Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng gaba và amylase trong quá trình nảy mầm gạo lứt

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình nảy mầm đến sự thay đổi hoạt độ α-amylase và hàm lượng GABA trong hạt gạo lứt Anh Đào ...47 3.2.1.. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Trường Giang

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn thạc sỹ ‘’Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến

hàm lượng GABA và amylase trong quá trình nảy mầm gạo lứt’’ là do chính tôi thực hiện Các số liệu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn

và tham chiếu đầy đủ

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Yến

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Trường Giang, người thầy đã hướng dẫn, động viên giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và viết luận văn này Những nhận xét, đánh giá của thầy, đặc biệt

là những gợi ý về hướng giải quyết vấn đề trong suốt thời gian nghiên cứu, thực sự

là những bài học quý giá đôi với em không chỉ trong quá trình viết luận văn mà cả trong quá trình công tác sau này

Em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến PGS.TS.Nguyễn Thanh Hằng, NCS Lưu Anh Văn cùng các thầy cô giáo, các anh chị cán bộ đang làm việc và nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã tận tình chỉ dẫn, truyền đạt những ý kiến chuyên môn và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Em xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và những người thân đã luôn ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Yến

1

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC BẢNG 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 6

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 10

1.1 Tổng quan về nguyên liệu 10

1.1.1 Nguyên liệu lúa 10

1.1.2 Giống lúa nếp Anh Đào 12

1.1.3 Giống lúa Tám Xoan 13

1.1.4 Giống lúa N97 13

1.1.5 Gạo lứt 14

1.1.6 Gạo lứt nảy mầm 15

1.2 Tổng quan về GABA 19

1.2.1 Khái niệm về GABA 19

1.2.2 Các nghiên cứu khoa học trên thế giới về GABA trong gạo 20

1.2.3 Nghiên cứu trong nước về các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng GABA trong gạo lứt 23

1.3 Tổng quan về enzym amylase 23

1.3.1 Enzym α-amylase(E.C.3.2.1.1) 26

1.3.2 β-amylase (1,4-α-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2) 28

1.3.3 Một số nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành enzym amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm 29

1.3.4 Ứng dụng của amylase từ gạo lứt nảy mầm trong công nghệ thực phẩm 30 CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2

2.1 Vật liệu 32

2.1.1 Nguyên liệu 32

2.1.2 Thiết bị 32

2.1.3 Hóa chất 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 33

2.2.2 Phương pháp phân tích 36

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Nghiên cứu lựa chọn loại gạo lứt 41

3.1.1 Đánh giá thành phần dinh dưỡng trong nguyên liệu gạo lứt ban đầu 41

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến thời gian hút nước bão hòa của gạo lứt ở nhiệt độ phòng 30±2 o C 42

3.1.3 Khả năng nảy mầm của gạo lứt 44

3.1.4 Khả năng sinh tổng hợp α-amylase và GAD trong quá trình gạo lứt nảy mầm 45

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình nảy mầm đến sự thay đổi hoạt độ α-amylase và hàm lượng GABA trong hạt gạo lứt Anh Đào 47

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch ngâm đến sự thay đổi hoạt độ α-amylase, GAD và hàm lượng GABA trong quá trình gạo lứt Anh Đào nảy mầm47 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến sự thay đổi hoạt độ α-amylase, GAD và hàm lượng GABA trong quá trình gạo lứt Anh Đào nảy mầm 51

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự thay đổi hoạt độ α-amylase, GAD và hàm lượng GABA trong quá trình gạo lứt Anh Đào nảy mầm54 3.2.4 Đánh giá thành phần nguyên liệu gạo lứt Anh Đào sau nảy mầm 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

Kết luận 60

3

Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 69

4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Chu trình Krebs)

5

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của gạo lứt 14 Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về gạo lứt nảy mầm 21 Bảng 3.1: Thành phần dinh dưỡng ban đầu trong gạo lứt của một số giống lúa 41 Bảng 3.2: Đánh giá thành phần dinh dưỡng trong gạo lứt Anh Đào sau nảy mầm 58

6

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cấu tạo hạt thóc 11

Hình 1.2: Thóc nếp Anh Đào 12

Hình 1.3: Gạo lứt Anh Đào 12

Hình 1.4: Gạo lứt nảy mầm 16

Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình nảy mầm 17

Hình 1.6: Cấu trúc của GABA 19

Hình 1.7: Cơ chế hình thành GABA 20

Hình 1.8: Sơ đồ chuyển hóa tinh bột dưới tác dụng của enzym α-amylase .27

Hình 1.9: Sơ đồ chuyển hóa tinh bột dưới tác dụng của enzym β-amylase .28

Hình 2.1: Quy trình thí nghiệm tổng quát 34

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nảy mầm của gạo lứt 45

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thay đổi hoạt độ enzym α-amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm 46

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thay đổi hoạt độ enzym GAD trong quá trình gạo lứt nảy mầm 47

Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi hoạt độ enzym α-amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm 48

Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi hoạt độ enzym GAD trong quá trình gạo lứt nảy mầm 49

Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi hàm lượng GABA trong quá trình gạo lứt nảy mầm 50

Hình 3.9: Các hạt gạo lứt Anh Đào nảy mầm ở điều kiện pH khác nhau 51

Hình 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến sự thay đổi hoạt độ enzym α-amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm 52

7

Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thay đổi hàm lượng GABA trong quá trình gạo lứt nảy mầm 53 Hình 3.13: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự thay đổi hoạt độ enzym α-amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm 54 Hình 3.14: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự thay đổi hoạt độ enzym GAD trong quá trình gạo lứt nảy mầm 55 Hình 3.15: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự thay đổi hàm lượng GABA trong quá trình gạo lứt nảy mầm 56 Hình 3.16: Các hạt gạo lứt Anh Đào nảy mầm ở các thời gian khác nhau 57

Gạo lứt hay còn gọi là gạo lức, là loại gạo chỉ xay bỏ lớp vỏ trấu, chưa được

bỏ lớp cám gạo Đây là một nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng hơn so với gạo trắng

về chất xơ, các acid amin thiết yếu, khoáng chất, protein, vitamin B và axit aminobutyric (GABA) do sự hiện diện của lớp vỏ cám bên ngoài Tuy nhiên, gạo lứt khó bảo quản và đòi hỏi thời gian chế biến lâu hơn, cơm gạo lứt có cấu trúc cứng và có vị không hấp dẫn như cơm gạo trắng Vì vậy, để cải thiện tình hình này nhiều sản phẩm từ gạo lứt nảy mầm đã được nghiên cứu và phát triển trên thị trường trong và ngoài nước

