luận án tiến sĩ phân lập và tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa n và tích lũy poly p trong nước thải sản xuất hủ tiếu mỹ tho và ứng dụng xử lý nước thải

LÊ THỊ LOANPHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, CHUYỂN HÓA N VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI... LÊ THỊ LOANPHÂN LẬP VÀ

LÊ THỊ LOAN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, CHUYỂN HÓA N VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI

LÊ THỊ LOAN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, CHUYỂN HÓA N VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

VI SINH VẬT HỌC

Cần Thơ – 2020

Trường Đại học Cần Thơ đã cung cấp kiến thức và hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình học tập.

- GS.TS Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn, góp ý cũng như là tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.

- Tiến sĩ Trần Thị Giang, giảng viên cùng nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương và cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, phòng thí nghiệm vi sinh vật đất của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, sinh viên Nguyễn Võ Tấn Lực, MSSV: B150445, Lớp: CNSH A2K41; Đặng Ngọc Bảo, MSSV: B1504422, Lớp: CNSH A2K41 Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

- Gia đình chú Trương Văn Thuận tại ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong, thành phố Mỹ Tho đã cũng cấp nguồn nước thải, địa điểm thực hiện đề tài, tạo điều kiện giúp đở để đề tài được hoàn thiện tốt nhất.

- Thạc sĩ Trịnh Thị Thắng phụ trách phòng thí nghiệm, Tiến sĩ Lê QuangKhôi, Phó Giám đốc Sở Khoa học và Công nghệ sinh tỉnh Tiền Giang đã hỗtrợ, cung cấp kết quả cho đề tài.

- Quý Thầy cô, anh, chị công tác tại Trung tâm học liệu đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình tìm kiếm tài liệu đề hoàn thành đề tài.

Trân trọng!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2020

Lê Thị Loan

TÓM LƯỢC Phân lập, tuyển chọn, và nhận diện vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa

N và tích lũy poly-P và trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng

dụng xử lý nước thải

Hủ tiếu là sản phẩm được sản xuất từ hạt gạo nấu chín ở châu Á; Quá trìnhchế biến hủ tiếu đã thải ra một lượng nước thải chứa nhiều độc tố gây ảnh hưởngđến môi trường sống và sức khỏe con người Mục tiêu đề tài là phân lập, tuyển chọn

và ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ vàdòng vi khuẩn tích lũy poly-Phosphate tốt để xử lý nước thải Tổng số 42 dòng vikhuẩn kết tụ sinh học, 59 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và 8 dòng vi khuẩn tíchlũy poly-Phosphate được phân lập từ nước thải của 8 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho,tỉnh Tiền Giang, Việt Nam Vi khuẩn kết tụ sinh học chia làm 2 nhóm: kết tụ protein

và polysaccharide; vi khuẩn chuyển hóa nitơ dị dưỡng chia làm 4 nhóm: vi khuẩnoxi-hóa ammonium (15 dòng), vi khuẩn oxi-hoa nitrite (15 dòng), vi khuẩn oxi-hoánitrate (18 dòng) và vi khuẩn nitrate và phản-nitrate hóa (11 dòng) Phân tích gene16S rDNA và giải trình tự cho thấy tất cả chúng có mức độ đồng hình từ 97% đến99%, tất cả các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học và tích lũy poly-P đều thuộc họ

Bacilaceae trong khi đó chi Bacillus chỉ chiếm 12% ở vi khuẩn chuyển hóa nitơ còn

lại thuộc vi khuẩn Gram âm (Proteobacteria) Tuyển chọn được 2 dòng kết tụ sinh

học Bacillus subtilis PRO.01.C và Bacillus subtilis PO.03.B, dòng chuyển hóa nitơ

Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03C và dòng vi khuẩn tích lũy

poly-Phosphat Bacillus megaterium poly-P.06.4B để xử lý nước thải hủ tiếu từ 100-mL,

1-L, 10-L, 100-L và 1000-L và kết quả đạt được pH nước thải từ 4,68 lên 6,13, TSS

từ 369 mg/L giảm xuống 17 mg/L, BOD5 từ 1200 mg/L giảm xuống 23 mg/L, TN

từ 45 giảm xuống 7,57 mg/l, TP từ 7,57 giảm xuống 4,76 mg/đạt tiêu chuẩn B, củaQCVN40:2011/BTNMT sau 4 ngày sục khí 8/24 giờ

Từ khóa: Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, Vi khuẩn chuyển hóa đạm ,Vi khuẩn tích lũy lân hòa tan, nước thải hủ tiếu.

ABSTRACT Isolation, Selection and Identification of bioflocculant-producing bacteria, heterotrophic nitrogen removal bacteria and poly-P nurturingbacteria in wastewater from “hu tieu My Tho” mills, Tien Giang province,

Vietnam and their application for wastewater treatment

Hu tieus are a form of rice product from cooked rice grain in Asia Theprocess of hu tieu production discharges an amount of wastewater containing amultitude of toxins that cause environmental degradation and human health risks.The aim of the study was to isolate, screen and utilize bioflocculant-producingbacteria, heterotrophic nitrogen-removal bacteria, poly-phosphate nurturing bacteria

as way of wastewater treatment A total of 42 bioflocculant-producing bacterialstrains (BPB), 59 heterotrophic nitrogen removal bacterial (HNRB) strains and 8poly-Phosphate nurturing bacterial strains were isolated from wastewater of 8 hutieu mills of My Tho City, Tien Giang province, Mekong Delta, Vietnam.Bioflocculant-producing bacterial strains were divided into two groups: protein-flocculant and polysaccharide; HNRB strains were classified into four groups ofheterotrophic ammonium-oxidizing bacteria (15 strains), nitrite-oxidizing bacteria(15 strains), nitrate-oxidizing bacteria (18 strains) and heterotrophic nitrifying anddenitrifying bacteria (11 strains) The virtually complete 16S rRNA gene was PCRamplified and sequenced The sequences from the selected BPB, HNR and poly-Pbacterial strains all showed high degrees of similarity to those of the GenBankreferences strains (between 97% and 99%) Phylogenetic trees based on the 16SrDNA sequences displayed high consistency, with nodes supported by highbootstrap (1000) values These presumptive HNRB strains were categorized intotwo groups that included members of genera belonged to Gram-positive bacteriaphylum and Proteobacteria phylum while BPB and poly-P bacteria strains belonged

to bacilli Application of two strains BPB Bacillus subtilis PRO.01.C and Bacillus

subtilis PO.03.B, HNR Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03C and poly-P

Bacillus megaterium P.06.4.B to treat wastewater from hu tieu in containers from

100mL, 1L, 10L, 100L and 1000L, the results recorded that pH of wastewaterincreased from 4.68 to 6.13, TSS and BOD5 concentration of wastewater reducedfrom 369 and 1200 mg/L to 17 and 23 mg/L, respectively Total nitrogen and totalphosphorous decreased from 45 and 6.3 mg/L to 7.57 and 4.56 mg/L, respectively.All targets reached B level according to QCVN40/2011 standard/Ministry ofNatural Resource and Environment of Vietnam

Keywords - Bioflocculant-producing bacteria, Heterotrophic Nitrogen Removal Bacteria, Poly-Phosphate bacteria, Rice-noodle, wastewater

