Nghiên cứu khả năng chuyền nạp Gen của hai giống bông vải SSR60F và COKER 312

Nghiên cứu khả năng chuyền nạp Gen của hai giống bông vải SSR60F và COKER 312

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI

KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khoá: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: PHẠM QUYẾT THẮNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005

Giáo viên hướng dẫn:

TS Trần Thị Cúc Hoà

Sinh viên thực hiện:

Phạm Quyết Thắng

LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học

Các Thầy cô trong và ngoài Trường Đại Học Nông Lâm

Đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học trong thời gian em học tập tại trường

Đặc biệt xin chân thành cảm ơn:

TS Trần Thị Cúc Hòa- Trưởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, TS Trần Thị Dung- Trưởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa luận

TS Trần Ngọc Thạch đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian

em thực hiện khóa luận

Các anh chị trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp

Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm

Phạm Quyết Thắng

TÓM TẮT

PHẠM QUYẾT THẮNG, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI

SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”

Giảng viên hướng dẫn:

TS TRẦN THỊ CÚC HÒA

Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây bông vải nhằm đưa vào những đặc tính mong muốn: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng cường chất lượng sợi… là điều rất cần thiết đối với ngành trồng bông của nước ta hiện nay Việc ứng dụng hệ thống

thanh lọc bằng đường mannose và chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây bông hiện vẫn còn mới mẻ tại Việt nam Việc sử dụng hệ thống

thanh lọc bằng đường mannose có ưu điểm vì không tạo ra sự lo ngại về an toàn sinh học như đối với hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh

Khóa luận “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vảI

SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” được thực hiện

nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải

SSR60F và Coker 312, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc

bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi được chuyển nạp

Trong nghiên cứu này, véctơ (vector) pManCa đã được thiết kế mang gen đánh

dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus và được chuyển nạp các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sau khi được chuyển nạp, mẫu cây được

nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có chứa mannose qua 3 vòng thanh lọc Kết quả được ghi nhận như sau:

Các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thường qua hai vòng thanh lọc trong môi trường có chứa mannose Ở vòng thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng mannose biểu hiện rõ Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở

cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F

Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trước khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển nạp gen thành công được chính xác

Cần tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc, kích thước mô sẹo, v.v để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose ờ bông vải Chú

ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chương trình tạo giống bông biến đổi gen

ở Việt Nam

ABSRACT

PHAM QUYET THANG, Nong Lam University August 2005

“STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON

CULTIVARS SSR60F AND COKER 312 BY USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ”

Supervisor: Dr Tran Thi Cuc Hoa

Study on gene transformation of cotton in order to tranfer of desirable traits like pest resistance, herbicide reistance, improved fiber quality …is necessary for the cotton industry of our country at present The application of mannose selection and

Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation method are still new in Vietnam

The application of mannose selection system has an advantage because it does not cause concerns on biosafety as the selection systems using antibiotics

The assignment “Study on the ability of gene transformation of two cotton

cultivars SSR60F and Coker 312 by using Agrobacterium tumefaciens” were carried

out to investigate the reponse ability of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 to

gene transformation, in which the study was focused on the use of mannose to screen calli of cotton after transformed

In this study, the vector pManCa was constructed carryring the selective marker

gene pmi (to facilate selection with mannose) and gene gus The hypocotyl segments

of 5 - 7 old seedlings in vitro of the two cotton cultivars were transformed by using Agrobacterium tumefaciens After transformed the explants were cultured on the

medium containing mannose passing three cycles of selection The results were recorded as follows

During the 1st and 2nd cycle selection with manose, calli of both cotton cultivars grew normally At the 3rd cycle of selection, the effect of mannose appeared obviously

It was recorded that all the non-transformed calli died, while with the transformed calli, the surivial percentage were 1.73% for the cultivar Coker and 3.67% for the cultivar SSR60F

The separation of calli into smaller pieces before culturing on the medium at the

3rd cycle of selection was necessary to prevent escape of non-transformed calli and to make the selection of putative transformed calli more precise

Further studies are needed to standardize the concentrations of mannose at each cycle of selection, the size of calli, etc to improve the efficiency of mannose selection for cotton Attention should be given to the cultivar SSR60F to be used in the breeding program to develop transgenic cotton cultivars in Vietnam

