Nghiên cứu phát triển que thử xác định aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi

Đa số các phương pháp đòi hỏi người phân tích phải có kỹ năng tốt, phải tiền xử lý mẫu, tốn thời gian và sử dụng thiết bị đắt tiền, chỉ phù hợp để thực hiện phân tích aflatoxin trong điề

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN

TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

PGS TS TRƯƠNG QUỐC PHONG

Hà Nội – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào, một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Học viên

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Trương Quốc

Phong – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học,

trường Đại học Bách khoa Hà Nội là người trực tiếp hướng dẫn và định hướng tôi về phương pháp nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên đang công tác và học tập tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã góp những ý kiến quý báu cho tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Với tất cả sự kính yêu và biết ơn chân thành, tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân yêu đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2018

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CÁC BẢNG x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 3

1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin 3

1.2 Điều kiện sản sinh Aflatoxin 4

1.3 Đặc điểm của Aflatoxin 5

1.3.1.Cấu trúc hóa học và phân loại 5

1.3.2.Tính chất hóa học và tính chất vật lý 8

1.3.3.Sự chuyển hóa và bài tiết aflatoxin 8

1.3.4.Độc tính của aflatoxin 10

1.4 Tình hình nhiễm độc aflatoxin trên thế giới và ở Việt Nam 12

1.4.1.Trên thế giới 12

1.4.2.Tại Việt Nam 13

1.5 Các phương pháp phát hiện Aflatoxin 14

1.5.1.Phương pháp sắc kí 14

1.5.2.Phương pháp quang phổ 17

1.5.3.Phương pháp miễn dịch 18

1.5.4.Phương pháp que thử sắc ký miễn dịch 21

1.6 Đặc tính que thử 23

1.6.1.Hạt nano vàng (GNPs) 23

1.6.2.Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 23

1.6.3.Miếng thấm mẫu 24

1.6.4.Miếng cộng hợp 24

1.6.5.Màng 25

1.6.6.Miếng thấm hút 25

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 26

2.2 Vật liệu 26

2.1.1.Hóa chất 26

2.1.2.Các kháng thể sử dụng 27

2.1.3.Thiết bị 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1.Phương pháp sản xuất kháng thể 28

2.2.2.Phương pháp tinh sạch kháng thể kháng AFB 1 bằng protein A 28

2.2.3.Phương pháp điện di SDS – PAGE 29

2.2.4.Phương pháp ELISA gián tiếp 30

2.2.5.Phương pháp Dot – blot 30

2.2.6.Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 31

2.2.7.Phương pháp chuẩn bị miếng cộng hợp 32

2.2.8.Phương pháp phân tích mẫu bằng que thử 32

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên cứu tạo kháng thể kháng AFB1 33

3.1.1.Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh kháng AFB 1 33

3.1.2.Nghiên cứu tinh chế kháng thể đa dòng kháng AFB 1 34

3.1.3.Đánh giá đặc tính của kháng thể kháng AFB 1 tinh sạch 37

3.2.Nghiên cứu chế tạo que thử 38

3.2.1.Thiết lập điều kiện ban đầu tạo que thử 38

3.2.2.Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp 39

3.2.3.Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 48

3.3.Đánh giá que thử 53

3.3.1.Độ lặp lại của que thử 54

3.3.2.Ngưỡng phát hiện 55

3.3.3.Thử nghiệm mẫu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi 56

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 65

Aflatoxin Aflatoxin B1

5 –Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt Bovine Serum Albumine

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Freund’s Complete Adjuvant Freund’s Incomplete Adjuvant Fast protein liquid chromatography Gold Nanoparticles (hạt nano vàng) Glutathione S-transferase

High – performance liquid chromatography High – performance thin layer chromatography Horseradish peroxidase

Immunoglobulin Keyhole Limpet Hemocyanin Lateral Flow Immunoassay Mass spectrometry

N-hydroxysuccinimide Polyacrylamide Gel Electrophoresis Phosphate Buffered Saline

Thin Layer Chromatography Ultraviolet–visible spectroscopy World Healthy Organization

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và các bào tử nấm

được nhìn dưới kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần 5

Hình 1 2 Cấu trúc 2 nhóm Aflatoxin điển hình B và G 6

Hình 1 3 Các nhóm Aflatoxin khác 7

Hình 1 4 Quá trình chuyển hóa aflatoxin B 1 trong cơ thể 9

Hình 1 5 Nguyên lý que thử hoạt động dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh 22

Hình 2 1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 26

Hình 2 2 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 31

Hình 3.1 Biểu đồ ELISA về quá trình gây đáp ứng miễn dịch ở thỏ bằng AFB 1 -KLH 34

Hình 3 2 Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ sử dụng cột Protein A-Sepharosevới thể tích gel 1 ml, tốc độ 1 ml/phút 35

Hình 3 3 Phổ điện di protein tinh sạch kháng thể kháng AFB 1 36

Hình 3 4 Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB 1 tinh sạch 37

Hình 3 5 Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 39

Hình 3 6 Xác định hàm lượng kháng thể kháng AFB 1 cộng hợp với GNPs thích hợp 40

Hình 3 7 Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 42

Hình 3 8 Phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 43

Hình 3.9 Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng 44

Hình 3 10 Ảnh hưởng của các công thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử 45

Hình 3 11 Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp 46

Hình 3 12 Nhiệt độ cố định cộng hợp 47

Hình 3 13 Thời gian sấy miếng cộng hợp 48

Hình 3 14 Ảnh hưởng của vật liệu màng đến kết quả nghiên cứu 49

Hình 3 15 Tối ưu hóa hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra (vạch T) 50

Hình 3 16 Thay đổi thể tích phun AFB 1 -BSA trên màng Nitrocellulose 51

Hình 3 17 Xác định nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose 52

Hình 3 18 Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose ở 37 o C 53

Hình 3 19 Xác định hàm lượng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng 53

Hình 3 20 Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu âm tính với AFB 1 54

Hình 3 21 Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu dương tính với AFB 1 55

Hình 3 22 Đánh giá ngưỡng phát hiện của que thử 56

Hình 3 23 Các mẫu nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi 57

Hình 3.25 Kết quả que thử que thử với 7 mẫu dương tính AFB 1 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Lượng aflatoxin trong nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 14 Bảng 3 1 Đặc điểm vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp que thử 46 Bảng 3 2 Đặc điểm vật liệu sử dụng làm màng lai 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Aflatoxin là chất chuyển hóa thứ cấp sản sinh bởi nấm mốc, chủ yếu là các

chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus [44], được tìm thấy trong

một loạt các nông sản như hạt ngô, lạc, gạo, ngũ cốc [30, 50] Đây là nhóm độc

tố nấm mốc nguy hiểm nhất gây độc cho người và động vật, có thể gây bệnh cấp tính (tổn thương gan, viêm gan, phù nề, hoại tử xuất huyết) hoặc ung thư biểu mô mãn tính (ung thư gan, phổi, thận và ức chế miễn dịch), thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong [6, 34, 55] Con người tiêu thụ đồng thời trực tiếp các sản phẩm nông sản có aflatoxin và các sản phẩm sữa, trứng, thịt từ động vật ăn phải aflatoxin do thức ăn chăn nuôi bị nhiễm nấm mốc, nên sự tích tụ aflatoxin cuối cùng đều ở con người Cho đến nay đã có hơn 20 loại aflatoxin được tìm thấy, các nhóm quan trọng nhất gồm AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 [49] Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại AFB1 là hợp chất gây ung thư quan trọng nhất (nhóm 1), đặc biệt liên quan đến ung thư gan [31], cũng như khả năng gây quái thai, gây đột biến [35, 40]