MỤC LỤC

Chương 1 – Giới thiệu

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Mục tiêu của nghiên cứu

1.3 Đối tượng nghiên cứu

1.4 Thời gian và địa điểm thu mẫu

1.5 Nội dung nghiên cứu

1.6 Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án

Chương 2 – Tổng quan tài liệu

2.1 Hiện trạng sản xuất hủ tiếu ở thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang

2.2 Quy trình sản xuất bánh hủ tiếu tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho

2.3 Vấn đề về nước thải và chất lượng nước thải của các cơ sở sản xuất hủ tiếu

2.4 Quy trình và biện pháp xử lý nước thải tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho

2.5 Vi khuẩn kết tụ sinh học

2.5.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant)

2.5.2 Kiểm tra khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của vi khuẩn bằng dung dịch kaolin

2.5.3 Cơ chế và đặc điểm của quá trình kết tụ sinh học (Mechanisms of Bioflocculation)

2.5.4 Một số nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

2.5.5 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nuớc thải

2.5 Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ (đạm) trong nước thải

2.6.1 Độc tính của Amoni và các hợp chất Nitơ dạng oxy hóa

2.6.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa Nitơ ngoài nước và trong nước

2.7 Vi khuẩn tích lũy lân dạng poly (poly-P)

2.7.1 Các dạng phospho tồn tại trong tự nhiên

2.7.2 Loại bỏ phospho bằng hóa chất 31

2.7.3 Loại bỏ phospho bằng con đường sinh học 31

2.7.4 Vi khuẩn tích lũy lân dạng poly (poly-P) 31

2.7.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ngoài nước và trong nước 33

2.7.5.1 Những nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ngoài nước 33

2.7.5.2 Những nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ở Việt Nam 34

2.8 Các nghiên cứu và ứng dụng 3 nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa đạmNitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P trong và ngoài nước 35

2.8.1 Giới thiệu 35

2.8.2 Các phương pháp xử lý nước thải trong ngành chế biến thực phẩm 35

2.8.2.1 Nước thải ngành chế biến thực phẩm 35

2.8.2.2 Tổng quan các phương pháp xử lý nước thải ngành chế biến thực phẩm 36

2.8.2.3 Xử lý nước thải chế biến thực phẩm bằng phương pháp sinh học hiếu khí 38

2.9 Các phương pháp xử lý nước thải tiên tiến trong và ngoài nước 50

2.9.1 Các biện pháp loại bỏ Nitơ 51

2.9.1.1 Loại bỏ nitơ bằng biện pháp sinh học: nitrate hóa và phản nitrate hóa 51 2.9.1.2 Loại bỏ nitơ bằng phương pháp hóa lý 51

2.9.2 Các biện pháp tích lũy Phospho 51

2.9.2.1 Loại bỏ lân bằng biện pháp sinh học 51

2.9.2.2 Loại bỏ lân bằng phương pháp hóa lý 52

2.9.3 Ứng dụng màng lọc tiên tiến xử lý nước thải 52

Chương 3 – Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 55

3.1 Vật liệu thí nghiệm 55

3.1.1 Môi trường nuôi cấy 55

3.1.1.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein 55 3.1.1.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học

3.1.1.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ 56

3.1.1.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P 57

3.1.2 Nguyên liệu và vật liệu thí nghiệm 57

3.2 Phương pháp nghiên cứu 57

3.2.1 Thu mẫu 57

3.2.2 Đếm mật số vi khuẩn 58

3.2.3 Phân lập vi khuẩn 59

3.2.3.1 Phân lập vi khuẩn 59

3.2.3.2 Trữ mẫu và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn 60

3.2.4 Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ N và vi khuẩn poly-P 61

3.2.4.1 Tuyển chọn 61

3.2.4.2 Nhận diện 70

3.2.5 Ứng dụng các dòng vi khuẩn tốt trên nước thải hủ tiếu 75

3.2.5.1 Ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho 75

3.2.5.2 Ứng dụng các dòng Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và dòng vi khuẩn Poly-P vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho 76

3.2.5.3 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1- L 78 3.2.5.4 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 10-L 79 3.2.5.5 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 100-L 79

Chương 4 - Kết quả và thảo luận 81

4.1 Mật số vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P 81 4.2 Phân lập các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa N và

vi khuẩn tích lũy poly-P

4.2.1 Phân lập các dòng vi khuẩn kết tụ sinh sinh học

4.2.1.1 i khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi trường protein

4.2.1.2 i khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi trường Polysaccharide

4.2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ

4.2.2.1 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường nitrite

4.2.2.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường nitrate

4.2.2.3 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường ammonium

4.2.2.4 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường tổng

4.2.3 Phân lập các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P

4.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-phosphate

4.3.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học

4.3.1.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học protein

4.3.1.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học polysaccharide

4.3.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa Nitơ

4.3.2.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa Nititrite (NO2 4.3.2.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrate ( NO3 4.3.2.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium (NH4 4.3.2.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ tổng hợp 4.3.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn tích lũy poly-P

4.4 Nhận diện vi khuẩn

4.4.1 Nhận diện vi khuẩn kết tụ sinh học

4.4.2 Nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá Nitơ 4.4.3 Nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P

4.5 Ứng dụng các dòng Vi khuẩn kết tụ sinh học, Vi khuẩn chuyển hóa N và Vi khuẩn Poly-P vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho

4.5.1 Ứng dụng các dòng Vi khuẩn kết tụ sinh học vào xử lý nước thải hủ tiếu

Mỹ Tho 1204.5.1.1 Chọn pH thích hợp 1204.5.1.2 Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn

4.5.1.3 Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn

4.5.1.4 Kết hợp các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein và

polysaccharide ở 100-mL nước thải hủ tiếu Mỹ Tho 1324.5.1.5 Kết hợp các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein và

polysaccharide ở 1-L nước thải nước thải 1344.5.1.6 Kết hợp các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein và

polysaccharide ở 10-L nước thải nước thải 1354.5.2 Ứng dụng các dòng của các dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ

4.5.2.1 Kết quả khảo sát khả năng xử lý nước thải của các dòng vi khuẩn

chuyển hoá Nitơ 1364.5.2.2 Khả năng xử lý NH4+ trong nước thải của các dòng vi khuẩn tích luỹ

Poly-P 1384.5.3 Kết quả ứng dụng khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển

hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1-L 1394.5.4 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích

luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 10-L 1404.5.5 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá N và tích luỹ

142Poly-P tốt nhất ở thể tích 100-L

4.5.6 Khả năng xử lý nước thải của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi

143khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1000-L

Chương 5 – Kết luận và Đề xuất 1495.1 Kết luận 149

5.2 Đề xuất 149Tài liệu tham khảo 150

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ vị trí thành phố Mỹ Tho và xã Mỹ Phong, nơi các làng nghề

sản xuất hủ tiếu 4

Hình 2.2 Quy trình sản xuất bánh hủ tiếu ở các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho 5

Hình 2.3 Sơ đồ phân giải protein ngoại và nội bào vi khuẩn cùng các con đường biến đổi acid amin nội bào 10 Hình 2.4 Công thức cấu tạo kaolin 13

Hình 2.5 Cơ chế kết tụ sinh học của vi khuẩn sinh ra chất kết tụ 15

Hình 2.6 Chu trình nitơ 19

Hình 2.7 So sánh sự tổ chức của các gen khử đạm trong các vi khuẩn P stutzeri, P aeruginosa, Paracoccus denitrificans 25 Hình 2.8 Cây phát sinh thể hiện mối quan hệ giữa các loài tham gia sự khử 26 đạm triệt để

