiệm trên heo cai sữa

All of 34 strains of recently collected HP-PRRSV had the same mutation of deletion of 30 amino acid in NSP2 The nucleotide similarities between the vaccine virus strain, infectious strain – MB6, the Lelystad, VR2332, CH-1a and JXA1 to the recently collected HP-PRRSV in the research respectively as 72.71%, 99.25%, 37.12%, 66%, 77.01%, 96.89% in NSP2 gene, and in the ORF7 gene, the percentages as respectively as 94.48%, 97.11%, 63.63%, 94.35%, 94.83%, 97.37% The Fostera P129 (new-live attenuated vaccine strain) showed the low genetic similarity to infectious virus strain – MB6, in NSP2 (72.7%) and high genetic similarity in ORF7 (94.8%) gene

Total 21 healthy 3-week-old piglets derived from negative farms of PRRSV were used in experiment Pigs were allocated into two groups, including (i) vaccinated and (ii) non-vaccinated At the 35th day of post-vaccination, all pigs were infected with 3ml of viral suspension of MB6 of HP-PRRSV, and 105TCID50/ml Experimental pigs were evaluated the clinical respiratory signs, macroscopic pathological, microscopic pathological, rectal temperature, antibody response, concentration of virus in the blood and distribution antigen levels in tissue

Research results showed that the IgG antibody-response on both groups, vaccinated and non – vaccinated, are different at the day of 28th (P<0.05) and day

of 35th (P<0.01) post-vaccination After infection, the IgG antibody levels in vaccinated group are higher and more significant than non-vaccinated group at the days of 3th, 5th, 7th and 10th (P<0.01) There are no different in the neutralizing-antibody levels between vaccinated and non-vaccinated groups at the time of vaccination But the higher neutralizing-antibody levels in the vaccination group are more significant at the day of 7th, 10th and 14th post-infection, compared to the non-vaccination group (P<0.05) The number of secreted-cells IFN--SC on the vaccinated group are higher and more significant than the non-vaccinated group on the day of 21th, 28th, 35th (P<0.05) post-vaccination and on the day of 7th, 10th (P<0.05), 14th (P<0.001) post-infection

After infection, the vaccinated piglets were showing most signs of recuperate

as of the different in low rectal-temperature, from the days of 4th to 10th (P<0.05), compared to the piglets in the non-vaccination group Similarly, the concentration

of viremia in post-infection showed more difference and more significant between the vaccinated group and non-vaccinated group on the day of 10th (P<0.05) Difference of the average respiratory-points between the vaccinated and non- vaccinated groups are significant on the day of 5th (P<0.01).The macroscopic-pathological-points in both groups showed more distinctive on the day of 7th (P<0.05) and on the day of 10th, 14th (P<0.01); while the microscopic-pathological was dissimilar on the day of 7th, 10th, 14th (P<0.05), and the distribution-antigens-points in the lung tissue also difference on the day of 7th, 10th (P<0.05), and on the day of 14th (P<0.01)

The results showed that the vaccine can be generated antibodies to help piglets reduce the clinical symptoms, lung pathology and internal organs pathology, the amount of virus in blood and reduce density virus in the lung tissue, compared

to pigs from the non-vaccinated group, but the effective of protection is incomplete

to against the infection of heterologous HP-PRRS virus (MB6) via the experimentally infection

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Trang Chuẩn Y ii

Lý lịch cá nhân iii

Lời cam đoan iv

Lời cảm ơn v

Tóm tắt vi

Summary viii

Mục lục xi

Danh sách các chữ viết tắt xv

Danh sách các bảng xvii

Danh sách các hình xviii

Đặt vấn đề 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) 3

1.2 Giới thiệu về vi-rút PRRS (PRRSV) 5

1.2.1 Cấu trúc bộ gen 5

1.2.2 Hình thái của hạt vi-rút PRRS 6

1.2.3 Protein PRRSV 6

1.2.3.1 Protein không cấu trúc 6

1.2.3.2 Protein cấu trúc PRRSV 7

1.2.3.3 Chu kỳ sao chép của PRRSV 10

1.2.4 Sự đa dạng gen của PRRSV 12

1.2.5 Đặc điểm của HP-PRRSV 13

1.3 Miễn dịch với PRRSV 13

1.3.1 Miễn dịch bẩm sinh với PRRSV 13

1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu với PRRSV 15

1.3.2.1 Miễn dịch qua trung gian tế bào với PRRSV 15

1.3.2.2 Miễn dịch dịch thể với PRRSV 16

1.4 Miễn dịch từ vắc-xin PRRS 17

1.4.1 Vắc-xin sống nhược độc (modified live virus –MLV vaccine) 17

1.4.2 Vắc-xin vô hoạt (Killed virus-KV vaccine) 17

1.5 Triệu chứng lâm sàng của heo nhiễm PRRSV 20

1.6 Bệnh tích trên heo nhiễm PRRSV 21

1.6.1 Bệnh tích đại thể 21

1.6.2 Bệnh tích vi thể 22

1.7 Các phương pháp chẩn đoán 23

1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 23

1.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 23

1.7.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 23

1.8 Khảo lược một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 24

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Thời gian và địa điểm 28

2.2 Đối tượng nghiên cứu 28

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.4 Vật liệu và hóa chất 28

2.4.1 Nguyên liệu 28

2.4.2 Hóa chất 29

2.4.3 Dụng cụ 29

2.4.4 Thiết bị 29

2.5 Phương pháp tiến hành 30

2.5.1 Bố trí thí nghiệm 30

2.5.2 Phân tích mức độ tương đồng trình tự gen NSP2 và ORF7 của các chủng PRRSV thực địa và chủng vi-rút vắc-xin nghiên cứu 32

2.5.2.1 Bố trí nội dung 1 32

2.5.2.2 Mục tiêu 32

2.5.2.3 Thu thập mẫu và xử lý mẫu thực địa 32

2.5.2.4 Primer (mồi) và phản ứng PCR nhân bản sản phẩm gen 35

2.5.2.5 Giải trình tự và phân tích tương đồng gen 36

2.5.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 36

2.5.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch và hiệu quả bảo hộ của vắc-xin 36