γ-Gạo lứt nảy mầm (GBR) được sản xuất bằng cách sử dụng gạo lứt cho nảy mầm, quá trình nảy mầm giúp GBR có hàm lượng dinh dưỡng cao, vị ngọt, dễ tiêu hóa và hấp thụ cao hơn gạo lứt chưa nảy mầm, đặc biệt là hàm lượng GABA trong GBR cao gấp 10 lần so với gạo trắng đã qua xay xát và gấp 4 lần gạo lứt Chính vì vậy, gạo mầm còn được gọi là gạo GABA

Ngoài ra, quá trình nảy mầm còn có vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa, tích lũy về khối lượng và hoạt lực của hệ enzyme có trong hạt gạo lứt, một trong những enzym đó là α-amylase được sinh tổng hợp làm cơ sở để thủy phân tinh bột cung cấp năng lượng cho hàng loạt quá trình sinh hóa, trong đó có những chu trình sinh tổng hợp các hợp chất chức năng như GABA

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu cải thiện hàm lượng GABA và amylase trong gạo lứt, tuy nhiên thông tin về các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng GABA

và amylase vẫn còn hạn chế Chính vì vậy việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng GABA và amylase trong quá trình nảy mầm gạo lứt là rất có ý nghĩa

và giá trị ứng dụng thực tiễn cao Đây cũng là lý do chính để chúng tôi thực hiện đề

9

tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng GABA và amylase trong quá trình nảy mầm gạo lứt”

Mục đích nghiên cứu của đề tài là:

- Nghiên cứu điều kiện nảy mầm gạo lứt thích hợp để hàm lượng GABA và enzym amylase thu được là cao nhất

Để thực hiện được mục tiêu trên, các nội dung chính cần thực hiện trong đề tài gồm:

- Lựa chọn loại gạo lứt thích hợp

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng GABA và enzym amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm như: thời gian ngâm, pH, nhiệt độ, thời gian ủ

- Xác định hàm lượng các thành phần dinh dưỡng trước và sau quá trình nảy mầm

10

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nguyên liệu

1.1.1 Nguyên liệu lúa

Theo phân loại học Thực vật, cây lúa thuộc: [63]

Loài: Oryza sativa L

Lúa có tên khoa học là Ozyra sativa là các loài thực vật sống một năm, có thể cao tới 1-1,8 m, đôi khi cao hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (2-2,5 cm) và dài 50–100

cm Các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 30–50 cm Hạt là loại quả thóc (hạt nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5–12 mm và dày 2–3 mm [54]

Cấu tạo giải phẫu của hạt thóc được thể hiện trên hình 1.1 Hạt thóc gồm có các bộ phận chính như sau:

Mày thóc: Tùy theo loại thóc và điều kiện canh tác mà mày thóc có độ dài ngắn khác nhau nhưng nói chung mày thóc không vượt quá 1/3 chiều dài vỏ trấu Trong quá trình bảo quản, do sự cọ sát giữa các hạt thóc, phần lớn các mày rụng ra làm tăng lượng tạp chất trong khối thóc [35]

Vỏ trấu: Có tác dụng bảo vệ hạt thóc, chống các ảnh hưởng xấu của điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm,…) và sự phá hoại của sinh vật hại (côn trùng, nấm mốc, …) Trên bề mặt vỏ trấu có các đường gân và nhiều lông ráp xù xì Trong quá trình bảo quản, lông thóc thường rụng ra do cọ sát với nhau giữa các hạt thóc, làm tăng lượng tạp chất trong thóc Tùy theo giống lúa mà vỏ trấu có độ dày và chiếm một tỷ lệ khác nhau so với toàn hạt thóc Độ dày của vỏ trấu thường 0,12 – 0,15 mm

và thường chiếm 18 – 20% so với khối lượng toàn hạt thóc [35]

Vỏ hạt: Là lớp vỏ mỏng bao bọc nội nhũ có màu trắng đục hoặc đỏ cua Về mặt cấu tạo, từ ngoài vào trong gồm có: quả bì, chủng bì và tầng aloron Tùy theo

11

giống lúa và độ chín của thóc mà lớp vỏ hạt này dày hay mỏng trung bình lớp vỏ hạt chiếm 5,6 – 6,1% khối lượng hạt lật (hạt thóc sau khi đã tách lớp vỏ trấu Lớp aloron có thành phần chủ yếu là protid và lipit Khi xay xát lớp vỏ hạt chủ yếu là aloron bị vụn nát ra thành cám [35]

Hình 1.1: Cấu tạo hạt thóc

Nội nhũ: Là thành phần chính và chủ yếu nhất của hạt thóc Thành phần hóa học chủ yếu của nội nhũ là gluxit, chiếm tới 90%, trong khi đó toàn hạt gạo nội nhũ chỉ chiếm 75% Tùy theo giống lúa và điều kiện canh tác mà nội nhũ có thể màu trắng trong hoặc trắng đục Các giống gạo hạt dài thường có màu trắng trong, còn các giống gạo ngắn nội nhũ thường trắng đục Các giống thóc nội nhũ trắng đục thường có vệt trắng ở giữa hạt hay phía bên hạt còn gọi là ‘’bạc bụng’’, khi xay dễ gãy nát và lâu chín, khi nấu phẩm chất cơm không ngon bằng gạo có nội nhũ trắng trong [34]

Phôi: Nằm ở góc dưới của nội nhũ thuộc loại đơn diệp tử (chỉ có 1 diệp tử áp vào nội nhũ), đay là bộ phận có nhiệm vụ biến các chất dự trữ trong nội nhũ thành chất dinh dưỡng nuôi mộng khi hạt thóc nảy mầm Phôi chứa nhiều protid, lipit, vitamin (vitamin B1 trong phôi chiếm 66% lượng vitamin B1 trong toàn hạt thóc) Tùy theo giống và điều kiện canh tác mà phôi hạt có thể to nhỏ khác nhau thường chiếm 2,2 – 3% khối lượng toàn hạt Phôi có cấu tạo xốp nhiều dinh dưỡng, hoạt động sinh lý mạnh, nên trong quá trình bảo quản dễ bị côn trùng và vi sinh vật gây hại, khi xay xát phôi hạt thường vụn nát ra thành cám [35]