MỤC LỤC

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các bảng x

1 LỜI MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 3

1.3 Hạn chế của khoá luận 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Cây bông vải 4

2.1.1 Vị trí và phân loại 4

2.1.2 Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố 4

2.1.2.1 Gossypium hirsutum 4

2.1.2.2 Gossypium arboreum 5

2.1.2.3 Gosypium barbadense 5

2.1.3 Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam .6

2.1.4 Tình hình sản xuất bông trên thế giới 7

2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải 10

2.2.1 Hạn chế của phương pháp tạo giống truyền thống 10

2.2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải 10

2.3 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 13

2.3.2 Plamid Ti 14

2.3.2.1 Chức năng của T-DNA 15

2.3.2.2 Chức năng của gen Vir 17

2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm 19

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

3.1 Vật liệu 22

3.2 Địa điểm và thời gian thực hiện 22

3.3 Phương Pháp 22

3.3.1 Quy trình chuyển nạp gen 22

3.3.1.1 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy .22

3.3.1.2 Nguồn Plasmid 23

3.3.1.3 Chuẩn bị vi khuẩn 24

3.3.1.4 Đồng nuôi cấy 24

3.3.1.5 Thanh lọc và tái sinh cây 25

3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi 26

3.3.2.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo 26

3.3.2.2 Kết quả thanh lọc 26

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Sự hình thành mô sẹo 28

4.1.1 Đặc điểm hình thái mô sẹo 28

4.1.2 Tỷ lệ hình thành mô sẹo 31

4.2 Kết quả thanh lọc 34

4.2.1 Thanh lọc lần 1 34

4.2.2 Thanh lọc lần 2 36

4.2.3 Thanh lọc lần 3 38

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề nghị 43

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

gus gen gus (gen chỉ thị)

MSS1, MSS2, MSS3 Môi trường thanh lọc lần 1, 2, 3

OD600 Độ hấp thụ tối đa ở bước sóng 600 nm

plasmid Ti Plasmid kích thích tạo khối u (pTi)

2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

v/v thể tích/thể tích (volume/volume)

w/v trọng lượng/thể tích (weight/volume)

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 13

Hình 2.2 Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 14

Hình 2.3 Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA 19

Hình 2.4 Quá trình hoà hợp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây 20

Hình 2.5 Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây 21

Hình 3.1 Cây mầm trên môi trường nảy mầm 23

Hình 3.2 Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi 24

Hình 4.1 Các khúc trụ hạ diệp trên môi trường đồng MSCo 28

Hình 4.2 Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trường MSRe 29

Hình 4.3 Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trường MSS1 29

Hình 4.4 Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường MSS2 30

Hình 4.5 Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường MSS3 31

Hình 4.6 Mô sẹo trên môi trường MSRe 33

Hình 4.7 Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trường MSS1 36

Hình 4.8 Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trường thanh lọc 38

Hình 4.9 Mô sẹo giống Coker 312 trên môi trường MSS3 39

Hình 4.10 Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trường MSS3 40

Hình 4.11 Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) trên môi trường MSS3 41

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam .7

Bảng 2.2 Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới 8

Bảng 2.3 Mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới 9

Bảng 3.1 Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc 25

Bảng 3.2 Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải 27

Bảng 4.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 .32

Bảng 4.2 Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F 32

Bảng 4.3 Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 35

Bảng 4.4 Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F 35

Bảng 4.5 Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 36

Bảng 4.6 Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F 37

Bảng 4.7 Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 41

Bảng 4.8 Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F 41

CHƯƠNG 1 LỜI MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bông vải là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thỏa mãn nhu cầu bức thiết của con người sau ăn là mặc (Lê Quang Quyến, 2004) Cây bông cũng là cây lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai sau cây đậu tương, hơn nữa hạt bông còn là nguồn cung cấp protein làm thức ăn cho gia súc (Jiang, 2004) Cây bông vải được trồng ở khắp nơi trên thế giới, nhưng chủ yếu trồng ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong các nước trồng bông vải, Ấn Độ là nước có diện tích trồng bông lớn nhất (9,7 triệu ha)

chiếm 32%, kế đến là Mỹ 24%, Trung Quốc 20% (Satyavathi và ctv., 2002)

Ở Việt Nam, nghề trồng bông vải có từ lâu đời Cây bông vải từng là cây trồng quan trọng ở vùng Duyên Hải Nam Trung Bộ đặc biệt ở các tỉnh Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp (Lê Kim Hỷ, 2003) Sau ngày thống nhất đất nước, chúng ta đã nhiều lần

cố gắng tổ chức trồng bông lại ở các địa phương trên nhưng các kế hoạch đó đều không thành công Hai nguyên nhân chính làm thất bại các nỗ lực trên là: thị trường giá cả bấp bênh, nông dân không trồng bông vì không trừ được sâu đục quả bông dẫn đến người trồng bông thua lỗ (Lê Quang Quyến, 2004)

Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật và công nghệ nên đã cho ra đời các giống bông lai kháng sâu năng suất cao đưa vào sản xuất Tuy nhiên, sản lượng bông xơ chỉ mới đáp ứng một phần nhỏ (10-15%) nhu cầu vật liệu cho ngành dệt may Trước thực trạng đó, gia tăng sản lượng bông xơ là yêu cầu cấp thiết Dự kiến đến năm 2010, sản lượng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nước

và diện tích bông đạt 1 triệu ha vào năm 2010, tập trung chủ yếu ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, Đồng Bằng Sông Cửu Long (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003)

