Ứng dụng phương pháp in Situ hybridiza để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú

Ứng dụng phương pháp in Situ hybridiza để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus)

TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ TUYẾT ANH

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9 – 2005

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005

iii

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

TS Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những khó khăn, vướng mắc trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp

CN Phạm Văn Điền và CN Hứa Đức Quới đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này

TS Lý Thị Thanh Loan và ThS Đinh Thị Thủy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện

Các anh chị làm việc tại phòng Mô Học, phòng Sinh Học Phân Tử và phòng Chất Lượng Nước tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường

và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Cô Linh, chị Lan thuộc Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Phú Yên đã giúp tôi thu mẫu hoàn thành đề tài

Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

Thành phố HCM, tháng 9 năm 2005

Sinh viên Phạm Thị Tuyết Anh

iv

TÓM TẮT

PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng

9 – 2005 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ

CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)

Giáo viên hướng dẫn: TS NGUYỄN VĂN HẢO

Đề tài được thực hiện từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005, tại Viện Nghiên Cứu

Nuôi Trồng Thủy Sản II, trên hai đối tượng là TSV trên P vannamei (Postlarvae và thương phẩm) và WSSV trên P monodon (Postlarvae và thương phẩm) Hai loại virus

này có mức độ nguy hiểm và khả năng tạo dịch bệnh lớn ở tôm nuôi tại Việt Nam Do

đó, chúng tôi sử dụng phương pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai tại chỗ nhằm

mục tiêu phát hiện nhanh và chính xác các mẫu tôm nhiễm bệnh Taura và đốm trắng,

để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát hai loại dịch bệnh này Đề tài gồm các thí nghiệm sau:

1 Các thí nghiệm trên P vannamei

Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phương pháp ISH chẩn

đoán TSV trên P vannamei Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng phương pháp ISH được ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán TSV trên P vannamei

Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ưu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:

 Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu, thực hiện trên 5 nghiệm thức Kết quả nhiệt độ biến tính mẫu theo nghiệm thức thứ ba (probe được biến tính trước ở 950C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C; khi lai thì cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên mẫu và thực hiện biến tính mẫu ở 700C trong 6 phút, sau đó ủ mẫu qua đêm ở 420C) là tốt nhất trên postlarvae và tôm thương phẩm

 Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ưu với Proteinase K, thực hiện trên 5 nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút Kết quả thời gian cắt với Proteinase K tối ưu trên postlarvae là 15 phút và trên tôm thương phẩm là 17 phút

 Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực hiện trên 3 nghiệm thức: 100µl, 75µl và 50µl Kết quả thể tích dung dịch lai thích hợp nhất trên tôm postlarvae và tôm thương phẩm là 75µl

2 Các thí nghiệm trên P monodon

Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phương pháp ISH chẩn

đoán WSSV trên P monodon Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy

sử dụng

 Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm, kết quả lai thực hiện theo quy trình này không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn

 Thí nghiệm biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trước khi lai: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm và thu được kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn

 Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe và mẫu đồng thời trên lame: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm và thu được kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn

3 Thí nghiệm so sánh phương pháp ISH với mô học và PCR

Thí nghiệm được thực hiện trên P vannamei (postlarvae và tôm thương phẩm)

và P monodon (postlarvae và tôm thương phẩm) Kết quả thí nghiệm cho thấy phương

pháp ISH có độ ổn định, độ chính xác và nhạy hơn mô học và PCR

Từ các kết quả thực nghiệm như trên, chúng tôi đã đưa ra quy trình ISH có độ nhạy, độ ổn định, độ chính xác cao và thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng được việc kiểm tra các mầm bệnh do WSSV và TSV gây ra trên tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong các hệ thống nuôi tôm ở Việt Nam

vi

MỤC LỤC

Trang bìa i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt xi

Danh sách các hình và các sơ đồ xii

Danh sách các bảng xiv

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1

I.1 Đặt vấn đề 1

I.2 Mục tiêu đề tài 2

I.3 Yêu cầu của đề tài 2

I.4 Nội dung của đề tài 2

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3

II.1.1 Hiện trạng chung 3

II.1.2 Các hình thức nuôi 3

II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới 3

II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam 4

II.2.1 Hiện trạng chung 4

II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang được áp dụng 5

II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam 5

II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng 5

II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P monodon và tôm thẻ chân trắng P vannamei 5

II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng 6

vii

II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú 6

II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng 7

II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng 7

II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú 7

II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng 7

II.3.4 Dinh dưỡng 7

II.3.4.1 Dinh dưỡng của tôm sú 7

II.3.4.2 Dinh dưỡng của tôm thẻ chân trắng 8

II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển 8

II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS) 8 II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD 8

II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh 8

II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý 11

II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh 11

II.4.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh 12

II.4.1.5 Phòng bệnh 12

II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 12

II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh 12

II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 13

II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh 14

II.4.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh 14

II.4.2.5 Phòng và trị bệnh 14

II.5 PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION 14

II.5.1 Sơ lược về phương pháp In situ hybridization 14

II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử 15

II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử 16

II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA 16

II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA 16

II.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử 17

viii

II.5.5 Probe 17

II.5.5.1 Khái niệm 17

II.5.5.2 Các loại probe 18

II.5.5.3 Các phương pháp đánh dấu probe 18

II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai 19

II.5.6 Các phương pháp lai tại chỗ ISH 23

II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc 23

II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể 23

II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô 24

II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH 25

II.5.8 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản 25

II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura 25

II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản 26

II.5.9 Xu hướng phát triển của phương pháp này 26

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 27

III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 27

III.2 Vật liệu sinh học 27

III.3 Hóa chất thí nghiệm 27

III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ 27

III.3.2 Hóa chất cần thiết nhưng không có trong bộ kit chẩn đoán 28

III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 28

III.4.1 Thiết bị thí nghiệm 28

III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm 29

III.5 Phương pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit 29

III.5.1 Chuẩn bị hóa chất 29

III.5.2 Chuẩn bị mẫu 30

III.5.2.1 Cố định mẫu 30

ix

III.5.2.2 Cách xử lý mẫu 30

III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin 31

III.5.2.4 Cắt mẫu 31

III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit 31

III.5.3.1 Ngày thứ nhất 31

III.5.3.2 Ngày thứ hai 32

III.6 Phương pháp nghiên cứu 34

III.6.1 Phương pháp thu mẫu 34

III.6.2 Bố trí thí nghiệm 34

III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei 35

III.6.2.2 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus monodon 36

III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phương pháp ISH với mô học và PCR 39

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P vannamei 41

IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phương pháp ISH 41

IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phương pháp ISH trên P vannamei 43

IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai 43

IV.1.2.2 Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K 46

IV.1.2.3 Kết quả thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp 49

IV.2 Kết quả trên tôm sú P monodon 52

IV.2.1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phương pháp 52

IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ưu cho WSSV áp dụng trong phòng thí nghiệm 54

IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit 54

IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh 56

IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai 59

x

IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe

trước khi lai 61

IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa ISH với mô học và PCR 65

IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei 65

IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae 65

IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thương phẩm 66

IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon 68

IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae 69

IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm 70

IV.5 Nhận xét chung 73

IV.6 Những thuận lợi và khó khăn 74

IV.6.1 Thuận lợi 74

IV.6.2 Khó khăn 74

IV.7 Ưu nhược điểm của phương pháp In situ hybridization 75

IV.7.1 Ưu điểm 75

IV.7.2 Nhược điểm 75

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

V.1 Kết luận 76

V.1.1 Phương pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do TSV trên P vannamei 76

V.1.2 Phương pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên P monodon 76

V.2 Đề nghị 77

CHƯƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA : Deoxyribonucleic Acid

RNA : Ribonucleic Acid

WSD : White Spot Disease

WSSV : White Spot Syndrome Virus

TSV : Taura Syndrome Virus

UV : Ultra – Violet

ISH : In Situ hybridization

PCR : Polymerase Chain Reaction

ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

RT – PCR : Reverse – transcription polymerase chain reaction

PBS : Phosphate Buffered Saline

TBS : Tris Buffered Saline

SSC : Sodium Chlorua/Sodium Citrate

NTB/BCIP : Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate TCT : Thẻ chân trắng

TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ KHV : Kính hiển vi

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

OD : Optimal density

xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng 10

Hình 2.2: Tôm sú bị nhiễm bệnh đốm trắng 11

Hình 2.3: Tôm bị nhiễm virus Taura TSV 13

Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin 21

Hình 2.5: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu huỳnh quang 21

Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe được đánh dấu với DIG 22

Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc 23

Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc thể của nấm Thinopyrum ponticum 23

Hình 4.1: Đối chứng dương trên phụ bộ tôm lớn, X10 42

Hình 4.2: Đối chứng âm trên mang tôm lớn, X10 42

Hình 4.3: Mẫu lai được thực hiện theo nghiệm thức thứ III, quan sát trên phụ bộ X10 và X40 46

Hình 4.4: Hiện tượng dương tính giả trên phụ bộ tôm lớn, X10 51

Hình 4.5: Đối chứng âm trên gan tụy tôm lớn, X40 53

Hình 4.6: Đối chứng dương trên mang tôm lớn, X10 53

Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10 53

Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu mang tôm lớn, X40 53

Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh 58

Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40 63

Hình 4.11: Một số hình ảnh thu được khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phương pháp 68

Hình 4.12: Một số hình ảnh thu được khi chẩn đoán WSSV đồng thời bằng ba phương pháp 72

xiii

Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trước khi thực hiện chẩn đoán 30

Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bước thực hiện trong ngày thứ nhất 32

Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bước thực hiện trong ngày thứ hai 33

Sơ đồ 3.4: Quy trình xử lý mẫu nhanh 38

Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện 64

xiv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các thông số tối ưu cho tôm phát triển 8

Bảng 2.2: Các tên gọi khác nhau của virus gây bệnh đốm trắng 9

Bảng 3.1: Các thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ưu cho WSSV trong phòng thí nghiệm 38 Bảng 3.2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P vannamei 40

Bảng 3.3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P monodon 40

Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng ISH 41

Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm postlarvae 44

Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm thương phẩm 45

Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên postlarvae 47

Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên tôm thương phẩm 48

Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm postlarvae 50

Bảng 4.7: Kếtquả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm thương phẩm 50

Bảng 4.8: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và hóa chất của bộ kit 52

Bảng 4.9: Kếtquả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất 55

Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae 56

Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thương phẩm 57

Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trước khi lai trên postlarvae 59

Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm thương phẩm 60

Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm postlarvae 61

Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm thương phẩm 62

xv

Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae 65 Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thương phẩm 66 Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae 69 Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thương phẩm 70

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU I.1 Đặt vấn đề

Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lượng của các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt Do đó nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết Ở nước ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao của nghề này và do sự ưu đãi của thiên nhiên nên nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi ngày càng được mở rộng hiện có hơn 260.000 ha dùng để nuôi tôm với nhiều hình thức nuôi khác nhau Khoa học kỹ thuật

đã được áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất

Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật

độ cao Do đó nếu kỹ thuật nuôi chưa được đảm bảo, việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trường nước, phá

vỡ môi trường sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và gây ra nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho nền kinh tế Dịch bệnh vào cuối năm

1993 đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294

tỷ đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể

WSSV (White Spot Syndrome Virus) là virus gây bệnh đốm trắng, một trong những bệnh quan trọng xảy ra trên rất nhiều các đối tượng tôm nuôi Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi Còn TSV (Taura Syndrome Virus) là một trong những virus gây bệnh nghiêm trọng trên tôm thẻ chân trắng (TCT) là chủ yếu nhưng cũng có khả năng lây lan và gây bệnh cho các loài tôm khác Hiện nay, hai loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm trên thế giới và gây nhiều thiệt hại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu Do đó, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm giám sát hai mầm bệnh này từ lúc thả

giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử

lý thích hợp Việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong đó có phương

pháp In Situ hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ

rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao

Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và được sự đồng ý của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng

Thủy Sản II, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng phương pháp In Situ

hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh do WSSV (White Spot Syndrome

Virus) trên tôm sú Penaeus monodon và TSV (Taura Syndrome Virus) trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei”

I.2 Mục tiêu đề tài

Phát triển phương pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus monodon và mầm bệnh TSV trên thẻ chân trắng (TCT) Penaeus vannamei trong

điều kiện phòng thí nghiệm nhằm xây dựng được quy trình chẩn đoán ổn định, có

độ nhạy và độ chính xác cao

So sánh độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định và hiệu quả kinh tế của phương pháp ISH so với phương pháp mô học truyền thống và PCR

I.3 Yêu cầu của đề tài

Xem xét khả năng ứng dụng vào thực tế để chẩn đoán bệnh của phương pháp này

Đánh giá được hiệu quả của phương pháp chẩn đoán này so với phương pháp mô học và PCR

I.4 Nội dung của đề tài

Phát triển phương pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm sú

So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phương pháp này với các phương pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm

sú

Phát triển phương pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do TSV trên tôm TCT

So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phương pháp này với các phương pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh TSV trên tôm TCT

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới

II.1.1 Hiện trạng chung

Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên thế giới Vào những năm cuối của thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có những bước phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm được xây dựng ở gần 40 nước, đưa sản lượng tôm nuôi

từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với tổng sản lượng tôm (Latscha, 1989)

So với năm 1984, sản lượng tôm nuôi năm 1990 tăng 368% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992) Năm 1995, sản lượng tôm nuôi đạt 712.000 tấn, chiếm 27% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản trên thế giới Trong đó các nước Đông Bán Cầu chiếm 78% tổng sản lượng tôm nuôi, còn lại là các nước Tây Bán Cầu (Rosenberry, 1995)

Hiện nay có khoảng 25 loài tôm đang được nuôi, nhưng chỉ có 5 loài đạt sản lượng trên 10.000 tấn/năm và ba loài đạt sản lượng 100.000 tấn/năm (Bộ Thủy Sản,