Theo nghiên cứu của Anuchita Moongngarm (2010) và Hyum Yong Kim (2012) đã phân tích thành phần hóa học và chức năng của hạt lúa và gạo lứt nảy mầm, cũng như so sánh hàm lượng GABA trong quá trình nảy mầm của gạo cũng như của lúa Kết quả cho thấy ở cùng một điều kiện ủ như nhau, nếu so sánh quả

12

trình nảy mầm của lúa và gạo lứt, hàm lượng GABA có trong sản phẩm lúa nảy mầm cao hơn so với gạo mầm mặc dù thành phần này trong cả hai sản phẩm là tương đương nhau Tuy vậy, thời gian để sản xuất lúa nảy mầm dài hơn 2 lần so với gạo lứt nảy mầm [35], [22] Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn gạo lứt để tiến hành nghiên cứu

1.1.2 Giống lúa nếp Anh Đào

Giống lúa nếp Anh Đào do TS Đào Xuân Tân, nguyên Trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2 và Công ty TNHH Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp VINABHTABA Bắc Ninh lai tạo và chọn lọc Giống đã tham gia mạng lưới khảo nghiệm của Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống – Sản phẩm cây trồng Quốc gia

từ năm 2014 Hiện được gieo trồng tại nhiều HTX ở các tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Thái Bình

Đặc tính:

Đây là giống lúa cảm ôn, cấy được cả hai vụ trong năm, thời gian sinh trưởng vụ xuân:

140 – 145 ngày, vụ mùa: 110 – 115 ngày Chiều cao cây 115 – 120 cm, cứng cây, chống đổ khá, thích hợp chân đất vàn và vàn thấp

Bông dài, hạt to, bầu, vỏ hạt màu vàng sẫm, khối lượng 28 – 30 gam/1000 hạt, năng suất trung bình 6 – 7 tấn/ha, thâm canh tốt có thể đạt 8 tấn/ha

Gạo đẹp xôi dẻo ngon, mùi rất thơm ngay cả khi để nguội

Khả năng chống chịu sâu bệnh tốt Giống cho năng suất cao hơn các giống lúa nếp khác cấy cùng trà từ 10 - 15%

Hình 1.2: Thóc nếp Anh Đào Hình 1.3: Gạo lứt Anh Đào

13

1.1.3 Giống lúa Tám Xoan

Nguồn gốc: Giống lúa Tám xoan (còn gọi là Tám thơm) là giống được trồng

từ lâu dời tại các huyện Nghĩa Hưng, Hải Hậu, tỉnh Nam Định Được nông dân tự chọn và để giống

Được bộ NN và CNTP cho phép đưa vào sản xuất từ tháng 11 năm 1995

Thời gian sinh trưởng 155 đến 160 ngày

Năng suất 80 - 120kg/sào

Hạt gạo thon dài, thơm ngon, không bạc bụng

Thích hợp trên đất vàn, vàn cao

1.1.4 Giống lúa N97

Nguồn gốc: Giống lúa nếp N97 do Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt

Nam chọn tạo từ tổ hợp lai (N87/Nếp 415)

Đặc tính:

Là giống cảm ôn, nên gieo trồng được cả vụ mùa và vụ xuân

Thời gian sinh trưởng vụ Xuân từ 140 – 143 ngày, vụ Mùa 105 – 110 ngày Chiều cao cây từ 90 – 95 cm, cứng cây, đẻ nhánh khoẻ, gọn

Chiều dài bông từ 25- 27 cm, hạt bầu, số hạt chắc/bông từ 110 – 120 hạt Khối lượng 1000 hạt từ 25- 26 gram, phẩm chất gạo ngon, xôi dẻo (dẻo lâu hơn nếp 352)

Năng suất trung bình đạt 55 – 60 tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt 65-70 tạ/ha Chịu rét trung bình, chống đổ tốt, kháng bệnh đạo ôn, bạc lá, khô vằn TB

14

1.1.5 Gạo lứt

Gạo lứt là gạo chỉ xát bỏ lớp vỏ trấu bên ngoài, giữ lại phôi và lớp vỏ cám nên giá trị dinh dưỡng hầu như không bị mất Hạt gạo lứt gồm 3 phần chính: vỏ, phôi và nội nhũ Lớp vỏ thường có màu hơi mờ, hơi xám, dễ dàng bị tách ra trong quá trình xát trắng gạo Vỏ được cấu tạo từ nhiều lớp tế bào, lớp ngoài cùng gồm các tế bào có kích thước lớn xắp xếp theo chiều dọc hạt, lớp giữa gồm các tế bào tương tự như lớp ngoài nhưng xắp xếp theo chiều ngang hạt Lớp vỏ có chứa nhiều chất béo và protein nhưng rất ít tinh bột Ngăn cách giữa lớp vỏ hạt và nội nhũ là lớp aloron Trong lớp aloron có chứa các hợp chất protein (35 - 45%), lipid (8 – 9%), vitamin và tro (11 – 14%), đường (6 – 8%), cellulose (7 – 10%), pentose (15 – 17%) Màu sắc của gạo lứt thay đổi theo giống và điều kiện trồng trọt

Quá trình chuyển từ gạo lứt sang gạo trắng làm mất đi khoảng 67% vitamin B3, 80% vitamin B1, 90% vitamin B6, 50% mangan, phosphor và 60% sắt, hầu hết các chất xơ và acid béo cần thiết [51] Lớp cám của gạo lứt chứa một chất dầu đặc biệt có tác dụng điều hòa huyết áp, làm giảm cholesterol xấu, giúp ngăn ngừa các bệnh tim mạch Đặc biệt, gạo lứt chứa một lượng lớn chất xơ Chất xơ trong gạo lứt gồm hai loại: loại không tan trong nước gồm cellulose và hemicellulose,… loại hòa tan gồm pectin, pentozan và chất nhầy có trong vỏ cám Vì vậy sử dụng gạo lứt trong bữa ăn, giúp phòng ngừa táo bón, bệnh ung thư, đặc biệt là ung thu đường tiêu hóa, giảm mỡ máu, phòng ngừa điều trị bệnh tiểu đường Thành phần các chất dinh dưỡng của gạo lứt được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của gạo lứt [34]