Vấn đề nhiễm Aflatoxin là toàn cầu và đặc biệt ảnh hưởng đến các quốc gia đặc trưng bởi điều kiện môi trường và thời tiết thuận lợi cho ô nhiễm và tăng trưởng của nấm mốc trong thu hoạch và bảo quản nông sản Theo đánh giá của Đại học Georgia, Mĩ, ước tính rằng 25% cây lương thực trên thế giới bị nhiễm độc tố nấm, và hơn 4,5 tỷ người và số lượng động vật không xác định được tiếp xúc với aflatoxin [14] Tại Việt Nam, nhiều cuộc kiểm nghiệm cho thấy sự có mặt của aflatoxin trong các mẫu nông sản ở Việt Nam rất cao từ 60% - 65%, đặc biệt ở ngô [3] Hiện nay khuynh hướng phát triển chăn nuôi của nước ta theo quy

mô công nghiệp, để nâng cao hiệu quả và lợi nhuận của chăn nuôi cần bảo quản tốt thức ăn chăn nuôi (TĂCN) và các nguyên liệu sản xuất TĂCN do TĂCN chiếm tỷ trọng lớn, khoảng 65-75% giá thành sản xuất thịt, sữa, trứng [2] Sự có mặt của các loại độc tố, nhất là aflatoxin, nhiễm vào TĂCN và ngũ cốc, có thể gây ảnh hưởng rất lớn đối với người tiêu dùng, người chăn nuôi và người sản

xuất TĂCN Vì vậy cần xác định sự có mặt của aflatoxin trong TĂCN để có biện pháp xử lý kịp thời

Hiện nay có rất nhiều phương pháp đã được phát triển để phát hiện aflatoxin với độ nhạy cao như TLC, HPTLC, HPLC, LC-MS/MS, FTIR, RIA, ELISA, SPR, điện hóa, và que thử miễn dịch Đa số các phương pháp đòi hỏi người phân tích phải có kỹ năng tốt, phải tiền xử lý mẫu, tốn thời gian và sử dụng thiết bị đắt tiền, chỉ phù hợp để thực hiện phân tích aflatoxin trong điều kiện phòng thí nghiệm Những năm gần đây phương pháp que thử miễn dịch với nhiều ưu điểm như dễ dàng thao tác, tiết kiệm thời gian phân tích, phù hợp sử dụng ngoài hiện trường đã được chú trọng phát triển để tiếp cận nhiều đối tượng người tiêu dùng

Do đó, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển que thử xác định aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi” với mục tiêu là tạo ra kháng thể đặc hiệu kháng AFB1

và nghiên cứu các điều kiện tối ưu để phát triển que thử phát hiện sự có mặt của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin

Vào cuối những năm 1950 và đầu những năm 1960, hơn 100 000 con gà tây

ở các trang trại chăn nuôi ở Anh bị chết một cách bí ẩn, chỉ trong vòng một vài tháng kể từ khi xuất hiện các triệu chứng bất thường, người ta gọi là bệnh “Gà tây X” [5] Những cuộc giải phẫu bệnh thú y đã cho thấy, những con vật này chết

là do ăn bột lạc Brazin, loại thức ăn thường được dùng cho các trang trại chăn nuôi Ngay sau đó, nhiều nghiên cứu chỉ ra bột lạc Brazin bị nhiễm một loại độc

tố có nguồn gốc từ thực vật, cụ thể là độc tố nấm Năm 1961 lần đầu tiên các nhà

khoa học đã phân lập được nấm Aspergillus flavus và xác định nó là một trong

các loài nấm có khả năng tiết ra độc chất này Loại độc tố này sau đó được đặt

theo tên của chủng nấm này là Aflatoxin (AF) vào năm 1962 [18]

Năm 1966 - 1969, tại Mỹ, nghiên cứu các bệnh nhiễm AF là nguyên nhân gây viêm gan ở chó, ngộ độc ngô mốc ở Lợn và chất gây ung thư mạnh trong cá hồi [42, 43] Cũng trong những năm này, mối liên hệ giữa aflatoxin và bệnh gan

ở người cũng đã được thực hiện

Năm 1974, một ổ dịch viêm gan do AF gây ra đã được báo cáo ở các bang Gujrat và Rajasthan ở Ấn Độ, dẫn đến ước tính có 106 ca tử vong [35] Các ổ dịch kéo dài trong 2 tháng và được giới hạn ở những người có lương thực chính

là ngô Các mẫu ngô đã được thử nghiệm và phân tích cho thấy các mẫu chứa

Aspergillus flavus [13, 35] Các triệu chứng trong làng bao gồm cổ trướng và phù

nề của vùng ngoại biên thấp hơn, cả hai triệu chứng của bệnh xơ gan và các bệnh gan khác Bởi vì aflatoxin gây ra mối đe dọa nghiêm trọng như chất gây ung thư, IARC đã đặt aflatoxin B1 vào danh sách các chất gây ung thư ở người vào năm

1988 Đây là một số nghiên cứu dịch tễ học được thực hiện ở Châu Á và Châu Phi đã chứng minh mối liên quan tích cực giữa AF và tế bào gan Một đợt bùng phát aflatoxin khác ảnh hưởng đến cả người và chó đã được báo cáo ở Tây Bắc

Ấn Độ năm 1974 [13] Một đợt bùng phát phơi nhiễm aflatoxin chính sau đó được ghi nhận ở Kenya vào năm 1981 [39, 44] Từ những phát hiện ban đầu này,

các nghiên cứu chuyên sâu đã cho thấy nguy cơ tiếp xúc với aflatoxin gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe con người và động vật trên toàn thế giới Khám phá này cũng giúp nâng cao nhận thức về mối nguy hiểm tiềm tàng của nấm mốc trong các ca ngộ độc thức ăn Các nghiên cứu khác sau đó còn chỉ ra

rằng, aflatoxin còn được nhiều chủng nấm khác như A parasiticus, A nomius và

A niger

1.2 Điều kiện sản sinh Aflatoxin

Aflatoxin được sinh ra từ các loài nấm thuộc chi Aspergillus, chủ yếu là

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Hình 1.1) Ngoài ra nó cũng được

sinh ra từ một số ít loài thuộc chi Penicillium Aspergillus phân bố rộng rãi trong

tự nhiên, sinh trưởng dễ ràng trong đất, thực vật mục nát và ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu cơ trong điều kiện độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao Nấm Aspergillus sản sinh

aflatoxin trong điều kiện nhiệt độ từ 8 - 37 độ , tối ưu ở 25-28 độ; độ ẩm tương đối 83-88% (độ ẩm càng cao càng thuận lợi) Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm như ở

nước ta tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc Aspergillus phát triển và sản sinh

aflatoxin…

Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào các loại hạt trước khi thu hoạch, trong thu hoạch và trong quá trình bảo quản Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng)

và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa, …

Aspergillus flavus

Aspergillus parasiticus Hình 1.1 Nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và các bào tử nấm được nhìn dưới kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần [58, 59]

Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức ăn nhiễm aflatoxin Tỷ lệ aflatoxin từ thức ăn nhiễm vào sữa ở bò sữa trung bình là 1-2% Tuy nhiên, bò tiêu thụ một lượng thức ăn lớn, tỷ lệ mang aflatoxin

M1 vào sữa có thể đạt 6,2%

1.3 Đặc điểm của Aflatoxin

1.3.1 Cấu trúc hóa học và phân loại

Aflatoxin là một độc chất thuộc nhóm mytocoxin, có khả năng gây ngộ độc, tổn thương gan và ung thư cho động vật và con người nếu tiêu thụ thường xuyên

Có khoảng 20 chất chuyển hóa nấm liên quan đến aflatoxin được sản xuất

chủ yếu bởi loài Aspergillus flavus, A nomus và A parasiticus, trong đó 6 loại

điển hình bao gồm AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 [22] Chúng là các phân tử difuranocoumarins với hai chuỗi cấu trúc hóa học quan trọng bao gồm chuỗi difurocoumarocyclopentenone (AFB1, AFB2, AFM1, AFM2 và aflatoxicol) và chuỗi difurocoumarolactone (AFG1, AFG2) Chữ “B” và “G” đề cập đến màu huỳnh quang xanh lam (Blue) và xanh lục (Green) được tạo ra bởi aflatoxin dưới ánh sáng tia cực tím trên bản sắc ký lớp mỏng, trong khi số chỉ số

