Nghiên cứu bệnh nấm do histoplasma trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi tại một số bệnh viện ở hà nội

iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.... 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NẤM HISTOPLASMA CAPSULATUM VAR.. capsulatum và Histoplasma capsulatum var... capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Chrysospo

h h g ố i , h g g hự

h g ố g h

T gi

Dương Thị Ngọc Thúy

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NẤM 4

1 1 L h g h ấ Histoplasma capsulatum 4

1 2 Vi ấ Histoplasma capsulatum 5

1.2.1 M ố ặ i ấ H.capsulatum Error! Bookmark not defined 1.2.2 i ề h g g ặ hi M H i ấ H.capsulatum 7

1 2 3 Kh g gâ h 8

1 2 3 1 Co ờ ễ 8

1 2 3 2 K ả ệ 8

1 3 h ấ Histoplasma 10

1 3 1 h h â g 10

1.3.2 iề hò g h ấ Hi i 12

1.3.3 h ễ h h ấ hổi (Hi i ) 13

1 4 h g h hi g g hẩ Histoplasma capsulatum 14

1.4.1 hẩ lâm sàng 16

1.4.2 N i ấ 16

1.4.3 H h h h 17

1.4.4 Ph g h P R g (Ne e –PCR) 18

1.4.5 Ph g h gi i h ự ge 19

iv

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 ối g ghi 21

2 1 1 h hẩ 21

2.1.2 h g g 21

2.2 Y ghi 21

2.3 V i 21

2.3.1 H hấ i g g g ghi 21

2.3.2 T g hi g g ghi 24

2.4 Ph g h ghi 25

2.4.1 Thi ghi 25

2.4.2 Kỹ h ghi 26

2.4.2.1 L ẫu ảo quả v vậ u ể 26

2.4.2.2 X ệ p ẩ 27

2.4.2.3 Nuô 28

2.4.2.4 N uộ Gr 29

2.4.2.5 P p áp tá t ADN 29

2.4.2.6 P p áp ELISA 30

2.4.2.7 P p áp PCR ồ (N st d-PCR) 32

2.4.2.8 T sạ sả p ẩ PCR v ả tr t 34

CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 Th h h hẩ 36

3.2 N i ấ h g H.capsulatum h hẩ 38

3.3 K ELISA hâ h h hâ hiễ ù g hổi i ố h i ở H N i 41

3.4 K g g h g h P R g h h ẩ Hi i

gi i h ự ge 46

v

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 52

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 58

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

ATP Adenosine Triphosphate

AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome

BSL3 Phòng thí nghi m an toàn sinh h c m 3

bp e i ( i z )

BHI Brain Heart Infusion (d ch chi t não tim)

Chl Chloramphenicol

dNTP Deoxynucleoside Triphosphase

ELISA Enzym-linked immunosorbent assay

H.capsulatum Histoplasma capsulatum

( Vi n nghiên c u các b nh nhiễm trùng Nh t B n) PCR Polymerase Chain Reaction

PBS Phosphate buffered saline

RPM Rounds per minute (Tố ly tâm vòng/ phút)

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

i 3 2: K ELISA hâ ố he hó ghề ghi 44

i 3 3: Tỷ hiễ H.capsulatum hâ he hó ổi 45

i 3.4: Tỷ hiễ H.capsulatum hâ he gi i h 45

h hổi ặ g, h hấ vong [14,21,25] Hi i ũ g

i h hiễ g h i ở hữ g g i gi h iễ h ( : g h , ấ gh g, hiễ HIV, hiễm AIDS) [8,29,33]

hẩ Hi i là ự h gi â g, iề

ắ h hò g ghi Ng , i h h g gh hi

i ó ấ hiề h g h ố g hò g h ghi hi g i hành hẩ histoplasmosis h h g h i ấ , h h , h

