Tiểu luận miễn dịch thực vật: quá trình nhận biết và sự tương tác protein R và MAMPPAMP effector, Các receptor nhận biết PAMPMAMPAvr protein. Các receptor này thường được phân nhóm thành (i) các receptor nhận biêt PAMPMAMP (đối với tính kháng không đặc hiệu) và (ii) các protein R (đối với tính kháng genforgen). Các receptor nhận biết các MAMPPAMP thường là các protein xuyên màng và có vùng lặp giàu leucin nằm phía bên ngoài tế bào. Tuy nhiên, cơ sở cho việc phân chia này không phải lúc nào cũng rõ ràng, vì vây người ta có thể gộp chung cả 2 nhóm thành protein kháng R.
Trang 1I. Protein và PAMP/MAMP.
Các receptor nhận biết PAMP/MAMP/Avr protein Các receptor này thường được phân nhóm thành (i) các receptor nhận biêt PAMP/MAMP (đối với tính kháng không đặc hiệu) và (ii) các protein R (đối với tính kháng gen-for-gen) Các receptor nhận biết các MAMP/PAMP thường
là các protein xuyên màng và có vùng lặp giàu leucin nằm phía bên ngoài tế bào Tuy nhiên, cơ
sở cho việc phân chia này không phải lúc nào cũng rõ ràng, vì vây người ta có thể gộp chung cả
2 nhóm thành protein kháng R
I.1. Protein
Protein liên quan đến sự gây bệnh (PR protein) là các protein được cây tạo ra do sự gây bệnh bởi các tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc các nhóm nấm vi khuẩn, virus, tuyến trùng Ngoài
ra sự tấn công của côn trùng cũng kích thích cây tạo ra PR protein Hiện có khoảng 17 nhóm (còn được gọi là họ) PR protein khác nhau, được ký hiệu từ PR1 đến PR17 (theo thứ tự được phát hiện Nhiều nhóm có hoạt tính kháng nấm Dưới đây là đặc điểm của một số nhóm quan trọng nhất :
cao sau khi bị nhiễm bệnh (có thể đạt tới 1-2% tổng lượng protein của lá) Protein của nhóm này
đã được phát hiện thấy trên tất cả các loại cây được kiểm tra Các protein có chức năng tương tự PR-1 cũng được phát hiện thấy ở nhiều sinh vât khác như nấm, côn trùng, đọng vật có xương sống (kể cả người) Mặc dù chức năng sinh học và cơ chế hoạt động của nhóm này chưa rõ nhưng các protein PR-1 có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo Các protein PR-1 có thể chia thành 2 nhóm hoặc kiềm hoặc acid Trên thuốc lá, có ít nhất 16 protein PR-1 đã được khám phá, trong đó 3 protein loại acid (PR-1a, -1b,-1c) và 1 protein (PR-1g) hình thành khi cây bị nhiễm Tobacco mosaic virus Trên lúa có 23 gen mã hóa protein PR-1 Trên ớt, sự biểu hiện của gen PR-1 loại kiềm được cảm ứng bởi TMV đã tạo tính kháng đối với tolerance to P parasitica var nicotianae, Ralstonia solanacearum, và P syringae pv tabaci
- PR-2 (β-1,3- glucanase) Là nhóm protein có mặt trong nhiều loài cây, động vật và vi sinh vật Glucanase có thể chia thành 3 nhóm: nhóm I là các glucanase có tính kiềm hình thành ở không bào; nhóm II và III có tính acid và là các protein ngoại bào Glucanase thuộc nhóm I có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo Glucanase thuộc nhóm II và III chỉ có hoạt tính kháng nầm nếu phối hợp với glucanase nhóm I hoặc chitinase Đặc tính kháng nấm của glucanase là khả năng phân hủy vách tế bào của nấm (cấu tạo bởi glucan)
- PR-3 (chitinase lớp I, II, IV, VI, VII), PR-8 (chitinase lớp III) và PR-11 (chitinase lớp V) Các chitinase là loại protein chiếm số lượng lớn thứ 2 trong các PR protein Các chitinase thực vật được chia làm 7 lớp (I, II VI) căn cứ vào cấu trúc protein, tính đặc hiệu cơ chất, cơ chế xúc tác