2.5.3.1 Bố trí nội dung 2 36

2.5.3.2 Đánh giá đáp ứng kháng thể trên heo thí nghiệm 38

2.5.3.2.1 Mục tiêu 38

2.5.3.2.2 Đánh giá đáp ứng kháng thể trên heo thí nghiệm 38

2.5.3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 40

2.5.3.3 Đánh giá hàm lượng vi-rút huyết trên heo thí nghiệm 40

2.5.3.3.1 Mục tiêu 40

2.5.3.3.2 Đánh giá hàm lượng vi-rút vắc-xin huyết trên heo thí nghiệm 40

2.5.3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 41

2.5.3.4 Đánh giá triệu chứng lâm sàng trên heo thí nghiệm 41

2.5.3.4.1 Mục tiêu 41

2.5.3.4.2 Đánh giá triệu chứng lâm sàng sau gây nhiễm 42

2.5.3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 42

2.5.3.5 Đánh giá bệnh lý trên heo thí nghiệm 42

2.5.3.5.1 Mục tiêu 42

2.5.3.5.2 Đánh giá bệnh lý sau gây nhiễm 42

2.5.3.5.3 Phương pháp xử lý số liệu 43

2.5.3.6 Đánh giá hàm lượng kháng nguyên trên mô phổi heo 44

2.5.3.6.1 Mục tiêu 44

2.5.3.6.2 Đánh giá hàm lượng kháng nguyên trên mô phổi heo sau gây nhiễm 44

2.5.3.6.3 Phương pháp xử lý số liệu 44

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Phân tích tương đồng gen NSP2 và ORF7 giữa chủng vi-rút vắc-xin so với các chủng PRRSV thực địa 45

3.1.1 Sự tương đồng NSP2 và ORF7 45

3.1.2 Mối liên hệ qua cây sinh dòng 51

3.2 Đánh giá đáp ứng miễn dịch và hiệu quả bảo hộ của vắc-xin 54

3.2.1 Đánh giá đáp ứng miễn dịch trên heo thí nghiệm 54

3.2.1.1 Kết quả đáp ứng kháng thể IgG 54

3.2.1.2 Kết quả đáp ứng kháng thể trung hòa 55

3.2.1.3 Kết quả đáp ứng kháng thể IFN--SC 56

3.2.2 Đánh giá hiệu quả bảo hộ trên heo thí nghiệm 58

3.2.2.1 Kết quả đánh giá hàm lượng vi-rút huyết trên heo thí nghiệm 58

3.2.2.2 Kết quả đánh giá triệu chứng lâm sàng trên heo thí nghiệm 59

3.2.2.2.1 Nhiệt độ trực tràng 59

3.2.2.2.2 Triệu chứng lâm sàng 60

3.2.2.2.3 Điểm hô hấp lâm sàng 61

3.2.2.3 Kết quả đánh giá bệnh lý trên heo thí nghiệm sau gây nhiễm 62

3.2.2.3.1 Bệnh tích đại thể 62

3.2.2.3.2 Bệnh tích vi thể 63

3.2.2.4 Kết quả đánh giá hàm lượng kháng nguyên trên mô phổi heo 65

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66

1 Kết luận 66

2 Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 79

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleic

BAL Broncho-alveolar lavage

CPE Cytopathic effect

Dpi Days post innoculation

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

ELISPOT Enzyme-linked ImmunoSpot

HP-PRRSV Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome

virus IFA Indirect fluorescent antibody

mARN Messenger axit ribonucleic

MHC Major histocompatibility complex

MLV Modified live virus

NF-κB Nuclear factor-kappa B

NSP Nonstructural protein

PAM Pulmonary alveolar macrophages

PBMC Peripheral blood mononuclear cells

PP Polyprotein

PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Real-time PCR Real-time polymerase chain reaction

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction

TCID50 Tissue culture infective dose 50

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng hợp tình hình dịch PRRS trong 4 năm (2007-2010) 4

Bảng 1.2 Tổng quan về các protein cấu trúc PRRSV 8

Bảng 1.3 Các loại vắc-xin PRRSV nhược độc trên thị trường 18

Bảng 1.4 Các loại vắc-xin PRRSV vô hoạt trên thị trường 19

Bảng 1.5 Các loại vắc-xin PRRS lưu hành tại Việt Nam 20

Bảng 2.1 Chủng PRRSV và chủng vắc-xin tham khảo sử dụng trong nghiên cứu

33

Bảng 2.2 34 chủng HP-PRRSV thu thập thực địa trong nghiên cứu 34

Bảng 2.3 Quy trình luân nhiệt PCR nhân bản gen NSP2, ORF7 36

Bảng 2.4 Tóm lược thí nghiệm và bố trí thu mẫu phân tích hiệu quả bảo hộ của vắc-xin 38

Bảng 3.1 Sự tương đồng (%) nucleotit (NSP2 và ORF7) giữa chủng vi-rút vắc-xin, chủng gây nhiễm MB6 và các chủng tham chiếu với các chủng HP-PRRSV thu thập thực địa trong nghiên cứu 46

Bảng 3.2 Tỷ lệ (%) triệu chứng lâm sàng của heo sau khi gây nhiễm thực nghiệm 61

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh PRRS năm 2013 3

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của PRRSV 5

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của PRRSV 6

Hình 1.4 Tổng quan về sự nhân lên của PRRSV 11

Hình 1.5 Triệu chứng lâm sàng điển hình của heo nhiễm PRRSV độc lực cao 21

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 31

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích mức độ tương đồng trình tự gen 32

Hình 2.3 Thời gian biểu thực hiện nghiên cứu 37

Hình 2.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng phiên mã ngượctrên máy PCR 41

Hình 2.5 Tỷ lệ phần trăm phân chia thùy phổi được sử dụng để đánh giá bệnh tích phổi 43

Hình 3.1 Các vùng đột biến mất đoạn (được kẽ khung) trên gen NSP2: so sánh giữa các chủng tham chiếu, chủng vi-rút vắc-xin với 34 chủng HP-PRRSV thu thập thực địa trong nghiên cứu 47

Hình 3.2 So sánh trình tự nucleotit trên gen ORF7: so sánh giữa các chủng tham chiếu, chủng vi-rút vắc-xin với 34 chủng HP-PRRSV thu thập thực địa 49

Hình 3.3 Hình ảnh cây sinh dòng NSP2 giữa 34 chủng HP-PRRSV thu thập thực địa trong nghiên cứu cùng với các chủng vi-rút tham chiếu và chủng vắc-xin 52

Hình 3.4 Sơ đồ cây sinh dòng ORF7 giữa 34 chủng HP-PRRSV thu thập thực địa trong nghiên cứu cùng với các chủng vi-rút tham chiếu và chủng vắc-xin 53

Hình 3.5 Đáp ứng kháng thể IgG 55

Hình 3.6 Đáp ứng kháng thể trung hòa 56

Hình 3.7 Đáp ứng kháng thể IFN- 57

Hình 3.8 Hàm lượng vi-rút vắc-xin huyết trên heo 59

Hình 3.9 Nhiệt độ trực tràng (oC) trung bình heo sau khi gây nhiễm thí nghiệm

60

Hình 3.10 Trung bình điểm hô hấp lâm sàng trên heo sau khi gây nhiễm thí nghiệm 62