2

T i Vi N , h iễ i ầ ố hấ ó h h hi

h ý h hi , h g h g lâm sàng không coi H capsulatum h

g hâ ó h hiễ ù g hổi ấ h h ặ h giố g , hi h hâ ừ g i h h ự ó h h h y,

Ch ng 1: Tổng quan tài liệu

Ch ng 2: Đối t ợng, Vật liệu và Ph ng pháp nghiên cứu

Ch ng 3: Kết quả và Bàn luận

Kết luận

Tài liệu tham hảo

Phụ Lục

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NẤM

HISTOPLASMA CAPSULATUM VAR CAPSULATUM 1.1 Lịch sử và căn nguyên bệnh nấm do Histoplasma capsulatum

Nấ Histoplasma capsulatum i ấ ỡ g hình g ó h i h ng

là Histoplasma capsulatum var capsulatum và Histoplasma capsulatum var duboisii h Histoplasma capsulatum var capsulatum h g gặ h ,

th g ở hữ g ù g ý hấ h hắ ù g g hâ Mỹ, Châu Phi, Australia, h g ũ g g Mi i i i Ohi , hi gặ ở hâ Â [13,29,39] M ố g h ở hâ Á h : Ấ ,

I e i , M i , Th i L , Si g e, Vi N Nh [41] Tuy nhiên,

g h ự h h h h h ghi â

h Histoplasma capsulatum var duboisii hỉ gặ i hâ Phi [6,13,31] Do

ó, ề i g ghi Histoplasma capsulatum var capsulatum

T g h i H capsulatum h hấ ó hiễ ấ g iề ,

i hi ự i H capsulatum h hi hấ ở h 80% â ố ở ù g

Nấ Histoplasma capsulatum h g hấ hiề ở ù g ấ ẩ , ặ

i ấ ó hiề hâ g , , hi h ặ hâ i h ở hữ g

ù g h h h g gi h hữ g g hâ h g i

i i i gà ũ, , ù g ấ i gố â ó hiề hi , g h g i h

ấ ễ ắ h [22,24] h H capsulatum ũ g ở hó, è , gự ,

h , h h i, h ó i, g h , h g ó h h â sàng giố g i h ở g i [35]

h i h i ấ e [22-24]

Hình 1.2: H capsulatum dạng mốc gồm các sợi nấm có vách ngăn

- ó h i i h i h :

7

a) b)

Hình 1.4: Hình thể nấm H capsulatumquan sát d ới ính hiển vi

a) Khi ở g ấ ố b) Khi ở g ấ e

- Kh g 10% i ấ ấ hi h, hỏ, h h , i ấ ó

h g M ố không sinh i hi ò gặ h i h ẩ hẵ ,

â h ặ h g h h ng

M ố i ấ h ũ g h h h h h ẩn g ự h H capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Chrysosporium và Sepedonium sp Do

ó, ầ hi i m h i ố h g h h h h h

ấ H capsulatum [12,33,39]

1.2.2 Đôi nét về háng nguyên ặc hiệu M và H của vi nấm H capsulatum

Các kháng nguyên chính trong hẩ H capsulatum là kháng nguyên M

và H là h i ei ặ hi H capsulatum Gố g glycoprotein

chúng gâ hữ g g iễ h ở h h h g gi

iễ h T Kh g g ó h ó g i ò g h gâ h H capsulatum [17]

ố i ấ ở hữ g gố â i ó hâ i, hâ hi h i ra, hữ g g

hi hiễ h h g ó h gắ h h i hiễ hiề , h g 10 g

Hình 1.5: Con ờng nhiễm H capsulatum gây bệnh nấm phổi

1.2.3 2 K ả ệ

h Histoplasmosis có nhiề i giố g i h , ó h g gâ hiễ ù g hổi ấ h [22,39]

9

Mắ h h h i h g hỏ ở h i ấ H capsulatum,

h h hỏ h ễ g h h g h ễ h

g h g h Ở hi h , ắ ầ h i h sang gi i ấ e M ghi g h h ởi

N h hâ ó iễ h h, h i hự , i

h ẽ “ h” i h â i h g

h ở hổi, ề h i h , ó h hẩ hầ g

h Tổ h g â i i hi X- g ằ g ố ầ ắ g [23]

