Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược

Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

* * * * * * *

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus monodon)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH

Thành phố Hồ Chí MinhTháng 8/2005

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

* * * * *

THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus monodon)

Thành phố Hồ Chí MinhTháng 8/2005

Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành Tôixin chân thành cảm tạ:

 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường

 TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp

 Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc ViệnNghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa

 Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

iii

NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Tháng 8/2005

“THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONGPHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG

(WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)”.

Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005

Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừaDịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2)

Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV)

gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon) Thí nghiệm được bố trí bằng cách trộn

chung dịch chiết virus WSSV với các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ở các nồng độkhác nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợp chất đối với virus WSSV Sau khisàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu quả tác dụng của các hợp chất này lên virusWSSV bằng cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất vào cơ thể tôm thínghiệm Đánh giá tác dụng của các hợp chất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệsống của tôm thí nghiệm

Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợp chất ký hiệu D2, B, M:

Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml):Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virushoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus

Hợp chất B và D2 có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml),

5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml)

iv

CHƯƠNG TRANG Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt vi

Mục lục v

Danh sách các hình viii

Danh sách các bảng và sơ đồ ix

PHẤN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới 3

2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam 4

2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú 6

2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú 7

2.4.1 Tác nhân gây bệnh 7

2.4.2 Khu vực phân bố 7

2.4.3 Ký chủ 8

2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền 8

2.4.5 Cơ chế xâm nhập 9

2.4.6 Bệnh lý 9

2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay 10

2.5.1 Một số phương pháp phổ biến 10

2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR 10

2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật 11

2.6.1 Alkaloid 11

v

2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật

trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản 12

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Vật liệu sinh học 15

3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 15

3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm 15

3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus 16

3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm 16

3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16

3.3.4 Phương pháp PCR 16

3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính 16

3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17

3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường 17

3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18

3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng 18

3.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm 19

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng 20

4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D2 20

4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B 21

4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M 23

vi

và hợp chất D2, B ở các nồng độ khác nhau 23

4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D2 27

4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B 29

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

vii

HÌNH TRANG

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp

dịch chiết virus được ủ với hợp chất D2 trong thời gian 2 giờ 20Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp

dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ 21Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp

dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ 22

H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 trước thí nghiệm 28

H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 sau thí nghiệm 28

H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B trước thí nghiệm 30

H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B sau thí nghiệm 30

viii

BẢNG TRANG

Bảng 2.1 Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng 3Bảng 2.2 Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng bằng các phương pháp khác nhau 10Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 24Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình

thí nghiệm 25Bảng 4.3 Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26

SƠ ĐỒ TRANG

Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo

dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 18

Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các

nồng độ khác nhau 19

ix

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật,đặc biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao Vì thế, sản lượng thủy sảnkhông thể đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày cànggiảm do khai thác quá mức Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồngthủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và làmột nhu cầu cần thiết

Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gầnđây, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển Nghề nuôi tôm nước ta phát triểnchủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế Điều đó dẫn đến

sự suy thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh Khoảng 20năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm.Một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đó là bệnh đốm trắng ( WhiteSpot Desease ) do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) Thiệt hại có thể lên đến

100 % quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh Có nhiều phương phápphòng trị bệnh đốm trắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còntồn tại nhiều mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao

Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rấtphong phú Thảo dược từ xưa đã được ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu quả trong yhọc và thú y Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi Thửnghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị bệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản

là hướng nghiên cứu mới và cần khai thác Được sự đồng ý của Trung tâm Quốc giaQuan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ(MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) và Bộ môn Công nghệSinh học Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô hướngdẫn, chúng tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm một số hợp chất chiết xuất

từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng

(WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)”

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới.

Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kểtrong thị phần xuất khẩu của một số nước trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Ánhư Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam Trong các đốitượng nuôi thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất Theocông bố của Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO), sản lượng tôm thế giới trong 2 thập

kỷ qua (1980 - 1998) tăng 175 % Theo báo cáo của hội nghị nuôi tôm toàn cầu(2003), sản lượng tôm nuôi trên thế giới từ 1999 như sau: 1.084000 tấn (1999),1.143000 tấn (2000), 1.291000 tấn (2001), 1.445000 tấn (2002), và 1.840000 tấn(2003) Mức tăng bình quân khoảng 10,5 % mỗi năm Các loài tôm được nuôi nhiều

nhất là tôm sú (P monodon), tôm nương (P chinensis) và tôm he chân trắng (P.

vannamei) Riêng 3 loài tôm này chiếm 86 % sản lượng tôm nuôi của thế giới Nếu

tính về sản lượng thì tôm sú chỉ xếp thứ 20 trong các loài thủy sản nuôi nhưng tính vềgiá trị thì chúng đứng đầu với 4,046 tỷ USD trong năm 2000

Năm 2000, xuất khẩu tôm thế giới đạt hơn 10,9 tỷ USD Với hiệu quả kinh tế

và xã hội to lớn, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút các nhà đầu tư

Sự phát triển mạnh mẽ, có thể nói là bùng nổ nghề nuôi tôm trên thế giới ngoài nhữngmặt lợi còn có mặt trái của nó Trong suốt 2 thập kỷ qua, nghề nuôi tôm trên thế giới

đã có rất nhiều thay đổi và trải qua nhiều khó khăn Dịch bệnh đã liên tiếp xuất hiện ởnhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Á, trong đó bệnh dovirus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền công nghiệp nuôi tôm Ước tính tổng thiệt hại

do virus gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD Bệnh do virusgây hội chứng đốm trắng trên tôm sú đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn chonghề nuôi tôm công nghiệp của các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và Ấn Độ.Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên vào năm 1992 – 1993 ở Bắc Á, sau đó là các khuvực khác trên thế giới Tên một số quốc gia và năm phát hiện bệnh đốm trắng đượctrình bày ở Bảng 2.1:

Bảng 2.1: Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng

Tên quốc gia Đài Loan Trung Quốc Ấn Độ Thái Lan Nhật Indonesia Úc Việt Nam

Tỷ lệ gây chết do virus có thể lên đến 100 % trong vòng 3 - 10 ngày kể từ khi

có dấu hiệu đầu tiên

2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam.

Hoạt động nuôi tôm biển ngày càng đóng vai trò quan trọng ở nước ta Tômnước lợ là đối tượng nuôi chủ lực ở các tỉnh ven biển Diện tích nuôi tôm nước lợ đạt546.757 ha (2003), trong đó diện tích nuôi thâm canh là trên 15.534 ha (chiếm khoảng2,84 % tổng diện tích nuôi tôm), nuôi bán thâm canh trên 20.116 ha (chiếm 3,67 %),còn lại là nuôi quảng canh cải tiến và quảng canh Năm 2003, diện tích nuôi tôm bịnhiễm bệnh là 32.423 ha, chiếm 3,2 % gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm Cáctỉnh duyên hải Nam Bộ có tổng diện tích nuôi lớn nhất, chiếm 87,17 % của cả nướcvới 476.528 ha Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt hơn 200.000 tấn

Trong cơ cấu mặt hàng xuất khẩu của Việt Nam trong năm 2003, tôm sú vẫn làmặt hàng chủ lực Khối lượng đạt trên 123.600 tấn, chiếm khoảng 25 %, nhưng về giátrị chiếm khoảng 50 %, đạt hơn 1 tỷ USD

Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 đã báo động trêntoàn quốc dịch bệnh tôm đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng Trong năm 1994, tổngdiện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225tấn, trị giá khoảng 294 tỷ đồng Đến nay dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càngrộng gây tổn thất nghiêm trọng Đồng Bằng Sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nhất donơi đây tập trung khoảng 87 % diện tích nuôi tôm của cả nước

Hiện tượng tôm chết hàng loạt ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 –

1994 đã xác định tôm sú có ba loại bệnh MBV, bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng (BùiQuang Tề, 1996, 1997; Nguyễn Việt Thắng và CTV, 1998)

Trong những năm gần đây, bệnh đốm trắng thường xuyên xuất hiện trong cáckhu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam Hầu hết các tỉnh khi tôm bị nhiễm bệnh đốmtrắng đã làm tôm chết hàng loạt gây tổn thất nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm Mùaxuất hiện bệnh là mùa xuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ nhiệt độtrong ngày biến thiên quá lớn (> 5oC) gây sốc cho tôm Bệnh đốm trắng thườnggây chết tôm sú, tôm rảo, tôm nương và cua, ghẹ