Hình 3.11 Điểm bệnh tích đại thể viêm phổi kẽ sau gây nhiễm 63

Hình 3.12 Bệnh tích phổi trên heo thí nghiệm vào ngày 14 sau khi gây nhiễm 63

Hình 3.13 Điểm bệnh tích vi thể viêm phổi kẽ sau gây nhiễm 64

Hình 3.14 Bệnh tích vi thể phổi trên heo thí nghiệm vào ngày 14 sau khi gây nhiễm 64

Hình 3.15 Điểm phân bố kháng nguyên trong mô phổi heo sau gây nhiễm 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên heo do vi-rút gây ra Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRSV) có vỏ

bao bọc, ARN sợi đơn dương, thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ

Nidovirales (Ropp và ctv, 2004) Đích tấn công của vi-rút là các đại thực bào dẫn

đến làm suy giảm hệ miễn dịch trên heo, tạo điều kiện cho các vi-rút, vi khuẩn gây bệnh cơ hội tấn công, heo mắc PRRS thường kế phát cùng nhiều bệnh nguy hiểm khác làm cho công tác chẩn đoán gặp nhiều khó khăn PRRS có đặc trưng lâm sàng như rối loạn sinh sản trên heo nái và rối loạn hô hấp trên heo con, đặc biệt nguy hiểm trên heo con sau cai sữa vì đây là nhóm heo mẫn cảm nhất với PRRSV (Phạm

Sỹ Lăng và ctv, 2007; Nguyễn Thị Lan và Nguyễn Thị Hoa, 2012)

Năm 2006, một bệnh mới nổi “hội chứng sốt cao trên heo” được báo cáo lần đầu tiên tại Trung Quốc Sau đó, hội chứng này được xác định nguyên nhân là do một biến thể của PRRSV được đặt tên là PRRSV chủng độc lực cao (HP-PRRSV) HP-PRRSV gây tỷ lệ mắc bệnh cao (50-100%) và tỷ lệ tử vong cao (20-100%) trên heo Tại Việt Nam, sự bùng phát dịch bệnh này gây ra tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi heo bắt đầu từ tháng 3 năm 2007, sau đó HP-PRRS lây lan nhanh khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung và niềm Nam (Do và ctv, 2015a; Do và ctv, 2015b) Năm

2008, dịch HP-PRRS đã xảy ra ở 956 xã, phường thuộc 103 quận, huyện của 26 tỉnh, thành phố; số heo chết và tiêu hủy lên đến 300.906 con trên 309.586 heo bệnh Năm 2010, dịch HP-PRRS lại tái phát với số heo chết và tiêu hủy là 241.109 con trong 458.894 heo bệnh. Các mẫu phân lập PRRSV của Việt Nam cho thấy có độ tương đồng cao khoảng 98,7% - 99,8% so với HP-PRRSV tại Trung quốc (Nguyễn Văn Cảm và ctv, 2011) Nghiên cứu của Do và ctv (2015a) cho thấy chủng HP-PRRS MB6 (phân lập tại miền Bắc Việt Nam năm 2009) và chủng HP-PRRS MN1 (phân lập tại miền Nam Việt Nam năm 2013) có tương đồng di truyền cao (khoảng

96,2% trình tự axít amin NSP2) nhưng chủng MB6 có độc lực cao hơn chủng MN1

và tỷ lệ tử vong khoảng 50% số heo nhiễm MB6

Nhiều nghiên cứu thử nghiệm và sản xuất vắc-xin đã được thực hiện để đánh giá bảo hộ các chủng PRRSV cổ điển Tuy nhiên, hiệu quả bảo hộ chưa được nghiên cứu đầy đủ để đánh giá hiệu quả phòng bệnh do HP-PRRSV Xuất phát từ

thực tiễn đó, nghiên cứu “So sánh tương đồng gen NSP2, ORF7 giữa một chủng

vắc-xin với các chủng vi-rút HP-PRRS thực địa và đánh giá hiệu quả bảo hộ

của chủng vắc-xin này chống lại HP-PRRS dị chủng trên heo cai sữa” được

Yêu cầu của đề tài

Sử dụng các chủng HP-PRRSV thực địa từ năm 2009-2014 tại nhiều tỉnh

thành trên cả nước và tiến hành giải trình tự gen NSP2, ORF7 của chúng; so sánh trình tự gen NSP2, ORF7 giữa chủng vi-rút vắc-xin và các chủng vi-rút HP-PRRS

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) là một bệnh truyền nhiễm do vi-rút gây ra với những biểu hiện đặc trưng gây rối loạn sinh sản và hô hấp Các triệu chứng được ghi nhận như sảy thai, đẻ muộn ở heo nái; viêm tinh hoàn ở heo đực; tiêu chảy, viêm phổi và tai xanh ở heo con theo mẹ (Ropp và ctv, 2004; Phạm Sỹ Lăng và ctv, 2007)

Hội chứng được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1987 tại Hoa Kỳ và sau đó hội chứng này đã lây lan nhanh trở thành một bệnh dịch lớn tại Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á trong những năm tiếp theo Ngày nay, PRRS đã trở thành một bệnh dịch địa phương đối với ngành chăn nuôi heo toàn cầu Tuy nhiên Thụy Điển, New Zealand

và Úc đã tuyên bố không có bệnh này (Ropp và ctv, 2004; Phạm Sỹ Lăng và ctv, 2007)

Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh PRRS năm 2013

(Nguồn: WAHID OIE)

Năm 2006, một chủng vi-rút PRRS độc lực cao (HP-PRRSV) có đặc điểm đột biến mất đoạn 30 axít amin trong vùng mã hóa NSP2 được phân lập trong các ổ dịch tại Trung Quốc Bệnh đặc trưng bởi sốt cao, tỷ lệ mắc bệnh cao (50% đến 100%) và tỷ lệ tử vong cao (20% đến 100%) Sau đó, HP-PRRSV đã lan truyền nhanh chóng qua các nước Đông Nam Á lân cận như Việt Nam, Lào, Campuchia, Myanmar, Philippines và Nga Hiện nay, HP-PRRSV gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi heo tại các nước châu Á (Yu và ctv, 2015; Do và ctv, 2015a;

Do và ctv, 2015b)

Theo báo cáo của Cục thú y (2007), toàn quốc có 324 xã, phường của 65 huyện, quận thuộc 18 tỉnh, thành phố có dịch bệnh PRRS Số heo mắc bệnh là 70.577 con (chiếm 0,26% tổng đàn, toàn quốc có 26.560.651 con), số heo chết và phải tiêu huỷ là 20.366 (chiếm gần 0,08%) Đợt dịch năm 2010, bệnh đã xuất hiện tại 1.978 xã, phường, thị trấn thuộc 286 quận, huyện của 49 tỉnh, thành phố; tổng số heo mắc bệnh là 12.947 con, số heo chết và buộc phải tiêu huỷ là 442.699 con Năm