và tính mẫn cảm với các chất ức chế 7 lớp này lại được xếp vào 3 nhóm PR protein Các chitinase có hoạt tính kháng nấm bằng cách xúc tác cho phản ứng thủy phân để cắt liên kết β-1,4-glycoside của N-acetyl-Dglucosamine (chitin, thành phần của vách tế bào nấm) Cần chú ý là phản ứng thủy phân này tạo ra các oligosacharid có vai trò là elicitor cho các phản ứng phòng thủ khác
liên kết với chitin của vách tế bào nấm dẫn tới ức chế sinh trưởng của nấm Loại PR-4 phổ biến nhất là legumin và vicilin (chiếm tới 80% hàm lương protein của hạt đậu) Vicilin đã được chứng minh có khả năng ức chế sinh trưởng và nảy mầm bào tử của nhiều loại nấm như Fusarium solani, F oxysporum, Collectotrichum musae, Phytophthora capsici, Neurospora crassa, Ustilago
Trang 2maydis Vicilin cũng được biết là có khả năng kháng cả côn trùng như một đậu (Callosobruchus maculatus)
kiềm và có mức tương đồng chuỗi aa đáng kể với thaumatin (một protein có vị ngọt, phân lập từ cây Thaumatococcus danielli Osmotin và TL tương tác với màng tế bào nấm và hình thành các
lỗ thủng xuyên màng Hai loại protein này cũng có hoạt tính 1,3-glucanase, liên kết với actin Osmotin trên thuốc lá kích thích MAPK do đó phá vỡ 1 đường hướng dẫn truyền tín hiệu (dựa vào MAPK) nhằm tăng cường tính ổn định của vách tế bào nấm TL protein có mặt trong nhiều loài cây
aspartic, serine, cystein
tử nhỏ (~5 kD), kích thước khoảng 45-54 aa Các protein này là các protein hoạt động trên màng, phát hiện thấy ở tất cả các nhóm sinh vật và độc đối với nấm Cơ chế gây độc đối với nấm của các loại protein này vẫn chưa rõ nhưng defensin đã được chứng tỏ là làm tăng vận chuyển ion K+ ra ngoài màng, tăng hấp thụ Ca+2 của nấm Neurospora crassa Chất defensin Dm-AMP1 của cây thược dược có thể tương tác đặc hiệu với sphingolipid của nấm men Sacharomyces cerevisiae
chuyển phospholipid qua màng Phân tử LTP có cấu hình gồm một xoang ghét nước chạy dọc phân tử Phân tử LTP khi tương tác với màng tế bào nấm sẽ tự gắn xuyên qua màng tế bào và xoang ghét nước sẽ tạo ra các lỗ dò trên màng tế bào nấm và nấm sẽ chết Ngoài ra, một LTP tờ cây Arabidopsis dã đươch chứng minh có khả năng vận chuyển các các phân tử tín hiệu trong phản ứng SAR
I.2. MAMP/PAMP
Tính kháng không đặc hiệu hình thành dựa trên khả năng của cây nhận biết được các các elicitor chung (general elicitor) của tác nhân gây bệnh Hiện nay, các elicitor này được gọi là các PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern) Thuật ngữ PAMP do các nhà nghiên cứu miễn dịch động vật sử dụng đầu tiên và đang dần bị thay thay thế bởi thuật ngữ MAMP (Microbe Associated Molecular Pattern) vì người ta thấy rằng các vi sinh vật không gây bệnh cũng có các PAMP giống như của tác nhân gây bệnh Các PAMP/MAMP nhìn chung đa dạng về bản chất hóa học, thường là các chuỗi peptide, glycoprotein, lipids và oligosaccharides có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh và không gây bệnh Các PAMP/MAMP hiển nhiên khá bảo thủ trong một nhóm tác nhân gây hại Một số các MAMP/PAMP chung nổi tiếng là:
• Lypopolysacharid (LPS) LPS có nguồn gốc từ các vi khuẩn gram (-) như Xanthomonas, Pseudomonas…LPS cảm ứng để tạo ra sự cháy oxy hóa, hình thành các enzyme kháng sinh
tiểu phần flagellin Flagellin chứa một motif nhân biết gồm 22 aa (đoạn fgl22) Flagellin có thể cảm ứng tạo để hình thành callose và các phản ứng phòng thủ khác như hình thành PR protein