1994) Trong đó loài tôm sú Penaeus monodon chiếm tới 53% tổng sản lượng tôm

nuôi ở khu vực Châu Á – Thái Bình Dương Vùng nuôi tôm sú tập trung chủ yếu ở Châu Á (Fast, 1992) điển hình ở các quốc gia như Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Việt Nam, Đài Loan

II.1.2 Các hình thức nuôi

Hiện nay trên thế giới có khá nhiều hình thức nuôi tôm: nuôi quảng canh; nuôi quảng canh cải tiến; nuôi bán thâm canh; thâm canh và nuôi kết hợp với cua, cá…(Liao, 1989) Việc lựa chọn hình thức nuôi phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước ao, vốn đầu tư, kinh nghiệm quản lý, cơ sở vật chất hiện có, thị trường tiêu thụ sản phẩm (Kungvankij và Kongkeo, 1988)

II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới

Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nước nhất là ở vùng Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm biển là điều không thể tránh khỏi, tùy theo mô hình nuôi, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh sẽ xuất hiện (Nguyễn Mạnh Hùng, 1994) Trung Quốc là nước có sản lượng tôm cao nhất thế

giới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do dịch bệnh thiệt hại 50% tổng sản lượng Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm sú nuôi, năm liền sau đó sản lượng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh Indonesia cũng đang bị thiệt hại nặng do môi trường xấu và do dịch bệnh Trong quý ba năm 1994, sản lượng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38% Thái Lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nước bị ô nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị chết gần 30.000 ha, mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD (Phan Lương Tâm, 1994)

Để đối phó với dịch bệnh nhiều nước có nghề nuôi tôm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Thái Lan… đã đầu tư nhiều kinh phí cho các công trình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng về lĩnh vực dịch bệnh tôm cá ở cấp quốc gia

và trong khu vực Thông qua các công trình được công bố ở trong và ngoài nước, cho thấy có khoảng 30 loại bệnh xảy ra trên tôm Tuy nhiên, các bệnh chưa được tìm hiểu một cách rõ ràng và cặn kẽ Ngoài các bệnh mà tác nhân là vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm, bệnh do môi trường…thì virus là tác nhân gây tổn thất nặng nề nhất cho nghề nuôi tôm (Phan Lương Tâm, 1995)

II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam

II.2.1 Hiện trạng chung

Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang, là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thuỷ sản nước mặn và nước lợ Nghề nuôi tôm ở nước ta

mà đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ mới phát triển mạnh mẽ vào cuối những năm 1980, dưới sự phát triển của các hình thức nuôi quảng canh cải tiến và bán thâm canh Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi còn hạn chế, độ rủi ro về dịch bệnh càng cao Năm 1997, mô hình nuôi tôm công nghiệp ở qui mô nông hộ 700 – 1.500 m2/ao (Ts Nguyễn Văn Hảo, 1997) được làm thí điểm tại Trà Vinh đạt năng suất trung bình 5 tấn/ha/vụ Năm 1998, mô hình nuôi tôm sú công nghiệp qui mô trại nhỏ 6.000 m2/ao tại Gò Công Đông (Ts Nguyễn Văn Hảo, 1998) đạt năng suất 7 tấn/ha/vụ Các mô hình nuôi tôm công nghiệp đạt kết quả cao, tạo tiền đề cho chương trình phát triển thâm canh hóa nghề nuôi tôm ở Việt Nam trong tương lai

II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang được áp dụng

Hiện nay, nước ta cũng áp dụng các hình thức nuôi tôm trên thế giới như nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến, nuôi bán thâm canh và thâm canh Ngoài ra nước ta cũng đã phát triển hình thức nuôi sinh thái: nuôi tôm – rừng, tôm – lúa…Trong đó, hình thức nuôi quảng canh được áp dụng phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là vùng ĐBSCL (Vũ Đỗ Quỳnh, 1992)

II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam

Tại Việt Nam, từ cuối năm 1993 dịch bệnh tôm đã được báo động trên toàn quốc, thiệt hại lớn nhất là ở các tỉnh ĐBSCL như Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, Minh Hải, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An…Ở các tỉnh này tôm nuôi đã bị bệnh và chết hàng loạt do môi trường nuôi bị nhiễm bẩn, thời tiết diễn biến phức tạp, nguồn giống chưa đảm bảo chất lượng (Phan Lương Tâm, 1994) Tính đến 30 – 9 – 1994, tổng diện tích nuôi tôm bị chết là 84.850 ha với thiệt hại ước tính 5.520 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Bùi Quang Tề, 1995) Năm 1995, sản lượng tôm nuôi của Việt Nam là 50.000 tấn giảm còn 30.000 tấn năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997)

Theo Ts Nguyễn Văn Hảo và ctv năm 1997, tác nhân chính gây bệnh ở tôm

nuôi vùng ĐBSCL ngoài nhóm Vibrios còn có sự xuất hiện của hai tác nhân Virus gây bệnh quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrome Virus) Tác nhân gây bệnh virus hiện nay được xem là một trong những tác nhân gây

bệnh nghiêm trọng nhất, việc chữa trị bệnh do virus không hiệu quả vì hiện nay chưa

có một loại thuốc hay hóa chất nào có thể chữa bệnh virus (Ts Nguyễn Văn Hảo, 2000)

Từ năm 1996 – 1997, bệnh đốm trắng đã xuất hiện khắp các vùng nuôi tôm biển

từ Hải Phòng đến các tỉnh miền Trung, các tỉnh ven biển Nam Bộ Bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm biển Việt Nam vì chúng lan truyền rất nhanh qua nguồn nước, đường tiêu hóa…với tỷ lệ chết 90 – 100% (Bùi Quang Tề, 1998)

II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng

II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P monodon và tôm thẻ chân trắng P vannamei

Đối với tôm sú

Ngành chân đốt: Arthropoda

Giống: Penaeus

Loài: Penaeus monodon Fabricius 1798 Tên tiếng Anh phổ biến là Giant Tiger Prawn, tên tiếng Pháp là Crevette geante Tigre, tên tiếng Australia là Jumbo Prawn…Ở Việt Nam P monodon được gọi là tôm

sú

Vị trí phân loại của TCT cũng giống như tôm sú nhưng chỉ khác là TCT thuộc

loài Penaeus vannamei Boone

Tên thường gọi là tôm bạc Thái Bình Dương, Camaron blanco, Whiteleg shrimp Tên của FAO là Camaron patiblanco Tên Việt Nam là tôm chân trắng, tôm he chân

trắng

(Theo hệ thống phân loại của Hoilthus, 1989)

II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng

II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú

Phân bố ngang: Tôm sú P monodon phân bố rộng rãi ở Ấn Độ Dương Ở Thái

Bình Dương, tôm sú phân bố về phía Bắc tới Nhật Bản, Đài Loan; phía Đông tới Tahiti; phía Nam tới Úc và vùng biển phía Đông Châu Phi Theo Motoh (1981), tôm