2011, dịch bệnh xuất hiện 2 đợt ở 35 tỉnh thành trên cả nước, tổng số lợn mắc bệnh

là trên 42.000 con, gần 21.000 con phải tiêu hủy Năm 2012, 12 tỉnh thành trong cả nước xảy ra dịch bệnh với số lượng heo bệnh là 33.239 con, số heo chết và tiêu hủy

là 30.441 con Trong năm 2013, bệnh đã xảy ra tại 168 xã, phường của 46 huyện, quận thuộc 13 tỉnh; tổng số heo mắc bệnh là 38.532 con, số heo tiêu hủy là 18.452 con Năm 2014, dịch bệnh đã được khống chế nhưng đến tháng 10/2015, bệnh đã xảy ra tại 4 tỉnh; tổng số heo mắc bệnh và tiêu hủy là 229 con và tháng 8/2016, bệnh

đã xảy ra tại 1 tỉnh; tổng số lợn mắc bệnh là 72 con

Bảng 1.1 Tổng hợp tình hình dịch PRRS trong 4 năm (2007-2010)

(Văn Đăng Kỳ, 2012) Năm Số tỉnh Số huyện có dịch Số xã, phường có dịch Số heo mắc bệnh Số heo chết, tiêu hủy

1.2 Giới thiệu về vi-rút PRRS (PRRSV)

1.2.1 Cấu trúc bộ gen

Vi-rút PRRS (PRRSV) thuộc nhóm Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ

Nidovirales Bộ gen của PRRSV là một ARN mạch đơn dương, có kích thước

khoảng 15 kb, chứa 10 khung đọc mở (ORF) Đầu 3' có gắn đuôi poly (A) và đầu 5' gắn cấu trúc mũ methyl (Ropp và ctv, 2004; Snijder và ctv, 2013; Edgar và ctv, 2015)

Bộ gen bao gồm hai gen polymerase là ORF1a và ORF1b và 8 gen cấu trúc

là ORF2a, 2b, 3, 4, 5a, 5, 6 và 7 ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 75% bộ gen rút, nằm tại đầu 5’ của bộ gen và mã hóa hai polypeptide (PP) không cấu trúc là PP1a và PP1ab ORF 2-7 nằm tại đầu 3’ bộ gen của vi-rút và mã hoá cho 8 protein cấu trúc của vi-rút là GP2a, E, GP3, GP4, GP5, protein ORF5a, M và N ORF1a được dịch mã trực tiếp trong khi ORF1b được dịch mã bởi khung dịch chuyển ribosome Sự phân giải PP1ab tạo ra các sản phẩm NSP9, NSP10, NSP11 và NSP12 liên quan đến sự sao chép và nhân bản của vi-rút Các PP1a được phân giải tạo ra 9 protein không cấu trúc là: NSP1α, NSP1β, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6, NSP7

vi-và NSP8 Quá trình phân giải protein để tạo ra các NSP được thực hiện bởi bốn enzyme được mã hóa trong các vùng NSP1α, NSP1β, NSP2 và NSP4 Các khung đọc mở ORF2a, ORF3, ORF4 và ORF5 mã hóa cho các protein glycosyl hóa tương ứng là GP2a, GP3, GP4, GP5 Riêng các ORF2b thì mã hóa cho các protein nhỏ nhất của các hạt vi-rút là GP2b (Snijder và ctv, 1996; Ropp và ctv, 2004; Edgar và ctv, 2015)

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của PRRSV (Edgar và ctv, 2015)

1.2.2 Hình thái của hạt vi-rút PRRS

Hạt vi-rút PRRS có hình cầu (50-60 nm) bao gồm một lõi nucleocapsid khoảng 40 nm, được bao bọc bởi một lớp vỏ lipid kép (Dokland, 2010) Lớp vỏ lipid có chứa nhiều protein vỏ: các protein không glycosyl hóa M, E và các glycoprotein GP2a, GP3, GP4 và GP5 Các GP5 và protein M là protein lớp vỏ chính, chúng xuất hiện trong các hạt vi-rút bằng liên kết cộng hóa trị cấu trúc dị dimer (Dokland, 2010; Mardassi và ctv, 1996) Các protein vỏ xuất hiện với số lượng rất ít là protein lớp vỏ phụ Các GP2, GP3 và GP4 được kết hợp thông qua các tương tác hóa học và protein E được liên kết với các bộ ba có 3 phân tử glycoprotein này (Wissink và ctv, 2005) Nucleocapsid của PRRSV được bao bọc bằng protein nucleocapsid (N) Các protein N chiếm phần lớn trong hạt vi-rút PRRS bằng các liên kết đisunfua (S-S) giữa các phân tử protein N (Music và Gagnon, 2010)

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của PRRSV (Mateu và ctv, 2011)

1.2.3 Protein PRRSV

1.2.3.1 Protein không cấu trúc

NSP1 có 383 axít amin, chứa hai tiểu phần: NSP1α và NSP1β (Edgar và ctv, 2015) NSP1β có khả năng ức chế sự tổng hợp và sự truyền tín hiệu IFN, trong khi

NSP1α chỉ ức chế mạnh sự tổng hợp IFN Biểu hiện của NSP1β là ức chế mạnh yếu

tố điều hòa IFN IRF3 (IFN regulatory factor 3) (Beura và ctv, 2010) NSP2 là một yếu tố quan trọng trong việc chống lại các chức năng kháng vi-rút của gen ISG15 (interferon-stimulated gene 15) (Sun và ctv, 2012) và kích hoạt yếu tố NF-κB (Fang

và ctv, 2012) Các tế bào bị nhiễm PRRSV tạo ra nhiều NSP2 và các NSP2 này cùng với NSP3 và NSP5 làm biến đổi màng của tế bào bị nhiễm để ưu tiên lắp ráp các phức hợp đa protein trong quá trình nhân lên của vi-rút NSP4 là enzyme phân giải protein quan trọng của vi-rút có vị trí hoạt động chứa 3 axít amin His 1103, Asp

1129 và Ser 1184 chịu trách nhiệm phân giải NSP3 đến NSP12

Các protein NSP3, NSP5, NSP6, NSP7 và NSP8 có vai trò tạo ra độc lực của vi-rút PRRS (Edgar và ctv, 2015) Protein NSP9 là enzyme có vai trò nhân đôi ARN (RNA-dependent RNA polymerase) cần thiết cho sự sao chép bộ gen NSP10

có chức năng mã hóa enzyme tháo xoắn Các NSP9 và NSP10 giúp tăng độc lực của chủng HP-PRRSV mới tại Trung Quốc NSP11 tham gia tổng hợp gen của vi-rút và

ức chế interferon (Li và ctv, 2014 ; Edgar và ctv, 2015)