Quá trình nảy mầm gạo lứt làm cải thiện chất lượng của gạo Quá trình nảy mầm bị ảnh hưởng bởi các nhân tố bên ngoài như: thời gian nảy mầm, sự hiện diện của ánh sáng, hàm lượng chất dinh dưỡng dự trữ trong hạt,… Quá trình nảy mầm của hạt gạo lứt giúp các enzyme nội bào bên trong hạt gạo hoạt động và phân cắt thành các chất có khối lượng phân tử lớn (protein, tinh bột,…) và những chất có khối lượng phân tử nhỏ Quá trình nảy mầm làm thay đổi thành phần dinh dưỡng và cấu trúc của hạt Hơn nữa, tinh bột trong hạt sau khi nảy mầm sẽ dễ dàng bị thủy phân bởi enzyme amylase tạo thành các đường đơn, giúp quá trình tiêu hóa tốt hơn Ngoài ra quá trình nảy mầm gây ra những thay đổi quan trọng về dinh dưỡng như

16

tăng hàm lượng GABA (Gama Amynobutyric acid), hàm lượng chất xơ, tocotrienols và Gamma oryzanol [62]

Hình 1.4: Gạo lứt nảy mầm

1.1.6.1 Quá trình nảy mầm của gạo lứt

Sự nảy mầm là toàn bộ quá trình bắt đầu từ sự tái hấp thu nước của hạt cho tới

sự lú rễ mầm ra khỏi hạt Các đặc tính quan trọng nhất của sự nảy mầm là hấp thu nước mạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh và phát sinh nhiệt mạnh [52]

Khi gạo bắt đầu nảy mầm, các enzym trong gạo bắt đầu hoạt động Theo Ashley Han, enzym α – amylase chịu trách nhiệm chính trong chuyển hóa tinh bột, trở lên hoạt động trong ngày đầu tiên của quá trình nảy mầm, nhưng hoạt độ của nó tăng lên theo cấp số nhân vào ngày thứ tư Lớp aleurone có hoạt độ amylase cao nhất với

sự hiện diện của axit gibberellic, một hormone tăng trương thực vật Cả amylose và amylopectin đều bị phá hủy bởi α-amylase, và sản phẩm chính tạo thành là dextrins

và oligosaccharides cùng với đường maltotriose cấu thành hầu hết các oligosaccharides Bởi vì đường khử tăng và hàm lượng tinh bột giảm, độ nhớt trong quá trình nảy mầm giảm, gạo sau nảy mầm cho vị ngọt, mềm hơn khi nấu [54] Cũng nhờ enzym amylase mà sự tăng hàm lượng các đường tự do, giúp cung cấp

17

năng lượng cho hàng loạt các quá trình sinh hóa trong hạt gạo, trong đó có chu trình sinh tổng hợp các hợp chất chức năng như GABA [40]

Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình nảy mầm [14]

Các giai đoạn của quá trình nảy mầm: [8]

Giai đoạn I: Sự hoạt hóa

Quá trình hấp thụ nước diễn ra nhanh kết quả là có sự xáo trộn về cấu trúc xảy

ra đặc biệt tại tế bào, điều này làm cho quá trình hút nước và hoạt hóa enzym có sẵn trong hạt Quá trình hô hấp và tổng hợp protein bắt đầu diễn ra

Giai đoạn II: Phôi bắt đầu nảy mầm, dài ra

Trong giai đoạn này quá trình tổng hợp protein sử dụng những mRNA có sẵn,

tế bào phân chia mạnh mẽ, nhu cầu tiêu thụ oxy là rất lớn để thực hiện quá trình hô hấp, hàng loạt quá trình sinh năng lượng diễn ra ở chu trình TCA, chu trình glucolysis

Giai đoạn III: Sự tăng trưởng của cây mầm

Các mRNA và DNA được tổng hợp mới, mầm phát triển nhanh hơn.Sự phân chia tế bào xảy ra hai đầu của trục phôi Một đầu phát triển thành chồi mầm, một đầu phát triển thành rễ mầm trên trục phôi có một hoặc hai lá mầm được gọi là tử

18

diệp Khi mầm bắt đầu tăng trưởng, trọng lượng tươi và khô của cây mầm bắt đầu tăng

1.1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm bao gồm nhiều thông số, chẳng hạn như giống hoặc nhiều loại gạo lứt, quá trình xay xát, điều kiện bảo quản, cũng như các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, độ ẩm, oxy hay khí, ánh sáng, pH [14]

Ảnh hưởng của độ ẩm

Thông số độ ẩm là cần thiết cho nảy mầm của gạo lứt Theo Hunter và Yoshida độ ẩm tối thiểu cho sự phát triển của gạo mầm là 26,5%, tuy nhiên độ ẩm trung bình cho sự nảy mầm là 30 – 40% tùy theo nhiệt độ [19], [49] Thời gian ngâm quá dài, hạt hút thiếu nước, tinh bột trong hạt phân giải thành đường và hòa tan trong nước làm tiêu hao chất dự trữ trong hạt và làm cho hạt bị chua, mầm bệnh phát triển, hạt sẽ bị thối hoặc mầm yếu Sự hút nước của hạt còn phụ thuộc vào loại giống [23] Theo nghiên cứu của Banchuen và cộng sự, giống gạo Niaw Dam Peuak Dam có hàm lượng amylose thấp nhất nhưng có khả năng hút ẩm cao nhất đạt bão hòa ở mức 40%, còn gạo Chiang Phatthalung có hàm lượng amylose cao nhất có mức bão hòa thấp nhất 30%, và nghiên cứu cũng chỉ ra rằng gạo lứt có hàm lượng amylose cao hay thấp chỉ ảnh hưởng đến khả năng hút ẩm cao hay thấp mà không liên quan đến khả năng sinh tổng hợp GABA cao [22]

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Các yếu tố quan trọng bên cạnh hàm lượng độ ẩm liên quan đến sự nảy mầm của gạo lứt còn có sự ảnh hưởng của nhiệt độ Các hạt khác nhau có dải nhiệt độ nảy mầm khác nhau, ở nhiệt độ quá thấp hay nhiệt độ quá cao sẽ ức chế quá trình nảy mầm của hạt Trong quá trình nảy mầm có nhiều biến đổi xảy ra giữa các giống, nhưng nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm chỉ khoảng 30-35oC, giá trị nhiệt độ thấp nhất là khoảng 10oC và cao nhất là 40-45oC [33] Trong quá trình ủ, bản thân khối hạt hô hấp cũng tạo ra nhiệt lượng để xúc tiến nảy mầm Ngâm ủ với khối lượng hạt giống ít, dễ bị thiếu nhiệt nên hạt nảy mầm chậm [4]

