Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây chóc máu (salasia chinensis l ) học dây gối(celastraceae) và cây ngọc nữ biển (clerodendrum inerme gaertn ) họ cỏ roi ngựa(verbenaceae)

Chúng ựược dùng ựể sản xuất thuốc chữa bệnh, các chất bảo vệ và ựiều tiết sinh trưởng thực vật, và là nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩmẦViệc nghiên cứu tìm kiếm các

-

TRẦN THỊ MINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGÀNH : HÓA HỮU CƠ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

CÂY CHÓC MÁU (SALACIA CHINENSIS L.) HỌ DÂY GỐI

(CELASTRACEAE) VÀ CÂY NGỌC NỮ BIỂN (CLERODENDRUM INERME

GAERTN.) HỌ CỎ ROI NGỰA

1.1.4.5 Triterpen khung taraxeran (friedooleanan) 17

1.2.2 Hoạt tính sinh học và ứng dụng trong y học cổ truyền 23

2.1 Các phương pháp sắc ký ñể phân lập các chất từ dịch chiết 30 2.2 Các phương pháp xác ñịnh cấu trúc của những chất phân lập ñược 30

3.1 Mẫu thực vật, thiết bị và hóa chất 33

3.1.3 Hóa chất và các hệ dung môi chạy bản mỏng 34

3.2.1 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu tại Thừa Thiên

3.2.3.2 Phân lập và tinh chế các chất từ lá cây Ngọc nữ biển 51

3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các dịch chiết và các

Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1 Cây Chóc máu thu tại Thừa Thiên Huế (mẫu SC-01) 56

4.2.2 Thành phần hóa học của dịch chiết n-hexan từ cành Chóc máu 69 4.2.3 Thành phần hóa học dịch chiết ethyl axetat của cành Chóc máu 72

4.2.3.1 Chất SCE1 (124): 7α,21α-dihydroxyfriedelan-3-on 73 4.2.3.2 Chất SCE3 (123): 7α,29-dihydroxyfriedelan-3-on 82 4.2.3.3 Chất SCE2 (125): 21α,30-dihydroxyfriedelan-3-on 90 4.2.4 Các chất từ dịch chiết n-hexan của lá Chóc máu 92

4.2.4.4 Chất S9 (78): axit 3,4-secofriedelan-3-oic 95 4.2.5 Quercitrin (SF1) từ dịch chiết ethyl axetat của lá Chóc máu 97 4.2.6 Mangiferin (SF2) từ lá Chóc máu thu tại Quảng Bình 98

4.3.2.2 Chất CE2 (128): stigmast-5-en-3β-ol 103 4.3.2.3 Các flavon: acacetin (CE3) và apigenin (CE4) 104

4.4.1.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh của các dịch chiết từ cây

• 1

H-NMR (MHz, dung môi ño): phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

•13

C-NMR (MHz, dung môi ño): phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

• DEPT: Distortionless enhancement by polarization transfer

• HSQC (heteronuclear singlet quantum coherence): phổ cố kết ña lượng tử dị hạt nhân

• HMBC (heteronuclear multiple bond correlation): phổ tương quan ña liên kết dị hạt nhân

• NOESY (nuclear Overhauser effect spectroscopy): phổ hiệu ứng NOE

• 1H-1H-COSY (1H-1H correlation spectroscopy): phổ tương quan proton-proton

• EI-MS: phổ khối va chạm electron

• ESI-MS: phổ khối phun mù ñiện tử

• HR-MS (high-resolution mass spectrometry): phổ khối phân giải cao

• IR (KBr) νmax (cm-1): phổ hồng ngoại

• SKC, silicagel: sắc ký cột sử dụng silicagel

• SKLM: sắc ký lớp mỏng

• ñ.n.c: ñiểm nóng chảy

• MeOH: methanol

• EtOAc: ethyl axetat

• EtOH: ethanol

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

Trần Thị Minh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất ựến GS TSKH Trần Văn Sung và PGS TS Vũ đào Thắng là những người ựã tạo mọi ựiều kiện và hướng dẫn tôi từng bước trong suốt quá trình thực hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hoàng Anh về sự chỉ bảo sâu sát

và nhiệt tình trong quá trình thực nghiệm cũng như những ý kiến quắ báu trong lĩnh vực phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối, TS J Schmidt - Viện Sinh hóa thực vật Halle Ờ Cộng hòa Liên bang đức trong việc ựo phổ khối phân giải cao