1.2.3.2 Protein cấu trúc PRRSV

Protein cấu trúc PRRSV được mã hóa bởi các ORF tương ứng: GP2a, ORF2b-E, ORF3-GP3, ORF4-GP4, ORF5-GP5, ORF6-lớp màng (M) và ORF7-protein nucleocapsid (N) Bốn loại protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4

ORF2a-và GP5 cùng với protein không glycosyl hóa E ORF2a-và M đều hiện diện trên vỏ của rút GP5 và M là những protein vỏ chính trong khi GP2a, E, GP3 và GP4 là những protein vỏ phụ (Wissink và ctv, 2005) Protein ORF5a được mã hóa bởi ORF5a (chồng lên ORF4 và ORF5) ở chủng PRRSV Bắc Mỹ VR2332 (Firth và ctv, 2011; Johnson và ctv, 2011) Trình tự ARN trong các vùng chồng lấn giữa ORF5 và ORF5a là cần thiết cho khả năng tồn tại của vi-rút (Sun và ctv, 2013) Bảng 1.2 mô

vi-tả tổng quan về protein cấu trúc của vi-rút PRRS (Music và Gagnon, 2010)

Bảng 1.2 Tổng quan về các protein cấu trúc PRRSV (Music và Gagnon, 2010)

Trình tự

mã hóa Protein

Số lượng

ORF2a GP2a 249/256 Protein cấu trúc phụ; chứa 2 hai vị trí glycosyl hóa N-linked được bảo tồn cao; cần thiết cho

lây nhiễm vi-rút; kết hợp với hạt vi-rút bằng một phức hợp đa phân

Protein cấu trúc phụ; không glycosyl hóa; cần thiết cho lây nhiễm vi-rút; kết hợp với hạt vi-rút như một phức hợp đa phân; có thuộc tính giống kênh ion và có chức năng như một viroporin trong lớp vỏ

Protein cấu trúc phụ; một trong những protein dễ biến tính nhất của PRRSV; khả năng glycosyl hóa cao với 7 vị trí N-linked oligosaccharide; tham gia vào việc trung hòa các vi-rút, cần thiết cho sự lây nhiễm của vi-rút, kết hợp với các hạt vi-rút bằng một phức hợp đa phân

ORF5 GP5 201/200

Protein cấu trúc chính; là loại protein màng với một số biến đổi tại các vị trí N-glycosyl hóa; là protein cấu trúc biến đổi nhất trong hệ gen của PRRSV cùng với GP3; tham gia bảo vệ và trung hòa vi-rút; các liên kết cộng hóa trị giữa GP5 và M là vô cùng quan trọng trong quá trình lắp ráp protein gắn kèm vi-rút; tham gia vào quá trình xâm nhập của vi-rút vào tế bào vật chủ và trong các hiện tượng chết theo chương trình

Protein cấu trúc chính không glycosyl hóa và được bảo tồn tốt nhất; đóng vai trò quan trọng trong việc lắp ráp và nảy chồi của vi-rút; liên kết GP5-M là rất quan trọng cho sự lây nhiễm của vi-rút

Protein cấu trúc chính, phosphoryl hóa và không glycosyl hóa; đáp ứng miễn dịch cao và là một ứng viên phù hợp cho việc xác định kháng thể đặc hiệu vi-rút và chẩn đoán bệnh; thành phần đặc trưng của vỏ capsid vi-rút và có thể tương tác với chính nó thông qua các liên kết cộng hóa trị và liên kết không cộng hóa trị; có thể xác định được trong nhân/hạch nhân và tương tác với các yếu tố phiên mã của tế bào

aa: axít amin; EU: chủng PRRSV Châu âu; NA: chủng PRRSV Bắc Mỹ

1.2.3.3 Chu kỳ sao chép của PRRSV

PRRSV ưa thích các tế bào bạch cầu đơn nhân hoặc các dòng của đại thực bào trong cơ thể Chúng lây nhiễm sang các tế bào chuyên biệt của các đại thực bào được biệt hóa trong phổi, mô bạch huyết và nhau thai Vi-rút có khả năng sao chép trong các nguyên đại thực bào phế nang của heo, trong khi ở các tế bào tủy xương

và tế bào bạch cầu đơn nhân thì bị kháng lại (Teifke và ctv, 2001)

Hai thụ thể sialic sialoadhesin và CD163 của đại thực bào điều khiển cho quá trình nhập bào của vi-rút (Gorp và ctv, 2010) Vi-rút xâm nhập vào tế bào theo cơ chế nội bào qua trung gian thụ thể sialoadhesin thông qua các túi nội bào được bao phủ bởi lớp clathrin trên màng các đại thực bào (Vanderheijden và ctv, 2003) Các phức hợp M/GP5 của vi-rút tương tác với các vùng N-terminal của thụ thể sialoadhesin Quá trình axít hóa nội bào có sự tham gia của CD163 của đại thực bào cùng một số protease khác trong tế bào (Misinzo và ctv, 2008; Gorp và ctv, 2008)

Tế bào CD163 tương tác với GP2/GP4 của vi-rút và tham gia vào quá trình cởi vỏ của vi-rút CD163 hiện diện chủ yếu trên các đại thực bào lưu trú tại mô, bao gồm các đại thực bào phế nang, bạch cầu đơn nhân (Das và ctv, 2010)

Khi hệ gen PRRSV được phóng thích vào tế bào chất của tế bào vật chủ, các sợi ARN dương vi-rút phải trải qua quá trình dịch mã nhờ bộ máy dịch mã của tế bào chủ tạo ra PP1a hoặc PP1ab và các polyprotein này được phân cắt thành các NSP trưởng thành (Pasternak và ctv, 2006; Fang và Snijder, 2010) Các NSP này bao gồm các enzyme có vai trò nhân đôi ARN (NSP9) và enzyme tháo xoắn ARN (NSP10) là những enzyme quan trọng tham gia vào quá trình tổng hợp ARN của vi-rút Chúng lắp ráp với những NSP khác vào trong các phức hợp phiên mã và tái bản của vi-rút liên kết với màng tế bào, đảm nhận sự tái bản bộ gen và tổng hợp các nhóm mARN tiểu hệ gen (subgenomic mRNAs) (Pasternak và ctv, 2006; Fang và Snijder, 2010) Phức hợp enzyme sao chép của vi-rút sau đó tổng hợp sợi ARN âm của bộ gen để làm khuôn mẫu cho quá trình tổng hợp nhiều sợi ARN dương mới của bộ gen vi-rút Các sợi ARN âm tiểu hệ gen được tạo ra thông qua một cơ chế phiên mã không liên tục để làm khuôn mẫu tổng hợp mARN tiểu hệ gen Các

mARN tiểu hệ gen được dịch mã để tạo thành các protein cấu trúc khác nhau (Snijder và Meulenberg, 1998; Pasternak và ctv, 2006; Fang và Snijder, 2010)