1 và 2 cho biết các hợp chất lớn và nhỏ, tương ứng AFM1 và AFM2 là các chất chuyển hóa tương ứng của AFB1 và AFB2 xuất hiện trong dịch cơ thể [25, 26]

Hình 1.2 Cấu trúc 2 nhóm Aflatoxin điển hình B và G [16]

Aflatoxin B1 và B2 được sinh ra bởi nấm A flavus và A parasiticus, còn

aflatoxin G1 và G2 được sinh ra bởi nấm A parasiticus Cấu trúc của chúng được

khám phá bởi nhóm nghiên cứu của Büchi vào năm 1963 (AFB1 và AFG1), năm

1965 (AFB2 và AFG2) [7, 8] Nhóm nghiên cứu này cũng đã làm sáng tỏ hoàn toàn hóa học lập thể của aflatoxin nhóm B và G bằng sự phân dã hóa học Về mặt cấu trúc, những hợp chất aflatoxin gồm 5 vòng, có một vòng furo furan (B

và C), một vòng thơm 6 cạnh (A), một vòng lactone 6 cạnh (D) và một vòng pentanone 5 cạnh hoặc một vòng lactone sáu cạnh (E) Các aflatoxin nhóm B có một vòng cyclopentane trong khi đó nhóm G có chứa vòng lactone [24] Trong

số các aflatoxin được đề cập thì aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất và có mặt trong hơn 75% các mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được kiểm tra có nhiễm aflatoxin [9, 19, 27]

Hình 1.3 Các nhóm Aflatoxin khác [16]

Aflatoxin M1 và M2 là các dẫn xuất hydroxyl hóa của aflatoxin B1 và B2,

thường được gọi là “độc tố sữa” Aflatoxin M1 là chất chuyển hóa của aflatoxin

B1 trên người và động vật (trong sữa mẹ có thể phơi nhiễm tới mức ng) còn

aflatoxin M2 là chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho ăn

thức ăn nhiễm độc tố aflatoxin B2 Trong cấu trúc của chúng có nhóm hydroxy ở

điểm giao nhau của hai vòng furan Mặc dù là dẫn xuất của aflatoxin B1 và B2,

aflatoxin M1 và M2 vẫn giữa được tính bền nhiệt trong quá trình chế biến sữa

[52]

Các aflatoxin được tìm thấy khác có nhóm hydroxyl thay vì nhóm cacbonyl

ở vòng E (R0, RB1, RB2, H1) Chúng được hình thành bằng chuyển hóa sinh học

hoặc hóa học với natri borohydride Ở một số aflatoxin, vòng D hoặc E mở

Aflatoxin B3 còn được gọi là parasiticol, vì nó là lần đầu tiên phân lập từ

Aspergillus parasiticus Tất cả các aflatoxin thể hiện trong Hình 1.3 là các sản

phẩm chuyển hóa trao đổi chất từ aflatoxin nhóm B

1.3.2 Tính chất hóa học và tính chất vật lý

1.3.2.1 Tính chất vật lý

Các aflatoxin là các tinh thể màu vàng, tan trong các dung môi phân cực như chloroform, methanol, acetone, đặc biệt là dimethylsulfoit (dung môi thường được sử dụng để đưa aflatoxin vào động vật thí nghiệm), chúng có thể tồn tại trong các dung môi này nhiều năm nếu được giữ trong điều kiện lạnh và tránh sáng Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10- 20 mg/L Chúng rất bền với nhiệt, không bị phá hủy khi đun nấu thông thường hay thanh trùng, dễ bị tia

tử ngoại phá hủy, đun trong nồi áp suất, xử lý bằng các chất oxy hóa Aflatoxin nhóm B có tính phát huỳnh quang màu xanh lam, trong khi đó nhóm G lại có khả năng phát huỳnh quang màu xanh lục dưới ánh sáng tử ngoại Do đó, chúng ta có thể dựa vào tính phát quang này để nhận biết và phân biệt giữa nhóm B và G

1.3.2.2 Tính chất hóa học

Trong phân tử aflatoxin có vòng lactone nên dễ bị thủy phân bởi các bazo mạnh, nên có thể dùng kiềm để xử lý thực phẩm nhiễm aflatoxin Tuy nhiên khi axit hóa thì các aflatoxin lại được tái tạo Ở nhiệt độ cao sẽ làm mở vòng decarboxylation, dẫn đến mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm

Nhiều tác nhân oxy hóa như hypochloride natri, thuốc tím, chlorine, H2O2, ozone, … phản ứng với aflatoxin và thay đổi cấu trúc phân tử của chúng, một số phản ứng làm mất huỳnh quang

1.3.3 Sự chuyển hóa và bài tiết aflatoxin

Quá trình loại bỏ (trao đổi chất và bài tiết) của các chất hóa học khỏi cơ thể liên quan đến hai giai đoạn chính Giai đoạn I chuyển hóa các chất hóa học có liên quan đến việc bổ sung một nhóm cực nhỏ chứa cả các điện tích dương và âm được thêm vào xenobiotics giống như aflatoxin bởi quá trình oxy hóa, acetyl hóa

và thủy phân và làm cho nó vô hại Giai đoạn I chủ yếu được trung gian bởi các

hệ thống enzyme Cytochrome P450 (CYP450) Chuyển hóa giai đoạn II liên quan đến các phản ứng liên hợp sulfate, glucuronide, glutathione và amino acid

Sự chuyển hóa của AFB1 đã được nghiên cứu bởi Wild và cộng sự, 2002;

Gallagher và cộng sự, 1996; Vondracek và cộng sự, 2001 (Hình 1.4) [23, 55, 54]

Aflatoxin trải qua quá trình chuyển hóa pha I bởi phản ứng oxy hóa bao gồm

phản ứng epoxid hóa, hydrat hóa, hydroxyl hóa và phản ứng oxy hóa O-demethyl

hóa liên quan đến siêu họ enzyme Cytochrome P450s (CYP450s) để tạo AFB1

-exo-8,9-epoxide (AFBO), AFB2a, AFM1, AFQ1 và AFP1 AFBO là chất gây ung

thư trong khi các chất chuyển hóa khác ít độc hơn và được liên kết với các phân

tử khác để nhanh chóng bài tiết qua mật và nước tiểu

Hình 1 4 Quá trình chuyển hóa aflatoxin B 1 trong cơ thể (1A2: CYP1A2, 3A4:

CYP3A4, 3A5: CYP3A5, GST: Glutathione S-transferase, AFAR: aflatoxin aldehyde

reductase, aflatoxin-S-G: aflatoxin-glutathione) [54]

AFB1 được chuyển hóa chủ yếu trong gan nhờ các CYP1A2,

CYP3A4/CYP3A5 và CYP3A7 (ở thai nhi) xúc tác chuyển hóa thông qua hai

phản ứng oxy hóa vận chuyển điện tử riêng biệt [12, 23, 54, 57] Enzyme

CYP1A2 phân cắt AFB1 thành exoepoxide, endoepoxide và AFM1, trong khi đó CYP3A4 phân cắt AFB1 thành AFB1-exo-8,9-epoxide và AFQ1 ít độc hơn AFM1

và AFQ1 không bị phân giải tiếp mà được bài tiết qua nước tiểu [56]

Các chất chuyển hóa AFB1 của giai đoạn I chuyển hóa qua quá trình chuyển hóa enzym giai đoạn II bởi glutathione S-transferases (GST), chủ yếu xúc tác phản ứng liên hợp AFB1-exo-8,9-epoxide có thể được chuyển hóa ngược lại hoặc thành aflatoxin-mercapturic acid thông qua con đường trung gian cộng hợp GST hoặc thành aflatoxin-glucuronide thông qua con đường aflatoxin-dihydrodiol Dạng hoạt hóa của AFB1 (exoeposide và endoepoxide) bị khử độc thông qua quá trình cộng hợp trung gian GST (glutathione S-transferase) sử dụng glutathione dạng khử (GSH) để tạo thành các cộng hợp AFB1 exoepoxidep-GSH

và endoexposide-GSH tương ứng [32] Các exoeposide và endoeposide dạng hoạt động cũng sẽ bị thủy phân nhanh chóng (không bởi enzyme) để tạo thành aflatoxin B1-8,9-dihydridiol rồi nhanh chóng chuyển hóa thành một ion

dialdehyde phenolate [32, 57]