Một số tác giả đã điều tra nghiên cứu diễn biến bệnh đốm trắng ở tôm Kết quả

cụ thể như sau:

Ở Việt Nam vào khoảng tháng 2/1994 tại huyện Bình Đại, Thạnh Phú (BếnTre) và tháng 3 – 4/1994 tại các đầm nuôi của công ty FIDECO, huyện Cần Giờ, TP

Hồ Chí Minh đã phát hiện tôm sú bị đốm trắng đã gây chết hàng loạt tôm nuôi sau 30– 40 ngày thả nuôi (Lý Thị Thanh Loan, 2003)

Theo Nguyễn Việt Thắng và cộng tác viên (1996), Tác nhân gây bệnh chínhtrên tôm sú nuôi thực nghiệm từ 25/10/94 – 25/2/95 trên 9 tỉnh Nam bộ là virus Vikhuẩn được xem là tác nhân cơ hội gây tác động cộng hưởng Kết quả nghiên cứubước đầu qua phân tích mô học cho thấy có đến ít nhất 2 - 3 nhóm virus khác nhau gâybệnh cho tôm nuôi ở miền Nam Việt Nam

Năm 2001, Bùi Quang Tề và cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định,Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3 %) mang mầm bệnh đốmtrắng ở tôm nuôi và tôm cua tự nhiên và có 169 hộ (34,99 %) bệnh đốm trắng đã gâytôm chết Tôm sú nuôi sau 1 - 2 tháng bệnh đốm trắng xuất hiện và gây tôm chết hàngloạt

Tôm sú bố mẹ khi đánh bắt ở biển khơi hoặc trong các đầm phá có hiện tượng

bị bệnh đỏ mang sau khi đánh bắt 3 - 4 ngày, tỷ lệ chết tới 80 - 100 %, thời gian tôm bịbệnh và chết nhiều vào tháng 3 – 4 (sau tết) Kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử thấy cóxuất hiện các thể virus hình que và test PCR dương tính với bệnh đốm trắng

Năm 2003, phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm sú và

tôm chân trắng (Lipopenaeus vannamei) nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng

Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá và Hà Tĩnh ) và tôm post đưa từ Quảng Nam

và Đà Nẵng chuyển ra Bắc Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm postđưa từ miền Trung (Đà Nẵng, Quảng Nam) là 23,08 %; tôm sú nuôi thương phẩm ởcác tỉnh phía Bắc là 26,92 %; tôm chân trắng là 13,33 %

Phân tích tỷ lệ lưu hành bệnh WSSV theo tháng trên tôm sú nuôi thương phẩmthì thấy tháng 7, 8, 9 có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (0,25 – 0,4); tháng 6 tỷ lệ thấp hơn(0,12) và tháng 5 chưa phát hiện thấy tôm nhiễm bệnh

Các bệnh trên tôm xảy ra chủ yếu là do virus gây hội chứng đốm trắng

(WSSV), ngoài ra còn xuất hiện bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh

trùng, do dinh dưỡng và gần đây còn xuất hiện bệnh phân trắng, teo gan tụy ở một vàinơi

Các bệnh thường gặp trên tôm nuôi thường được phân chia thành hai loại bệnhtruyền nhiễm và không truyền nhiễm trong đó chủ yếu là do bệnh truyền nhiễm.

Từ tình hình dịch bệnh chung ở trên cho thấy để phát triển bền vững nghề nuôitôm đòi hỏi phải kết hợp rất nhiều yếu tố quan trọng như nghiên cứu hoàn thiện quytrình sản xuất giống và nuôi tôm thịt, các vấn đề về dinh dưỡng và môi trường, đồngthời không kém phần quan trọng đó là nghiên cứu các tác nhân gây bệnh để tìm ranhững biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả

2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú.