Hình 1.4 Tổng quan về sự nhân lên của PRRSV (Cao, 2013)

Ngoại trừ các protein nucleocapsid N, các protein cấu trúc còn lại được tích hợp vào trong màng của mạng lưới nội chất Các protein N tương tác với ARN của

bộ gen vi-rút để tạo ra các phức hợp nucleocapsid Sau đó nucleocapsid nảy chồi qua mạng lưới nội chất trơn/phức hợp Golgi và đồng thời hình thành lớp vỏ lipid Cuối cùng, các hạt vi-rút mới được hình thành và phóng thích thông qua quá trình xuất bào (Pol và ctv, 1997; Snijder và Meulenberg, 1998; Dokland, 2010)

1.2.4 Sự đa dạng gen của PRRSV

Dựa trên so sánh trình tự nucleotit cũng như sự khác biệt về đặc tính sinh học, PRRSV được chia thành hai kiểu gen: chủng vi-rút Lelystad (LV) của các kiểu gen châu Âu (Type 1) và VR-2332 của kiểu gen Bắc Mỹ (Type 2) (Ropp và ctv, 2004) Các trình tự axít amin trong hai chủng này khác nhau khoảng 40% (Nguyễn Văn Cảm và ctv, 2012) PRRSVcó tỷ lệ đột biến là 10-2/axít amin/năm, trái ngược với tỷ lệ từ 10-3 đến 10-5/axít amin/năm đối với các dòng vi-rút ARN khác, tốc độ sao chép nhanh làm cho tỷ lệ đột biến cao (Hanada và ctv, 2005) Năm 2006, xuất hiện chủng vi-rút biến thể HP-PRRSV thuộc về kiểu gen PRRSV Type 2 (kiểu gen Bắc Mỹ) tại Trung Quốc (Do và ctv, 2015a)

Các chủng Bắc Mỹ được phân lập từ heo nhiễm bệnh cho thấy có sự đa dạng

di truyền cao hơn so với các chủng châu Âu Những chủng phân lập từ Hà Lan, Tây Ban Nha, Pháp và Anh có sự tương đồng khoảng 96-100% ở gen ORF7 và đối với trình tự axít amin của các protein nucleocapsid N thì tỷ lệ tương đồng khoảng 98-100% Ngược lại, một chủng vi-rút được tìm thấy ở Belarus (Belarus EU-PRRSV) được xác định có kiểu gen bắt nguồn từ chủng châu Âu và có sự đa dạng với mức

độ khá cao Sự đa dạng này được biểu hiện bởi sự đa hình trong kích thước của ORF7 ở khoảng 375-393 nucleotit Ngoài ra, chủng Belarus EU-PRRSV được đánh giá là có sự đa dạng cao hơn so với chủng Bắc Mỹ Các quần thể PRRSV tổ tiên từ Bắc Mỹ chứa biến thể di truyền nhiều hơn so với chủng hiện nay ở châu Âu (Andreyev và ctv, 2000; Stadejek và ctv, 2006)

1.2.5 Đặc điểm của HP-PRRSV

Phân tích trình tự gen cho thấy rằng HP-PRRSV tại Trung Quốc là một chủng biến thể thuộc kiểu gen PRRSV Type 2 (kiểu gen Bắc Mỹ) Trình tự axít amin trong các vùng NSP2 cho thấy sự đồng nhất vào khoảng 95,7-99,4% so với chủng HUN4 của Trung Quốc, 68-69% so với chủng VR-2332 và 58-59% so với chủng MN184 (Metwally và ctv, 2010) Bốn vị trí có đột biến mất nucleotit được bảo tồn trong tất cả các HP-PRRSV, trong đó có một đột biến mất adenosin triphosphate ở vị trí 122 tại vùng không mã hóa đầu 5', một đột biến mất guanosin triphosphate ở vị trí 15.278 tại vùng không mã hóa đầu 3' và 2 đột biến mất không liên tục của 30 axít amin trong NSP2 (bao gồm đột biến mất chỉ một axít amin tại vị trí 482 và đột biến mất 29 axít amin giữa các vị trí 533 và 561) (An và ctv, 2010) Đột biến mất 30 axít amin trong NSP2 được xem là một dấu hiệu di truyền của HP-PRRSV và không ảnh hưởng đến sự phát triển của HP-PRRSV mà làm gia tăng sự sao chép của PRRSV trước khi gây nhiễm (An và ctv, 2010; Xu và ctv, 2012)

1.3 Miễn dịch với PRRSV

1.3.1 Miễn dịch bẩm sinh với PRRSV

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm miễn dịch dịch thể (cytokines, protein phản ứng viêm cấp tính, bổ thể và defensin) và các tế bào thành phần (tế bào giết tự nhiên, các đại thực bào, tế bào đuôi gai,…) Các đại thực bào và tế bào đuôi gai là những tế bào miễn dịch bẩm sinh quan trọng nhưng PRRSV có thể tương tác với các tế bào đuôi gai phổi nguyên phát và được tái tạo trong các đại thực bào biệt hóa (Chang và ctv, 2008; Katze và ctv, 2008) Vì vậy, nhiễm PRRSV thường liên quan đến suy giảm và rối loạn của một số cơ chế miễn dịch bẩm sinh

Interferon là các cytokin đa chức năng có vai trò quan trọng đối với việc bảo

vệ để kháng lại vi-rút và tạo miễn dịch đặc hiệu IFN thường được phân thành loại I

và loại II IFN loại I (IFN-α và IFN-β) là các cytokin chính của miễn dịch bẩm sinh chống lại sự nhiễm vi-rút (Haller và ctv, 2006; Kawai và Akira, 2006) Việc kiểm soát IFN-α khi bị nhiễm PRRSV làm tăng các phản ứng của miễn dịch đặc hiệu (Buddaert và ctv, 1998; Royaee và ctv, 2004) Bốn protein không cấu trúc của

PRRSV có liên quan đến các hoạt động ức chế sản xuất IFN loại I là: NSP1, NSP2, NSP4 và NSP11 (Han và ctv, 2013; Kim và ctv, 2010)

Các IFN loại II (IFN-γ) chủ yếu liên kết với đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Tuy nhiên một số tế bào miễn dịch bẩm sinh có thể sản xuất loại cytokin này để kháng vi-rút bằng cách kích thích hoạt động của đại thực bào Bằng

cách kiểm soát của IFN-γ in vivo, PRRSV nhân lên trong PAM có thể bị ức chế

Tế bào NK bẩm sinh là những quần thể tế bào lympho có khả năng cung cấp các dòng tế bào đầu tiên chống lại sự nhiễm vi-rút (Biron và ctv, 1999) Khi tế bào gây độc NK ở mức độ vừa đủ trên heo, PRRSV ức chế mạnh các chức năng NK vào khoảng 50-80% trong khoảng 7-24 ngày sau nhiễm (Renukaradhya và ctv, 2010)