Việc cải thiện di truyền của các loài bông vải nhằm tăng năng suất cũng như tăng tính kháng sâu bệnh đã được quan tâm nhiều Kết quả là nhiều giống bông vải tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống Tuy nhiên, việc sử dụng các phương pháp này khó có thể khai thác được các nguồn gen có lợi một cách

có hiệu quả do rào cản bất tương hợp Công nghệ sinh học nói chung và công nghệ gen trên thực vật nói riêng có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống bông có nhiều đặc tính ưu việt như: kháng sâu bệnh hại, kháng thuốc diệt cỏ, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường (rét, khô, hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lượng cũng như chất

lượng của bông và sợi (Perlak và ctv., 2001) Tuy nhiên, việc chuyển nạp gen vào cây

bông vải đã gặp phải nhiều khó khăn Cây bông vải được xem là cây rất khó chuyển nạp gen với hiệu quả cao Hơn nữa, ở Việt Nam các phương pháp nuôi cấy mô hiện tại dùng để tái sinh cây chuyển gen từ các mô sẹo hoặc từ tế bào có khả năng sinh phôi chưa được xây dựng hoàn chỉnh Ngoài giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mô sẹo có khả năng sinh phôi sẽ có hình dạng dị thường do biến dị soma phát triển trong quá trình nuôi cấy mô Hiện nay, việc chuyển nạp gen mới chỉ thành công trên các giống nhóm Coker, hầu hết các gen mong muốn đều được chuyển vào các giống Coker

và sau đó đem hồi giao với các giống khác (Nobre và ctv., 2001)

Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chưa thành công nhiều, việc chuyển nạp gen chỉ được thực hiện bằng phương pháp vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001) Tuy nhiên, các phương pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhưng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây chuyển gen giả định là không được hoàn toàn, tạo ra các cây thể khảm, gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này Hơn nữa, ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào xác định loài bông vải nào đang được trồng

thích hợp việc chuyển nạp gen Chính vì thế chúng tôi thực hiện khóa luận: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F

VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

1.2 Mục tiêu

Khóa luận: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI

GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium

Tumefaciens” nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải

SSR60F và Coker 312 bằng phương pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens,

trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi được chuyển nạp

1.3 Hạn chế của khoá luận

Với quỹ thời gian ngắn (4 tháng) nên khóa luận chỉ có thể thực hiện phần chọn lọc bằng mannose (qua 3 lần chọn lọc), các bước tiếp theo sau khi chọn lọc chưa có điều kiện thực hiện

Khóa luận cũng chỉ giới hạn nghiên cứu ở hai giống bông vải, trong đó giống

SSR60F là giống bông đang trồng ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cây bông vải

2.1.1 Vị trí phân loại

Cây bông vải thuộc: Ngành hiển hoa bí tử (Angospermatophyta), Lớp song tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Phạm Hoàng Hộ, 1997)

2.1.2 Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố

Trong chi Gossypium có khoảng 39 loài và rất đa dạng, trong đó có sáu loài bông được canh tác là: G hirsutum, G arboreum, G barbadense, G herbaceum, G tricuspidatum và G perriri (Bộ GD và ĐT,Trường ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội,bộ môn Cây Công Nghiệp, 1996) Nhưng theo Jiang (2004), Brubaker và ctv (2002) chi Gossypium có khoảng 50 loài và có bốn loài được canh tác là: G hirsutum L., G barbadense L., G arboretum L., G herbaceum L., loài trồng phổ biến nhất thế giới là

G hirsutum Cũng theo Brubaker và ctv (2002) chi Gossypium phân bố ở phía Tây và

Nam Mexico khoảng 18 loài, ở Đông Bắc châu Phi và Arập khoảng 14 loài, và ở Australia khoảng 17 loài Trong sáu loài trên, ở Việt Nam trồng phổ biến ba loài đầu

2.1.2.1 Gossypium hirsutum

Loài G hirsutum thường được gọi là bông Luồi hay bông Tàu, có bộ nhiễm sắc

thể 2n = 52 (Jiang, 2004) Bông Luồi có nguồn gốc từ Trung Mỹ, nay được trồng lan rộng ra khắp nơi trên thế giới, sản lượng xơ bông Luồi chiếm khoảng 70% sản lượng toàn thế giới (Bộ GD và ĐT,Trường ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, bộ môn Cây Công Nghiệp, 1996) Bông Luồi được trồng nhiều nhất là ở Mỹ trên 95% (Jiang, 2004), Nga,