Môi trường nước gồm một loạt các thông số tác động đến sự sinh trưởng và táisản xuất của sinh vật Ở điều kiện bình thường thì giữa sinh vật (vật chủ ), nguồn bệnh

và môi trường giữ trạng thái cân bằng, bất cứ sự phá vỡ cân bằng nào đều có thể gâybệnh Trong hầu hết các trường hợp, nguồn gốc chính của việc phát sinh bệnh là vấn

đề môi trường dù rằng trong bản thân nội tại của vật chủ có sự tồn tại của mầm bệnh,đây không nên xem là nguyên nhân chính sinh ra bệnh

Cơ chế kháng bệnh của tôm chủ yếu là miễn dịch không đặc hiệu, điều này cóhạn chế so với động vật có xương sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ không

có và không tạo ra được kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập Các phân

tử có hoạt tính miễn dịch trong huyết tương (hemolymph) của tôm gồm hai dạng chủyếu là huyết bào (hemocyte) và các phân tử lectin

Từ máu của giáp xác có thể phân lập được ba nhóm tế bào là bạch cầu khônghạt, bạch cầu bán hạt và bạch cầu có hạt Trong đó bạch cầu không hạt chủ yếu lànhững thực bào loại bỏ các thể lạ xâm nhập bao gồm virus, vi khuẩn và các tế bàonấm Số lượng tế bào thực bào chiếm từ 2 - 28 % trong tổng số các tế bào máu Sựthực bào có thể xảy ra tại nơi bị tổn thương, trong các mô và cơ quan lọc của hệ thốngtuần hoàn và đôi khi cả chính trong thể dịch Hiệu quả của sự thực bào phụ thuộc vàotác nhân xâm nhập, cũng như các yếu tố sinh lý của ký chủ và môi trường

Bạch cầu bán hạt đóng vai trò đầu tiên trong việc phát hiện và bắt giữ các thể lạ

có kích thước lớn, và trợ giúp cho hoạt động thực bào thông qua sự hoạt hoá của hệthống Pro-phenoloxydase Kết quả của quá trình hoạt hoá này là các sản phẩm oxy hoáđược hình thành có hoạt tính cao và do đó rất độc đối với vi sinh vật

Lectin là phân tử glycoprotein có khả năng gắn với phần đường của các phân tửkhác, đặc biệt ở các tác nhân lạ Điều kỳ lạ là vi khuẩn, virus, độc tố cũng có thể có

lectin bề mặt Các phân tử lectin này một mặt có thể giúp nối kết tác nhân lạ với huyếtbào tôm, hoạt hóa chúng làm tăng hoạt động thực bào và hoạt tính kháng khuẩn Mặtkhác vi khuần, virus cũng có thể sử dụng lectin để sáp nhập vào tế bào tôm ở vị trí cácthụ thể để khởi đầu cho quá trình nhiễm trùng.

Ngoài các bạch cầu kể trên thì ở giáp xác có các tiểu quần thể bạch cầu đảmnhiệm chức năng như tế bào diệt tự nhiên, tiêu diệt tế bào ung thư, tế bào nhiễm virus

và tế bào ngoại lai

Như vậy tôm cũng có đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể đối với tác nhânvirus nhưng không có tế bào tạo ra kháng thể và không có sự bảo vệ đặc hiệu chống lạitác nhân lạ Vì vậy sự nhiễm virus dai dẳng tồn tại hiển nhiên trong cơ thể tôm Vì thếviệc tăng cường sức đề kháng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản thuộc nhóm giáp xáckhông thể dựa vào việc sử dụng các loại vaccin mà chủ yếu là các biện pháp tăngcường hiệu quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môitrường nuôi và sử dụng các chất kích thích miễn dịch

2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú.

2.4.1 Tác nhân gây bệnh.

Bệnh đốm trắng được xem là bệnh nguy hiểm và gây hậu quả nghiêm trọngnhất đến ngành nuôi tôm công nghiệp Bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1993 Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu,kích thước 70 x 300 nm

Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kilodalton Vỏ bao

có 2 lớp protein VP28 và VP 19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24 và Vp15

Nhân có cấu trúc DNA sợi đôi ( dsDNA ): không có thể ẩn ( Occlusion body ).Khi bị nhiễm bệnh đốm trắng, tôm rất yếu và mềm vỏ do các đốm trắng (nêngọi là bệnh đốm trắng) có đường kính từ 0,5 – 2 mm, hiện rất rõ ở dưới vỏ kitin Đốmtrắng là chất đọng lại không bình thường của muối canxi bởi biểu bì vỏ kitin Khi đãthấy rõ dấu hiệu này thì tôm chết rất nhanh

Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ 1995) Bệnh đã làm giảmnghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên.