Luận án này ựược hoàn thành với sự giúp ựỡ, cộng tác vô tư và nhiệt tình của các thầy cô, anh chị và các bạn ựồng nghiệp Bộ môn Hóa Hữu cơ Ờ Khoa Công nghệ Hóa học Ờ Trường đại học Bách khoa Hà Nội và Phòng Tổng hợp Hữu cơ Ờ Viện Hóa học Ờ Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ký tên

Trần Thị Minh

STT Tên bảng biểu và sơ ñồ Trang

Bảng 4.2 Số liệu phổ 13C-NMR của SPA1, SPA1-TP, và SPA2 72

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR, HSQC, 1H-1H COSY, HMBC của SCE1 81

Bảng 4.4 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR, HSQC, H-H COSY, HMBC của SCE3 89

Bảng 4.9 Dữ liệu các phổ 1H-, 13C – NMR, HMBC và H-H COSY của CE5 109

Bảng 4.10 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh của các dịch chiết từ cây

Sơ ñồ 3.3 Phân lập các chất từ cặn chiết n-hexan của cành cây Chóc máu

thu tại Thừa Thiên Huế

36

Sơ ñồ3 4 Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl axetat của cành cây Chóc

máu thu tại Quảng Bình

1 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ đào Thắng, Trần Văn Sung (2009), Các kết quả tiếp theo về thành phần hóa học của cây Chóc máu

(Salacia chinensis L.), Tạp chắ Hóa học, Vol 47 (4A), pp 192-196

2 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung

(2009), Chemical constituents of Salacia chinensis L growing in Vietnam, Journal of Chemistry of Vietnam, Vol.47(2A), pp.469-473

3 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung

(2009), Chemical constituents from Clerodendrum inerme species in Viet Nam, Traditional and Alternative Medicine (Research & Policy Perspectives), pp

170-174

4 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung

(2008), Study on chemical constituents of Salacia chinensis L collected in Vietnam, Z Naturforsch., Vol 63b, No 12, pp 1411-1414

5 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung

(2008), Triterpenes from Salacia chinensis L collected in Quang Binh Province, Viet Nam, International Scientific conference on ỘChemistry for development and IntegrationỢ, Hanoi, pp 397-402

6 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, Tran Van Sung

(2008), Study on chemical constituents of Salacia chinensis L collected in Thua Thien Hue, Journal of Chemistry of Vietnam, Vol.46(1), pp.47-51

7 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ đào Thắng, Trần Văn Sung (2008), Một số kết quả nghiên cứu thành phần hóa học cây Ngọc nữ biển Việt

Nam (Clerodendrum inerme), Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hóa Dược toàn Quốc lần thứ I, Hà Nội 12/2008, Tr 285-290

8 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ đào Thắng, Trần Văn Sung (2007), Bước ựầu nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tắnh sinh

(2007), Andrograholid và lupenyleste từ cây Ngọc nữ biển Việt Nam

(Clerodendrum inerme Gaernt.), Tạp chí Hóa học, T.45 (6A), Tr 166-170

đẶT VẤN đỀ

Hợp chất thiên nhiên, ựặc biệt là các hợp chất có hoạt tắnh sinh học ựóng vai trò quan trọng trong ựời sống con người Chúng ựược dùng ựể sản xuất thuốc chữa bệnh, các chất bảo vệ và ựiều tiết sinh trưởng thực vật, và là nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩmẦViệc nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên mới có hoạt tắnh và biến ựổi cấu trúc hoá học của chúng ựể ựạt ựược các chất

có hoạt tắnh mong muốn cao hơn, góp phần giải quyết những vấn ựề mang tắnh toàn cầu về sức khoẻ cộng ựồng, về dinh dưỡng và về môi trường sinh thái,Ầ hiện ựang

là vấn ựề ựược nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu Nhờ các kỹ thuật phân lập, chuyển hóa và xác ựịnh cấu trúc các chất, cũng như của những kỹ thuật thử hoạt tắnh sinh học mà gần ựây người ta ựã phát hiện ra nhiều hoạt tắnh mới, quắ báu của những hợp chất thiên nhiên ựã biết cũng như của những hợp chất thiên nhiên mới đã có rất nhiều hợp chất thiên nhiên ựược sử dụng ựể làm thuốc chữa các bệnh hiểm nghèo như: HIV/AIDS, ung thư, viêm nhiễm, tiểu ựường, tim mạch,Ầ Vắ dụ ựiển hình là việc sử dụng vinblastin một hợp chất ựược phân lập từ cây Dừa cạn làm thuốc chữa ung thư [64] Hoạt tắnh kháng HIV của axit betulinic và các dẫn xuất của nó, một loại chất thuộc nhóm triterpen tồn tại phổ biến trong thực vật cũng ựược phát hiện và ựang ựược quan tâm nghiên cứuẦ.[44] Các hợp chất thiên nhiên ngày càng cuốn hút mạnh mẽ sự chú ý của các nhà khoa học,