Hầ h h hâ hiễ ù g ặ g i H capsulatum hữ g g i ó

hi h iễ h , ặ i hữ g g i hiễ HIV, g i gh

g h i ố i hữ g g i i ề hi h h i e fe

-gamma [29,33] V i ấ hữ g g h ắ h ấ , h h ấ H capsulatum g h i h h hấ h hố g iễ h

trung gian – ấ g g i h h hiễ ù g

10

Hình 1.6: Tổn th ng do nhiễm H capsulatum lâu dài sẽ bị canxi hóa và biểu

hiện trên X-quang, CT scan bằng các nốt sần trắng

gi iễ h T i hiễ h ấ h h g ghi g h i hiễ

ù g iề h i ò ó g iễ h gâ ởi g ầ [18,20]

1.3 Bệnh nấm do Histoplasma

1.3.1 Các thể bệnh lâm sàng

i hi â g hiễ ấ Histoplasma ấ g Th g

Histoplasmosis i i g â hầ , iề h h h h h thấ h g 70-80% ố hỉ h hi ằ g h h h g h h i [1,20]

h i hi i các g:

h : ỏi, ố ừ , ắ h t, h g, h X-quang phổi ẽ

hấ ổi h h h ặ h i ố hổi, xung quanh hổi ố ố ắ g i [20,27]

hâ hiễ h hổi ù g hổi, h h g hấ h ặ ổ h g g

ố ỏ [1,14,27]

 g Histoplasma h i hổi h

h i ấ Histoplasma h ở hổi, h hấ ở g i ó ổi ( 45),

h i h i i h h ặ i hiễ g i i h T i h g h h i giố g hổi h g hẹ h h ố ề hiề , h , â , ổ h i ,

12

h i hi h h iề ẩ h h i h g hiễ ù g, nhi h hâ g, ổ g g Vi ấ h i ù g ở hiề , : Nổi h ch t hâ ; L h i hi g ; Tổ h g ỷ

hâ ó h iễ h h h ng Itraconazole ố g iề ấ Histoplasma ở

hổi hiễ ấ g g g h h g hiễ HIV Kh g

g h i i h ố g g h h hâ ó i hi h ở h hố g não – hầ i h

- V i h hâ h ó hiễ ấ Histoplasma l ỏ , h e i i

(Fungizone®) i h h h ố ự h ù g I z e ó hi ở

h hâ AI S ù g h e i i ó

 Phòng h

- i h ự hò g: H h ự h i hiễ i i ẩ g i g hiễ h h g g ấ ở g h Ph h ặ ầ gi i, dùng hẩ g h ó h h h ẩ ổ h i f i 3% (V

f i 3% hấ ó h g gâ g h , i g ó h i

i g h h ) [1,22]

- Ki h hâ , g i i i i h:

+ Báo cáo ừ h g: Thự hi ở ù g h h h h ( ở H Kỳ); â h h g ầ ở hiề

+ h h g h i h , h g gâ iễ h h g i i

13

+ L h i ù g ẩ â hiễ

+ iề g i i g gi h ghề ghi ằ g h g â hiễ ừ g i g hung

- i h hố g h: ầ ghi g hiễ h ấ Histoplasma hi ấ

h h h h h ghi â

Hình 1.7: Báo cáo công bố về bệnh histoplasmosis ở một số n ớc Châu Á

(Wang T.L., et al.Tropical Medicine and International Health, 1, pp 35-42, 1996)