Ion dialdehyde phenolate sau đó bị thủy phân bởi aflatoxin aldehyde reductase (AFAR) tạo thành một dialcohol trong phản ứng khử phụ thuộc NADPH Aflatoxin B1 dialdehyde cũng tạo phản ứng với nhóm amin bậc một của các gốc axit amin như lysine trong phân tử protein như albumin để tạo thành dạng cộng hợp aflatoxin B1- albumin [57] Cộng hợp này tồn tại trong hệ thống mạch máu dưới dạng một dẫn xuất aflatoxin B1-albumin bền vững

Ngoài gan, aflatoxin cũng được chuyển hóa trong các tế bào ruột của biểu

mô ruột non có chứa hàm lượng enzyme CYP3A cao và điều này có thể làm giảm sự hấp thu toàn thân của chúng Các lipoxygensase và prostaglandin H synthase cũng cung cấp một con đường quan trọng của sự trao đổi chất aflatoxin trong các cơ quan ngoài gan khác

1.3.4 Độc tính của aflatoxin

Độc tính gây ung thư do aflatoxin đã được báo cáo ở cả người và động vật trên toàn cầu và trong các nghiên cứu thực nghiệm ở nhiều loài động vật khác

nhau đã cung cấp bằng chứng về khả năng gây ung thư của aflatoxin Tính gây ung thư của aflatoxin đã được phân loại dựa trên các bằng chứng được quan sát thấy ở động vật thí nghiệm là “bằng chứng đầy đủ về khả năng gây ung thư của AFB1, AFG1 và AFM1 tự nhiên , bằng chứng giới hạn cho AFB2 và bằng chứng không đầy đủ cho AFG2” AFB1 có độc tính gây ung thư mạnh nhất đặc biệt là ung thư gan, ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) và AFB2 là chất gây ung thư gan

ít nhất Khả năng gây ung thư và độc tính của AFB1, AFG1, AFM1, AFB2 và AFG2 có liên quan đến sự chuyển hóa sinh học trong các loài động vật khác nhau bao gồm con người, chuột, vịt và nhiều động vật khác

AFB1 trải qua quá trình oxy hóa trong gan để tạo AFB1-8,9-epoxide (AFBO, còn được gọi là AFB1-2,3-epoxide trong các tài liệu cũ) để gây tác dụng gây ung thư cho gan, đặc biệt là HCC Hiệu lực gây ung thư của AFB1 tương quan chặt chẽ với mức độ liên kết cộng hóa trị của AFBO với DNA, khả năng kích hoạt các

cơ chế biểu sinh và sự ức chế gen P53 (gen ức chế khối u) Sự hình thành AFBO

đã được báo cáo là một yếu tố quyết định quan trọng của sự khác biệt về tính nhạy cảm của aflatoxin đối với ung thư đặc biệt là HCC ở các loài động vật khác nhau Ở vịt, chúng dễ bị nhiễm độc AFB2 so với các loài động vật khác AFB2 gây độc tính cho gan đối với vịt và điều này là do gan của vịt có khả năng chuyển hóa sinh học AFB2 thành AFB1 sau đó tiếp tục kích hoạt bằng các phản ứng trao đổi chất thông qua con đường epoxid hóa như AFB1 AFB2 được kích hoạt trong gan bằng 2,3 desaturation thành AFB1 Ở người và động vật gặm nhấm, sự mất bão hòa AFB2 trong gan không xảy ra và điều này làm giảm tiềm năng gây ung thư của nó hơn 150 lần so với AFB1 Ở người và các động vật khác, AFB1 được kích hoạt trong gan dẫn đến sự hình thành AFB1-2,3-epoxide là một hợp chất hóa học gây ung thư mạnh AFB2 không trải qua cùng một lộ trình trao đổi chất như AFB1 do thiếu sự liên kết đôi 2,3 trong hợp chất Biến đổi sinh học của AFB2 thành AFB1-2,3-epoxit xảy ra thông qua sự hình thành trung gian AFB1 bằng sự khử bão hòa ở 2,3-cacbon của AFB2 Và do đó, tỷ lệ chất bổ sung axit nucleic được hình thành từ hai hợp chất (AFB1 và AFB2) được báo cáo là

tương tự với các chất gây ung thư của hai aflatoxin đến khoảng 1: 100 (AFB2 : AFB1) Tuy nhiên, sự hình thành một lượng nhỏ AFB1 từ AFB2 được cho là nguyên nhân gây ung thư của AFB2 ở người và động vật AFB1, AFM1 và AFG1 được báo cáo là gây ra nhiều loại ung thư khác nhau ở các loài động vật khác nhau Tuy nhiên, sự khác biệt về khả năng gây ung thư của các aflatoxin này phụ thuộc vào sự thay đổi tế bào khi chúng liên kết với các DNA và các phân

tử sinh học khác trong cơ thể AFG1 liên kết với DNA và làm sai nhiễm sắc thể ở loài gặm nhấm được điều trị trong cơ thể AFB1 chủ yếu gây ung thư gan ở người

và động vật gặm nhấm trong khi AFG1 ngoài ra gây ung thư thận ở động vật gặm nhấm thí nghiệm

1.4 Tình hình nhiễm độc aflatoxin trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Trên thế giới

Từ năm 2004, nhiều đợt bùng phát aflatoxicosis đã được báo cáo trên toàn thế giới, dẫn đến 500 bệnh cấp tính và 200 ca tử vong [10, 38] Ngộ độc cấp do tiêu thụ lượng lớn aflatoxin gấp hàng ngàn lần hàm lượng cho phép hiếm khi xảy

ra nhưng gây tử vong cao, với vụ dịch gần nhất được ghi nhận tại Kenya, 2004 (317 ca mắc và 125 tử vong) và trước đó tại Ấn Độ, 1974, với tổng lượng aflatoxin từ ngô ước tính trung bình là 2 - 6 mg/người/ngày (397 ca mắc và 106

tử vong) [44] Năm 2013, nhiễm aflatoxin ở sữa cũng được ghi nhận một số nước châu Âu như tại Romania, Serbia và Croatia

Trên thế giới, aflatoxin cũng được cho nguyên nhân của 25 200-155 000 trường hợp ung thư tế bào gan hàng năm, chiếm 5-28% tổng số gan ung thư tế bào gan trên thế giới Aflatoxin hiện diện ở nhiều loại thực phẩm và theo ước tính, khẩu phần ăn của người sống tại vùng Đông Nam Á có tổng lượng aflatoxin trung bình một ngày là 30-100 ng/kg thể trọng/ngày Hàm lượng phơi nhiễm trung bình này có liên quan đến nguy cơ ung thư tế bào gan do chất này là 3-10 ca/1 triệu dân/năm So với người không nhiễm, người đồng nhiễm viêm gan siêu

vi B và aflatoxin có nguy cơ ung thư tế bào gan cao gấp 30 lần

1.4.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, năm 1988, Viện Dinh dưỡng đã báo cáo kết quả nghiên cứu thăm dò afltoxin B1 trong lạc và sản phẩm từ lạc: kết quả cho thấy 7/55 mẫu lạc

nhân có chứa aflatoxin, chiếm 13%

Trong giai đoạn 1990-1995, Viện Dinh dưỡng đã kiểm tra 387 mẫu lương thực thực phẩm trong đó có 73 mẫu (19%) bị nhiễm aflatoxin và 19 mẫu (4,9%)

có hàm lượng aflatoxin vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế

Kết quả khảo sát phân tích trên 243 mẫu ngô, lạc và sản phẩm chế biến làm thức ăn chăn nuôi tại 3 xã thuộc huyện Tân Kỳ - Nghệ An đã phát hiện mức độ

và nguy cơ nhiễm aflatoxin khá cao: trên 95,4% (232/243) số mẫu lấy tại các hộ gia đình đang bảo quản phát hiện có nhiễm aflatoxin và tỷ lệ vượt giới hạn cho phép theo quy định của Bộ Y tế là > 23% (56/243 mẫu) Trong số 243 mẫu, có