• Harpin Harpin là các protein được mã hóa bởi gen hrp (viết tắt của hypersensitive response and pathogenicity) của vi khuẩn gram (-) Phần lớn các loài vi khuẩn có 2 cum gen hrp Cum lớn gồm 6-9 đơn vị phiên mã, mỗi đơn vị mã hóa 1-9 protein Các protein harpin nằm trên màng tế bào vi khuẩn, tham gia cấu tạo nên hệ thống tiết loại III của vi khuẩn Hệ thống tiết loại III sẽ
Trang 3vận chuyển Avr protein và cả harpin vào trong tế bào cây Harpin cảm ứng để tạo phản ứng siêu nhạy/apoptosis và các phản ứng phòng thủ khác
hình thành phytoalexin và lignin hóa tế bào cây
Glucan có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin
• Glycoprotein Glicoprotein có nguồn gốc từ vách tế bào nấm trứng như Phytophthora Glycoprotein có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin
Các tác nhân vi sinh vật hình thành các phân tử gọi là các mô hình phân tử ký hiệu là
ví dụ MAMP/PAMP: 1.Flagellin; 2.Harpin Vd MAMP/PAMP 1: Flagellin: Là protein cấu tạo nên lông roi (flagella) vi khuẩn gram (-) Mỗi lông roi gồm hàng ngàn flagellin Flagellin chứa một motif nhân biết gồm 22 aa (đoạn fgl22) Cảm ứng tạo callose, PR protein flg22 Ví dụ MAMP/PAMP 2: harpin Harpin là các protein được mã hóa bởi gen HRP của vi khuẩn gram (-), nằm trên màng tế bào vi khuẩn, tham gia cấu tạo nên hệ thống tiết loại III Hệ thống tiết loại III vận chuyển Avr protein và cả harpin vào trong tế bào cây Cảm ứng tạo phản ưng siêu nhạy
- MAMP (Microbe-Associated Molecular Pattern): mô hình phân tử có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung
- PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern): mô hình phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh Một số ví dụ về các MAMP/PAMP:
• Lipopolysacharide (LPS) của vi khuẩn Gram (-)
• Peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+)
• Flagellin của lông roi vi khuẩn
• Glucan, chitin của vách tế bào nấm
• Các Avr protein của tác nhân gây bệnh cây (Avr=Avirulence)?
II. Nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/MAMP/Effector
Sự nhận biết và tương tác này tuân theo 1 trong 2 cơ chế trực tiếp hoặc gián tiếp như trình bày ở chương trước Vai trò của Effector (chất hiệu ứng): Như đã biết, effector là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh Đối với cây, sự nhận biết các elicitor chung (MAMP/PAMP) đã hình thành tính kháng cơ bản Tính kháng này còn được gọi là tính kháng khởi động bởi MAMP/PAMP Tính kháng này
có thể hiệu quả dẫn tới cây không bị bệnh
Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh có thể khắc phục tính kháng cơ bản bằng cách tiết vào tế bào cây các effector Một vi khuẩn gây bệnh (vd Pseudomonas syringae) trong quá trình gây bệnh có thể tiết vào trong tế bào thực vật từ 20 -30 effector khác nhau thông qua hệ thống tiết loại III Tương tự, các loại nấm biotroph cũng tiết vào tế bào cây nhiều effector thông qua vòi hút (haustorium) hình thành bên trong tế bào (vd nấm gỉ sắt cây lanh M lini tiết vào tế bào tới 21 loại effector khác nhau) Nhiều effector của tác nhân gây bệnh có hoạt tính enzym, có vai trò biến đổi các protein của ký chủ nhằm tạo điều kiện cho sự gây bệnh và làm mất khả năng nhận biết của cây Một trong các vai trò của các effector này là ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua nhận biết PAMP/MAMP Một số các protein của virus thực vật (Vd
Trang 4HP = Helper Component) của các potyvirus) có khả năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua cơ chế gene silencing cũng có thể được xem là effector của virus Nếu hoạt động của các effector này hiệu quả, cây sẽ bị nhiễm bệnh