Phân bố thẳng: Giai đoạn ấu trùng và ấu niên P monodon sống nổi, dần dần

thích nghi sống đáy Ở vùng cửa sông, tôm ấu niên và thiếu niên sống ở tầng mặt, trong khi phần lớn tôm trưởng thành sống ở mực nước sâu khoảng 70 m Ở ngoài khơi

Philippine, vịnh Thái Lan là 30 – 39 m và nhiệt độ là 340C và độ mặn là 35‰ (Trần Minh Anh, 1989)

II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng

TCT hay còn gọi là tôm chân trắng Nam Mỹ, được phân bố tự nhiên từ các nước ven bờ Thái Bình Dương, Châu Mỹ - từ Mehico đến miền trung Peru, nhiều nhất

là vùng biển Ecuador

II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng

II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú

Trong thiên nhiên, tôm sú sinh sản trên biển Khi tới mùa sinh sản, tôm di cư ra vùng biển sâu có độ mặn cao để đẻ trứng Trứng nở ra ấu trùng trải qua ba giai đoạn: Nauplius, Zoea và Mysis Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các cửa sông, nơi có nước biển và nước sông pha trộn lẫn nhau nên độ mặn thấp hơn ngoài biển nên thích hợp cho sự phát triển của ấu trùng Người ta gọi đó là vùng nước lợ, có độ mặn từ 13 - 30‰ Tại môi trường nước lợ, ấu trùng larvae chuyển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae Sau đó hậu ấu trùng sẽ chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi

ra biển tiếp tục tăng trưởng, sinh sản và tiếp diễn chu kỳ sống (Vũ Thế Trụ, 1994)

II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng

Quá trình phát triển của tôm TCT trải qua sáu giai đoạn Nauplius kéo dài 1,5 ngày, ba giai đoạn Zoea kéo dài 5 ngày, ba giai đoạn Mysis kéo dài 5 ngày và cuối cùng là Postlarvae Sau giai đoạn postlarvae tôm chuyển sang giai đoạn ấu niên Juvenile và tiếp diễn chu kỳ sống (Thái Bá Hồ và Ngô Trọng Lư, 2003)

Tôm TCT rất linh hoạt và nhạy cảm với sự biến đổi của môi trường sống TCT

có thể thành thục trong ao nuôi, đây là ưu điểm của loài tôm này so với các loài tôm khác trong việc chủ động về nguồn tôm bố mẹ và giống thả nuôi

II.3.4 Dinh dưỡng

II.3.4.1 Dinh dưỡng của tôm sú

Tôm sú ở giai đoạn ấu trùng Zoea ăn thực vật phù du với hai giống tảo Silic

thích hợp là Chaetoceros và Skeletonema Giai đoạn Mysis chuyển sang ăn một số loài

động vật phù du, luân trùng và ấu trùng của Artemia Giai đoạn postlarvae tôm ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bả hữu cơ (Apud, 1984) Tôm sú là loài

ăn tạp, đặc biệt tôm sú trưởng thành thích ăn giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều

tơ, nhuyễn thể, cá, côn trùng (Hal, 1962)

II.3.4.2 Dinh dưỡng của tôm thẻ chân trắng

TCT là loài tôm ăn tạp Giống như các loài tôm he khác, thức ăn của nó cũng cần các thành phần protid, lipid, glucid, vitamin và muối khoáng…Giai đoạn Nauplus không cần cho ăn, chúng tự nuôi bằng noãn hoàng có sẵn Giai đoạn Zoea, tôm ăn thực vật phù du và đặc biệt là các loại tảo khuê Giai đoạn Mysis, tôm ăn thực vật phù du lẫn động vật phù du Khả năng chuyển hóa thức ăn của tôm rất cao, trong điều kiện nuôi lớn bình thường, lượng cho ăn chỉ cần 5% thể trọng tôm (Thái Bá Hồ, Ngô Trọng

Lư, 2003) Trong thời kỳ tôm sinh sản, lượng thức ăn hàng ngày tăng lên gấp 3 – 5 lần

II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển

Bảng 2.1: Các thông số tối ưu cho tôm phát triển

STT Các thông số tối ưu Penaeus monodon Penaeus vannamei

(Theo Chanratchakook P., 1995 và Brock J.A., Main K.L., 1994)

II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS)

II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD

II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh

(a) Phân loại

Trước năm 2002, có ba chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hay còn gọi là

virus Trung Quốc Tùy từng nước nghiên cứu mà chúng có tên gọi và kích thước khác nhau

Bảng 2.2: Các tên gọi khác nhau của virus gây bệnh đốm trắng

Virus Trung Quốc

(Theo Bùi Quang Tề, 2003)

Virus gây bệnh đốm trắng WSSV đầu tiên đƣợc phân loại thuộc họ

Baculovirdae (Francki và ctv, 1991) Tuy nhiên, trong những phân tích trình tự hệ gen

WSSV gần đây cho thấy chúng mã hóa một số loại protein không giống protein của

Baculovirus nhƣ protein ribonucleotide reductase (RR1 và RR2) (van Hulten và ctv,

2000) Protein capsid (VP26, VP28) (van Hulten và ctv, 2000) của WSSV không giống bất kì một protein nào trong database Ngoài ra, trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác (van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001) Sự khác biệt về genome và phổ kí chủ rộng của WSSV (Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại diện cho một họ virus mới (van Hulten và ctv, 2000)

Trong Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002), các tác giả Just M Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C Loh và Peter J Walker đã phân loại virus gây hội chứng đốm

trắng thành một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae

Hình 2.1: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng

A – Hình thái WSSV phóng to trên kính hiển vi điện tử, X100

B – Nuclecapside của WSSV trên kính hiển vi điện tử, X100

C – WSSV nhuộm âm trong huyết tương tôm sú bị đốm trắng

(c) Cấu trúc protein và vật chất di truyền

Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: bao màng (envelope), nucleocapside và vật chất di truyền Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 có trọng lượng phân tử tương ứng là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa

Hiện nay virus WSSV đã được giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001) Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thước thay đổi tùy theo các mẫu phân lập từ các vị trí địa lí khác nhau

(d) Phổ ký chủ

Phổ ký chủ rộng, chủ yếu là các loại tôm: P monodon, P vannamei, P indicus,

P japonicus,…các loại cua và các động vật thủy sinh khác (theo V.A Graindorge và

T.W Flegel, 1999)

(e) Cơ chế xâm nhiễm

Khi xâm nhập vào tôm virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như nội bì, mô

dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ

sở vật chất và nguyên liệu của tế bào Quá trình này làm cho số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào Virus tiếp tục

Hình 2.2: Tôm sú bị nhiễm

bệnh đốm trắng

phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết tế bào, sau đó virus được phóng thích

ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập, tấn công Nếu như virus không tìm được ký chủ mới thì nó chỉ có thể sống tự do trong nước khoảng 24 giờ