56 mẫu có hàm lượng aflatoxin > 10 ppb; 22 mẫu có hàm lượng AF từ 5-10 ppb;

50 mẫu có hàm lượng AF từ 2-5 ppb [4]

Theo nghiên cứu của Đậu Ngọc Hào và các cộng sự, mức nhiễm nấm mốc

và aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa cho thấy 50-80 % số

mẫu (24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột) bị nhiễm Aspergillus flavus [1]

Viện Vệ sinh Y tế công cộng Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành phân tích các mẫu gửi tới kiểm nghiệm Kết quả cho thấy trong 115 mẫu (gồm sản phẩm chế biến từ đậu phộng, nước tương làm từ đậu nành, đồ hợp chay làm từ các loại đậu phù và bột mì, cà phê, thức ăn chăn nuôi) có 30% mẫu cà phê, 42,9% mẫu nước tương, 66,7% mẫu đồ hộp chay và 68,2% mẫu động phộng và sản phẩm từ đậu phộng bị nhiễm AFB1 Đặc biệt đáng quan tâm là 94,6% mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa aflatoxin AFB1 Hầu hết các mẫu bị nhiễm aflatoxin đều ở hàm lượng rất cao (> 10 ppb), đặc biệt có mẫu chứa 140 - 300 ppb

Gần đây nhất, trong tháng 5/2017, nhằm giám sát aflatoxin trong ớt khô, cán

bộ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành giám sát chủ động có chủ đích, tập trung vào các mẫu ớt khô có nguy cơ cao (ớt khô không có đóng gói, không có xuất xứ rõ ràng) được bày bán ở một số điểm kinh doanh nhỏ lẻ ở một

số tỉnh, thành phố Kết quả xét nghiệm phát hiện 20,8% số mẫu vượt ngưỡng AFB1 quy định theo quy chuẩn kỹ thuật Việt Nam Đây là dấu hiệu chỉ điểm, giúp rà soát lại chuỗi thực phẩm từ công tác canh tác, thu hoạch, vận chuyển, chế biến, bảo quản và sử dụng ở ớt khô không bao bì và không rõ nguồn gốc

Theo nghiên cứu của Trần Văn An (1991), hàm lượng aflatoxin trong một số nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam như sau:

Bảng 1 1 Lượng aflatoxin trong nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam

Tên nguyên liệu Số mẫu Hàm lượng aflatoxin

trung bình (ppb)

Hàm lượng aflatoxin tối đa (ppb)

một vật liệu trơ như thủy tinh, hoặc nhựa và được gọi là chất nền Pha động bao gồm hỗn hợp các dung môi methanol, chlorofom, acetone, nước Thời gian phân tích kéo dài từ 45 phút đến 2 giờ Ưu điểm của việc sử dụng phương pháp TLC

là nó có thể xác định nhiều loại aflatoxin trong một mẫu đơn Mặc dù, TLC có

độ nhạy cao nhưng nó cũng đòi hỏi người phân tích phải có kỹ năng tốt, phải tiền xử lý mẫu và sử dụng thiết bị đắt tiền Ngoài ra, TLC có thể thiếu chính xác

do các vấn đề trong quá trình tra mẫu, hiển thị tín hiệu và phân tích kết quả Những cố gắng để cải thiện TLC đã được phát triển thành một dạng TLC tự động được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Kỹ thuật HPTLC đã khắc phục được các vấn đề nhược điểm của phương pháp TLC thông thường như nạp mẫu, hiển thị và phân tích kết quả tự động Hiện nay, kỹ thuật HPTLC

là một trong số những phương pháp chính xác và hiệu quả trong phân tích aflatoxin [48] Tuy nhiên, do đòi hỏi người thực hiện phân tích phải có kỹ năng tốt, giá thành của thiết bị cao và tiền xử lý mẫu phức tạp nên kỹ thuật HPTLC chỉ phù hợp cho phân tích tại phòng thí nghiệm và không thể ứng dụng để phân tích aflatoxin ngoài hiện trường

• Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký phổ biến nhất dùng để phân tách và xác định trên 80 % các hợp chất hữu cơ trên thế giới [17] Kỹ thuật HPLC sử dụng một pha tĩnh nằm trong cột thủy tinh/cột nhựa, còn pha động là hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ có thể chạy qua các chất hấp phụ rắn

Mẫu phân tích thường được bơm vào pha tĩnh và các chất cần phân tích được di chuyển dọc theo pha tĩnh bởi pha động sử dụng áp suất cao Các chất cần phân tích được phân bố khác nhau trong pha tĩnh thông qua tương tác vật lý

và hóa học với các pha tĩnh và pha động Tại thời điểm một chất nhất định được thôi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bằng một cảm biến và được ghi nhận theo thời gian trễ của nó Các cảm biến ví dụ như cảm biến huỳnh quang (FLD), cảm biến

tử ngoại (UV) hoặc cảm biến dãy diode (DAD) có thể được sử dụng để phát hiện

và xác định các aflatoxin Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao đã được sử

dụng để xác định aflatoxin trong các loại thực phẩm bao gồm các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao cùng pha và ngược pha Phương pháp HPLC ngược pha là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phân tách và xác định aflatoxin Sắc ký lỏng hiệu suất cao được xem là một phương pháp xác định aflatoxin nhanh, chính xác và thời gian phân tích ngắn Độ nhạy của phương pháp có thể đạt được 0,1 ng/kg sử dụng cảm biến FLD Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp HPLC để xác định aflatoxin cũng có một số hạn chế như mẫu cần được tinh sạch cao sử dụng cột sắc ký ái lực, cần quá trình tạo dẫn xuất trước và sau cột để giảm ngưỡng phát hiện của aflatoxin B1 và G1 [40] Do đó, để khắc phục hạn chế trong việc tạo sẫn xuất trước khi phân tích aflatoxin, phương pháp HPLC cũng đã được cải biến bằng cách kết nối với khối phổ và đây là phương pháp hiện nay thường được sử dụng để xác định aflatoxin Do phương pháp khối phổ không đòi hỏi sử dụng UV hoặc sự hấp thụ của một chất phân tích nên không cần bước tạo dẫn xuất của các aflatoxin HPLC - MS/MS là một phương pháp sử dụng một lượng nhỏ mẫu để tạo ra thông tin về cấu trúc và có giới hạn phát hiện thấp Tuy nhiên, HPLC-MS/MS là một hệ thống lớn và rất đắt tiền nên chỉ được thực hiện bởi những người được đào tạo và có kỹ năng tốt Phương pháp này cũng chỉ phù hợp để thực hiện phân tích aflatoxin trong điều kiện phòng thí nghiệm và hoàn toàn không phù hợp để thực hiện tại hiện trường

• Sắc ký khí

Trong sắc kí khí, pha động là khí mang và pha tĩnh là chất lỏng được phủ lên các hạt rắn trơ Tương tự như các phương pháp sắc ký khác, sắc ký khí phân tích mẫu chủ yếu dựa vào phân tách khác nhau của các chất giữa hai pha Pha tĩnh bao gồm các hạt trơ được phủ một lớp chất lỏng và thường được giới hạn trong một ống thép không gỉ hoặc thủy tinh dài được gọi là cột, duy trì ở nhiệt độ thích hợp Mẫu cần phân tích bay hơi vào pha khí và được truyền qua pha tĩnh bằng khí mang Các thành phần hóa học khác nhau trong mẫu được phân bố giữa pha động và pha tĩnh Các thành phần có ái lực cao với pha tĩnh sẽ di chuyển qua cột chậm hơn, và ngược lại, các thành phần có ái lực thấp với pha tĩnh sẽ di chuyển

nhanh hơn Mỗi thành phần khác nhau có một hệ số phân bố riêng biệt, từ đó ta

dễ dàng điều chỉnh tốc độ đi qua cột phù hợp với quá trình cần phân tách [15] Sau khi tách các chất, việc phát hiện các sản phẩm dễ bay hơi được thực hiện bằng cách sử dụng detector FID, ECD hoặc máy đo khối phổ (MS) Do tính không tan trong tự nhiên, có thể cần tạo dẫn xuất aflatoxin để phát hiện