2.4.3 Ký chủ

Hầu hết các loài tôm he đều có thể nhiễm bệnh này Một số loài tôm he có thể

nhiễm ngoài tự nhiên như P monodon, P japonicus, P chinensis, P indicus, P.

merguiensis, P seriferus, P vannamei Một số tôm he đã bị nhiễm trong điều kiện thí

nghiệm như P stylirotris, P aztecus, P duorarum, P setifecus,… Một điều nguy hiểm là ngoài tôm he, một số loài của Metapenaeus spp cũng bị nhiễm, và một số giáp xác khác như cua (Scylla serrata, Callapa lophos,…), tôm hùm (Parulinus spp), tôm càng xanh (Macrobrachium rosrnbergii), Artemia,…cũng có thể bị nhiễm trong tự

nhiên và trong cảm nhiễm nhân tạo Mặt khác bệnh này có thể xảy ra ở hầu hết giaiđoạn phát triển của tôm Người ta đã gặp bệnh này ở Postlarvae 20 ngày tuổi, tôm mẹ,nhưng thường xảy ra nhất là ở Post 50 – 70 ngày tuổi

Rajendran và CTV (1999) đã nghiên cứu thực nghiệm ở bờ biển Đông Nam Ấn

Độ bằng cách lấy virus bệnh đốm trắng từ tôm sú nhiễm bệnh tiêm hoặc cho ăn với 5

loài tôm nước mặn (P monodon, P indicus, P semisulcatus, Metapenaeus

monoceros), 2 loài tôm nước ngọt (Macrobrachium rosenbergii, M idella), 4 loài cua

(Scylla serrata, S tranquebarica, Metapograpsus sp, Sesarma sp) và 3 loài tôm hùm (Panulirus homarus, P ornatus, P polyphagus) Tất cả các loài thí nghiệm đều nhiễm

virus bệnh đốm trắng Các loài tôm nhiễm bệnh thực nghiệm đều có dấu hiệu bệnh lý

và mô bệnh học như tôm sú nhiễm bệnh tự nhiên Tỷ lệ dồn tích trong vòng 5 – 7 ngày

đối với tôm tiêm virus, 7 – 9 ngày đối với tôm cho ăn virus Hai loài cua (S serra và

tranquebarica) và tôm hùm không có dấu hiệu bệnh lý.

Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi hoặc sống tự

nhiên: tôm sú (P monodon), tôm thẻ (P indicus), tôm rảo (Metapenaeus ensis), tôm đất (M lysianassa) (theo Lý Thị Thanh Loan, 2003); tôm chân trắng (L vannamei)

nhập vào nuôi ở Việt Nam (Bùi Quang Tề, 2003)

2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền.

Sự phát sinh và bùng nổ bệnh đốm trắng phụ thuộc rất nhiều vào khí hậu, thờitiết và môi trường ao nuôi Bệnh sẽ xảy ra nếu tôm mang virus và các yếu tố thủy lý,thủy hóa biến động rất lớn vượt ra ngoài ngưỡng sinh thái thích hợp

Bệnh lan truyền theo chiều dọc (từ bố mẹ sang con) và theo chiều ngang (quanước và thức ăn, các loại giáp xác hoang dã trong ao và do tôm khoẻ ăn con bị nhiễmbệnh đốm trắng) Kết quả theo dõi tôm sú nuôi tại Hải Phòng và Hà Tĩnh năm 2003của Bùi Quang Tề cho thấy lan truyền theo chiều ngang là chính

2.4.5 Cơ chế xâm nhập.

Theo L M.passano, đây là dạng DNA virus, hình que ngắn Khi xâm nhập vàotôm, virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận như nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinhhoàn, hệ thống thần kinh, mắt chân bơi và các bộ phận khác Sau khi thâm nhập vào tếbào chủ, virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào.Quá trình này làm số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt độngbình thường của tế bào, virus tiếp tục phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết

tế bào sau đó lan truyền ra môi trường nước, tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập tấncông Hoặc tôm khoẻ ăn tôm bị nhiễm virus cũng tạo điều kiện cho virus tấn công vào

ký chủ mới Nếu virus không tìm được ký chủ mới nó chỉ có thể sống được trong môitrường nước khoảng 24 giờ