Hình 2.9 Phân phối HPO42- và H2PO4- tùy theo pH của môi trường 30

Hình 2.10 (A) Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR (B) Sự chuyển đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí 33 Hình 2.11 Các thành phần chính của hệ thống bùn hoạt tính 39

Hình 2.12 Các công đoạn của quy trình xử lý nước thải bằng bể bùn hoạt tính 40 Hình 2.13 Sơ đồ quy trình xử lý nước thải bằng bể lọc sinh học nhỏ giọt. 43

Hình 2.14 Sơ đồ bể lọc sinh học nhỏ giọt 45

Hình 2.16 Phân phối nước bằng các cánh xoay tròn 48

Hình 2.17 Sơ đồ một hệ thống xử lý nước thải bằng đĩa quay sinh học 49

Hình 2.18 Sơ đồ trao đổi chất của PAO trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí 53

Hình 2.19 Phân loại màng lọc dựa trên kích thước 54 Hình 3.1 (A) Pha loãng mẫu và đếm sống nhỏ giọt

(B) xác định mật số vi khuẩn 59

Hình 3.2 Mẫu đã kiểm ròng được trữ trong ống nghiệm 60

Hình 3.3 Đường chuẩn đo lân 68

Hình 3.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 72

Hình 3.5 Chương trình PCR dùng để nhận diện vi khuẩn chuyển hoá Nitơ 73

Hình 3.6 Chương trình PCR dùng để nhận diện vi khuẩn tích luỹ Poly-P 74

Hình 3.7 Sơ đồ đánh giá khả năng kết tụ hay % kết tụ và hàm lượng TSS của nước thải 76 Hình 3.8 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá hiệu quả Vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và vi khuẩn poly-P trên nước thải hủ tiếu Mỹ Tho 80

Hình 4.1 Đặc điểm của một số dạng khuẩn lạc vi khuẩn sản xuất chất kết tụ 83 sinh học

Hình 4.2 i khuẩn kết tụ sinh học (PRO.01.C) có dạng que ngắn dưới độ phóng đại 10.000 lần 85 Hình 4.3 Vi khuẩn kết tụ sinh học (PO.03.B) có dạng que dài dưới độ phóng đại 9.000 lần 86 Hình 4.4 Dạng khuẩn lạc vi khuẩn kết tụ sinh học 87

Hình 4.5 Độ nhớt của khuẩn lạc 88

Hình 4.6 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn nitrite có màu trắng đục, mô, bìa nguyên 89 Hình 4.7 Tế bào vi khuẩn nitrite (HNi.01.03.DL) đa số có hình que ngắn, dưới độ phóng đại 6.000 lần 90

Hình 4.8 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn nitrate có tròn, đục, bìa nguyên 91

Hình 4.9 Tế bào i khuẩn nitrate (HNa.02.03.C) có hình dạng que ngắn dưới độ phóng đại 6.000 lần 92 Hình 4.10 huẩn lạc của vi khuẩn ammonium 94 Hình 4.11 Hình dạng vi khuẩn ammonium (HAm.03.05.C) có dạng que ngắn

dưới độ phóng đại 6.000 lần 96

Hình 4.12 Dạng khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa nitơ 97Hình 4.13 Hình dạng vi khuẩn (COM.04.07.C) tổng hợp 03 loại nitơ dưới độ

phóng đại 7.500 lần 98Hình 4.14 Một số hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập

từ nước thải hủ tiếu 99Hình 4.15 Dạng khuẩn lạc vi khuẩn tích lũy poly-P 100Hình 4.16 Hình dạng vi khuẩn tích lũy Poly-P (Poly-P.06.4.B) có dạng

que dài 101Hình 4.17 Tỷ lệ kết tụ của dòng vi khuẩn kết tụ protein trong dung dịch

Kaolin102Hình 4.18 Tỷ lệ kết tụ của dòng vi khuẩn kết tụ polysaccharise trong dung

Hình 4.19 Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn khi thử nghiệm trên môi

trường tối thiểu bổ sung nitrite ở 10 mM (A) và giảm dần ở

30 mM (B) 105Hình 4.20 Số dòng vi khuẩn khử nitrite giảm dần trên môi trường bổ sung

NO2- với nồng độ tăng dần105Hình 4.21 Số dòng vi khuẩn khử nitrite giảm dần trên môi trường bổ sung

NO3- với nồng độ tăng dần106Hình 4.22 Khả năng phát triển của vi khuẩn khử ammonium trên môi trường

bổ sung NH4+ với nồng độ tăng dần 107Hình 4.23 hả năng phát triển của vi khuẩn chuyển hóa N trên môi trường

bổ sung 3 loại Nitơ với nồng độ tăng dần108Hình 4.24 hả năng tích luỹ poly-P của các dòng vi khuẩn trên môi trường

phospho 108Hình 4.25 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng

vi khuẩn kết tụ sinh học trên gel agarose 1,2% 109Hình 4.26 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn

kết tụ sinh học 111

Hình 4.27 Phổ điện di của sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn chuyển hóa

N trên gel agarose 2%

Hình 4.28 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩnchuyển hoá Nitơ

Hình 4.29 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩntích lũy poly-P

Hình 4.30 Tỷ lệ kết tụ sinh học trung bình của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh

học protein và polysaccharide xử lý trong 100 mL nước thải hủtiếu Mỹ Tho

Hình 4.31 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến khả năng tổng

hợp chất kết tụ sinh học chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

PO.03.B

Hình 4.32a Đồ thị mặt đáp ứng của tỷ lệ kết tụ theo khoáng vô cơ = 0,75%,tinh bột = X (0,5% - 1,5%) và urê = Y (0,025% - 0,075%)

Hình 4.32b Đồ thị đường mức của tỷ lệ kết tụ theo khoáng vô cơ

FeCl2 = 0,75%, tinh bột = X (0,5% - 1,5%) và urê = Y

(0,025% - 0,075%)

Hình 4.33 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả năng kết tụ

sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PO.03.B

Hình 4.34 Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả kết tụ sinh học dòng vi khuẩnPRO.01.C

Hình 4.35 Ảnh hưởng của liều lượng dung dịch vi khuẩn lên khả năng kết tụ

sinh học của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis PRO.01.C

Hình 4.36 Tỷ lệ kết tụ trung bình của tổ hợp các dòng vi khuẩn kết tụ sinhhọc xử lý trong 100 mL nước thải hủ tiếu Mỹ Tho

Hình 4.37 Tỷ lệ kết tụ trung bình của 2 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học

PO.03.B và PRO.01.C xử lý trong 1 L nước thải hủ tiếu Mỹ Tho

Hình 4.38 Tỷ lệ kết tụ trung bình của tổ hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh họcPO.03.B và PRO.01.C xử lý trong 10 lít nước thải hủ tiếu Mỹ

Tho 135Hình 4.39 Hàm lượng ammonium (mg/L) ở các dòng vi khuẩn chuyển hoá N

sau 03 ngày xử lý 136Hình 4.40 Hàm lượng orthophosphate (mg/L) ở các dòng vi khuẩn chuyển

hóa N sau 03 ngày xử lý 137Hình 4.41 Hàm lượng ammonium (mg/L) ở các dòng vi khuẩn tích luỹ Poly-P

sau 03 ngày xử lý 138Hình 4.42 Hàm lượng orthophosphate (mg/L) ở các dòng vi khuẩn tích luỹ