Sắc ký khí là một phương pháp có thể dùng để phát hiện aflatoxin, tuy nhiên được sử dụng ít phổ biến hơn trong phân tích thương mại do có nhiều phương pháp sắc ký khác với giá thành rẻ hơn Bên cạnh đó, sắc ký khí cũng đòi hỏi một bước làm sạch ban đầu trước khi phân tích và do đó phương pháp này hạn chế để phân tích một vài độc tố nấm mốc, chẳng hạn như A-trichothecenes và B-trichothecenes Ngay cả trong các phân tích như vậy, sắc ký khí vẫn có những nhược điểm như khó lập đường chuẩn, kết quả dễ bị ảnh hưởng từ các mẫu trước

đó [47]

1.5.2 Phương pháp quang phổ

• Quang phổ huỳnh quang:

Cấu trúc của các loại vật liệu dễ dàng được làm sáng tỏ trong vùng ánh sáng UV-VIS bởi sự hấp phụ ở các bước sóng đặc trưng Tuy nhiên, đối với một số phân tử quá trình hấp thụ sẽ được xảy ra sau sự phát ra các bước sóng ánh sáng khác nhau Các phân tử như vậy được gọi là các chất huỳnh quang Sự phát huỳnh quang là rất quan trọng trong việc xác định và phân tích các phân tử có khả năng giải phóng năng lượng ở các bước sóng nhất định và đã được sử dụng

để phân tích aflatoxin trong các loại hạt [11] Phương pháp đo huỳnh quang có thể định lượng aflatoxin từ 5 – 5000 ppb trong thời gian dưới 5 phút Tuy nhiên,

để phân tích tốt hơn đối với các aflatoxin sử dụng thiết bị đo huỳnh quang, việc tạo dẫn xuất có thể là cần thiết để tăng khả năng phát quang của aflatoxin Giới hạn phát hiện cao hơn so với quy định của Châu Âu (4 µg/kg) và do vậy phương pháp này là không phù hợp để kiểm nghiệm các mẫu từ các sản phẩm xuất khẩu vào Châu Âu

• Quang phổ hồng ngoại:

Một phương pháp quang phổ khác có khả năng phân tích aflatoxin hữu hiệu

đó là quang phổ hồng ngoại (IR) Quang phổ hồng ngoại hoạt động dựa vào sự thay đổi trong dao động phân tử phụ thuộc vào sự kích thích bởi bức xạ hồng ngoại Sự dao động các liên kết trong phân tử có thể được ghi nhận Vì kích thước nguyên tử, chiều dài liên kết và cường độ liên kết là có sự khác biệt lớn giữa các phân tử, nên tốc độ mà ở đó một liên kết nhất định hấp thụ bức xạ hồng ngoại sẽ khác nhau đối với từng liên kết và dạng dao động Hai phân tử hữu cơ khác nhau sẽ có có phổ hồng ngoại khác nhau và do vậy mỗi hợp chất sạch có thể được nhận diện bằng việc xác định phổ hồng ngoại của nó Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier đã được sử dụng để phân tích aflatoxin trong hạt đậu

và bánh hạt đậu Pearson và cộng sự cũng đã sử dụng quang phổ truyền qua và quang phổ phản xạ để xác định aflatoxin trong hạt ngô [46] Kết quả phân tích cũng cho thấy rằng hơn 95% các loại hạt được phân tích có chứa aflatoxin trong

đó chia thành hai nhóm đó là nhóm có nồng độ aflatoxin cao (> 100 ppb) và nồng độ aflatoxin thấp (< 10 ppb)

1.5.3 Phương pháp miễn dịch

Phương pháp miễn dịch đã phát triển từ những năm 1970 do có nhiều ưu điểm [11] Phương pháp này dựa vào tính đặc hiệu của sự gắn kết giữa các kháng thể và kháng nguyên Sự hình thành liên kết kháng nguyên - kháng thể hoặc phức hợp thụ thể có thể được định lượng bằng cách dựa vào sự thay đổi độ hấp thụ của các photon năng lượng ánh sáng quang phổ Trong các trường hợp khác, sự liên kết này có thể được khuếch đại để nhận dạng tín hiệu tốt hơn Điều này đã đạt được bằng cách sử dụng các chất đánh dấu khác nhau bao gồm các enzyme, fluorophore và đồng vị phóng xạ, Nhờ những tiến bộ, kỹ thuật miễn dịch được

áp dụng trong một loạt các lĩnh vực/ngành, bao gồm ngành sinh học, thực phẩm

và dược phẩm Ưu điểm của phương pháp miễn dịch là mức độ đặc hiệu và độ nhạy cao của chúng ngay cả khi có các vật liệu nhiễm bẩn, không yêu cầu nhân viên có tay nghề cao, ít tốn sức lao động và tiết kiệm thời gian hơn Các phương

pháp miễn dịch chính được sử dụng trong phân tích aflatoxin bao gồm xét nghiệm phóng xạ (RIA), xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA), que thử sắc ký miễn dịch và immunosensors

• RIA

Kỹ thuật xét nghiệm radioimmunoassay dựa trên nguyên tắc liên kết cạnh tranh giữa một kháng nguyên có đánh dấu phóng xạ và một kháng nguyên không hoạt tính Kháng nguyên có đánh dấu phóng xạ cạnh tranh với kháng nguyên không hoạt tính không có đánh dấu phóng xạ đối với một lượng cố định kháng thể hoặc các vị trí liên kết kháng nguyên trên cùng một kháng thể Số lượng kháng nguyên có đánh dấu phóng xạ và số lượng kháng nguyên không được có đánh dấu phóng xạ được xác định từ các tiêu chuẩn phản ứng cạnh tranh với lượng kháng thể đã biết và giới hạn Lượng kháng nguyên được đánh dấu tỷ lệ nghịch với lượng kháng nguyên không đánh dấu trong mẫu Xét nghiệm phóng

xạ cũng đã được sử dụng để phân tích các aflatoxin trong các mẫu thực phẩm Langone và van Vunakis đã báo cáo việc sử dụng kỹ thuật phản ứng phóng xạ trong việc xác định aflatoxin B1 trong đậu phộng và đạt được giới hạn phát hiện 1 μg/kg [38] Tương tự, các xét nghiệm phóng xạ đã được sử dụng để định tính và định lượng nồng độ AFB1 và AFM1 [49] Ưu điểm chính của xét nghiệm phóng

xạ là khả năng thực hiện nhiều phân tích đồng thời với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, RIA cũng bị một số nhược điểm: nó đòi hỏi một kháng nguyên ở trạng thái tinh khiết, đồng vị phóng xạ được sử dụng như một chất đánh dấu và

có nguy cơ ảnh hưởng sức khỏe, và nó có vấn đề liên quan với việc lưu trữ và xử

lý chất thải phóng xạ ở mức độ thấp Những bất lợi này đã hạn chế việc sử dụng RIA thường xuyên trong phân tích aflatoxin

• Phương pháp ELISA

Hiện nay kỹ thuật ELISA được sử dụng để xác định aflatoxin trong các sản phẩm nông nghiệp và phát triển thành một số kít thương mại Hầu hết kít sử dụng enyzme horseradish peroxidase (HRP) và alkaline phosphatase (AP) như là chất đánh dấu trong phân tích aflatoxin [38] Phương pháp ELISA có một số ưu

điểm: có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, kít ELISA rẻ và dễ dàng sử dụng hơn so với phương pháp kể trên và không cần làm sạch mẫu, không nguy hại đến con người Tuy nhiên kỹ thuật ELISA đòi hỏi rất nhiều bước rửa nên mất nhiều thời gian