2.4.6 Bệnh lý

Có thể chia bệnh virus đốm trắng thành hai dạng Dạng 1 là bệnh cấp tính gây

tỷ lệ chết cao trong vòng 2 tuần Bệnh thường gặp ở các loài tôm: P monodon, P.

indicus và P penicilatus Dạng 2 là bệnh tiềm ẩn, virus đặc biệt này tồn tại trong các

loài tôm Macrobrachium sp, các loại cua tự nhiên, tôm hùm tự nhiên thường không có

dấu hiệu bệnh lý rõ rệt

Tuy nhiên một số nhà khoa học khác đã chia bệnh virus đốm trắng xuất hiện ởtôm he thành 3 dạng chính theo các dấu hiệu bệnh Trong dạng I bệnh xuất hiện (cấptính và thứ cấp tính) mức độ phá huỷ nhiều ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chếttrong vòng 7 – 10 ngày và dấu hiệu bệnh lý thể hiện rõ nhất là xuất hiện các đốm trắngdưới vỏ Tỷ lệ tôm chết từ trung bình đến cao, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm từ trungbình đến cao Dạng II tôm chết cấp tính Bệnh xuất hiện tác động làm tôm chuyển màu

đỏ, mức độ phá huỷ rất mạnh ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết hầu hết trongvòng từ 2 – 3 ngày, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm rất cao Dạng III bệnh xuất hiện mãntính tổ chức mô phá huỷ thấp không có đốm trắng và không có màu đỏ, tỷ lệ tôm chếtkéo dài từ 15 - 28 ngày

2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay.

2.5.1 Một số phương pháp phổ biến.

Hiện nay có nhiều phương pháp để phát hiện bệnh như phát hiện bệnh: mô học,lai tại chỗ (In Situ Hybridization), PCR (Polymerase Chain Reaction), kính hiển viđiện tử

Năm 1997, Lightner đã đưa ra bản đánh giá chung các phương pháp được ứngdụng để chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng

Bảng 2.2: Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm sú bằng

các phương pháp khác nhau (Lightner, 1997)

2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR.

Nguyên tắc: PCR là một kỹ thuật in-vitro (trong ống nghiệm) Bằng kỹ thuật

này, một chuỗi phân tử DNA đặc thù nằm giữa hai vùng của một chuỗi đã biết có thểđược khuếch đại bởi một chu kỳ nhiệt được lặp đi lặp lại

Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn chính:

- Biến tính chuỗi DNA kép thành mạch đơn, ở nhiệt độ 92 – 95oC,chuỗi xoắn kép DNA sẽ tách thành 2 mạch đơn

- Bắt cặp giữa đoạn mồi và (primers) và mạch DNA đơn, sự bắt cặptheo chiều 3’ của sợi DNA mục tiêu ở nhiệt độ khoảng 45 – 55oC

- Tổng hợp mạch DNA bổ sung từ điểm bắt cặp giữa đoạn mồi(primers) và mạch DNA đơn nhờ enzyme DNA polymerase, từ đầu 3’

của primers ở nhiệt độ khoảng 70 – 75oC

Mỗi chu kỳ DNA gồm 3 giai đoạn chính trên Số chu kỳ được thực hiện là từkhoảng 25 – 40 chu kỳ Số lượng đoạn gen được khuếch đại, theo lý thuyết là 2n, với n

là số chu kỳ

Trong những năm gần đây, công nghệ PCR đã được nâng lên một tầm cao mớivới sự ra đời của Realtime PCR Đây là kỹ thuật dựa trên nền PCR thông thườngnhưng có nhiều ưu điểm hơn

Realtime PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theotừng chu kỳ được theo dõi trực tiếp Hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt(PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính

Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằngphản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạothành Để có được tín hiệu Realtime phản ứng đang diễn ra người ta sử dụng phẩmnhuộm hoặc các probe đặc hiệu Các phẩm nhuộm như Ethidium Bromide, SYBRgreen, Hoechst dye khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang Tuy nhiên cácphẩm nhuộm này không cho kết quả đặc hiệu vì nó có thể chèn vào cả những DNAcần tìm và DNA không cần tìm Vì vậy người ta thường sử dụng các probe hơn, Cácprobe sẽ phát sáng khi gắn bổ sung với DNA đích và không phát sáng khi ở dạng tựdo

2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật.