Các effector của tác nhân gây bệnh được nghiên cứu nhiều nhất là các Avr protein Nếu cây
có gen R có thể nhận biết được các Avr protein thì một lớp phản ứng kháng thứ 2 sẽ hình thành
và được gọi là tính kháng khởi động bởi effector Tính kháng khởi động bởi effector hiển nhiên
là đặc hiệu và thường tuân theo quan hệ gen-đối-gen
Hình Nhận biết và tương tác giữa protein R và PAMP/MAMP/Effector (Chisholm et al., 2006) III. Dẫn truyền tín hiệu trong miễn dịch thực vật
Phản ứng phòng thủ tạo được của cây điều khiển bởi một mạng lưới các đường hướng dẫn truyền tín hiệu chồng chéo lên nhau Nhiều phân tử tham gia các đường hướng dẫn truyền tín hiệu
3.1 Đường hướng salicyclic acid (SA)
Salicyclic acid (SA) là một phytohormon, có vai trò quan trọng trong phát triển, quang hợp,
hô hấp… của thực vật SA cũng là một phân tử tín hiệu nội sinh tham gia cảm ứng tính kháng tạo được của thực vât Vai trò của SA trong dẫn truyền tính kháng đã được chứng minh trong một số thí nghiệm:
nhiều PR protein (thí nghiệm của White, 1970)
• Lây nhiễm TMV trên thuốc lá dẫn tới hàm lượng SA tăng cục bộ (tại vị trí lây nhiễm) và hệ thống (toàn cây)
• Cây Arabidopsis chuyển gen NahG (naphthalene hydroxylase G) của vi khuẩn Pseudomonas putida (là gen mã hóa salicylate hydroxylase, một enzyme chuyển SA thành
Trang 5dạng bất hoạt là catechol) đã biểu hiện tính mẫn cảm cao đối với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau như nấm, vi khuẩn và virus
• Cây chứa các đột biến mất khả năng tích lũy SA như eds4, eds5 (enhanced disease susceptibility), sid1, sid2 (SA induction-deficient), pad4 (phytoalexin-deficient) biểu hiện tính mẫn cảm cao với tác nhân gây bệnh
SA tương tác với catalase – là một enzyme xúc tác cho sự phân hủy H2O2 thành H2O và O2 H2O2 là phân tử hoạt động phía thượng lưu của quá trình dẫn truyền tín hiệu Phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tín hiệu (phía sau SA) là một protein gọi là NPR1 (non-expressor of PR1 protein) cần cho dẫn truyền SA Sản phẩm cuối cùng của đường hướng dẫn truyền SA là các loại PR protein (xem bài 3), trong đó quan trọng nhất là protein nhóm PR1 Đường hướng dẫn truyền SA thường do các tác nhân gây bệnh nhóm biotroph gây ra (bài 3) Nhìn chung các tác nhân gây bệnh này sinh trưởng trong gian bào và nhân lên trong mô nhiều ngày trướ khi gây chết hoại mô
3.2 Đường hướng dẫn truyền JA và ET
Jasmonic acid (JA) và ethylen (ET) cũng là các phytohormon Cả JA và ET đã được chứng minh có vai trò trong tính kháng bệnh như trong các ví dụ sau:
gen fatty acid desaturase) hoặc mất khả năng tiếp nhận JA như coi1 (coronatine insensitive1) hoặc kháng JA như jar1 (jasmonic acid resistant1) biểu hiện tính mẫn cảm dối với một loạt tác nhân gây bệnh như nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium,
vi khuẩn Erwinia carotovora
mẫn cảm với nấm B cinerea và vi khuẩn E carotovora
defensin) và Thi2-1 (mã hóa protein phòng thủ là thionin), hel (hevein-like protein) và chib (chitinaseB) Các gen này được xem là dấu hiệu phổ biến của đường hướng dẫn truyền JA/ET
Đường hướng JA/ET có nhiều điểm khác với đường hướng SA: (1) JA/ET hình thành chủ yếu do nhóm necrotroph như nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium, vi khuẩn Erwinia carotovora Các tác nhân này giêt chết nhanh chóng tế bào cây để hấp thu dinh dưỡng (xem bài 2); (2) sự tích lũy JA và ET có thể hình thành do tác nhân gây bệnh, nhưng cũng có thể hình thành từ các tổn thương do côn trùng