Ảnh hưởng của oxi

19

Hô hấp là một quá trình oxi hóa cần thiết và phải có sự cung cấp oxi đầy đủ cho quá trình này, nếu hàm lượng oxi thấp sẽ làm chậm quá trình nảy mầm của hầu hết các loại hạt Oxy rất cần thiết cho quá trình hô hấp của phôi hạt, mầm non lúc nảy mầm Hạt lúa có thể nảy mầm trong điều kiện hoàn toàn không có oxy nhưng mầm yếu và phát triển không bình thường, mầm lúa phát triển tốt nhất khi hàm lượng oxy trong môi trường nước đạt 0,2% [4]

Ảnh hưởng của ánh sáng

Điều kiện sáng hoặc tối ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm Sự nảy mầm trong điều kiện tối sẽ làm phá hủy nội nhũ tinh bột và protein nhanh hơn điều kiện nhiều ánh sáng [11]

1.2 Tổng quan về GABA

1.2.1 Khái niệm về GABA

γ-amynobutiric acid (GABA) là một axit amin phi protein bốn cacbon (Hình 1.6) Cấu trúc phân tử linh hoạt có thể phỏng đoán một vài cấu trúc trong dung dịch, bao gồm cấu trúc vòng tương tự như proline Nó được tổng hợp chủ yếu trong tế bào cây thông qua xúc tác của enzym glutamat decacboxylase (GAD) [4]

Hình 1.6: Cấu trúc của GABA [4]

GABA có công thức phân tử C4H4NO2, khối lượng mol là 103,12 g/mol và nhiệt độ nóng chảy 203,7°C, tan tốt trong nước

Theo Pananivelu và cộng sự (2013), enzym GAD làm xúc tác cho quá trình decarboxyl glutamate biến đổi glutamate thành GABA Sau đó, GABA được chuyển vào trong ty thể và bị biến đổi thành succinic semialdehyde bởi enzym GABA-T sử dụng cả α-ketoglutarate và pyruvate như là nơi tiếp nhận các amino acid Tiếp theo, succinic semialdehyde được biến đổi thành succinate bởi enzym succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH), sau đó tham gia vào chu trình Krebs

1.2.2 Các nghiên cứu khoa học trên thế giới về GABA trong gạo

Sự tích lũy GABA dựa trên nhiều yếu tố kích thích khác nhau, ví dụ như điều kiện ngâm, pH, nhiệt độ thay đổi hay áp suất cơ học Trong BR, vài nghiên cứu trước đã chỉ ra rằng hàm lượng GABA tăng có thể đạt được bằng cách điều chỉnh

21

điều kiện ngâm giữa 30 – 35oC khoảng 8-12 giờ, và điều kiện nảy mầm là 35oC khoảng 21-24 giờ Dưới đây là bảng tổng hợp một số nghiên cứu về ảnh hưởng của loại giống và phương pháp nảy mầm đến hàm lượng GABA trong GBR

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về gạo lứt nảy mầm [14]

Giống

Mẫu gạo

Các phương pháp nảy mầm

Hàm lượng GABA

22

Giống

Mẫu gạo

Các phương pháp nảy mầm

Hàm lượng GABA

Từ bảng 1.2 ta thấy, gạo lứt nảy mầm cho hàm lượng GABA cao hơn rất nhiều

so với gạo lứt chưa nảy mầm Tùy từng giống gạo lứt khác nhau mà có hàm lượng GABA khác nhau và điều kiện nảy mầm khác nhau Chính vì vậy việc nghiên cứu

23

các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng GABA là rất cần thiết, để lựa chọn được chế

độ nảy mầm gạo lứt thích hợp nhằm thu hàm lượng GABA cao

1.2.3 Nghiên cứu trong nước về các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng GABA trong gạo lứt

Theo nghiên cứu của tác giả Cung Tố Quỳnh và cộng sự (2013), hàm lượng GABA đạt được cao nhất đối với gạo lứt Huyết Rồng và Jasmine khi ngâm ở pH 6, nhiệt độ 30oC trong thời gian 20 giờ Kết thúc quá trình ngâm, gạo được đem ủ ơ 35oC trong thời gian 36 giờ đối với gạo Jasmine và 48 giờ với gạo Huyết Rồng Gạo thu được sẽ đem sấy ở nhiệt độ 60oC trong 18 giờ để thu được gạo có độ ẩm thích hợp cho quá trình bảo quản tiếp theo Hàm lượng GABA trong gạo mầm thành phẩm tăng gấp 5 lần so với gạo lứt nguyên liệu [53]

Theo nghiên cứu của tác giả Lê Nguyễn Duy Đoan và Nguyễn Công Hà (2014), hàm lượng GABA thu được cao nhất khi ngâm gạo lứt trong 6 giờ, pH dịch ngâm thích hợp ở pH 3 đối với giống IR 50404 và pH 2 với Jasmine 85 Sau đó, gạo lứt được đem nảy mầm dưới điều kiện yếm khí (nồng độ CO2 10%), sẽ cho ra gạo thành phẩm có hàm lượng GABA cao nhất là 88,88 mg/100 g đối với IR 50404 và 104,80mg/ 100 g đối với Jasmine 85 sau khi ủ 30 giờ [29]

Trong nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Khang và cộng sự (2016), đã nghiên cứu khi ngâm gạo lứt IR 50404 với axit glutamic 0,6%, pH 3, sau đó đem ủ ở nhiệt

độ 36 oC, độ dày lớp hạt 0,9 cm, thời gian ủ 24 giờ hàm lượng GABA được sinh ra đến 269,23 mg/kg chất khô (tăng 1,9 lần so với hàm lượng GABA khi ngâm ở điều kiện chỉ có pH ngâm tối ưu) [58]

1.3 Tổng quan về enzym amylase

Enzym là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein Enzym được cấu tạo từ

L – α – axitamin kết hợp với nhau qua liên kết peptit Dưới tác dụng của các peptit hydrolase, axit, hoặc kiềm các enzym bị thủy phân hoàn toàn thành các L – α – axitamin Trong nhiều trường hợp ngoài axitamin còn nhận được các chất khác Trong trường hợp thứ nhất enzym là một protein đơn giản gọi là enzym một cấu tử