Tế bào đuôi gai có chức năng chính là bắt giữ và trình diện kháng nguyên trên bề mặt các tế bào của hệ miễn dịch Vi-rút PRRS có thể làm ảnh hưởng đến trạng thái kích hoạt của các tế bào trình diện kháng nguyên mặc dù không có khả năng gây nhiễm sinh sản trong các tế bào (Loving và ctv, 2007) Khi tế bào đuôi gai nhiễm vi-rút sẽ gây hậu quả nghiêm trọng đến sự phát triển của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đặc hiệu với vi rút

1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu với PRRSV

1.3.2.1 Miễn dịch qua trung gian tế bào với PRRSV

Miễn dịch qua trung gian tế bào (như sản xuất IFN-γ) thì không hiệu quả để làm giảm sự lây nhiễm PRRSV Sau 10 ngày nhiễm bệnh, kháng thể kháng lại PRRSV xuất hiện nhưng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào xuất hiện trong giai đoạn từ 4-8 tuần sau khi nhiễm trùng và ngày càng trở nên rõ rệt hơn vào những tháng sau đó Các đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào với PRRSV chỉ

có trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (Xiao và ctv, 2004) Sự suy giảm nhất thời lượng bạch cầu lympho trong máu ngoại vi của heo nhiễm PRRSV được ghi nhận khoảng vài ngày ngay sau khi nhiễm trùng, tỷ lệ phần trăm của tổng số tế bào lympho, tế bào CD4+ và các tế bào CD8+ giảm đáng kể (Shibata và ctv, 2000; Lamontagne và ctv, 2003) Bắt đầu từ 10-24 ngày sau nhiễm trùng, sự tăng lên của quần thể lympho T CD8+ cùng với sự gia tăng kiểu hình tế bào lympho T gây độc được quan sát thấy trong máu và phổi heo nhiễm PRRSV (Costers và ctv, 2009) Đáp ứng tế bào T tăng nhanh, đặc trưng chủ yếu là các cytokin biểu hiện kiểu hình IFN-γ và IL-2 (Lopez Fuertes và ctv, 1999) Trên heo bị nhiễm PRRSV, sự tăng sinh tế bào đặc hiệu kháng vi-rút có thể được xác định bởi IFN-γ dựa trên xét nghiệm tăng sinh tế bào lympho Bắt đầu từ tuần thứ 4 sau nhiễm trùng, sự gia tăng đáp ứng tế bào lympho T đặc hiệu với vi-rút PRRS có thể được phát hiện trong máu ngoại vi (Bautista và Molitor, 1997) và sự gia tăng chủ yếu liên quan đến tế bào lympo T CD4+ phụ thuộc MHC lớp II và tế bào lympo T CD8+ phụ thuộc MHC lớp I đặc hiệu với vi-rút Khi các tế bào này xuất hiện, số lượng của chúng tăng rất chậm và đạt đỉnh vào khoảng 7 tuần sau nhiễm trùng, sau đó biến mất khoảng 11-14 tuần sau nhiễm trùng (Bautista và Molitor, 1997; Lopez Fuertes và ctv, 1999)

PRRSV tạo ra đáp ứng yếu và chậm của IFN-γ (cytokin đặc trưng của Th1) (Li và ctv, 2014) Sự gia tăng tế bào tiết ra IFN-γ khi nhiễm PRRSV có tương quan thuận với nồng độ IFN-α, nếu thiếu đáp ứng IFN-α sẽ làm suy giảm sự gia tăng của

tế bào T, do đó kiểm soát IFN-α trong quá trình chủng ngừa PRRSV sẽ giúp phát triển tế bào T (Meier và ctv, 2003; Royaee và ctv, 2004) Trong khi đó, mối tương

quan nghịch giữa nồng độ IL-10 và sự hiện diện của tế bào tiết IFN-γ trong nuôi cấy PBMC cho thấy IL-10 có liên quan đến sự suy giảm tế bào T (Diaz và ctv, 2006) IFN-γ được dùng để đánh giá đáp ứng của tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên trên heo và rất quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ chống lại một số bệnh nhiễm trùng

do vi-rút Các kiểu hình của tế bào T tiết ra IFN-γ để đáp ứng với PRRSV bao gồm:

tế bào nhớ CD4+ CD8+ và tế bào giúp đỡ CD4+ Ngoài ra, IFN-γ ức chế sự sao chép PRRSV trong các đại thực bào và tổng hợp ARN PRRSV qua cảm ứng protein kinase ARN sợi đôi (Xiao và ctv, 2004)

14 dpi sau đó đạt mức tối đa vào 25 dpi và biến mất sau 40 dpi (Labarque và ctv, 2000) Các kháng thể có thể bảo vệ chống lại sự nhiễm vi-rút trong nhiều cách khác nhau (Burton, 2002): các kháng thể có thể gắn với kháng nguyên vi-rút trên tế bào

bị nhiễm và được hệ thống bổ thể ly giải; các kháng thể có thể gắn kết với protein vi-rút trên các hạt vi-rút tự do và làm ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm của chúng dẫn đến sự trung hòa, opsonin hóa vi-rút, tiếp theo là sự thực bào hoặc bổ thể ly giải vi-rút Các epitope của vi-rút có khả năng cảm ứng kháng thể trung hòa thì nằm trên các protein M, GP2a, GP3, GP4 và GP5 (Yang và ctv, 2000; Kim và Yoon, 2008) Kháng thể trung hòa vi-rút đóng vai trò trung tâm trong việc bảo vệ heo chống lại

sự tái nhiễm với PRRSV vì sự truyền thụ động của các kháng thể có thể bảo vệ heo nái mang thai chống lại độc lực PRRSV và ngăn chặn lây nhiễm qua nhau thai (Osorio và ctv, 2002)

1.4 Miễn dịch từ vắc-xin PRRS

1.4.1 Vắc-xin sống nhược độc (modified live virus –MLV vaccine)

Các vắc-xin sống nhược độc có hiệu quả bảo hộ trên heo trong trường hợp các chủng vi-rút gây nhiễm có kiểu gen gần giống với chủng vi-rút vắc-xin và khi gặp chủng PRRSV không tương đồng về mặt di truyền thì những loại vắc-xin này không mang đến hiệu quả phòng bệnh bền vững Tiêm vắc-xin MLV gây ra đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được đặc trưng bởi sự gia tăng của các tế bào sản xuất IFN-γ đặc hiệu với vi-rút (Charerntantanakul, 2012; Li và ctv, 2014)