Poly-P sau 03 ngày xử lý 139Hình 4.43 Hàm lượng ammonium và orthophosphate (mg/L) nước thải

sau khi xử lý 140Hình 4.44 Hàm lượng ammonium và orthophosphate (mg/L) nước thải

sau khi xử lý ở qui mô 10-L 141Hình 4.45 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển

hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P trên pH của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho

sau 4 ngày xử lý 143Hình 4.46 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển

hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P trên BOD5 và TSS của nước thải hủ

tiếu Mỹ Tho sau 4 ngày xử lý 144Hình 4.47 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển

hoá N và tích luỹ Poly-P trên tổng nito và tổng phospho của nước

thải hủ tiếu Mỹ Tho sau 4 ngày xử lý 145

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Chỉ tiêu thành phần nước thải của các cơ sở sản xuất bánh hủ tiếu

tại cơ sở sản xuất hủ tiếu tại thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang

Bảng 2.2 Giá trị C của các thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp quy định bởi QCVN 40:2011/BTNMT

Bảng 3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide

Bảng 3.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Bảng 3.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích luỹ poly-P

Bảng 3.5 Địa điểm 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu ở Thành phố Mỹ Tho, Tiền Giang được lấy mẫu

Bảng 3.6 Các nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ được bổ sung trong 6 36 55 56 56 57 58 môi trường nuôi sinh khối chủng vi khuẩn kết tụ sinh học tốt nhất 63

Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến hiệu quả kết tụ sinh học ở dòng kết tụ sinh học polysaccharide hat protein tốt nhất 64 Bảng 3.8 Thành phần môi trường cơ bản bổ sung nitrate, nitrite và ammonium 66 Bảng 3.9 Thành phần hóa chất xây dựng đường lân chuẩn 67

Bảng 3.10 Thành phần cho 1 phản ứng PCR (50 μL) 71

Bảng 3.11 Thành phần cho 1 phản ứng PCR (50 µL). 72

Bảng 3.12 Thành phần cho 1 phản ứng PCR (50 µL) 73 Bảng 4.1 pH và mật số 3 nhóm vi khuẩn trong 08 mẫu nước thải hủ tiếu của

08 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang 81 Bảng 4.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi

trường protein 84 Bảng 4.3 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn sản xuất chất kết tụ

sinh học trên môi trường protein 85 Bảng 4.4 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn sản xuất chất kết tụ

sinh học trên môi trường polysaccharide 86 Bảng 4.5 Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học

trên môi trường polysaccharide 87 Bảng 4.6 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn phân lập trên

môi trường nitrite 89 Bảng 4.7 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn phân lập được

trên môi trường nitrite 90

Bảng 4.8 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường nitrate 91

Bảng 4.9 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập được trên môi trường nitrate 92

Bảng 4.10 Tổng hợp các đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường nitrate 93

Bảng 4.11 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường ammonium 94

Bảng 4.12 Tổng hợp các đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường ammonium 95

Bảng 4.13 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập được trên môi trường ammonium 96

Bảng 4.14 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường tổng 97

Bảng 4.15 Tổng hợp các đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường tổng 98

Bảng 4.16 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập được trên môi trường tổng (T) 99

Bảng 4.17 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường lân 100 Bảng 4.18 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập trên môi trường tích luỹ poly-P101 Bảng 4.19 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn trên môi trường tích luỹ poly-P 101

Bảng 4.20 So sánh tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học 104

Bảng 4.21 Kết quả giải trình tự 06 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học 110

Bảng 4.22 ết quả giải trình tự 11 dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ 113

Bảng 4.23 ết quả giải trình tự 03 dòng vi khuẩn tích luỹ Poly-P 118 Bảng 4.24 Ảnh hưởng của nguồn (%) carbon, (%) nitrogen và (%) khoáng

vô cơ đến tỷ lệ kết tụ (%) của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

PO.03.B 123 Bảng 4.25 Ảnh hưởng của nguồn (%) tinh bột, (%) urê, (%) va FeCl3 (%) đến

tỷ lệ kết tụ (%) của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PO.03.B 125 Bảng 4.26 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến khả

năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của dòng vi khuẩn Bacillus

subtilis PRO.01.C 129 Bảng 4.27 Ảnh hưởng của sự thay đổi tỷ lệ (%) tinh bột, (%) urê, (%) va

Cl (%) đến tỷ lệ kết tụ (%) của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

PO.03.B 131Bảng 4.28 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học trên

lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho 133Bảng 4.29 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tự sinh học trên

lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho ở 1-L nước thải 134Bảng 4.30 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tự sinh học trên

lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho ở 10-L nước thải 135Bảng 4.31 Hiệu quả của vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ

và vi khuẩn tích lũy Poly-P trên pH và lý, hóa tính của nước thải

hủ tiếu Mỹ Tho 142

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ADPATPPCRBODBOD5

BTNMTCODDNAN

N2

NH4+NO3-ODPPoly-PQCVNRNATNTPTSS

LVKPACBLAST

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Gạo là nguồn lương thực chính ở các quốc gia châu Á và loại lương thực nàyđược chế biến nhiều loại sản phẩm khác nhau trong đó có hủ tiếu Hủ tiếu được sảnxuất theo quy trình gạo được ngâm trong thời gian 24 giờ, sau đó tháo nước rửa chua,

kế tiếp là xay bột rồi ủ bột trong khoảng thời gian 48 giờ Bước tiếp theo là luộc bột

và tráng bột trên các vĩ mỏng sau đó phơi khô và dùng máy cắt thành sợi Hủ tiếuthành phẩm có thể trộn với rau củ quả cùng với thịt và nước súp (nước lèo) được nấuchín từ xương heo là đặc sản nổi tiếng ở Mỹ Tho, Tiền Giang

Tuy nhiên, hầu hết các cơ sở sản xuất hủ tiếu chưa có hệ thống xử lý nước thảihay xử lý không đạt tiêu chuẩn Nhu cầu nước cho sản xuất tại các cơ sở chế biếnnông sản thực phẩm thường rất lớn, nhưng nước thải trong quá trình sản xuất thườngkhông được xử lý mà xả thẳng ra môi trường gây ô nhiễm nặng nề cho nguồn nướcsông, rạch Cụ thể ở Mỹ Tho - Tiền Giang, đa số các cơ sở đều mang tính tự phát, nhỏ

lẻ nên chưa thật sự chú trọng đến việc xử lý nước thải bảo vệ môi trường Nhiều cơ

sở sau khi sản xuất đã xả trực tiếp nước thải hủ tiếu chưa qua xử lý ra môi trườngkhiến nhiều sông ngòi, kênh rạch gây ô nhiễm nghiêm trọng đồng thời gây nguy hạicho sinh vật và người dân sống quanh đó

Nhận thấy được tiềm năng cũng như hiệu quả của các nhóm vi khuẩn kết tụ sinhhọc, vi khuẩn chuyển hóa đạm, vi khuẩn tích lũy poly-P trong việc xử lý nước thải,đồng thời vấn đề cấp bách hiện tại là phải có biện pháp xử lý nước thải hủ tiếu, đểngăn chặn việc ảnh hưởng đến môi trường Quan trọng hơn là bảo vệ danh tiếng của