Ấn Độ, Mehico, Trung Quốc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc

Ở Việt Nam, bông Luồi du nhập vào nước ta khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế

kỷ XX Phần lớn các giống thuộc loài này do người Pháp đưa vào nhằm mục đích khai thác và sản xuất bông hàng hóa Về sau, loài này được du nhập vào bằng nhiều con đường khác nhau, chủ yếu thông qua các chương trình viện trợ của các tổ chức quốc

tế Qua quá trình thực nghiệm cho thấy loài này có khả năng thích ứng rộng, phù hợp

với điều kiện trồng bông nhờ nước trời ở nước ta Với tiềm năng cho năng suất cao và

có chất lượng xơ tốt, các giống bông này dần dần thay thế các giống bông Cỏ trước đó

(Lê Quang Quyến, 2004) Bông Luồi có nhiều loài phụ như: G hirsutum ssp Mexicanum, G hirsutum ssp Punctatum (Achum và Thonn), G hirsutum ssp

Panicultum (Balanco)…

2.1.2.2 Gossypium arboreum

Loài G arboreum thường được gọi là bông Cỏ Loài này có lẽ được trồng lâu

đời nhất, có nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ, lan truyền sang vùng Đông Nam Á, vùng

có gió mùa khí hậu ẩm ướt Bông Cỏ thường được trồng ở vùng đồng bằng nhưng cũng có trồng ở vùng núi cao 1500-2000 m Vùng sản suất chính là Ấn Độ, Trung Quốc,Việt Nam, Myanmar, Lào Hằng năm sản lượng bông Cỏ chiếm 20% tổng sản lượng bông thế giới Hiện nay, diện tích trồng bông Cỏ ngày càng thu hẹp do chất lượng xơ ngắn

Ở Việt Nam khoảng thế kỷ XIII- XIV loài bông này được trồng phổ biến khắp mọi miền đất nước, từ đồng bằng đến vùng Trung du và Miền núi Đến năm 1955, loài bông Cỏ vẫn còn phổ biến trên các vùng trồng bông ở Bắc Bộ và một số vùng thuộc Bắc Trung Bộ, trong lúc đó ở các vùng bông ở Nam và Trung Bộ đang dần thay thế bằng các giống bông Luồi

Các giống bông Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc hai loài phụ: G arboreum ssp Neglectum và G arboreum ssp Nanking, kể cả hai dạng bông lâu năm và hằng năm

(Lê Quang Quyến, 2004)

2.1.2.3 Gossypium barbadense

Loài G barbadense thường được gọi là bông Hải đảo, bông Ấn Độ Bông Hải

đảo có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay được trồng nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nước khác Bông hải đảo cung cấp khoảng 10% sản lượng bông sơ toàn thế giới và hiện nay diện tích trồng bông Hải đảo đang được mở rộng do phẩm chất xơ đặc biệt tốt

Ở Việt Nam, chưa tìm thấy tài liệu nào nói về loài bông Hải đảo được trồng phổ biến trong sản xuất và bắt nguồn từ đâu Loài này thường gặp dưới dạng cây lâu năm ở trong các vườn hoang và bờ giậu Đến năm 1941- 1945 mới du nhập một số giống như

Ghiza, Pima vào miền Nam, các giống Trường Nhung, Menufi, Tiến Vọt vào miền Bắc năm 1955-1956 qua chương trình hợp tác và trao đổi giống Qua quá trình nghiên cứu và thử nghiệm cho thấy loài bông Hải đảo thích hợp trong vụ khô có tưới, không hợp với điều kiện mưa nhiều độ ẩm cao

Bông Hải đảo có nhiều loài phụ như: G barbadense ssp Darwwinii (Watt) Mauner, G barbadense ssp redurale Mauner, G barbadense ssp Ventifolum (Lam)

và G barbadense ssp Eubarbadense Mauner

2.1.3 Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam

Trước thời Pháp thuộc, giống bông được sử dụng chủ yếu là các giống bông Cỏ

địa phương (Gossypium arboreum L.) Giống bông này cho năng suất thấp Một số ít diện tích ở Trung Bộ và Nam Bộ đã được trồng các giống bông Luồi (Gossypium hirsutumL.) nhập nội, với năng suất đạt 300 – 500 kg/ha Đầu thế kỷ 20, nước ta đã

xuất khẩu bông sang Nhật, Hồng Kông Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện tích trồng bông đã được phát triển mạnh trong đó liên khu V đạt khoảng 10.000 ha và liên khu IV đạt khoảng 13.000 ha

Sau năm 1954, các giống bông Luồi nhập nội đã thay thế một phần cho các giống bông Cỏ địa phương Sau năm 1975, năng suất bông hạt thấp chỉ đạt 3 – 4 tạ/ha Nguyên nhân năng suất và diện tích bông giảm ở giai đoạn này là do sâu bệnh phá hoại nặng và chưa có các giống bông thích hợp cho các vùng Do chí phí sản xuất quá lớn vì đầu tư thuốc trừ sâu rất cao, người trồng bông luôn bị thua lỗ, thêm vào đó môi trường bị ô nhiễm nặng, ngành bông Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn

Từ sau những năm 1990, ngành bông Việt Nam có những bước thay đổi mạnh

mẽ, chúng ta đã tạo được các giống bông, đặc biệt là các giống bông lai có năng suất cao, chất lượng xơ tốt, chống chịu được sâu bệnh Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật được

áp dụng như: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo

vệ thực vật, các biện pháp kỹ thuật canh tác khác như hệ thống luân canh xen canh hợp

lý, phủ màng PE cho bông, phun các chất điều hòa tăng trưởng…chính vì vậy mà năng suất và chất lượng bông xơ tăng, nghề sản xuất bông cho hiệu quả kinh tế cao Hiện nay, diện tích đã đạt hơn 35.000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trước đây

Bảng 2.1 Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam (Lê Quang Quyến, 2004)

6,0 9,0 8,0 10,0 9,0 11,0 10,5

6.866 10.986 16.245 17.578 20.340 32.530 36.960

2.1.4 Tình hình sản xuất bông trên thế giới

Vụ bông 2001- 2002, tổng diện tích bông trên thế giới là 33,5 triệu ha, trong đó các nước đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nước phát triển chỉ chiếm có 30% diện tích Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới được liệt kê ở bảng 2.2, trong đó Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha Điều đáng chú ý là 70% diện tích bông thế giới được trồng ở các nước miền nam và diện tích trồng của ba nước châu Á

là Ấn Độ , Trung Quốc, Pakistan đã chiếm khoảng 50% diện tích trồng bông thế giới (ISAAA, 2002)

Bảng 2.2 Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002

( ISAAA, 2002) STT

Nước Diện tích (triệu ha)

Benin

8,730 5,596 4,824 3,125 1,453 0,75 0,654 0,550 0,516 0,415

Sản lượng bông thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1960-1961 lên 21,1 triệu tấn niên vụ 2001-2002, tức là tăng hơn 116% sau 40 năm Danh sách mười nước

có sản lượng bông xơ lớn nhất thế giới được liệt kê ở bảng 2.3, trong đó Trung Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn Điều đặc biệt là trong mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới thì có sáu nước là các nước đang phát triển Về năng suất Australia dẫn đầu với năng suất là 1.658 kg bông xơ/ ha, tiếp theo là Syria 1.303 kg bông xơ/ha và Trung Quốc 1.103 kg bông xơ/ha

(ISAAA, 2002)

Bảng 2.3 Mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002

Ai cập

5,320 4,420 2,508 1,853 1,055 0,880 0,750 0,670 0,335 0,314

999 1.658 1.303

994

Trong khi đó, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng Diện tích trồng bông trên thế giới năm 2004 là 32 triệu ha (ISAAA, 2004), trong đó bông chuyển gen chiếm 28% (9 triệu ha) So với năm 2003 diện tích bông chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2004 so với 7,2 triệu ha trong năm 2003) Trong số các nước trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nước có diện tích trồng bông chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003) Năm 2003, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn

ha bông chuyển gen nhưng năm 2004 diện tích bông chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha Trung Quốc cũng là nước có sự gia tăng diện tích trồng bông chuyển gen đáng chú ý: năm 2003 có 2,8 triệu ha nhưng năm 2004 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bông) Theo dự báo của các chuyên gia diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hướng chuyển gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu nhưng bên cạnh đó chất lượng sợi bông cũng được quan tâm nhiều (ISAAA, 2004)

2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải

2.2.1 Những hạn chế của phương pháp tạo giống truyền thống

Cây bông đóng một vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dệt may thế giới Chính vì vậy mà việc cải thiện giống bông để nâng cao năng suất cũng như chất lượng sợi bông thì rất được chú ý Các phương pháp tạo giống truyền thống như: lai đơn, lai với loài hoang dại, hồi giao, đột biến đã được sử dụng để đưa các tính trạng như: năng suất cao, chất lượng sợi cao và kháng bệnh vào các giống bông Kết quả là tạo ra những giống bông có năng suất cao và phẩm chất sợi tốt Tuy nhiên, các phương pháp tạo giống truyền thống đã không đáp ứng được yêu cầu ngày càng cao về chất lượng sợi bông, về sản lượng bông cũng như về khả năng kháng sâu bệnh Thêm vào

đó, hiện nay trong các giống bông chưa tìm thấy các gen kháng sâu bệnh chính vì thế

mà rất khó tạo ra một giống bông kháng sâu bệnh bằng phương pháp lai tạo truyền

thống

2.2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải

Hiện nay, trong nghiên cứu chuyển nạp gen với nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp xung điện, phương pháp vi tiêm, phương pháp sử dụng PEG (polyethylene glycol), phương pháp bắn gen và phương pháp chuyển nạp gen bằng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens Nhưng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng

súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù đã

được báo cáo (McCabe và Martinell, 1993, Rajasekaran và ctv., 2000), phương pháp chuyển nạp gen bằng Agrobacterium tumefaciens (Rajasekaran, 1996, Satyawathi và ctv., 2002, Umbeck và ctv., 1987)