II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý

Tôm nhiễm bệnh có thể có màu hồng đến màu nâu

đỏ (Guang Hsiung và ctv, 1998) Bên trong vỏ giáp xác xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 0,5 – 2,0 mm Các đốm trắng này có thể do sự lắng đọng của muối canxi trên lớp biểu bì mặt trong của lớp vỏ kitin, các đốm trắng này xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp (carapace) và đốt bụng thứ V, VI Gan tụy trương to có màu trắng hoặc hơi vàng

Tôm có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ kém hoạt động, thường có khuynh hướng cặp mé

bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Y G Wang và ctv, 1998) Tôm bệnh có dấu hiệu trương nhân trong tế bào bị nhiễm (Chou và ctv, 1995) Bệnh đốm trắng xảy ra kèm theo sự tiêu thụ thức ăn giảm nhanh (Takahashi và ctv, 1994) Một vài trường hợp, tôm ở trạng thái hấp hối thường chuyển sang màu đỏ hoặc hồng, tỷ lệ chết có thể lên

đến 90 – 100% trong vòng 3 – 7 ngày nhiễm bệnh (Feng Yang và ctv, 2001)

II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh

Phân bố: Bệnh đốm trắng WSD (white spot disease) xuất hiện lần đầu tại Bắc Á

vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nước có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh Bệnh đốm trắng được thông báo đầu tiên ở Trung Quốc, trong các đầm nuôi tôm sú với tỷ lệ chết cao (Chen, 1989) Năm 1992 – 1993, bệnh đốm trắng xuất hiện ở Thái Lan (Flegel T.W, 1996) Năm 1993, Nhật Bản nhập tôm Trung Quốc về nuôi đã xuất hiện bệnh đốm trắng Năm 1994, đã có các báo cáo từ Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản và Thái Lan, tìm ra nguyên nhân gây bệnh đốm trắng

Trong những năm gần đây bệnh đốm trắng thường xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam, hầu hết ở các tỉnh khi tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng thì tôm chết hàng loạt và gây tổn thất lớn cho nghề nuôi tôm

Truyền bệnh: Bệnh đốm trắng lây truyền chủ yếu theo chiều ngang Virus lây từ

giáp xác khác nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm Bệnh đốm trắng không có khả năng lây lan theo đường thẳng đứng, vì các noãn bào (trứng) khi phát hiện chúng bị nhiễm virus đốm trắng thì chúng không chín được (Bùi Quang Tề, 2003) Nhưng trong quá trình đẻ trứng của tôm mẹ có thể thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng của chúng, do đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm

II.4.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh

Dựa trên dấu hiệu bệnh đặc trưng là xuất hiện các đốm trắng dưới vỏ và phân

lập vi khuẩn gây bệnh khi tôm bị đỏ thân

Chẩn đoán bằng phương pháp mô bệnh học, quan sát các nhân của tế bào biểu

bì dưới vỏ, tế bào biểu bì tuyến anten, tế bào cơ quan bạch huyết, cơ quan tạo máu, tổ chức liên kết của vỏ… Khi nhuộm Hematoxylin và Eosin, các nhân tế bào có một thể

vùi (inclusion body) lớn, bắt màu đỏ đồng đều

Chẩn đoán bằng phương pháp PCR, Enzyme miễn dịch

II.4.1.5 Phòng bệnh

Hiện nay chưa có biện pháp điều trị hữu hiệu bệnh đốm trắng trên tôm, do đó phòng bệnh là chủ yếu Để phòng được bệnh đốm trắng trên tôm, ta áp dụng các phương pháp phòng bệnh tổng quát sau:

 Lựa chọn Postlarvae khỏe mạnh không mang mầm bệnh (kiểm tra bằng mô học, PCR, sốc formalin)

 Chẩn đoán chính xác, kịp thời, kiểm soát dịch bệnh, đặc biệt là giai đoạn tôm mẫn cảm với virus đốm trắng

 Quản lý tốt ao nuôi để phòng bệnh

 Khi phát hiện bệnh tốt nhất là thu hoạch ngay

II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome)

II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây ra hội chứng này là Taura Syndrome Virus (TSV) hay

Picornavirus thuộc họ Picornaviridae (Bonami và ctv, 1997) Virus hình cầu có 20

mặt, đường kính 30 – 32 nm, hệ thống gen là RNA mạch đơn có chiều dài 10,2 kb, cấu

Hình 2.3: Tôm bị nhiễm virus Taura TSV Hình A – tôm nhiễm ở giai đoạn cấp tính Hình B – đuôi tôm nhiễm TSV cấp tính được phóng to Hình C – tôm nhiễm TSV ở giai đoạn mãn tính

Ký chủ chính: P vannamei, P setiferus, P stylirostris (theo V.A Graindorge

và T.W Flegel, 1999), các loài tôm nhiễm thực nghiệm như P aztecus, P duorarum

(Lightner, 1996; Overstreet và ctv, 1997)

II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh Taura có ba giai đoạn chính: cấp tính, chuyển tiếp và mãn tính được phân biệt rõ trên tôm bị nhiễm bệnh

Giai đoạn cấp tính: tôm yếu, lờ đờ, đuôi tôm phồng chuyển màu đỏ, mềm vỏ và ruột không có thức ăn

Giai đoạn chuyển tiếp: tôm yếu, có nhiều đốm đen trên cơ thể do biểu bì bị hoại

tử, tôm có hoặc không có dấu hiệu phồng đuôi hoặc chuyển sang màu đỏ

Ở hai giai đoạn này, virus ký sinh trong các tổ chức trung bì và ngoại bì Biểu mô biểu bì bị ảnh hưởng nặng ở giai đoạn cấp tính

Giai đoạn mãn tính: trên cơ thể có những đốm đen nhưng ít, virus ký sinh trong

tổ chức lympho

vannamei ở giai đoạn nhiễm cấp tính thường có tỷ lệ chết cao nhưng tôm P stylirostris

bị nhiễm bệnh nhưng có khả năng kháng lại virus gây bệnh Mô biểu bì hoặc dưới biểu

mô các tế bào nhiễm virus bị hoại tử, tế bào chất bắt màu hồng trong có chứa nhân kết đặc hoặc phân mảnh Đặc điểm quan trọng là tế bào chất của biểu bì chuyển màu hồng hoặc xanh nhạt

II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh

Phân bố: Bệnh do TSV lần đầu tiên phát hiện trên tôm P vannamei nuôi ở

Ecuador (6 – 1992) Ngay sau khi phát hiện, mầm bệnh này nhanh chóng lan rộng sang các nước nuôi tôm ở Tây Bán Cầu như Peru, Colombia, Honduras, Guatemala, El Salvador, Brazil, tây Mexico và các bang của Châu Mỹ như Hawaii, Florida, Texas và Nam Carolina (Lightner, 1996)

Hội chứng Taura thường xảy ra trên tôm P vannamei ở giai đoạn nuôi từ 14 –

40 ngày nuôi ở ao hoặc các bể ương Bệnh do TSV thường gặp ở tôm giống cỡ nhỏ từ 0,05 – 5,0 gram, ở tôm lớn hơn cũng có thể xuất hiện Nếu giai đoạn đầu bệnh chưa phát thì giai đoạn giống lớn hoặc thương phẩm bệnh có thể xảy ra Bệnh TSV có thể gây chết từ 40 – 90% tổng số tôm nuôi trong ao (Bùi Quang Tề, 2003)