14

Nhiễm H capsulatum h ng x y ra trong các ho ng hàng ngày ở khu vực

mà b nh Histoplasmosis h h hâ Á i H capsulatum không ph i là

i ặc hữu, tuy nhiên hằ g n có báo cáo về nh này m t phầ ũ g

do g i â i ề từ i H capsulatum h h hiễm b nh Theo nghiên

c u c a Ohno H và c ng sự [28], 2013 ở Nh t B n, trong 5 b h hâ c

15

Bảng 1.1: Đánh giá u, nh ợc iểm của một số ph ng pháp ứng dụng trong

nghiên cứu nhằm phát hiện H capsulatum trong mẫu bệnh phẩm

- Â h gi ở hữ g g

h gi h iễ h

h i i i h g nguyên

Bên c h ó, i u ch ng c a b h h i giống lao phổi và các th b nh lâm sàng

do H capsulatum gây ra rấ ng tùy thu c vào m h i hiễm, kh g

gây b h, gi i n c a b nh khác nhau thì bi u hi ũ g h h ó, vi c chẩ chính xác Histoplasmosis dựa trên c k t qu h gi â g t cách th n tr g h g h hò g ghi m

1.4.2 Nuôi cấy

Th g h ng, nuôi cấy v h g h i h ẩn vàng và cung cấp m t

bằng ch ng rõ ràng nhất cho vi c chẩ nhiễm trùng do H capsulatum Ph g

h c s d g h h ng qui chẩ i h i n trong phòng thí nghi m.Tuy nhiên, không ph i phòng thí nghi ũ g m b o tiêu chuẩn về

an toàn sinh h thực hi n kỹ thu t nuôi cấy Do v y, kỹ thu t này chỉ c phép thực hi n t i m t số phòng thí nghi m thu c tuy g g

Histoplasma Các xét nghi h h h i nuôi cấ , h g ó t số h n

ch h t qu âm tính gi ở nhữ g ng h p suy gi m miễn d ch hay m i ti p xúc v i h g g g ò g i 6 tuần, nó có th g h gi do ph n

ng chéo v i các nấ h h Blastomyces, Aspergillus hay hi u giá kháng th kháng l i Histoplasma v n còn cao trong nhiều tháng hoặc th m chí nhiề

khi b nhiễ ù g ầu [7,15,36,40] ó, h g h h t thanh h c

h ng chỉ giúp cho vi c ki h gi tỷ l histoplasmosis

18

1.4.4 Ph ng pháp PCR lồng (Nested –PCR)

PCR l ng h g h P R ó 2 gi i : gi i ầu dùng m t cặp

m i ngoài (g i P R ò g g i) khu h i m n A N g ó h a các trình tự ặc hi u muố , ó ù g n phẩm PCR vòng ngoài làm khuôn cho vào ống PCR có cặp m i g (g i P R ò g g) khu h i trình tự ặc

hi u muốn tìm này Do v y, s n phẩm c a PCR lần 2 sẽ ó h h c nhỏ h n phẩm lầ 1 Ng i c tính rằng PCR l g h h g i 104 lầ nh y

c a kỹ thu P R h ần Mặc dù s n phẩm PCR lần 1 không rõ (ít hoặc nhiều

s n phẩm ph ) song các kh h ẽ c khu h i lên nhiều lần nh PCR l ng

và có th làm khuôn cho PCR l ng ti p theo Hi ng này d n các s n phẩm

ge h g ặc hi ũ g ẽ c khu h i và làm sai l ch k t qu iều này có

th khắc ph c bằng cách pha loãng s n phẩm PCR lần 1 hoặc tinh ch s n phẩ c khi ti n hành PCR l ng lầ 2 Th ó, g i ng h p,

vi c ti n hành song song các m ối ch ng là h t s c cần thi t [2,3,10,26,28]

lo i nucleotide A, T, C, G trên phân t ADN, nh ó ghiên c ặ i m di truyền ở m sinh h c phân t Hi n nay, gi i trình tự g h phát tri n

c ng d ng cao trong nhiề h ực nghiên c h h h gi i trình tự

h h, nh type vi khuẩn, virus, nh n d ng cá th , nh n d g i, nh

t bi n gen, ng d ng trong s n xuấ i e, iều tr h g h

N 1977, h i h h h g i Mỹ A M W e Gi e

h i h h g h hó h c có th h c trình tự các nucleotide trong chuỗi ADN ũ g , Sanger và c ng sự h i h h g