• Que thử miễn dịch

Que thử là một công cụ phân tích nhanh hoạt động dựa trên nguyên tắc sắc

ký miễn dịch (LFA) Nguyên lý của kỹ thuật này là dựa vào tính đặc hiệu và độ nhạy cao của phản ứng kháng nguyên kháng thể để phát hiện nhanh các phân tử cần phân tích [28] Que thử có cấu tạo gồm miếng thấm mẫu, miếng cộng hợp, màng và miếng thấm hút Đa số các que thử được đặt trên một thanh đỡ hoặc hộp nhựa bảo vệ chỉ để lộ phần hiển thị kết quả Trên hộp nhựa lỗ nhỏ để tra mẫu Khi mẫu dạng dịch lỏng được đưa vào que thử sẽ chảy qua một miếng thấm mẫu, có vai trò tiền xử lý mẫu Sau đó chất lỏng từ miếng thấm mẫu di chuyển đến một miếng cộng hợp có chứa các chất đánh dấu, có vai trò là chiếc cầu nối để chất lỏng đi vào màng Chất lỏng di chuyển trên màng nhờ hiện tượng mao dẫn xong vẫn cần một miếng thấm hút phía cuối có vai trò tăng thể tích chất lỏng và giữ chất lỏng khi dịch di chuyển qua màng không quay ngược trở lại Que thử đã được phát triển để xác định AFB1 trong thức ăn của lợn [21] Giới hạn phát hiện aflatoxin của que thử là 5 µg/kg trong thời gian 10 phút Giới hạn phát hiện này nằm ngưỡng cho phép của Hội đồng Châu Âu Một phương pháp sắc ký miễn dịch khác đã được phát triển bởi Ho và Wauchope Kỹ thuật dựa trên sự cạnh trang giữa AFB1 tự do và liposome có chứa đuôi chất màu gắn với AFB1 đối với kháng thể tương ứng Que thử này có thể phát hiện được 18 ng aflatoxin trong thời gian 12 phút Que thử có ưu điểm là dễ sử dụng, thời gian phân tích ngắn, rẻ nên phù hợp với việc kiểm tra aflatoxin hàng ngày

• Cảm biến miễn dịch

Cảm biến miễn dịch là một cảm biến sinh học sử dụng một kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu như một thành phần nhận dạng sinh học kết hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu như than chì, vàng hoặc Carbon giúp phát hiện các liên kết

đặc hiệu bổ sung Các cảm biến miễn dịch thường được sử dụng gồm: cảm biến điện áp, cảm biến quang học và cảm biến điện hóa Bằng kỹ thuật này, Spinella

và cộng sự đã phát hiện AFB1 ở mức 0,5 - 10 ppb [33] Báo cáo của Jn và cộng

sự cho thấy đã phát hiện hiện AFB1 trong sữa nhiễm bẩn nhân tạo ở dải nồng độ 0,01 – 10,0 ng/ml [31] Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên cần sử dụng kháng thể và kháng nguyên có độ tinh khiết cao

1.5.4 Phương pháp que thử sắc ký miễn dịch

1.5.4.1 Tình hình sử dụng que thử phát hiện aflatoxin tại Việt Nam

Hiện nay tại Việt Nam chưa có công bố nghiên cứu về que thử nhanh phát hiện aflatoxin, các que thử hiện có 100% nhập ngoại từ các nước Trung Quốc,

Mỹ, Nhật Bản,… với độ nhạy từ 5 – 20 ppb Các que thử trên thị trường Việt Nam gồm có que thử định lượng và que thử định tính aflatoxin

Reveal for Aflatoxin (Mĩ) là que thử định tính với độ nhạy 20 ppb được sử dụng để xác định sự có mặt của aflatoxin trong ngô, hạt bông, thức ăn thô, cháo ngô, đậu phộng, bắp rang, gạo, bột đậu nành và lúa mì

Reveal Q+ for Aflatoxin là sản phẩm que thử định lượng với khoảng đo từ

2 – 150 ppb trong thời gian 6 phút

Reveal Q+ for Aflatocxin Green có ưu điểm hơn là có khả năng đọc kết quả một cách chính xác với một con số cụ thể kèm theo máy đọc que test Reveal Q+

1.5.4.2 Nguyên lý que thử xác định aflatoxin B 1

Có hai định dạng que thử LFA được phát triển phổ biến đó là dạng LFA trực tiếp và LFA cạnh tranh Phương pháp LFA cạnh tranh được phát triến để xác định các phân tử nhỏ như mycotoxin, kháng sinh, Trong đó, quá trình phản ứng và hiển thị tín hiệu được diễn ra trong phần màng nitrocellulose Cộng hợp kháng nguyên aflatoxin với chất mang sẽ được cố định lên màng tại vị trí kiểm tra (T-line); kháng thể kháng kháng thể cộng hợp sẽ được cố định trên thanh que thử tại vị trí kiểm chứng (C-line) Miếng cộng hợp chứa phức cộng hợp giữa kháng thể kháng aflatoxin với hạt nano vàng

Định dạng của que thử được thể hiện như Hình 1.5:

Hình 1 5 Nguyên lý que thử hoạt động dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh

Mẫu cần xác định aflatoxin bằng que thử sẽ được chuẩn bị dưới dạng dịch

lỏng trong dung dịch thích hợp

Nhỏ dung dịch mẫu đã được chuẩn bị vào vị trí miếng thấm mẫu, khi đó dịch mẫu lỏng sẽ thấm từ miếng thấm mẫu sang miếng cộng hợp chứa phức cộng hợp kháng thể kháng aflatoxin và hạt nano vàng Dịch lỏng lại tiếp tục thấm vào màng nitrocellulose và di chuyển về hướng miếng thấm hút (phía đầu bên kia của que thử)

• Trong trường hợp mẫu phân tích không chứa aflatoxin: Kháng thể cộng hợp hạt nano vàng (Ab-GNP) sẽ di chuyển dọc theo màng nitrocellulose đi tới vạch T, tại đây sẽ xảy ra phản ứng giữa kháng thể cộng hợp và phức hợp kháng nguyên - chất mang Do kháng thể cộng hợp bị giữ lại nên các hạt nano vàng cũng bị giữ lại theo và tạo thành một vạch tín hiệu màu hồng tía Một phần kháng thể cộng hợp không bị giữ lại ở vạch T sẽ được di chuyển tiếp đến vạch C, tại đây kháng thể cộng hợp lại bị bắt giữa bởi kháng thể kháng kháng thể cộng hợp

đã được cố định sẵn và tạo thành vạch tín hiệu màu hồng tía Que hiển thị 2 vạch tín hiệu màu hồng tía

• Trong trường hợp mẫu phân tích có chứa afltoxin: AF sẽ bám vào vị trí paratope trên kháng thể cộng hợp tạo thành phức AF-Ab-GNP và di chuyển tiếp đến vị trí kiểm tra T Tại đây, do vị trí paratope trên kháng thể cộng hợp đã bị phong tỏa bởi aflatoxin có trong mẫu phân tích nên kháng thể này không thể bám vào AF được cố định với chất mang tại vị trí T trên màng nitrocellulose của

thanh que thử nên không tạo thành vạch tín hiệu tại vị trí T này Phức GNP tiếp tục di chuyển đến vị trí C và bị bắt giữ bởi kháng thể kháng kháng thể cộng hợp tạo thành một vạch tín hiệu màu hồng tía

AF-Ab-Kết quả phân tích que thử có các trường hợp sau:

+ Âm tính: Xuất hiện hai vạch, trong đó vạch T ngang bằng vạch C

+ Dương tính: có hai trường hợp: (1) cường độ vạch T mờ hơn vạch C, (2) vạch T hoàn toàn biến mất, vạch C có cường tín hiệu không đổi