24

trường hợp thứ hai enzim là một protein phức tạp gọi là enzym hai cấu tử (hai thành phần) Trong phân tử enzim hai cấu tử, protein có tên gọi là ‘’feron’’ hoặc’’ apoenzym’’ được kết hợp với một phần không phải protein gọi là nhóm ngoại agon Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần ‘’apoenzim’’ (khi cho thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những agon đó còn có tên riêng là coenzym [55]

Amylase là một loại enzym có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử còn gọi là diastase Enzym này có cả ở thực vật lẫn động vật Amylase thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glicoside nội phân tử trong các polysacharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế [57]

Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase và γ-glucosidase thủy phân liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide đồng loại Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside Sáu loại amylase này được xếp thành hai nhóm: endoamylase và exoamylase

Endoamylase: gồn có α-amylase và nhóm enzym khử nhánh Nhóm enzym khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase , khử gián tiếp

là transglucosylase và amylo-1,6-glucosidase Các enzym này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

Exonuclease: gồm có , β-amylase và γ –glucosidase Đây là những enzym thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Các dạng amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt Tốc độ phản ứng của amylase phụ thuộc vào

pH, nhiệt độ, mức độ polymer hóa của cơ chất các enzym amylase từ các nguồn khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau [57]

25

Enzym amylase trong gạo lứt:

Theo Dong-Hwa Cho và Seung-Taik Lim, những thay đổi trao đổi chất của hạt khô đòi hỏi phải có đủ năng lượng, mà chủ yếu là do sự giảm hàm lượng tinh bột trong gạo lứt α-amylase được coi là enzym chính để thủy phân tinh bột Tuy nhiên, trong giai đoạn đầu của sự nảy mầm, sản phẩm glucose tạo ra từ saccarose và maltose do sự thủy phân tinh bột bởi β-amylase là nguồn năng lượng chủ yếu, vì α – amylase hoạt động mạnh hơn ở giai đoạn cuối Có nghiên cứu cho rằng, α – amylase được tạo ra trong quá trình tổng hợp protein vào cuối giai đoạn (sự phát triển của cây con) hơn là tồn tại trước trong hạt, mặc dù trong hạt khô có tồn tại một lượng nhỏ enzym Ngược lại, β-amylase theo trình tự phá vỡ tinh bột thành maltose, một lượng lớn xuất hiện trong nội nhũ gạo lứt và trở lên hoạt động khi bắt đầu hấp thụ nước [14]

Theo Helland, tinh bột là thành phần chính trong các hạt ngũ cốc chín, khi các hạt được ngâm trong nước enzym trong hạt khô bắt đầu hoạt động Có 3 loại enzym chính trong nhóm amylase thủy phân tinh bột là α-amylase, β-amylase và limit dextrinases α-amylase là enzym chủ yếu được tổng hợp trong quá trình nảy mầm và đảm nhiệm để chuyển tinh bột dự trữ trong nội nhũ α-amylase hoạt động bằng cách cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột (amylose và amylopectin) Cuối cùng, tất cả amylose được chuyển hóa hết thành maltose Còn amylopectin, sản phẩm được giải phóng ra bao gồm glucose, maltose và α-limit dextrins β-amylase là một exoenzym tấn công tinh bột từ đầu không khử của các sản phẩm dextrin được sinh ra bởi α-amylase và limit dextrinase Nó tấn công liên kết α-1,4-glucoside theo đôi một để giải phóng ra maltose, nhưng không thể phá vỡ liên kết α-1,6-glucoside, nên kết quả tạo ra các β-limit dextrin Sự kết hợp giữa α-amylase và β-amylase giúp giảm tinh bột nhanh hơn và hoàn toàn hơn khi hoạt động một mình Enzym limit dextrinase ít được biết đến hơn, nhưng nó hoạt động

dễ dàng thủy phân amylopectin hơn so với polymer tự nhiên và nó cần thời gian nảy mầm tương đối dài để hoạt động [21]

26

Theo Sadia Galani , trong quá trình nảy mầm enzym chính chuyển hóa tinh bột thành các đường đơn giản cho hạt mầm phát triển là α-amylase Amylase chủ yếu thực hiện quá trình này cho đến khi cây mầm trở lên độc lập để quang hợp Khả năng nảy mầm của hạt ngũ cốc có thể phụ thuộc vào mức độ hoạt động của α-amylase, bằng cách nảy mầm hoạt độ α-amylase được cải thiện làm tăng mức đường hòa tan, giúp kích thích hạt mầm xuất hiện nhanh hơn và đồng nhất [17]

1.3.1 Enzym α-amylase(E.C.3.2.1.1)

α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzym nội bào α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy

hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn

Cơ chế tác dụng của α-amylase

Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:

Trước tiên enzym phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục để tạo ra maltose

và glucose [57]

Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6 – 7 gốc glucose) dưới tác dụng của α-amylase, sau đó các oligosaccharide này tiếp tục phân cắt nên chuỗi bị ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin [57]

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:

Giai đoạn dextrin hóa:

α-amylase

27

Giai đoạn đường hóa:

monosaccharide

Hình 1.8: Sơ đồ chuyển hóa tinh bột dưới tác dụng của enzym α-amylase

Khả năng dextrin hóa của α-amylase rất cao do đó người ta còn gọi là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

Đặc tính: α -amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác,

mỗi loại α -amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α -amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành phân tử enzyme α -amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine [57]

Amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng

Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

pH tối thích cho hoạt động của α -amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4,7 - 5,4 [57]

α -amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ

58-60oC Hoạt tính của enzyme α-amylase sẽ thay đổi trong suốt quá trình nảy mầm của hạt gạo, hoạt tính enzyme α-amylase của hạt gạo chưa nảy mầm là rất thấp vì hạt đang ở trạng thái ngủ vì vậy enzyme không được kích hoạt Trong quá trình nảy mầm từ 0 giờ đến 96 giờ thì hoạt tính của α-amylase ngày càng tăng [63]

Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Palmiano và Juliano (1972), hoạt tính của

enzyme α-amylase tăng sau 5 ngày nảy mầm ở ngoài sáng và 4 ngày trong tối khi

α-amylase

28

kiểm soát được sự phát triển của vi sinh vật Vì vậy hoạt tính của enzyme có thể tăng trong suốt quá trình nảy mầm, tuy nhiên không thể kiểm soát được sự phát triển của vi sinh vật nên sau 36 giờ thì hoạt tính của enzyme giảm [15]

1.3.2 β-amylase (1,4-α-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)