ẩm thực Việt Nam, danh tiếng 50 năm danh hiệu của hủ tiếu Mỹ Tho và hình ảnh củaViệt Nam Vì vậy đề tài “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóanitơ và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lýnước thải” được thực hiện là một nghiên cứu vô cùng cấp thiết và mang tính ứngdụng vào thực tiễn rất cao nhằm giải quyết những khó khăn nêu trên

1.2 Mục tiêu của nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng các vi khuẩn khả năng xử lý nước thải từ các

cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho

1.3 Đối tượng nghiên cứu

Các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N (nitơ) và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu

1.4 Thời gian và địa điểm thu mẫu

Thời gian: Từ tháng 2 năm 2016 đến tháng 8 năm 2018

Địa điểm thu mẫu: tại 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu tại xã Mỹ Phong, Thành phố

Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang

1.5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N và tíchlũy poly-P trong nước thải hủ tiếu

- Nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng vi khuẩn kết tụ sinhhọc, loại bỏ N và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu có các đặc tính tốt bằngphương pháp sinh học phân tử và công cụ Tin Sinh học kết hợp với một số mô tả hìnhthái tế bào và khuẩn lạc đã có

- Tuyển chọn một số dòng kết tụ sinh học, loại bỏ N và tích lũy poly-P trongnước thải hủ tiếu tốt nhất để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải hủ tiếu trong thùnghay bể chứa có dung tích 100 mL, 1-L, 10-L, 100-L

1.6 Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án

Kết quả nghiên cứu của đề tài là một bộ sưu tập gồm 109 dòng vi khuẩn kết tụsinh học, chuyển hóa N và tích lũy poly-P Trong đó: 42 dòng vi khuẩn kết tụ sinhhọc (23 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ protein và 19 dòng vi khuẩn có khả năngkết tụ polysaccharide), 59 dòng vi khuẩn chuyển hóa N (15 dòng vi khuẩn chuyểnhóa ammonium, 18 dòng vi khuẩn chuyến hóa nitrate, 15 dòng vi khuẩn chuyển hóanitrite và 11 dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonium, nitrite, nitrate), 8dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P

Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn hai nhóm kết tụ sinh học và tích lũy poly-P

là đều là họ Bacillaceae trong khi đó vi khuẩn ở nhóm chuyển hóa N có sự đa dạng loài hơn bao gồm vi khuẩn Gram âm và Bacillus trong đó Bacillus chỉ chiếm tới 12%

tổng số dòng vi khuẩn

Do các nguồn vi khuẩn được phân lập có giới hạn trong khu vực nhỏ nên số cáthể phân lập không cao và sự đa dạng không nhiều nhưng đối với nhóm khuẩnchuyển hóa N có sự đa dạng hơn các nhóm vi khuẩn còn lại

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hiện trạng sản xuất hủ tiếu ở thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang

Thành phố Mỹ Tho là thủ phủ của tỉnh Tiền Giang, Việt Nam tọa độ[106°33’96” đến 106°33’27” Đông và 10°36’51” đến 10°36’27 Bắc] thuộc vùngĐồng bằng sông Cửu Long (Hình 2.1)

Hình 2.1 Bản đồ vị trí thành phố Mỹ Tho và xã Mỹ Phong, nơi các làng nghề sản

xuất hủ tiếu

(nguồn: https://ungdungmoi.edu.vn/ban-do-viet-nam.html)

Hủ tiếu Mỹ Tho là một trong những đặc sản từ gạo, sản xuất từ 08 cơ sở sảnxuất tại xã Mỹ Phong, tập hợp lại thành thương hiệu đăng ký nhãn hiệu “hủ tiếu MỹTho” Tuy nhiên, những cơ sở này sản xuất thủ công nên nước thải không thông qua

xử lý hoặc xử lý không triệt để trước khi thải ra sông, rạch đặc biệt nhiều chất vớihàm lượng cao như TN, TP, BOD5, TSS (Bảng 2.1)

2.2 Quy trình sản xuất bánh hủ tiếu tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho

Các công đoạn sản xuất bánh hủ tiếu ở Mỹ Tho: gạo được ngâm trong thời gian

24 giờ, sau đó tháo nước rửa chua, kế tiếp là xay bột rồi ủ bột trong khoảng thời gian

48 giờ Bước kế tiếp là luộc bột và tráng bột trên các vĩ mỏng, phơi khô và sau đódùng máy cắt thành sợi, được trình bày ở Hình 2.2

THÁO NƯỚC, RỬA CHUA NGÂM GẠO 24 GIỜ

Ủ BỘT TRONG 48 GIỜ

PHƠI BÁNH TRÁNG BÁNH

Hình 2.2 Quy trình sản xuất bánh hủ tiếu ở các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho

(Nguồn: ảnh chụp tại cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ tho, 2017)

Nước chứa tinh bột thải ra nhiều nhất ở công đoạn rửa chua sau khi ngâm gạo.Nước rửa chua có màu trắng đục, việc rửa chua được thực hiện nhiều lần đến khiphần nước của bể ngâm gạo trong hơn và sạch bụi bẩn Ngoài ra, nước rửa bể chứanước tẻ bột và nước vệ sinh sàn nhà cũng mang theo bột gạo xả ra sông hoặc ao tậptrung nước Thành phần chủ yếu của loại nước này chứa các tạp chất cơ bản ở dạnghoà tan hoặc lơ lửng, trong đó chủ yếu là các hợp chất carbohydrate như tinh bột,đường, các loại acid hữu cơ (acid lactic) (Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý,2012) Nếu chất thải này thải trực tiếp vào nguồn nước mà không được xử lý thíchhợp thì quá trình phân huỷ sinh học sẽ làm suy kiệt oxy hoà tan của nguồn nước, gây

ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

Quá trình sản xuất bánh hủ tiếu Mỹ Tho đã thải ra ngoài một lượng nước thải rấtlớn, mặc dù không có bảng chiết tính minh họa về hiệu quả kinh tế, nhưng bảng phântích nước thải từ các cơ sở này (Bảng 2.1) cho thấy:

Theo kết quả phân tích trên, đa phần các chỉ tiêu trong nước thải không đạt Quychuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải loại B (QCVN 40:2011/BTNMT)

Bảng 2.1 Chỉ tiêu thành phần nước thải của các cơ sở sản xuất bánh hủ tiếu tại cơ sở

sản xuất hủ tiếu tại thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang

STT

123456

7ML

(Nguồn: Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ sinh học - Sở Khoa học và Công nghệ Tiền Giang, năm 2013 và 2014)

2.3 Vấn đề về nước thải và chất lượng nước thải của các cơ sở sản xuất hủ tiếu

Các chất hữu cơ chứa trong nước thải chủ yếu là các chất dễ phân hủy gồm:carbohydrate, protein, lipid, … khi thải vào nguồn nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxyhòa tan trong nước do vi sinh vật sử dụng để phân hủy các chất hữu cơ Nồng độ oxyhòa tan thấp có thể gây ảnh hưởng tới sự phát triển của hệ thủy sinh trong vùng vàcòn gây ảnh hưởng đến khả năng tự làm sạch nguồn nước, làm giảm chất lượng nướccho sinh hoạt và sản xuất