Truyền bệnh: bệnh TSV có thể lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều thẳng

đứng

II.4.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh

Phương pháp truyền thống gồm các phương pháp sau: dấu hiệu lâm sàng, mô học và xét nghiệm sinh học

Phương pháp kháng thể đơn dòng trong xét nghiệm ELISA

Phương pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction)

II.4.2.5 Phòng và trị bệnh

Áp dụng phương pháp phòng bệnh tổng hợp tương tự như phương pháp phòng bệnh do virus đốm trắng

II.5 PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION

II.5.1 Sơ lược về phương pháp In situ hybridization

Phương pháp In Situ hybridization (ISH) được phát hiện đầu tiên vào năm

1969 do công của Gall và Pardue Đây là một trong những phương pháp lai phân tử nhằm phát hiện các trình tự acid nucleic đặc hiệu nằm ngay trong các tế bào hoặc trong

mô bằng cách lai mẫu tế bào với các mẫu dò (probe) là RNA hoặc cDNA đã được

đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ hay bằng phương pháp hóa học (John và ctv, Gall

và Pardue, 1969) Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn trung gian là tách chiết chúng ra khỏi tế bào hay mô Giống với phương pháp Northern và Southern blot, ISH cũng có thể xác định được sự hiện diện của RNA hoặc DNA đặc biệt nào đó, nhưng ISH khác với hai phương pháp kia là nhờ các probe đã được đánh dấu nên ta có thể xác định vị trí của RNA và DNA đang hiện diện ở một vị trí xác định trong tế bào

Từ khi ra đời ISH đã trở thành một công cụ quan trọng để phát hiện các mRNA Trong các tế bào có nhiều dạng mRNA biểu hiện ở mức độ cao nhưng số lượng mRNA có chức năng thì tồn tại với số lượng rất thấp (Hahn và ctv, 1982) Vì phương pháp ISH có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nên có thể phát hiện được mRNA với số lượng thấp trong một tế bào cũng như phát hiện được mRNA ở các mức độ khác nhau giữa các tế bào khác nhau

Các ứng dụng của kiểu lai này rất đa dạng đi từ kỹ thuật định vị gen trên nhiễm sắc thể, phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng đến việc nghiên cứu một mRNA chuyên biệt trong tế bào và mô

II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử

Lai phân tử là hiện tượng tái bắt cặp trở lại của hai mạch đơn khi nhiệt độ xung quanh giảm từ từ và điều kiện thí nghiệm thích hợp Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột, lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn với một cấu hình không gian vô trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch phân tử tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ và điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại tạo nên hiện tượng lai Lai phân tử có hai đặc điểm sau:

 Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung mặc dù chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu các trình tự khác

 Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA nên hình thành các phân tử DNA – DNA, DNA – RNA hay RNA – RNA

II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử

II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên ở một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy Tm thì hai mạch sẽ tách rời nhau, do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch Sự chuyển từ mạch đôi sang mạch đơn xảy ra đột ngột khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm do tính cộng hưởng của phản ứng

Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang OD ở bước sóng 260 nm Giá trị mật

độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành dạng mạch đơn, hiện tượng này gọi là “hiện tượng siêu sắc” Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song, cấu trúc đó che lắp một phần các base khiến chúng không hấp thụ ánh sáng Khác với DNA mạch đôi, ở DNA mạch đơn thì hai mạch DNA được tách rời nhau nên các base không bị che khuất nên chúng hấp thu được ánh sáng tối đa và tạo ra hiện tượng siêu sắc như trên

II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA

Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các liên kết hydro Sự tách rời hai mạch tương ứng với sự phá vỡ các liên kết ấy Do đó, số lượng các liên kết

và các yếu tố làm thay đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi nhiệt độ nóng chảy của DNA

Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA: trong phân tử DNA, A liên kết với T bằng hai liên kết hydro, G liên kết với C bằng ba liên kết hydro nên liên kết giữa C và G chặt hơn Do đó thành phần các base cấu tạo nên một DNA mạch đôi

có ảnh hưởng rất quan trọng đến sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là tỷ lệ các base C và G Trong điều kiện chuẩn, Tm thường được đánh giá bằng công thức sau:

Tm = 20C*(A + T) + 40C*(C + G), nếu các đoạn DNA <= 25 bp (Wallace, 1989) Hay Tm = 81,50C + 16,6*(log Na+) + 0,41*(%G + C) – (500/n) – 0,61*%FA, nếu các đoạn DNA > 25 bp, trong đó FA là formaldehyde (Meinkoth – Wahl,1989)

Ảnh hưởng của độ dài đoạn DNA: đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng các liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó nhiệt độ nóng chảy cũng càng cao

Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (mismatch): những điểm bắt cặp sai lệch (A liên kết với G hay C thay vì liên kết với T…) làm giảm tính ổn định của một phân tử lai, do đó sẽ làm giảm Tm

Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

o Ảnh hưởng của nồng độ muối: nồng độ muối của môi trường giảm hay lực ion của môi trường giảm sẽ làm cho nhiệt độ nóng chảy của DNA giảm đi rất mạnh Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng mất tính ổn định chuỗi xoắn kép DNA

o Ảnh hưởng của formamide: Formamide được sử dụng trong các phương pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai Nồng độ formamide thường dùng là 50% tương ứng với việc hạ Tm xuống 30% (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

II.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử

Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Để sự tái bắt cặp xảy ra giữa hai mạch

đơn, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau Như vậy, tần số gặp gỡ giữa hai trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp Ở một nhiệt độ xác định, hai chỉ tiêu ảnh hưởng đến tần số gặp gỡ là nồng độ DNA và thời gian phản ứng Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng; kết quả là tốc độ phản ứng lai càng tăng lên Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất nói trên càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp

Hai thông số nói trên thường được xem xét đồng thời Tích số giữa nồng độ và thời gian được gọi là Cot (C: concentration - nồng độ, t: time - thời gian) Cot1/2 là giá trị tại đó có 50% số phân tử lai

Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ Thông thường tốc độ

phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính acid nucleic đó khoảng 25%

Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 – 10 lần Nồng

độ NaCl vượt quá 1,2 M lại hoàn toàn không có tác dụng

II.5.5 Probe

II.5.5.1 Khái niệm

Để phát hiện một trình tự xác định, ban đầu ta chỉ cần một bản sao trung thực của trình tự ấy Bản sao này được đánh dấu để nhận biết khi có hiện tượng lai xảy ra

và bản sao này được gọi là probe (mẫu dò) Qua sự lai giữa probe và trình tự bổ sung,

ta có thể phát hiện và định vị được trình tự ấy trong bất kỳ hỗn hợp acid nucleic nào