Nghiên cứu chuyển nạp gen thành công bằng Agrobacterium tumefaciens trên cây bông vải được công bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv.,

1987, Umbeck và ctv., 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp Trong nghiên cứu

của mình, Firoozabady đã sử dụng mẫu cấy tử diệp 12 ngày tuổi để đồng nuôi cấy với

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid có chứa gen kháng kanamycin

Sau ba ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy sẽ được chuyển lên môi trường tạo mô sẹo có chứa kanamycin Kết quả là có hơn 80% các mô sẹo sống sót trên môi trường có chứa yếu tố chọn lọc kanamycin Từ đó nhiều gen được chuyển thành công vào cây bông

nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng, gen

kháng thuốc diệt cỏ (Chen và ctv., 1994; Perlak và ctv., 1990) Các loại mẫu cấy như

trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng như phôi non đã được dùng

trong việc chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv., 1987, Perlak và ctv., 1990) Gould và Cedeno (1998) đã sử dụng

đỉnh chồi làm mẫu cấy phục vụ cho việc chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi

đã được sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv., 1995) Chuyển gen bằng súng bắn gen đã được Finer và McMullen (1990) thực hiện

trên dịch huyền phù tế bào và kết quả là thu được cây chuyển gen Trước đó Finer và Smith (1984) đã thực hiện nghiên cứu tạo mô sẹo và phôi soma từ mẫu cấy là thân và cuống lá Súng bắn gen cũng được sử dụng để chuyển gen vào các mô thu được từ việc

tái sinh phôi soma (Rajasekaran, 1996, Reichert và ctv., 2002)

Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường khá thấp, biến động 20 – 30% khi trụ hạ diệp

được dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv., 1987, Rajasekaran, 1996) Một hiệu quả

chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã được công bố khi trụ hạ diệp được dùng

làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) được dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv., 1987) Chaudhary và ctv (2003) cũng

báo cáo với mẫu lây nhiễm là phôi soma sau khi thanh lọc tỉ lệ mẫu biểu hiện GUS là

75% Nhưng chỉ là kết quả của thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc và gen gus Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp ở song tử diệp chỉ khoảng

20-30%, hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp hơn khi sử dụng phương pháp bắn gen Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy được dùng trong chuyển nạp gen có ảnh hưởng đến hiệu quả của chuyển nạp gen và tái sinh cây Ví dụ người ta cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp dương tính giả, tử

diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv., 1987) Nghiên cứu về chuyển

nạp gen trên cây bông vải, Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh

hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Nghiên cứu này cho thấy các yếu tố như chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen Thêm vào đó kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trường chọn

lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001) Theo Chen và ctv (2000) để chuyển nạp gen có

hiệu quả nhiệt độ trong giai đoạn đồng nuôi cấy không lớn hơn 280C, thời gian chiếu

sáng 16h sáng/8h tối là thích hợp cho tất cả các giai đoạn chuyển nạp gen và tái sinh Ngoài ra, pH môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển nạp gen

Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp gen như bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thường khó có thể tái sinh và chuyển nạp được Sự thiếu một phương pháp tái sinh cây hiệu quả đã được xem như là một rào cản chính cho việc áp

dụng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady

và ctv., 1987) Để cải tiến phương pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu

quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy phải được phát triển, cùng với môi trường cải tiến thích hợp Hiện nay, Trung Quốc thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phương pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhưng phương pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây được tạo

thành nhưng chỉ một số ít cây được chuyển nạp gen (Chen và ctv., 2000)

2.3 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào bộ gen sinh vật đang nghiên cứu Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã

mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra các cây trồng mang những tính trạng di truyền mong muốn Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã được ghi nhận bằng cách sử dụng vectơ plasmid Ti, thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn

được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chi Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và

kí chủ Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A radiobacter (loài này không gây bệnh cho cây), A tumefaciens và A rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ, A rubi gây bệnh khối u trên cây mía Gần đây nhất một loài mới vừa được đề nghị là A vitis,

loài này gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Ophel và Kerr, 1990)

Hình 2.1 Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra A: một

khối u lớn trên thân cây hoa Hồng, B: các khối u trên cành Nho

(Deacon và ctv., 2005)

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv., 2005) Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có

5-11 lông roi Vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt độ 290C trong môi trường có bổ

sung một chút mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm do

nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000) Khi rễ cây xuất hiện vết thương, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có mang gen tạo khối u và được biết đến với tên gọi là pTi Plasmid Ti cũng mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây Những vi khuẩn không mang pTi được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, ban đầu được tìm thấy ở gốc cây Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi (hình 2.1 và 2.2) Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn

khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu Các khối u có đường kính đến 30 cm nhưng phổ biến là 5-10 cm Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên pTi sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine Vi khuẩn sẽ sử dụng

chất này như một nguồn cacbon cho các hoạt động biến dưỡng(Zhu và ctv., 2000)