Chất rắn lơ lửng làm cho nước đục và có màu sậm làm hạn chế cường độ ánhsáng chiếu xuống các tầng nước gây ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của các loạitảo và đây cũng là nguyên nhân gây tác động tiêu cực đến tài nguyên thủy sinh.Ngoài ra, lượng chất rắn lơ lửng cao còn gây bồi lắng lòng kênh, mương làm cản trở

sự lưu thông nguồn nước bị ô nhiễm

Ảnh hưởng của Nitơ và Phospho, đây là những nguyên tố dinh dưỡng đa lượng.Nếu nồng độ trong nước quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng phú dưỡng hóa, làm bùngphát sự phát triển của các loại tảo, quá trình hô hấp của các loại tảo này vào ban đêmlàm cho nồng độ oxy trong nước rất thấp gây ngạt thở và diệt vong các sinh vật,ngược lại vào ban ngày thì nồng độ oxy lại quá cao (Moronescu, 2011) Ngoài ra, cácloại tảo nổi trên mặt nước tạo thành lớp màng làm cho bên dưới không có ánh sáng,cản trở quá trình quang hợp của hệ thực vật tầng đáy

Vi sinh vật gây bệnh, trong nguồn nước bị ô nhiễm có chứa rất nhiều vi sinh vậtgây bệnh và trứng giun sán, thường là nguyên nhân dẫn đến bùng phát các loại dịchbệnh Con người trực tiếp sử dụng nguồn nước nhiễm bẩn này sẽ dễ dàng mắc phảicác dịch bệnh như bệnh lỵ, tiêu chảy cấp, bệnh thương hàn, bệnh nhiễm khuẩn đườngtiết niệu,

Nhìn chung, các chỉ tiêu về độc tính trong nước thải giữa nước thải cơ sở sảnxuất bún và cơ sớ sản xuất hủ tiếu tương tự về các chỉ tiêu như BOD5, pH, TN, TSS,

…

2.4 Quy trình và biện pháp xử lý nước thải tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho

Như trình bày ở phần trên, quy trình sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho có những côngđoạn xả bỏ (thải ra) những nước chua trong quá trình ngâm gạo 24 giờ, nước ngâmgạo trong thời gian 24 giờ làm pH nước giảm do quá trình hoạt động của vi khuẩnlactic và nước rửa chua này được rửa làm nhiều lần Nước rửa này thường xả bỏ trênnền nhà để chảy lan ra ngoài

Sau đó gạo được xay thành bột mịn và thải ra một lượng lớn nước xay bột (lắngbột) còn chứa ít nhiều tinh bột gây mùi hôi, nước lắng bột được chứa trong 1 bể riêng

để dùng cho chăn nuôi (nếu cần)

Công đoạn kế tiếp, bột được lắng trong vòng 2 hay 3 ngày và phần nước trongbên trên được bỏ đi và phần nước này cũng được tích chứa chung với phần nước xaybột Nhiều cơ sở sản xuất hủ tiếu bơm nước thải này vào bồn có dung tích >1000-L

để chứa một thời gian hay đợi con nước lớn thì xả bỏ ra sông

Bên cạnh những hộ sản xuất xả thải trực tiếp, có một hộ xây dựng hệ thống lọc

cơ học như sau: Nước ngâm gạo, nước ngâm bột và nước tẻ bột được đưa vào bồnchứa nước thải, sau đó từ bồn chứa cho nước thải chảy qua hầm lọc chứa đá xanhnhiều lớp Nước thải qua hầm lọc đá xanh nhiều lớp, nước trong lại và cuối cùng xảtrực tiếp ra sông, rạch (không qua hệ thống xử lý nào khác) Như vậy, ba công đoạn:ngâm gạo, xay bột, lắng bột đã thải ra một lượng lớn nước thải ra môi trường

Theo Lương Đức Phẩm và ctv (2009), tinh bột từ các nguồn khác nhau rất khác

nhau về mạch phân nhánh, mức độ polymer hóa và những tính chất khác nữa Tuynhiên, sự phân hủy tinh bột đều qua 03 con đường: thủy phân, phosphoryl hóa vàglycosyl hóa Trong tự nhiên, tinh bột rơi vào đất hoặc nước, vi sinh vật chưa thể tiêuhóa được ngay Các vi sinh vật trước tiên phải tiết ra amylase ngoại bào để phân cắttinh bột thành dextrin, oligosaccharide, mantose và glucose để thấm qua màng tế bào,sau đó mới tiếp tục phân giải trong nội bào Các con đường phân hủy tinh bột còn lạidiễn ra trong tế bào vi sinh vật

Thủy phân tinh bột thường dùng các chế phẩm α-, β-, γ-amylase và dextrinase

từ ngũ cốc nảy mầm hoặc nuôi cấy vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn hay nấm men).Các sản phẩm sau khi thủy phân tinh bột như sau:

Tinh bột

Tinh bột

Tinh bột

Nấm mốc, vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) và vi khuẩn sinh α-amylase Các giống vi

sinh vật có khả năng sinh amylase ngoại bào như Bacillus, Clostridium hay

Aspergilus Các loài Aspergillus được nghiên cứu và sử dụng sản xuất các chế phẩm

α-amylase, nhiều hơn cả là A.oryzae, A.niger hoặc A.usamii Bên cạnh đó, vi khuẩn thuộc giống Bacillus được quan tâm nhiều nhất, đặc biệt là dùng để thu α-amylase, gồm có B subtilis, B polymyxa và các loài thuộc giống Pseudomonas Ngoài ra, nhiều chủng xạ khuẩn cũng có khả năng này như Streptomyces.

Trong điều kiện ngập nước, tinh bột cùng với xác thực vật ở trong đất cũng bị vi

sinh vật kỵ khí phân hủy, trong đó chủ yếu là vi khuẩn kỵ khí Clostridium.

Sự tổng hợp enzyme thủy phân carbohydrate như tinh bột ở hầu hết các loài

thuộc giống Bacillus đều bị ức chế do sự chuyển hóa nhanh glucose (Lin et al.,

1998); và Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý (2012) đã tìm thấy một số dòng

vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tại làng nghề Sa Đéc

Chu trình biến đổi các hợp chất nitơ trong nước thải gồm: thủy phân các phân tửhữu cơ lớn (protein) thành các acid amin và tiếp tục thành ammoniac Một phầnammoniac hình thành từ thủy phân được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp tế bào (TrầnVăn Nhân và Ngô Thị Nga, 1999)

Quá trình amon hóa là quá trình phân hủy protein bởi vi sinh vật Trong quátrình này có mặt các enzyme protease Cũng giống như các hợp chất cao phân tử kháctrong tự nhiên, protein trước hết bị thủy phân do các enzyme từ tế bào Cùng cácenzyme ngoại bào, protein bị cắt thành các đoạn ngắn như polypeptid, oligopeptid,peptid và acid amin Các đoạn polypeptid và oligopeptid được tế bào hấp

thụ qua màng vào nội bào và trong tế bào sẽ thủy phân thành các acid amin nhờ

peptidase (Hình 2.3)

Các protease của vi sinh vật gồm polypeptidase, oligopeptidase, desaminase,…

Trong đó, polypeptidase và oligopeptidase chủ yếu được tiết ra ngoại bào Các sản

phẩm phân hủy protein chưa hoàn toàn bằng enzyme pepsin là hỗn hợp các mẫu

peptid ngắn, thường được gọi là pepton Chất này thường được dùng trong môi

trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật

Sản phẩm của quá trình amon hóa tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật, tính chất

protein, tự nhiên, sự thoáng khí, độ ẩm và nhiệt độ Nếu đủ oxy thì phân hủy protein

có thể hoàn toàn với các sản phẩm là NH3, CO2, H2O, H2S và các muối khoáng

Các vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ chứa nitơ thường được gọi là vi sinh

vật thối rữa Chúng có khả năng tiết một lượng lớn protease Trong số này, vi khuẩn