Kháng thể đặc hiệu với PRRSV xuất hiện khoảng 2 tuần và cao nhất khoảng

4 tuần sau khi chủng ngừa Kháng thể trung hòa đặc hiệu với vi-rút PRRS có nồng

độ tương đối thấp trong suốt quá trình tiêm chủng Mặc dù vắc-xin MLV có thể tạo

ra đáp ứng miễn dịch bảo vệ heo chống lại PRRSV nhưng vẫn có những lo ngại về

sự an toàn vắc-xin MLV đó là sự hoàn nguyên độc lực thông qua các đột biến gen của chủng vi-rút vắc xin và sự tái tổ hợp chủng vi-rút vắc-xin với vùng gen độc lực cao của PRRSV Đặc tính di truyền và kiểu hình của các chủng phân lập tại thực địa cho thấy có sự hoàn nguyên độc lực (Li và ctv, 2009; Charerntantanakul, 2012)

1.4.2 Vắc-xin vô hoạt (Killed virus-KV vaccine)

Vắc-xin vô hoạt thì an toàn hơn vắc-xin MLV nhưng hiệu quả kém hơn so với vắc-xin PRRS MLV và khả năng bảo vệ hạn chế trong việc kháng lại vi-rút đồng chủng hay dị chủng Chủng ngừa bằng vắc-xin KV không kích thích các kháng thể phát hiện và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (không thể kích thích đáp ứng IFN-γ đặc hiệu với PRRSV) Tác dụng của vắc-xin KV PRRS được thấy rõ hơn trên heo bị nhiễm vi-rút PRRS như: giúp nâng cao khả năng sinh sản (tăng tỷ lệ đẻ, số heo con cai sữa) và tình trạng sức khỏe của heo con sinh ra từ heo nái được tiêm chủng Trên heo bị nhiễm PRRSV, các đáp ứng miễn dịch tăng cường được phát hiện khoảng 2 tuần sau khi tiêm vắc-xin KV lần thứ hai nên có thể áp dụng vắc-xin KV PRRS vào điều trị tại các trại đã nhiễm vi-rút PRRS (Charerntantanakul, 2012)

Bảng 1.3 Các loại vắc-xin PRRSV nhược độc trên thị trường (Charerntantanakul, 2012)

Liều lượng (mL)

Tiêm bắp 2 Tiêm vào bất kỳ giai đoạn sinh sản

ReproCyc

PRRS-PLE

Heo nái tơ/heo nái Tiêm bắp 5 Tiêm 4-6 tuần trước khi đẻ

Nhắc lại: trước khi đẻ ở lứa tiếp theo Ingelvac PRRS

2/0.2 Tiêm 2-4 tuần trước khi đẻ

Nhắc lại: 2-4 tuần trước khi đẻ ở lứa tiếp theo hoặc mỗi 4 tháng

Tiêm lúc 2 tuần tuổi trở lên

Amervac-PRRS Heo theo mẹ/heo trưởng thành Tiêm bắp 2 Tiêm lúc 4 tuần tuổi trở lên

Pyrsvac-183 Heo nái tơ/heo nái

Heo con/heo theo mẹ/heo trưởng thành

Tiêm bắp 2 Tiêm 2-4 tuần trước khi đẻ

Nhắc lại: 3-4 tuần trước khi đẻ ở lứa tiếp theo

Tiêm lúc 2-3 tuần tuổi trở lên

Bảng 1.4 Các loại vắc-xin PRRSV vô hoạt trên thị trường (Charerntantanakul, 2012)

tiêm

Liều lượng (mL)

2 Tiêm 2 lần, khoảng 3 tuần trước khi đẻ

Nhắc lại: 60-70 ngày mỗi thai kỳ Tiêm 2 lần, khoảng 3-4 tuần tuổi và vào bất kỳ giai đoạn sinh sản

Nhắc lại: 60-70 ngày mỗi thai kỳ Suipravac-

PRRS

Heo nái tơ

Heo nái

Tiêm bắp

2 Tiêm 2 lần, khoảng 3-4 tuần tuổi hoặc lúc đưa vào trại

Nhắc lại: theo chương trình tiêm chủng của heo nái

Tiêm 2 lần, khoảng 3-4 tuần tuổi, trong thai kỳ hoặc đang cho bú

Nhắc lại: mỗi 4 tháng Suivac PRRS-

2 Tiêm 3 lần; lần 1 lúc 5-6 tháng tuổi, lần 2 khoảng 3-4 tuần

sau lần 1 và lần 3 trước ngày heo đẻ 4-6 tuần Nhắc lại: 2 lần; lần 1 lúc 3-4 tuần sau khi đẻ và lần 2 lúc 6-

4 tuần trước ngày heo đẻ ở lứa tiếp theo

Tiêm 2 lần, khoảng 4 tuần tuổi và từ 6 tháng tuổi Nhắc lại: 4-6 tháng

Tiêm 3 lần: khoảng 3-4 tuần tuổi và từ 6-10 tuần tuổi

Theo công văn số 1989/TY-DT của cục thú y ngày 20/11/2012, hiện nay có 7 loại vắc-xin PRRS được phép lưu hành và sử dụng tại Việt Nam và được liệt kê trong bảng 1.5

Bảng 1.5 Các loại vắc-xin PRRS lưu hành tại Việt Nam

1 Vắc-xin nhược độc Ingelvac PRRS MLV

(công ty Boehringer - Đức)

ATCC VR-2332 (dòng Bắc Mỹ)

2 Vắc-xin nhược độc Amervac-PRRS MLV

(côngty Hipra - Tây Ban Nha)

VP046 BIS

3 Vắc-xin nhược độc Porcilis PRRS MLV

4 Vắc-xin nhược độc BSL-PS 100 MLV

(công ty Bestar- Singapore)

JKL-100 (dòng Bắc Mỹ)

5

Vắc-xin nhược độc chủng Hp-PRRS MLV

(Đại Hoa Đông - Trung Quốc)

JXA1-R (dòng Bắc Mỹ)

6

Vắc-xin nhược độc JXA1-R MLV

(công ty China Animal Husbandry Industry

company-Trung Quốc)

JXA1-R (dòng Bắc Mỹ)

7 Vắc-xin chết PRRS KV

(công ty Chengdu – Trung Quốc)

NVDC – JXA1 (dòng Bắc Mỹ)

1.5 Triệu chứng lâm sàng của heo nhiễm PRRSV

Triệu chứng lâm sàng của bệnh có thể khác nhau tùy từng loại heo:

Đối với heo nái: giai đoạn mang thai: sốt 40-42oC, biếng ăn, sảy thai vào giai đoạn chửa 2 hoặc thai chết lưu thành thai gỗ, thể cấp tính tai chuyển màu xanh, đẻ

non; giai đoạn đẻ và nuôi con: sốt cao, biếng ăn, lười uống nước, mất sữa, viêm vú,

đẻ sớm, phần da mỏng biến màu (màu hồng), lờ đờ hoặc hôn mê, thai chết lưu, heo