Hình 2.2 Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

tạo ra (nguồn http://biologi.uio.no/plfys/haa/gen/gmo.htm)

Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thước

là 2,6 Mb Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước 200-800 kbp (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập Plasmid này có tên gọi là plasmid Ti , hầu hết các gen gây khối u đều

nằm trên plasmid này (Deacon và ctv., 2005)

2.3.2 Plamid Ti

Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn Việc xác định pTi như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động của một giai đoạn

mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens Điều này đã mở ra khả năng

nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T-DNA-trình tự mã hoá được chuyển vào

trong cây, vùng vir-vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep-cần cho sự tái bản của pTi, vị trí tra và trb- tham gia vào quá

trình chuyển tiếp hợp của pTi, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine

(Zhu và ctv., 2000) Trong cấu trúc của pTi, hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển

gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA

và gen Vir (Gelvin, 2003)

2.3.2.1 Chức năng của T-DNA

T-DNA đã được nghiên cứu rất kỹ Đó là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kbp (Gelvin, 2003), trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong pTi, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải

và bờ trái Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có kích thước 25 bp (Gelvin, 2003) Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và được đề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước rồi tiến dần về phía trái Việc đảo ngược bờ phải

sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và ctv., 1992, Gelvin, 2003) Các trình tự

bờ không chỉ là mục tiêu của của VirD1/VirD2 endonuclease mà còn là vị trí gắn của protein VirD2

T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây bao gồm kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box), yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và

làm thay đổi hình dạng bên ngoài Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự

chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin) Sản

phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và

Costantino, 1998) và các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử

hydro của một nhóm methyl của isopentenyl Hai gen trên T-DNA khác được cho là có

chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b) Sản phẩm của gen 5 điều

khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và

ctv., 1991) Trong khi đó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ nhạy cảm của

các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích (Tinland và

ctv., 1992) Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây

khối u khác

Một nhóm gen được chuyển thứ hai điều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho

vi khuẩn, đó là các opine Đây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto

(keto) axit hoặc một đường (Dessaux và ctv., 1998) Các tế bào chuyển gen tổng hợp

và tiết ra một số lượng lớn các opine Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985) Dựa trên các kiểu opine được tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn

Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và

leucinopine Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt Cho ví dụ, các plasmid Ti kiểu octopine điều khiển tổng

hợp ít nhất 8 opine Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate

với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và tất cả những opine này đều được tìm thấy trong các khối u

(Dessaux và ctv., 1998) Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine

hoặc glutamic axit với glucose (mặc dù điều này chưa được chứng minh bằng thực

nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic axit Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine

thành agropine Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic axit

(Dessaux và ctv., 1998) Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi plasmid Ti kiểu octopine

có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine

2.3.2.2 Chức năng của gen Vir

Vùng Vir trên plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên

mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thước khoảng 30-

40 kbp (de la Riva và ctv., 1998) Theo Stachel và ctv (1987) vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là: virA, virB, virC, virD, virE và virG Những gen vir này

mã hoá cho các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, tạo đoạn T-DNA sợi đơn, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ (Gelvin, 2003)

Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua dấu

hiệu hoá học tiết từ vết thương Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo

ra được nhận biết trước tiên bởi protein VirA, rồi đến protein VirG để làm kích hoạt

các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết Gen vir được kích hoạt tối đa

ở pH axit với sự hiện diện của các hợp chất phenon như là acetosyringone (AS), chất

mà được giải phóng khi tế bào cây bị tổn thương (Stachel và ctv., 1987) Hệ thống điều hoà gen vir hoạt động thông qua hai gen độc: virA và virG Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào Protein VirA đáp ứng với sự trao

đổi chất của vết thương của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể được kích thích bởi đường, các opine khối u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001) Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá Sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG được phosphoryl hoá bởi

aspartic axit còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv., 1990) và kích hoạt sao

mã cho tất cả các gen vir Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12 bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv., 1987) Sự phosphoryl hoá làm cho protein VirG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH (Ziemienowicz,

2001)

Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn (hình 2.3)

và đưa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây Các protein được mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA Protein VirD2 là một endonuclease,

protein này sẽ cắt T-DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp

để tạo ra phân tử sợi đơn DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn DNA Protein VirD2 được tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ ở

T-vị trí tương đồng (Deng và ctv., 1998) Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn

DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào

cây (Deng và ctv., 1998) Protein VirE2 là protein chiếm số lượng nhiều nhất Protein

VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy đưa phức hợp

T-DNA vào nhân Hai sản phẩm của gen vir cũng được cho là có chức năng trong việc

tạo T-DNA sợi đơn là: VirC1 và VirC2 VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng

“overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở

vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003) Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn Nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp Do đó đề nghị rằng

chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv., 2000) Ngoài ra, protein

VirD2 được cho là có chức năng trong sự kết nạp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước kết nạp Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp T-DNA đã được

đề nghị: VirD2 hoạt động như một enzyme integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001)

Cùng với protein VirD4, mười một protein VirB, VirE2 và VirF tham gia đưa

T-DNA vào nhân Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hóa bởi operon virB, operon

này mang 11 gen Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon

virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất

khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado, 1998) Các protein VirB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tương tự như chiên mao tiếp hợp) và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase

và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA, hoặc cả hai Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của cây được

thực hiện (Zhu và ctv., 2000) Cầu nối VirB có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bởi

protein VirD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp Hệ thống VirB/VirD4 đưa phức hợp T-DNA–VirD2 và protein VirE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-DNA cuối cùng được tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein VirE2 (Ziemienowicz, 2001)

2.3.3.3 Cơ chế lây nhiễm

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề

mặt rễ cây Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tạo ra Nhưng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây

bị tổn thương do nhiều nguyên nhân Yêu cầu về vết thương cho việc xâm nhiễm có thể dễ dàng được chứng minh bằng các thí nghiệm Trong điều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học Điều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần phổ biến khác trong rễ Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang pTi sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như acetosyringone Chất này có tác dụng rất mạnh mặc dù ở nồng độ thấp (10-7 M) Bởi vậy, một trong những chức năng của pTi là

mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm Ở nồng

độ cao (10-5

– 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên pTi (Deacon và ctv., 2005) Các gen vir được kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25-270C Tuy nhiên, hầu hết các chủng

Agrobacterium hoạt động ổn định ở nhiệt độ 18-200C (Gelvin, 2003)

Hình 2.3 Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA

(nguồn Valentine, 2003)

Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo T-DNA sợi đơn

trong tế bào vi khuẩn (hình 2.3) Quá trình tạo T-DNA sợi đơn được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và VirD2 thực hiện Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T-DNA Ngoài VirD1, VirD2 người ta còn cho rằng VirC1 và VirC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi đơn Phức hợp

T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 được chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ

thống chuyển nạp được mã hoá bởi các gen virB Cùng với một số thành phần trong tế

chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001)

Hình 2.4 Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây

(nguồn Valentine, 2003)

Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây (hình 2.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây đã được đề nghị Theo mô hình này, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3’ của T-DNA đều được enzyme nuclease thực hiện Cuối cùng nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tương đồng (microhomology) trên DNA cây

và gắn vào Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn

(Ziemienowicz, 2001) Các opine được tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium

nhiễm vào được vi khuẩn biến dưỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opin trên pTi Tùy theo kiểu opine mà được chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985)

Khả năng chuyển nạp đoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào cây

cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật và do đó chuyển nạp

gene qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium là một trong những kỹ thuật được sử

dụng phổ biến trong chuyển nạp gene cây trồng Trong thời gian ban đầu, phương

pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do tin rằng Agrobacterium chỉ

có thể nhiễm vào cây hái lá mầm Sau này, người ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium

chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhưng nó có thể nhiễm vào cây một lá mầm và không tạo khối u (Ziemienowicz, 2001)

Hình 2.5 Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây

(nguồn Zhu và ctv., 2000)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

Giống bông vải: hạt của giống bông vải Coker 312 (đối chứng), SSR60F được

thu từ nhà lưới của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long Hạt của các giống bông vải này phải đảm bảo là các hạt tự thụ

Mẫu cấy: Trụ hạ diệp của cây mầm 5-7 ngày tuổi

Dụng cụ, hóa chất, nguồn vi khuẩn và hóa chất: Các dụng cụ và hóa chất

chuẩn bị cho nuôi cấy mô, chuyển nạp gen và xét nghiệm sinh học của phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục)

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen,

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Cờ Đỏ, Tp Cần Thơ

Thời gian thực hiện: Nghiên cứu được tiến hành từ ngày 21 tháng 3 năm 2005

đến ngày 31 tháng 7 năm 2005

3.3 Phương pháp

3.3.1 Quy trình chuển nạp gen

3.3.1.1 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy

Hạt của các giống bông vải được đốt lớp bông xơ bao quanh bằng axit sulfuric (H2SO4) đậm đặc (98%), rồi rửa với nước máy cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 400C cho đến khi đạt độ ẩm 14% (khoảng 48h)

Hạt được khử trùng bề mặt với cồn 700 (2 phút) và rửa hai lần bằng nước cất vô trùng Sau đó, hạt được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) bổ sung thêm 2 hoặc 3 giọt Tween 20 và lắc ở tốc độ 80 rpm Thao tác khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) được lặp lại hai lần, mỗi lần 10 phút và giữa hai lần khử trùng hạt được rửa bằng nước cất tiệt trùng Sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% (w/v), hạt được