đóng vai trò rất quan trọng Các loài thuộc giống Bacillus có thể tiết 1g protease vào

1L môi trường và có thể tách enzyme này ở mức độ tinh khiết khác nhau phục vụ sản

xuất công nghiệp

Enzyme proteolytic Protein

Enzyme ngoại bào

Acid amin nội bào

Khử amin và phá vỡ khung C Khử cacboxyl chuyển amin và phá vỡ khung C

Sử dụng trực tiếp làm vật liệu xây dựng tế bàoHình 2.3 Sơ đồ phân giải protein ngoại và nội bào vi khuẩn cùng các

con đường biến đổi acid amin nội bào

Các vi sinh vật thối rữa có thể là hiếu khí hoặc kỵ khí, tạo thành bào tử haykhông tạo bào tử Chúng có thể ưa ẩm, ưa nhiệt hoặc ưa lạnh Vì vậy, ở nhiệt độ thấp,protein cũng vẫn bị thủy phân nhưng với tốc độ chậm hoặc rất chậm Đa số các vikhuẩn rất nhạy cảm với độ acid và hàm lượng muối ăn trong môi trường Các vi

khuẩn gây thối thường gặp là các loài thuộc giống Bacillus, Pseudomonas hay

Proteus Chúng thuộc nhóm hiếu khí, sinh protease kiềm Trong khi đó, các vi khuẩn

kỵ khí thường là các loài thuộc giống Clostridium Các loài nấm mốc hoặc

Aspergillus, Trichoderma, Clasdosporium và các loại xạ khuẩn cũng có khả năng

phân hủy protein nhưng nấm men không có protease ngoại bào nên không thủy phânprotein Tóm lại, các vi sinh vật thối rữa là tác nhân phá hoại các loại thực phẩm giàuprotein (thịt, cá, trứng, sữa,…)

Phosphate (Pi) được cây hấp thu từ đất, được động vật sử dụng khi chúng ănthực vật và trả lại đất như một dạng cặn bã hữu cơ, sau đó sẽ được phân rã vào trongđất Hầu hết Pi được sử dụng bởi những sinh vật sống và chúng trở thành những liênkết chặt chẽ trong những liên kết hữu cơ Khi những vật liệu hữu cơ từ thực vật trả lạiđất thì những Pi hữu cơ này sẽ được phóng thích một cách chậm chạp như là Pi vô cơhoặc được liên kết chặt chẽ vào những vật liệu hữu cơ ổn định hơn và trở thành mộtthành phần hữu cơ của đất Hoạt động của vi sinh vật có hiệu quả cao là tùy thuộc

vào nhiệt độ và độ ẩm của đất (Busman et al., 2009) Mặc dù vi sinh vật tham gia vào

quá trình oxi hóa khử của lân nhưng những cơ chế sinh hóa và di truyền học của quá

trình biến đổi đó hiện nay chưa được tìm hiểu một cách rõ ràng (Ohtake et al., 1996).

Tất cả các dạng đạm (nitrate, nitrite, ammonium,…), dạng đương đơn, đườngđôi, đường đa, và dạng phosphate hàa tan…theo nước thải làm ô nhiễm nguồn nướcsông, rạch bên ngoài,… điều này đã và đang làm ô nhiễm nguồn nước sông rạch tạichỗ

Các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tương tự như các cơ sở sản xuất tinh bộtkhác (bún,…) đã xả thải ra nước thải chứa nhiều độc chất như pH thấp, hàm lượng

TN, TSS và BOD5 cao Các cơ sở sản xuất này không có biện pháp hay công cụ, kỹthuật gì để xử lý nước thải và nước thải được xả thẳng ra sông, rạch; gây ô nhiễm

trực tiếp cho môi trường Hàm lượng TN, TP, BOD5,… trong nước thải cao hơn nướcthải cùng cơ sở sản xuất gấp nhiều lần và như thế cần xử lý nước thải trước khi đổ ramôi trường bên ngoài.

2.5 Vi khuẩn kết tụ sinh học

2.5.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant)

Kết tụ sinh học là quá trình do vi sinh vật tổng hợp ra hợp chất đa phân tử có

khả năng thu gom và làm lắng các vật chất lơ lửng trong dung dịch (Kwon et al., 1996; Shih et al., 2001) Kết tụ sinh học có tính chất hóa học thuộc một trong ba dạng protein, polysaccharide hoặc glycoprotein (Gao et al., 2006) Vi khuẩn có thể sử dụng

các chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp chất đa phân tử trong tế bào dưới

sự hoạt động của các loại enzyme khác nhau, các đa phân tử này có thể được bài tiết

ra ngoài và tồn tại trong môi trường hoặc trên bề mặt vỏ tế bào vi khuẩn Cho nên,hoạt động của vi khuẩn biến đổi những chất có trong môi trường thành các đa phân tử

phức tạp có thể sử dụng trong kết tụ (Deng et al., 2003), có nhiều dạng tổng hợp chất

kết tụ sinh học ở vi khuẩn có thể ở dạng polyme ngoại bào của các tế bào sống

(Salehizadeh et al., 2000) hoặc quá trình tích lũy chất kết tụ sinh học ngoại bào và sự gom tụ tế bào (Jie et al., 2006).

Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có nhiều dòng hoặc chủng vi khuẩn

khác nhau có thể tạo chất kết tụ sinh học khác nhau như: Bacillus licheniformis (Hiroaki and Kiyoshi, 1985) và Nocardia amarae YK1 (Takeda et al., 1992) có khả năng tạo chất kết tụ sinh học là protein; Alcaligens latus KT201 (Kurane et al., 1991)

và Bacillus subtilis IFO3335 (Yokoi et al., 1996) có khả năng tạo chất kết tụ sinh học

là polysaccharide; Arcuadendron sp TS-4 (Lee et al., 1995) và Arthrobacter sp (Wang et al., 1994) có khả năng tạo chất kết tụ sinh học là glycoprotein Chất kết tụ

sinh học là một chất có phân tử lớn dễ bị vi sinh vật phá hủy (biodegradable) được

tiết ra từ các vi sinh vật (Gong et al., 2008) Tính chất hóa lý của chất kết tụ sinh học được xác định bởi bản chất di truyền (genetic make-up) của sinh vật (Salehizadeh et

al., 2000) Nhiều vi sinh vật tổng hợp các chất kết tụ sinh học như Rhodococcus

erythropolis, Paecilomyces sp., Klebsiella pneumoniae, Citrobacter sp đã được tìm

thấy (Lian et al., 2008).