20

pháp enzyme s d ng các dideoxynucleotide, h g h ựa vào sự ho t

ng c a enzyme DNA- e e tổng h p m ch bổ sung c a trình tự cần xác

Hình 1.8: S ồ hệ thống máy giải trình tự tự ộng

21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối t ợng nghiên cứu

Ư g

2.1.2 Chứng d ng

ADN- H.capsulatum, Aspergillus spp., Candida albicans; Cryptococcus gattii; Rhizomucor; Coccidioides posadassi; Penicillium marneffei doVi n nghiên

c u các b nh truyền nhiễm Quốc gia, Tokyo, Nh t B n cung cấp

2.2 Y ức của nghiên cứu

 g h g h g h g h hỏ h g IgG g i, g h i peroxidase hấ ổ h ( ONJ P )

- P i e ( i) i, i e g c c g ấ ởi công ty IDT (

Intergrated DNA Technologies – Mỹ) hi ự g h ghi

g ố Ohno H g ự [28]

Bảng 2.1:Các cặp mồi cho phản ứng PCR lồng phát hiện H capsulatum

Độ dài (bp)

Msp3R

5- CGG GCC GCG TTT AAC AGC GCC -3 5- ATA AGG ACG TCA CGA AGG GC -3 269

 D g h SY R® safe DNA stain

 Sinh phẩm dùng cho tách chiết, tinh sạch ADN

- i h hẩ QIAamp® DNA mini kit (QIA ge , ) h hi A N ừ

2.3.2 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- T i h h II

Biological safety cabinet – BSC

- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge

25

2.4 Ph ng pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết ế nghiên cứu

A Với mẫu bệnh nhân

S ồ 2.1: Quy trình chung cho nghiên cứu mẫu bệnh nhân

(

*) h h g ý g ấ / h ặ h hổi

B Với mẫu môi tr ờng

S ồ 2.2: Quy trình chung cho nghiên cứu mẫu môi tr ờng

Tấ h â h ghi gặ g ắ i h h hò g h ghi ( he h i h h Vi V i h h ễ T g g)

26

2.4.2 Kỹ thuật nghiên cứu

2.4.2.1 Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển

- iề ầ h g i ề h hâ , h hâ , g ấ

hi ghi hi iề

- T ố g ự g ghi ầ h g i h , ố, i h g ấ

- h hẩ h hổi/ h :Lấ 3-5 h h ố g h h ghi g HI, ở hi h g h ề hò g h ghi ngay trong ngày ( iề hự hi i ấ )

- h hẩ : Lấ 5 h h ối i h hâ g i 1-2 ối i h hâ ẻ e M ấ g hẹ h g h h

Tokyo, Nh (NII )

h h h ố g ự g ù g

+ ý i h h ghi h h h h g

ò g 5 g h ở h 4-80 h ặ giữ i -200 h i gi h ghi 1 ầ

+ H h ối i g hiề ầ

2.4.2.3 Nuôi cấy

M ầ hâ h i ấ h h HI ( i He I f i agar – Me ) ổ g h g i h h he i (100 g/ ), h h HI + 5%

- Ở iề i hi 370 h h ẩ nhỏ, g h 0,5-1 mm, ó g

e , hi i ó ấ e , h i hỏ

2.4.2.5 Phương pháp tách chiết ADN

a Tách chiết ADN từ mẫu huyết thanh (tiến hành theo quy trình nội bộ của NIID)

S ồ 2.3: Quy trình nội bộ về phân tách ADN từ mẫu huyết thanh

Huy t thanh 100 µl + 100 µl dung d ch ly gi i

↓ Thêm w e (β-glucanase)