2.6.1 Alkaloid.

Theo R F Raffauf (Plant alkaloids: Aguide To Their Discovery andDistribution, 1996), có hơn 10.000 alkaloid khác nhau được khám phá trên 300 họthực vật khác nhau Alkaloid là một hợp chất hữu cơ thường có một hay nhiều vòngcarbon, có chứa nitơ và có tác dụng dược lý hiệu quả trên cơ thể người và động vật

Alkaloid có tính kiềm và khi gặp acid tạo những muối có hoạt tính sinh họcmạnh và đặc hiệu, có tác dụng lâm sàng rõ ràng như dùng thuốc giảm đau, thuốc gây

tê đặc biệt là morphine, điều trị tăng huyết áp, rối loạn tinh thần, khối u, và thuốcchống vi khuẩn,… Ngoài ra các alkaloid có tác dụng diệt ký sinh trùng, trị nguyên sinhđộng vật như quinin, emezin, conessin Tác dụng kháng khuẩn của berberin, quinon là

quan trọng hơn cả Theo Ukita Mizuno và Tamura (1994) nhận thấy thì berberin có tácdụng tốt đối với vi khuẩn tụ cầu khuẩn, trực khuẩn Berberin có nhiều trong họ thựcvật Ranunculaceae, Rutacea, Menispermaceae.

Alkaloid thay đổi trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Yếu tố khíhậu, đất đai và cách thu hái, bảo quản cũng ảnh hưởng đến sự thay đổi của alkaloidtrong cây Hầu hết alkaloid đều có vị đắng, không màu hay có màu vàng như Berberin,màu đỏ như Sangkinarine,…

2.6.2 Flavonoid.

Flavonoid có trong hầu hết các loại thực vật, và được lưu trữ nhiều trong hạt, ởhoa, vỏ trái cây, hay trong vỏ cây Theo báo cáo của nhiều tác giả cấu trúc của hợpchất của phân tử bao gồm 2 vòng benzen và 3 carbon nằm ngoài 2 vòng Là sắc tố màuvàng trong cây, màu sắc đậm nhạt thay đổi theo từng loại cây Có vị đắng hơi chua

Flavonoid đã được nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy quá trình oxy hoá các chất,dùng trong các trường hợp chuyển hoá cơ bản giảm Các gốc tự do như superoxide(O2-), hydroxyl (OH-), hydoperoxy (H2O2), lipidperoxide, có khả năng tiêu diệt hoặc ứcchế vi khuẩn, có khả năng chống viêm, chống dị ứng, chống virus, chống ung thư,…ngoài ra các gốc oxygen này cũng có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơthể

Ngoài 2 hoạt chất kể trên thì trong thực vật còn rất nhiều hoạt chất khác nhưacid hữu cơ, acid béo chưa bão hoà, anthraquinon, glycoside, saponin, tinh dầu,…cũng

có tác dụng trong công tác phòng và trị bệnh ở người và động vật

2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản.

Trong thiên nhiên, cây cỏ rất nhiều chủng loại nhưng số loài cây có hoạt chấtsinh học chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ so với tổng số các loài cây Chúng đã và đang được

sử dụng rộng rãi trong các ngành dược phẩm, hương liệu và mỹ phẩm

Trong nuôi trồng thủy sản, các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược ngày càngđược quan tâm để thay thế các hoá chất khử trùng, diệt mầm bệnh, diệt tạp độc hại vàcác thuốc kháng sinh chữa bệnh cho thủy sản nuôi trồng

Trên cơ sở thử kháng sinh đồ của các cây thuốc, Hà Ký và cộng tác viên (1995)

đã phối chế thành thuốc KN - 04 - 12 mà thành phần chủ yếu là các cây thuốc vàvitamin với tỷ lệ rất thấp từ 0,1 – 0,5 % tổng khối lượng của chế phẩm thuốc và các