2.5.2 Kiểm tra khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của vi khuẩn bằng dung dịch kaolin

Kaolin là một khoáng sét có công thức là Al2Si2O5(OH)4 và công thức cấu tạo(Hình 2.4), được nghiền mịn cho vào nước tạo thành một dung dịch các chất lơ lửng.Dung dịch này dùng để đánh giá khả năng kết tụ của chất kết tụ sinh học được tổnghợp từ vi khuẩn, thông qua đa phân tử kết tụ sinh học sẽ hấp thụ các phân tử kaolintrong dung dịch và lắng xuống đáy làm trong dung dịch

Hình 2.4 Công thức cấu tạo kaolin

(Nguồn: Grim, 1962)

Độ trong của dung dịch được kiểm tra bằng cách xác định chỉ số OD ở bước

sóng 550nm sẽ đánh giá được khả năng kết tụ của chất kết tụ sinh học (Deng et al.,

2003) Đây là bước đầu trong việc đánh giá khả năng kết tụ nhằm chọn ra dòng vikhuẩn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học hiệu quả nhất

2.5.3 Cơ chế và đặc điểm của quá trình kết tụ sinh học (Mechanisms of Bioflocculation)

Việc nghiên cứu cơ chế của quá trình kết tụ có thể giúp chúng ta hiểu rõ vai tròcủa chất kết tụ sinh học trong xử lý nước và nước thải Khối lượng phân tử và cácnhóm chức trong phân tử chất kết tụ là nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ, chấtkết tụ sinh học là protein: nhóm amino và carboxyl là nhóm chức năng trong sự kết

tụ, nhưng khối lượng phân tử thường thấp Trong khi chất kết tụ sinh học làpolysaccharide thường có trọng lượng phân tử cao và có nhóm chức nhiều hơn

(Kurane et al., 1994).

Chất kết tụ sinh học MPFA9 được tạo ra từ dòng Bacillus mucilaginosus là một

polysaccharide có khối lượng phân tử là 2,6 x 106 (đvC) và chứa acid uronic (19,1%).Trong đó nhóm carboxyl nằm hướng ra ngoài và kéo các vật thể nhỏ xung quanh, do tácdụng của lực Van der Waals các nhóm OH-, COO- của chất kết tụ và nhóm H+, OH- trên

bề mặt vật thể hình thành liên kết hydro làm cho các vật thể bị hấp thụ về chất kết tụ

(Deng et al., 2003), nhiều cầu nối hóa học xảy ra khi vật thể được hấp thụ vào bên trong

chuỗi kết tụ sinh học và nhiều vật thể hấp thụ chuỗi này có thể hấp thụ cùng lúc vớinhiều chuỗi khác, tiếp tục kết thành khối và lắng xuống đáy

Wu et al (2007) Vi khuẩn Bacillus subtilis DYU1 tổng hợp chất kết tụ sinh học

DYU500 với khả năng kết tụ cao Ở nồng độ chất kết tụ sinh học DYU500 là 40mg/L, 50 mM CaCO3 và nhiệt độ 30oC thì khả năng kết tụ (13,5), tỷ lệ kết tụ (97%)đạt giá trị cao nhất Trong thành phần của DYU500 có acid poly-glutamic (PGA)chiếm số lượng lớn Trọng lượng phân tử trung bình của DYU500 khoảng (3,16 - 3,2)x106 Da Các thành phần chính của DYU500 là các đường tổng, acid uronic, protein

và polyamide (polyme đồng hình của acid glutamic) với hàm lượng (w/w) lần lượt là14,9%, 2,7%, 4,4% và 48,7% Hoạt tính kết tụ của DYU500 trong kaolin tăng rõ rệtkhi thêm các cation hóa trị hai như Ca2+ hoặc Mg2+ với khoảng nồng độ tối ưu lầnlượt là 0,15 - 0,9 mM (Ca2+) và 0,1 - 0,9 mM (Mg2+) Sự ảnh hưởng của các cationmạnh nhất ở pH acid yếu hoặc pH trung hòa (6,0 - 7,0) Hoạt tính kết tụ giảm

tuyến tính cùng với việc gia tăng nhiệt độ ủ và vô hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 120°C(do phá hủy cấu trúc polyamide của DYU500).

Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500 được đề xuất theo hai cơ chếnhư sau: (1) Theo Hình 2.5a cho thấy: Quá trình kết tụ có lẽ là do sự giảm điện tíchtrên bề mặt các hạt cao lanh trong huyền phù khi có sự hiện diện của các cation, vàdẫn đến điện tích có thể chuyển ngược từ âm sang dương Do đó, các nhóm carboxyl(COO-) tích điện âm của chất kết tụ sinh học DYU500 có thể phản ứng với các vị trítích điện dương của các hạt cao lanh trong huyền phù (2) Theo Hình 2.5b: Các cationkích thích quá trình kết tụ thông qua quá trình trung hòa điện tích và quá trình làm ổnđịnh điện tích dư của nhóm carboxyl của chất kết tụ sinh học DYU500 sau đó hìnhthành cầu nối tạo liên kết với các hạt cao lanh Tuy nhiên, có thể có các cầu nối cuốicùng xảy ra sau khi các hạt đã được hấp thụ vào các mạch của chất kết tụ sinh họcDYU500 Nhiều hạt cao lanh có thể hấp thụ thành một mạch phân tử dài và chúng cóthể hấp thụ đồng thời bởi các mạch khác của chất kết tụ sinh học

Hình 2.5 Cơ chế kết tụ sinh học của vi khuẩn sinh ra chất kết tụ

(Nguồn: Grim, 1992)

2.5.4 Một số nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

Có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn tổng hợp chất kết sinh học trên thếgiới điển hình các chủng vi khuẩn đã tìm thấy ở các công trình nghiên cứu dưới đây:

Chủng vi khuẩn Paecilomyces sp I-1 tổng hợp chất kết tụ PF-101 có trọng

lượng 300,000 dalton với công thức phân tử là (C8H16NO8)n PF-101 là mộtpolysaccharide gồm khoảng 85% galactosamine, 2,3% acetyl, 5,7% formyl (Takagi

et al., 1985); Vi khuẩn Rhodococcus erythropolis tổng hợp chất kết tụ sinh học

(NOC-1) trong thành phần có protein (Takeda et al., 1991); Hỗn hợp vi khuẩn R-3 gồm bốn chủng vi khuẩn Oerskovia sp., Acinetobacter sp., Agrobacterium sp và

Enterobacter sp được phân lập từ mẫu bùn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học

(Kurane et al., 1994).

Chủng vi khuẩn Bacillus As-101 tổng hợp chất kết tụ được phân lập từ bùn hoạt tính, chất kết tụ sinh học được tổng hợp bởi chủng vi khuẩn Bacillus As-101 có hoạt tính kết tụ bị giảm tuyến tính trong suốt quá trình gia nhiệt (Salehizadeh et al., 2000).

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum tổng hợp chất kết tụ sinh học REA-11

có thành phần gồm acid galacturic, có khả năng kết tụ khoảng 80% được phóng thích

trong dịch nuôi cấy, còn 20% ở trong các tế bào vi khuẩn (He et al., 2002).

Ba chủng vi khuẩn Bacillus subtilis WD90, Bacillus subtilis SM 29 và

Enterobacter agglomerans SM 38 tổng hợp polyme chịu nhiệt (lần lượt là 24,18 oC;14,63 oC và 10,84 oC) và có hoạt tính kết tụ cao lần lượt là 94,29%, 90,69% và87,84% Ba chủng này có khả năng làm mất màu từ màu nâu sẫm chuyển sang màu

polyacrylamide không ion hóa (Lu et al., 2005); chủng vi khuẩn Vagococcus sp W31

phân lập từ các mẫu nước thải của dòng sông Little Moon ở Bắc Kinh, Trung Quốc