II.5.5.2 Các loại probe

Probe là một đoạn Oligonucleotide: Loại probe này được tổng hợp bằng

phương pháp hóa học, rất thuận lợi cho sử dụng vì nó có kích thước nhỏ 40 – 50 cặp base và kháng lại RNase Ngoài ra, vì đây là một probe được tổng hợp nhân tạo nên ta

có thể tạo ra các probe theo mong muốn Hơn nữa, oligonucleotide có dạng mạch đơn nên ta không cần giai đoạn biến tính trước khi lai Hiện nay, loại probe này được sử dụng rất nhiều trong phương pháp ISH

Probe là DNA mạch đơn: Probe loại này có khoảng 200 – 500 cặp base Các

probe DNA mạch đơn có thể tạo ra bằng kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật sao chép ngược của RNA Nhược điểm của loại probe này là cần nhiều thời gian để chuẩn bị, hóa chất đắc tiền và đòi hỏi phải có kiến thức sâu về sinh học phân tử

Probe là DNA mạch đôi: Các probe DNA mạch đôi có thể được tạo ra nhờ kỹ

thuật PCR hoặc tạo ra trong vi khuẩn Vì đây là DNA mạch đôi nên ta phải biến tính probe này trước khi lai Loại probe này có độ nhạy kém vì các mạch đơn của probe sau khi biến tính, hai mạch đơn luôn có khuynh hướng tái bắt cặp trở lại và hiện nay người

ta ít sử dụng loại probe này

Probe là đoạn RNA (còn gọi là probe cRNA hoặc riboprobe): Loại probe

này dùng trong việc phát hiện trình tự RNA Probe là một mạch đơn bổ sung với RNA được tổng hợp từ RNA bằng cách nhân dòng vô tính ngược (reverse cloning) (Polak

và ctv, 1990) Liên kết giữa RNA-RNA thì rất bền và có thể kháng lại với RNase nên thuận tiện cho ta loại bỏ các tín hiệu lai không phải là RNA và các chất nền không cần thiết khác sau khi lai, tuy nhiên giai đoạn xử lý trước khi lai thì rất khó thực hiện (Power và Versatility)

II.5.5.3 Các phương pháp đánh dấu probe

Đánh dấu bằng Nick – translation: Phương pháp này được thực hiện như sau:

DNAse I cắt các phân tử DNA ở những vị trí khác nhau tạo ra các “lỗ thủng” (Nick) phân bố một cách ngẫu nhiên trên cả hai mạch Từ những lỗ thủng này DNA polymerase I một mặt gặm dần mạch bị cắt theo chiều 5’ – 3’ (nhờ hoạt tính exonuclease 5’ – 3’), mặt khác lại tổng hợp bù đoạn bị thiếu (nhờ hoạt tính polymerase) Do trong phản ứng có hiện diện của một loại nucleotide đã được đánh dấu, nên đoạn tổng hợp mới sẽ mang nhiều nucleotides đánh dấu Kết quả cuối cùng là DNA sẽ được đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử

Đánh dấu bằng Random priming: Đầu tiên mẫu dò được biến tính bằng nhiệt

rồi làm lạnh đột ngột Người ta thêm vào phản ứng một hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp (thường 6 nucleotide) Các hexanucleotide này tương ứng với tất cả các trình

tự tổ hợp có thể có trên lý thuyết Như vậy chắc chắn một vài hexanucleotide trong số

đó sẽ bắt cặp với hai mạch đơn của mẫu dò Lúc đó chúng trở thành primer cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch bổ sung Vì một trong bốn loại nucleotide thêm vào phản ứng được đánh dấu nên mạch mới tổng hợp được cũng sẽ được đánh dấu DNA polymerase thường được sử dụng là đoạn Klenow của DNA polymerase I hoặc T7 polymerase

Đánh dấu probe là RNA: Trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải

được dưa vào một vector có mang các promoter dạng SP6, T3, T7 Vector này được cắt ra thành dạng mạch thẳng, sau đó RNA polymerase thích hợp được thêm vào phản ứng cùng với các nucleotide được đánh dấu RNA polymerase sẽ phiên mã trình tự DNA bắt đầu từ promoter tạo ra một lượng lớn RNA được đánh dấu Sau phản ứng vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I phân hủy, các enzyme được loại bỏ qua tách chiết bằng phenol và RNA được tinh sạch trên sắc ký lọc gel

Ngoài các phương pháp đánh dấu chủ yếu trên, người ta còn dùng các phương pháp như gắn đuôi vào đầu 3’ (3’ tailing), đánh dấu ở đầu 3’ (3’ end labeling) và phương pháp PCR để đánh dấu các probe trước khi thực hiện thí nghiệm

II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai

A Probe được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ

Các chất đồng vị phóng xạ thường dùng để đánh dấu mẫu dò là 32

P, 35S và 3

H Trong đó 32P được sử dụng nhiều nhất và nó phát tia ß có năng lượng rất cao nên tín hiệu nhận được rõ Nhưng bên cạnh đó thì 32P có hai nhược điểm lớn là:

- Chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh Mẫu dò được đánh dấu bằng 32P không sử dụng được nhiều lần trong một thời gian dài dẫn đến chi phí cao

- Do năng lượng rất cao của tia xạ nên tín hiệu nhận được không tinh mà khuếch tán trên một vùng rộng

35S phát tia có năng lượng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 – 3 tháng) nên giúp giải quyết được nhược điểm trên của 32P nhưng năng lượng do 35S phát ra thấp nên ít được sử dụng để đánh dấu mẫu dò

Đối với một số phương pháp đặc biệt như lai tại chỗ cần độ phân giải cao thì người ta sử dụng 3H để đánh dấu mẫu dò, mặc dù năng lượng do tia phát ra rất yếu nhưng bù lại tín hiệu phát ra rất tinh

Nhìn chung, ưu điểm của các đồng vị phóng xạ là có độ nhạy cao, cho tín hiệu mạnh với thời gian phát sáng ngắn Nhưng chúng có nhược điểm là có hại cho sức khỏe của con người Đặc biệt là 32P phát tia có độ xuyên sâu nên đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn tốn kém trong thao tác và xử lý chất thải Ngoài ra, các mẫu dò cũng không thể dùng được trong một thời gian dài do chu kỳ bán rã của các đồng vị phóng

xạ

Các probe được đánh dấu theo phương pháp này thì các phân tử lai được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography)

B Probe được đánh dấu bằng các chất hóa học khác

Việc sử dụng các chất hóa học khác để đánh dấu mẫu dò giúp khắc phục được các nhược điểm của việc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ Tuy nhiên, ở đây lại vấp phải vấn đề về độ nhạy thấp hơn các phương pháp trước Hiện nay, chúng ta có các hệ thống đánh dấu hóa học thông dụng nhất là:

Hệ thống sử dụng avidin (hay streptavidin) – biotin: đây là một cặp ligand có hằng số ái lực cao nhất tìm thấy trong sinh học Đầu tiên, mẫu dò được đánh dấu bằng biotin theo hai cách: biotin được gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học hoặc DNA được tổng hợp từ những nucleotide có gắn biotin Sau quá trình lai, biotin hiện diện trong