β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm Trong hạt ngũ cốc nảy mầm, β -amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α -1,4-glucan trong tinh bột, glycogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch

Ở lúa, β-amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô

Cơ chế tác dụng của β-Amylase:

β-amylase là một enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải bắt đầu

từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng cạnh liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân

tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6-glucoside và được gọi là β-dextrin

β-amylase

Hình 1.9: Sơ đồ chuyển hóa tinh bột dưới tác dụng của enzym β-amylase

Lượng tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α và β-amylase lên tới 95%

29

β-amylase chịu nhiệt kém hơn α –amylase nhưng bền hơn với acid β-amylase

bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC Nhiệt độ tối thích của β-amylase là 55oC, pH tối thích trong khoảng 5,1 – 5,5

1.3.3 Một số nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành enzym amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm

Theo nghiên cứu của Moongngarm (2010) khi ngâm gạo lứt trong các điều kiện thời gian khác nhau từ 24, 48, 72 giờ, sau đó đem ủ trong một lớp vải đựng trong hộp plastic kín, nảy mầm khoảng 24, 36, 48, 72 và 96 giờ, độ ẩm duy trì 90 – 95% Kết quả cho thấy hoạt độ enzym amylase ở các thời gian ngâm và thời gian ủ khác nhau là không giống nhau, tăng nhanh chóng từ ngày thứ hai của quá trình nảy mầm và giảm nhẹ ở ngày thứ tư [1]

Theo nghiên cứu của Trần Huỳnh Như An và cộng sự (2016) khi ngâm gạo lứt

ở các điều kiện khác nhau pH 3 – 6, pH dịch cám 3 – 7% hay acid glutamic 0,2 – 0.6%, nảy mầm ở 37oC, yếm khí trong 20 – 28 giờ Kết quả cho thấy pH thích hợp của gạo lứt Một Bụi Đỏ (MBĐ) khi ngâm trong 6 giờ là 4, IR50404 là 3 α-amylase

ở MBĐ cao nhất là 60.42 (UI/g) và ở IR50404 cao nhất là 58.38 (UI/g) Còn khi mỗi giống lúa có pH ngâm thích hợp, bổ sung dịch cám và acid glutamic thì amylase không có sự khác biệt so với nguyên liệu gạo lứt ban đầu [61]

Theo Jacobsen và cs., 1995 Gibberellin từ phôi cảm ứng sự tổng hợp amylase (ở cấp độ phiên mã) trong các lớp aleurone của hạt ngũ cốc Gibberellin gỡ

α-bỏ sự ngủ và thúc đẩy sự nảy mầm của các hạt giống ngủ [28], [30]

Theo Subajiny Veluppillai và cộng sự, (2009) khi ngâm gạo lứt trong nước cất khoảng 12 giờ ở 30oC, để nảy mầm trong bóng tối, 30oC khoảng 5 ngày Kết quả đạt được hoạt độ amylase tăng từ ngày thứ nhất đến ngày thứ năm là 1,1 đến 190 U/g DM nguyên liệu khô [46]

Theo nghiên cứu của Savitha Gujjaiah và Chandra Kumari (2013) trên các loại ngũ cốc, hoạt độ enzym α-amylase và β-amylase trong quá trình ngâm và ủ tăng đáng kế trong quá trình nảy mầm Hoạt độ enzym α-amylase đạt cực đại sau khi ngâm và ủ 6 ngày (236.50 maltose/mg/phút/g), hoạt độ β-amylase đạt lớn nhất sau 4

30

ngày ủ (364.40 maltose/mg/phút/g) Nảy mầm gạo lứt là một phương pháp giúp tăng hoạt độ enzym trong các hạt ngũ cốc, đồng thời cũng làm tăng giá trị dinh dưỡng trong ngũ cốc [20]

Trong nghiên cứu của Hitoshi Ogiwara và Kazuo Terashima (2010) về hoạt độ enzym α-amylase trong nội nhũ của 6 loại gạo Arroz da Terra, Calrose, Haenuki, Fukuhibik, S-201và Blue Bonnet được thực hiện ở các điều kiện nhiệt độ thấp (16

và 26oC), hoạt độ enzym trong sự phát triển của các hạt mầm ở 16oC cao hơn đáng

kể khi hạt phát triển ở 26oC [37]

Theo nghiên cứu của Reihaneh Ahmadzadeh Ghavidel (2011) thực hiện trên 4 giống đậu, khi tiến hành ngâm đậu trong nước cất khoảng 12 giờ, 22 – 25oC, kết quả cho thấy hoạt độ enzym amylase trong 4 loại đậu này tăng nhiều so với nguyên liệu đậu ban đầu Khi tiếp tục kết hợp với quá trình ủ, hoạt độ enzym tiếp tục tăng cao hơn từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 3 [41]

1.3.4 Ứng dụng của amylase từ gạo lứt nảy mầm trong công nghệ thực phẩm

Trong thực tế người ta đã sử dụng enzyme α-amylase từ các nguồn vi sinh vật, thực vật, động vật cho rất nhiều ngành sản xuất thực phẩm [59]:

Trong công nghệ tinh bột, α-amylase được dùng cho dịch hoá liên tục tinh bột trong nồi hơi hoặc trong những thiết bị tương tự hoạt động ở nhiệt độ 105-110°C

và vì vậy lợi dụng được tính ổn định nhiệt cực cao của enzyme

Trong công nghệ nấu cồn, α-amylase được sử dụng để phân tán tinh bột trong nghiền và chưng cất Và ở giai đoạn này cũng lợi dụng được độ ổn định nhiệt của enzyme Hơn nữa, rất có thể thực hiện chưng cất không cần điều chỉnh pH

và thêm Ca mặc dù điều kiện có hơi khác điều kiện tối ưu Điều này là do phạm

vi pH tương đối lớn và việc đòi hỏi calci của enzyme tương đối thấp Nó làm cho quy định sản xuất được đơn giản và mức độ rủi ro của cặn calci được giảm thiểu trong cột chưng cất

Trong công nghệ nấu bia, α-amylase được dùng để phụ giúp cho việc dịch hoá được dễ dàng Do độ ổn định ở nhiệt độ cao của enzyme quy trình nấu có thể được đơn giản hoá Nhờ vậy, việc gia tăng tỷ lệ phụ cũng có thể thực hiện được

31

Trong công nghệ đường, α-amylase được sử dụng để phá lượng tinh bột hiện diện trong nước mía Vì vậy, hàm lượng tinh bột trong đường thô được giảm và việc lọc đường tại nhà máy tinh luyện được dễ dàng hơn