+ Que thử hỏng: chỉ xuất hiện vạch T hoặc không xuất hiện cả hai vạch T và C

1.6 Đặc tính que thử

1.6.1 Hạt nano vàng

Hơn 70% nghiên cứu hiện nay sử dụng hạt nano vàng làm chỉ thị màu trong thành phần que thử Trong nghiên cứu này, hạt nano vàng được tạo ra ở dạng lỏng bằng cách khử hydro tetraclorua vàng (HAuCl4), Au3+ bị khử thành Au2+ Sau khi hòa tan HAuCl4 trong nước cho khuấy từ nhanh, đun sôi ở nhiệt độ

280oC, bổ sung tác nhân khử vào theo tỷ lệ thích hợp, vàng bắt đầu dần dần kết tủa dưới dạng hạt nhỏ hơn cỡ nano mét và lớn dần lên khi dung dịch trở nên siêu bão hòa Hạt nano vàng được chức năng hóa bề mặt với các nhóm chức hữu cơ tạo nên liên kết vô cơ - hữu cơ, làm chúng được bao phủ bởi một lớp phân tử hữu

cơ tích điện Chúng có thể kết hợp với các phân tử sinh học thông qua các nhóm chức để tạo thành chất đánh dấu Để làm được điều này, hạt nano vàng cần có tính chất sau:

- Gắn kết bền vững với các phân tử sinh học và không làm ảnh hưởng tới hoạt tính của phân tử sinh học

- Không làm ảnh hưởng tới cấu trúc không gian của phân tử sinh học và không cản trở sự gắn kết với phân tử thụ cảm của phân tử sinh học

1.6.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng

Hiện nay, hai phương pháp cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng là liên kết không cộng hóa trị (hấp phụ) và liên kết cộng hóa trị với những ưu nhược điểm riêng:

- Hấp phụ vật lý: kháng thể được hấp phụ lên bề mặt hạt nano vàng nhờ các

tương tác vật lý gồm: tương tác kỵ nước, tương tác ion và lực Van der Waals Liên kết này có độ bền không cao do kháng thể hấp phụ lên bề mặt của các hạt nano vàng thông qua lớp citrate, phụ thuộc rất lớn vào pH, áp suất, nhiệt

độ, điều kiện khuấy trộn, … và có khả năng nhả hấp phụ nếu các điều kiện môi trường không được duy trì ổn định Tuy nhiên, thao tác tạo cộng hợp lại khá đơn giản và ít tốn kém, dễ dàng điều khiển

- Liên kết cộng hóa trị: Ở phương pháp này, kháng thể gắn lên bề mặt vàng

bằng liên kết cộng hóa trị Để làm được việc đó, các hạt nano vàng được gắn sẵn lớp polyethylene glycol (PEG) với đầu hướng ra ngoài là nhóm cacboxyl Nhóm này sau khi được xúc tác bởi tác nhân EDC/NHS sẽ hình thành liên kết cộng hóa trị với kháng thể Đây là liên kết bền vững, khó bị phá vỡ Tuy nhiên, cần nhiều hóa chất và thời gian hơn

1.6.3 Miếng thấm mẫu

Miếng thấm mẫu được đặt ở vị trí đầu tiên trong que thử có vai trò nhận dịch lỏng phân tích, vận chuyển đến các thành phần khác của que thử một cách trong suốt, liên tục và đồng nhất Ngoài ra miếng thấm mẫu cũng giúp loại bỏ cặn hoặc các yếu tố gây nhiễu trong mẫu và kiểm soát tốc độ dịch lỏng đi vào miếng cộng hợp Vật liệu dùng làm miếng thấm mẫu có đặc trưng về: trọng lượng, độ dày, kích thước, độ bền cơ học, khả năng ly giải, … Có hai loại vật liệu được sử dụng phổ biến để làm miếng thấm mẫu là: sợi dệt dạng mắt lưới và cellulose Trong

đó, cellulose được sử dụng nhiều nhất để làm miếng thấm mẫu do chúng cho phép nạp một lượng lớn dung dịch, chất ổn định pH và cường độ ion, chất tăng cường độ nhớt, …

1.6.4 Miếng cộng hợp

Miếng cộng hợp được đặt ở vị trí cầu nối giữa miếng thấm mẫu và màng nitrocellulose được sử dụng để cố định cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng Vật liệu làm miếng cộng hợp phải đảm bảo các yêu cầu sau: không làm hỏng hay làm bất hoạt kháng thể, không làm thay đổi liên kết cộng hợp khi sấy khô, có độ thấm

ướt phù hợp và ổn định đặc điểm dòng chảy, có khả năng nhả phức cộng hợp kháng thể-hạt nano vàng hoàn toàn Miếng cộng hợp có ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử Các vật liệu thường dùng để làm miếng cộng hợp bao gồm: sợi thủy tinh, sợi cellulose, polyester và polypropylene được đặc trưng bởi kích thước lỗ màng, độ dày và trọng lượng

1.6.5 Màng

Màng nitrocellulose là một trong những thành phần quan trọng nhất trong chế tạo que thử Trên màng, các phần tử sinh học được cố định bằng cách phun hoặc chấm điểm tùy theo mục đích nghiên cứu Khi các chất đánh dấu di chuyển trên màng tới vị trí bị bắt giữ, nó sẽ tập trung để tạo thành vạch tín hiệu để có thể quan sát được, từ đó đưa ra đánh giá mẫu phân tích Thuộc tính vật lý và hóa học của vật liệu làm màng có ảnh hưởng tới đặc tính mao dẫn của nó, qua đó ảnh hưởng đến độ nhạy, độ đặc hiệu và tính ổn định của vạch kiểm tra Một màng lý tưởng cần có đặc tính sau: Kiểm soát tốc độ dòng chảy mao mạch, liên kết chặt chẽ với kháng thể, ít hấp phụ không đặc hiệu tại vùng vạch kiểm tra và vạch đối chứng, dễ sử dụng và xử lý, rẻ tiền và có ái lực cao với các phân tử protein hoặc các phân tử sinh học khác

1.6.6 Miếng thấm hút

Miếng thấm hút liên kết với màng ở vị trí cuối cùng trong que thử, có chức năng chính là tăng tổng thể tích mẫu vào que thử, đồng thời tham gia vào việc duy trì tốc độ dòng chảy của chất lỏng qua màng, không cho dòng chảy quay ngược trở lại Do tổng thể thể tích mẫu tạo thành tín hiệu được điều khiển bởi thể tích hòa tan các hạt đánh dấu ở vạch kiểm tra và vạch đối chứng, chứ không phải thể tích mẫu đi vào que thử nên các miếng thấm hút tác động rất ít đến độ nhạy của phép thử Vật liệu làm miếng thấm hút được đặc trưng bởi các thông số kỹ thuật là: kích thước, độ bền cơ học, độ dày, …

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu

A Dung dịch hydro tetraclorua vàng (HAuCl4) của Sigma

- Hóa chất cho que thử: Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2 g; Na HPO 1,44 g; KH PO 0,24 g Dẫn H O đến 100 ml

- Các hóa chất: BSA (Sigma, Mỹ), Tween 20 (Merck, Đức), NaCl (Merck, Đức), Sodium Borate (Mỹ), Sucrose (Merck, Đức)

- Miếng cộng hợp Miếng cộng hợp (Hãng Biotech - Conjugate pad ZC J2, size 21x20 cm)

- Miếng thấm mẫu (Hãng Biotech - Sample pad FM Y2)

- Màng nitrocellulose (HãngBiotech)

- Vỏ nhựa (Xuất xứ Trung Quốc)

- Miếng thấm hút (Hãng Biotech –Absorbent pad H5076, size 20x30 cm, Trung Quốc)

2.1.2 Các kháng thể sử dụng

2.1.2.1 Kháng thể cho tạo que thử

- Kháng thể cộng hợp (KT1): kháng thể kháng AFB1 trong nghiên cứu này

- Kháng thể ở vạch kiểm chứng: kháng thể kháng – kháng thể thỏ có nguồn gốc từ dê (Vector Lab, US)

2.1.2.2 Kháng thể cho ELISA và Dot-blot

- Cân kỹ thuật TE 612 (Sartorius, CHLB Đức)

- Cân phân tích CPA 324S (Sartorius, CHLB Đức)

- Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Bản)