Hình 2.5: Cơ chế phát hiện probe

đánh dấu huỳnh quang

Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin Hình a: Streptavidin có gắn với chất phát huỳnh quang, hình b: phát hiện biotin kết hợp với khuếch đại tín hiệu (Tyramide signal amplification)

phân tử lai được phát hiện khi cho ligand của nó là avidin (hay streptavidin) vào phản ứng Avidin (hay streptavidin) trước đó có gắn với một nhóm phát huỳnh quang hay một enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu Kết quả là những tín hiệu phát sáng hay tín hiệu màu nhận được trên màng lai

Hệ thống huỳnh quang: các probe được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang

sẽ phát sáng khi quan sát dưới tia UV (ultra violet) Cách đánh dấu này rất hữu ích khi kiểm tra các mẫu vi khuẩn hoặc mẫu tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi Thuận lợi của

hệ thống đánh dấu này là cùng một lúc ta có thể lai với nhiều probe được đánh dấu với

các chất phát huỳnh quang khác nhau và các phân tử lai được phát hiện cùng một lúc

Hệ thống dùng kháng thể: người ta dùng một nhóm kháng nguyên gắn vào probe và phát hiện sự hiện diện của probe này bằng các kháng thể đặc hiệu Các kháng thể này phải được đánh dấu bằng các tác nhân đánh dấu như trên để nhận biết Hệ thống này được dùng rộng rãi hiện nay nhất

là hệ thống đánh dấu bằng Digoxigenin – AntiDigoxigenin/Alkaline phosphatase (DIG

Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe được đánh dấu với DIG

Hình a: dùng một kháng thể; hình b dùng hai kháng thể trong đó Anti –

DIG là kháng nguyên của kháng thể thứ cấp

– AntiDIG/AP) Nếu probe được đánh dấu bằng DIG – AntiDIG/AP thì các phân tử lai được phát hiện bằng phản ứng tạo màu sau phản ứng Người ta dùng cơ chất NTB/BCIP (Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate) tạo phản ứng với enzyme alkalin phosphatase có gắn trên AntiDIG, sau phản ứng tạo kết tủa màu xanh khi nhìn dưới kính hiển vi quang học Trong một số quy trình, AntiDIG không được gắn với enzyme nên muốn phát hiện tín hiệu sau khi lai ta phải nhờ vào cộng hợp enzyme với kháng thể thứ cấp kháng lại AntiDIG

Hệ thống sử dụng Enzyme: Trước hết mẫu dò được đánh dấu bằng alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase (DNA và các enzyme này hình thành một phức hợp bền vững) Sau quá trình lai, người ta cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất của hai enzyme và cơ chất đó có khả năng phát sáng khi bị biến đổi Ánh sáng phát ra

sẽ in dấu ấn lên một phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim

Hệ thống dùng chất phát quang bằng phản ứng hóa học: người ta dùng các chất hóa học có khả năng phát sáng để đánh dấu vào probe và phát hiện chúng bằng cách

đo ánh sáng phát ra bằng một máy đo đặc hiệu

Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc

thể của nấm Thinopyrum ponticum

Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc

II.5.6 Các phương pháp lai tại chỗ ISH

II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc

Phương pháp này được sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái

tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen

Ngân hàng gen (tức tập hợp các dòng vi khuẩn tái tổ hợp) được trải trên mặt thạch của đĩa petri Sau khi các khuẩn lạc đạt kích thước xác định, người ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai lên mặt các khuẩn lạc Trước khi thực hiện thao tác này, cả đĩa thạch và màng lai đều phải được đánh dấu trước để làm căn cứ đọc kết quả sau này Khi áp màng lai lên mặt các khuẩn lạc, mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai Màng lai sau đó được xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA Việc cố định DNA trên màng lai và thao tác lai diễn tiến theo các bước tương tự như các phương pháp lai trên pha rắn như Southern Blot và Northern Blot Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên đĩa petri ban đầu Dòng vi khuẩn này sau đó được thu nhận và thực hiện các phân tích khác

II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể

Phương pháp lai này cung cấp những thông tin

chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình tự

DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò

(probe) chuyên biệt

Các nhiễm sắc thể thường có nguồn gốc từ các bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ được xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame Sau công đoạn loại bỏ RNA bằng RNase và loại bỏ protein bằng Proteinase K, nhiễm sắc thể cố định trên lame được đem lai với probe có đánh dấu phóng xạ Trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện phân tử lai, người ta phủ lên lame một huyền dịch nhạy cảm với tia xạ Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lame được đem quan sát dưới kính hiển vi Kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai

II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô

Trong tế bào và mô, các DNA và RNA đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô Nghiên cứu trên DNA và RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể Trong trường hợp đó người ta thường hay sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô

Mô được xử lý bằng các phương pháp mô học (cố định, khử nước, tẩm paraffin, cắt thành từng lát mỏng, đính trên lame) và dùng để thực hiện lai Thao tác xử lý mẫu lai và phát hiện phân tử lai tương tự như lai trên nhiễm sắc thể Kết quả được đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi quang học

Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp sau:

Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ Ở đây người ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của một DNA hay mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức Các thông tin này sẽ góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó

Các phương pháp miễn dịch tế bào cho phép phát hiện một protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trưng của nó Khi phối hợp phương pháp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, người ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó Từ đó xác định được mối tương quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen

Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống

Hiện nay kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn Điều này đã tạo những bước nhảy vọt lớn cho các phương pháp lai tại chỗ, đặc biệt là cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò được đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau

II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH

Phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng

Định vị một gen xác định trên nhiễm sắc thể

Nghiên cứu sản phẩm phiên mã và dịch mã của một gen xác định trong mô hay

tế bào, từ đó giúp người ta chẩn đoán được các bệnh nguy hiểm trên người như bệnh ung thư, bệnh viêm gan…Đây là một hướng ứng dụng rộng rãi nhất của phương pháp ISH

II.5.8 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản

II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura

Mở đầu là công trình nghiên cứu về loại mô đích của virus gây bệnh đốm trắng

do Lo và ctv thực hiện Họ đã gây nhiễm nhân tạo virus gây bệnh đốm trắng WSBV (White spot baculovirus) trên tôm sú và đạt tỷ lệ nhiễm 100% Sau 40 giờ nhiễm, họ

phát hiện virus gây bệnh bằng phương pháp In Situ hybridization và xác định được

mang và gan tụy là cơ quan đích của virus này Các kết luận sau đó cho rằng mô đích của virus đốm trắng chính là các mô có nguốn gốc trung bì (Lo và ctv, 1996)

Một nghiên cứu khác của nhóm là sử dụng kỹ thuật PCR, Dot Blot và Southern Blot để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng cũng thu được nhiều kết quả tốt (Lo và ctv, 1996)

Arun K Dhar, Michelle M Roux và Kurt R Klimpel (2001) đã sử dụng kỹ thuật Real – Time Quantitative PCR và SYBR Green Chemistry để phát hiện và định

lượng WSSV nhiễm trên Penaeus sp Qua kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học