Tuy nhiên, ứng dụng của enzym α-amylase từ nguồn thực vật, đặc biệt là trong hạt nảy mầm vẫn còn hạn chế Mà hoạt độ của α-amylase sau quá trình ủ mầm tăng lên rất nhiều, có thể đem lại triển vọng sử dụng để chế biến dịch đường và các sản phẩm có tính prebiotic từ gạo lứt nảy mầm

Từ các nghiên cứu trong mục 1.3 trên, ta thấy trong hạt mầm enzym amylase trong hệ enzym amylase đóng vai trò quan trọng và có nhiều ứng dụng trong thực tế, nên chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu sự thay đổi của enzym α-amylase trong quá trình gạo lứt nảy mầm

2.1.2 Thiết bị

- Nồi hấp tiệt trùng (Liên Xô)

- Tủ cấy vô trùng (Hàn Quốc)

- Bể ổn nhiệt (Trung Quốc)

- Máy lắc ổn nhiệt (Memmert - Đức)

- Thiết bị ly tâm (Hettich, Đức)

- NaH2PO4.2H2O (Trung Quốc)

- Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc)

33

- GABA chuẩn (Merck)

- I2 (Trung Quốc)

- KI (Trung Quốc)

- Ethanol (Việt Nam)

- DNS (dinitro salicilic acid)

- Tinh bột

Và một số thiết bị, hóa chất khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các nghiên cứu sẽ được tiến hành theo quy trình tổng quát:

Thóc (Anh Đào, N97, Tám Xoan)

Xay

Lựa chọn và phân loại

Gạo lứt

Xử lý sơ bộ (Ngâm với NaCl 0,9%, 30 phút)

Ngâm (Thời gian, pH thích hợp ở nhiệt độ phòng 30±2oC)

Làm ráo nước

34

Ủ yếm khí không hoàn toàn

Gạo lứt nảy mầm

Bảo quản (– 20°C) và tiến hành phân tích

Hình 2.1: Quy trình thí nghiệm tổng quát

Thóc (Anh Đào, N97, Tám Xoan) được đem xay bằng máy Satake Sau khi xay ta thu được một hỗn hợp gồm nhiều thành phần: gạo lứt (hạt nguyên, hạt gãy) , thóc, trấu, các tạp chất để thu được gạo lứt thì ta cần loại bỏ các thành phần không liên quan Gạo lứt thu được có thể sử dụng ngay sau khi xay xong hoặc được bảo quản trong bao bì plastic ở nhiệt độ 8 - 10oC trong tủ lạnh không quá 7 ngày ở ngăn mát

Gạo lứt được đem rửa qua với nước cất để loại bỏ bụi bẩn bám ngoài hạt gạo thì được ngâm với dung dịch NaCl có nồng độ 0,9% trong 30 phút để sát trùng Tiếp theo khảo sát quá trình ngâm gạo, kết thúc quá trình ngâm cho gạo vào khăn

ẩm đã tiệt trùng và đặt trong hộp kín Khảo sát quá trình ủ gạo ở các điều kiện khác nhau (nhiệt độ, thời gian) thu gạo lứt nảy mầm Gạo lứt mầm đem bảo quản ở 20oC

và tiến hành phân tích

2.2.1.1 Nghiên cứu lựa chọn loại gạo lứt

Thí nghiệm 1: Đánh giá thành phần dinh dưỡng trong nguyên liệu gạo lứt

ban đầu

Ba giống lúa nếp Anh Đào, N97 và Tám Xoan sau khi mua về được đem xay xát, loại bỏ tạp chất để thu được gạo lứt Sau đó, lấy 3 g gạo được nghiền mịn để xác định các thành phần dinh dưỡng: hàm lượng tinh bột, protein, lipit, đường

khử,tro

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến thời gian hút nước bão hòa của gạo lứt ở nhiệt độ phòng (30±2°C)

35

Lấy mỗi loại 50 g gạo lứt, xử lý ngâm với dung dịch NaCl 0.9% khoảng 30 phút Sau đó ngâm trong 100 ml nước cất pH 7.0 (tỷ lệ gạo : nước ngâm là 1:2 (w/v)) ở 30oC, lấy mẫu sau các khoảng thời gian khác nhau là 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10 giờ Xác định độ ẩm của mẫu tại các khoảng thời gian trên bằng cách nghiền mịn, cân, rồi mang sấy đến khối lượng không đổi ở 105oC, để chọn được thời gian gạo hút nước đạt trạng thái bão hòa

Thí nghiệm 3: Khả năng nảy mầm của gạo lứt

Gạo lứt sau thí nghiệm 2 được vớt ra, cho vào khăn ẩm đã được tiệt trùng rồi cho vào hộp kín có nắp, đem ủ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37oC trong 24 giờ Lấy gạo ra xác định tỷ lệ nảy mầm

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến sự thay đổi hoạt độ enzym α-amylase và GAD trong quá trình gạo lứt nảy mầm

Gạo lứt sau thí nghiệm 2 được vớt ra, cho vào khăn ẩm đã được tiệt trùng rồi cho vào hộp kín có nắp, đem ủ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37oC trong 24 giờ Sau đó lấy gạo lứt mầm ra nghiền mịn rồi xác định hoạt độ α-amylase

và hoạt độ GAD tại các nhiệt độ ủ

2.2.1.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự thay đổi hàm lượng GABA

và α-amylase trong quá trình nảy mầm gạo lứt Anh Đào

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch ngâm đến sự thay đổi hoạt

độ α-amylase, GAD và hàm lượng GABA trong quá trình gạo lứt Anh Đào nảy mầm

Cân 50g gạo lứt Anh Đào sau khi được xử lý sạch sẽ, đem ngâm trong đệm citrat với các pH khác nhau: pH 2, 3, 4, 5, 6; tỷ lệ gạo : nước là 1:2 (w/v) tại bể ổn nhiệt ở 30°C±2 trong thời gian là 6 giờ Sau đó, vớt gạo ra để vào giấy lọc đến khi ráo nước Cho gạo vào khăn ẩm đã được tiệt trùng rồi đặt vào hộp kín có nắp, đem ủ

ở 30oC trong 24 giờ Lấy gạo lứt nảy mầm ra đem nghiền mịn rồi xác định hoạt độ α-amylase, GAD và hàm lượng GABA