3.3 Giao tiếp chéo (cross talk) giữa đường hướng SA và JA/ET.
Đã có nhiều bằng chứng cho thấy 2 đường hướng SA và JA/ET không hoàn toàn độc lập với nhau mà có tương tác với nhau Cả 2 đường hướng đều có ảnh hưởng thuận và nghịch nhưng nhìn chung, mối quan hệ nghịch (đối kháng) là phổ biến Ví dụ cây Arabidopsis mang gen kháng eds1 và pad4 (giảm tích lũy SA) đã làm tăng khả năng biểu hiện của đường hướng JA/ET
Quan hệ đối kháng này cần được xem xét khi ứng dụng thực tế vì khi tạo SAR để chống bệnh theo đường hướng SA thì SAR theo đường hướng JA/ET có thể bị ức chế dẫn tới cây dễ bị nhiễm côn trùng gây hại
3.4 Dòng thác ion và sự đốt cháy oxy hóa
nhận biết được sự có mặt của tác nhân gây bệnh tại màng tế bào, có sự thay đổi về dòng ion đi vào/ra tế bào qua kênh ion dẫn tới thay đổi cân bằng K+/H+ của màng (dòng Ca2+ và H+ vào tế
Trang 6bào tăng, dòng K+ và Cl- ra khỏi tế bào tăng) Phản ứng lại sự thay đổi này là sự hoạt hóa các protein liên kết màng như kinase, phosphatase, phospholipase và protein G Các kinase sẽ hoạt hóa NADPH oxidase để chuyển O2 thành các lớp oxy hoạt hóa (ROS= reactive oxygen classes) như H2O2, O2-, HO2 Ngoài ra, các kinase cũng hoạt hóa nitric oxydase để tổng hợp nitric oxide (NO) khi sử dụng năng lượng từ NADPH
hóa vách tế bào hoặc liên kết các hợp chất của vách tế bào (crosslinking) ROS cũng có thể oxy hóa các hợp chất đặc biệt là lipid của màng tế bào, ví dụ tạo thành các lipid hdroperoxide là các chất độc đối với tế bào ROS cũng có thể oxy hóa các hợp chất phenolic thành các chất quinon độc với tế bào Hậu quả là tế bào bị chết nhanh chóng (phản ứng siêu nhạy HR) Cần chú ý trong quá trình cảm ứng phản ứng siêu nhạy này có vai trò của NO Người ta đã chứng minh rằng sự cân bàng NO/ H2O2 là cần thiết để cảm ứng phản ứng siêu nhạy
phòng thủ khác Ví dụ H2O2 có thể cảm ứng đường hướng MAPK (xem phần đường hướng MAPKi) hoặc cảm ứng để tổng hợp phenylalanin ammonia lyase (PLA), một enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp SA (xem phần đường hướng SA)
Hình Dòng thác ion trong dẫn truyền tín hiệu miễn dịch thực vật
3.5 Đường hướng MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases)
Đường hướng MAPK là đường hướng dẫn truyền chủ chốt đối với tính kháng bệnh Đây là một đường hướng chung đối với sinh vật nhân thật và là một cách dẫn truyền các tín hiệu ngoại bào thông qua các receptor bề mặt Đường hướng MAPK dựa vào sự nhận biết thông qua PAMP/MAMP
Trang 7Sự nhận biết giữa receoptor của ký chủ và PAMP/MAMP của vi sinh vật (Vd: flg22, HrpZ, EF-Tu của vi khuẩn, Pep 13, NPP1, glucan của nấm trứng, chitin và ergosterol của nấm thật) dẫn tới một dòng thác dẫn truyền tín hiệu trong tế bào gọi là đường hướng dẫn truyền MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) MAPK là một protein kinase đặc hiệu serin/threonin có nghĩa nó sẽ phosphorin hóa nhóm OH của serin hoặc threonin Một dòng thác MAPK nhìn chung
là chuỗi MAPKKK=>MAPKK=>MAPK cho phép truyền các dấu hiệu ngoại bào thông qua receptor thành một loạt các phản ứng nội bào Ví dụ bộ gen của Arabidopsis mã hóa ít nhất 20 MAPKs Sự hoạt hóa dòng thác MPK sẽ kích hoạt yếu tố phiên mã WRKY trong nhân tế bào và dẫn tới kích hoạt quá trình phiên mã của nhiều gen phòng thủ (WRKY là một họ protein có khả năng liên kết với promoter của các gen kháng)
Flagellin là một loại PAMP chung được nghiên cứu nhiều nhất trong số các PAM/MAMP của vi khuẩn hại thực vật Flagellin là protein cấu trúc của lông roi vi khuẩn Flagellin chứa một đoạn 22 amino acid bảo thủ gọi là fgl22 Fgl22 có thể được nhận biết bởi một receptor của tế bào thực vật là FLS2 FLS2 là một receptor kinase xuyên màng với đoạn lặp giàu leucin (LRR) nằm phía ngoài màng tế bào (chịu trách nhiệm nhận biết) và một vùng có hoạt tính kinase nằm trong
tế bào chất
Ngay sau khi FLS2 nhận biết sự có mặt của fgl22, vùng kinase của nó sẽ khởi động đường hướng MAPK bằng cách hoạt hóa các kinase của tế bào là AtMEKK1 => AtMKK4/5 => AtMPK3/6, dẫn tới khởi động các yếu tố phiên mã hoạt động trong trong nhân (Vd như yếu tố WRKY) và cuối cùng tổng hợp các hợp chất tạo ra tính kháng (vd như các PR protein)
Đường hướng dẫn truyền tín hiệu MAPK
IV. Tài liệu tham khảo
Trang 8- Hà Viết Cường, 2011, giáo trình miễn dịch thực vật, Học viện nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất bản Đại học Nông nghiệp I