ựó là do chúng là nguồn quan trọng ựể phát hiện các thuốc mới trong thế kỷ 21 Việt Nam là một nước có thảm thực vật rất phong phú và ựa dạng, theo ước tắnh có khoảng hơn 12000 loài, trong ựó có ựến 3830 loài ựược dùng làm thuốc, nhưng phần lớn chúng ựều chưa ựược ựiều tra, nghiên cứu một cách ựầy ựủ và có hệ thống Do vậy chúng ta chưa ựặt ựược kế hoạch khai thác, sử dụng và bảo vệ một cách hợp lý

Chi Salacia họ Dây gối (Celastraceae) và chi Clerodendrum họ Cỏ roi ngựa

(Verbenaceae) là các chi lớn và phân bố rộng rãi, nhất là ở các nước nhiệt ựới Có

rất nhiều loài trong hai chi này ñược dùng làm thuốc chữa bệnh trong dân gian ở nhiều nước như Trung Quốc, Ấn ðộ, Thái Lan, … Thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của thực vật thuộc các chi này ñã ñược nghiên cứu tương ñối nhiều trên thế giới ðây là các chi có tiềm năng rất lớn về khai thác ñể làm thuốc chữa bệnh Tuy nhiên, ở Việt Nam mới chỉ một số rất ít loài trong các chi này ñược nghiên cứu về hóa học Một số loài ñược sử dụng trong dân gian ñể làm thuốc chữa bệnh nhưng chưa ñược nghiên cứu cụ thể và hệ thống, trong ñó có cây Chóc máu

(Salacia chinensis L.) và cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.)

Vì vậy, nhiệm vụ của luận án này là tiến hành thu thập mẫu, xác ñịnh tên khoa học, nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của của hai loài chưa ñược nghiên cứu ở Việt Nam ñó là:

1- Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.), thuộc chi Salacia họ Dây gối

(Celastraceae)

2- Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.), thuộc chi Clerodendrum

họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae)

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.)

1.1.1 ðặc ñiểm thực vật

Theo thống kê, họ Dây gối (Celastraceae) có 15 chi và 79 loài, trong ñó chi

Salacia có khoảng 14 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt ñới như: Việt Nam,

Mianma, Thái Lan, Lào, Campuchia, Trung Quốc, [2], [4]

Cây Chóc máu, còn gọi là Chóp máu, Sa lạp mộc có tên khoa học là Salacia chinensis L., chi Salacia họ Dây gối (Celastraceae)

Hình 1.1: Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.)

Cây Chóc máu là loài cây bụi cao 2-3m, cành nhỏ có cạnh Lá chất da hình bầu dục dài 3,5 -11cm, ñỉnh tù hoặc hơi nhọn, mép nguyên hay có răng tù, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới có màu lục nâu, gân bên 6-8 cặp, cuống lá dài 0,8-1cm Hoa nhỏ màu vàng nhạt, gồm 2-6 cái ở nách lá, cuống hoa dài 6 ñến 10mm, lá ñài 5, hình tam giác, dài khoảng 3mm, mở rộng hoặc cong ra ngoài, ñĩa mật hình cốc, cao khoảng 1mm, nhị 3 ô, mỗi ô có 2 noãn Quả mọng, hình cầu hay hình trứng hoặc

hình quả lê, cao 1-1,5cm, khi chín có màu ñỏ tím, một hạt Phân bố nhiều ở các vùng từ Nghệ An, Quảng Trị ñến Thừa Thiên Huế Tên ñồng nghĩa của cây này là

Salacia prinoides (Willd.) DC [4]

1.2.2 Hoạt tính sinh học và ứng dụng trong y học cổ truyền

Cây Chóc máu có vị chát, tính ấm có tác dụng khu phong, trừ thấp Dân gian thường dùng rễ và lá sắc uống chữa viêm khớp, phong thấp, cơ thể suy nhược Nước sắc của thân cây có tác dụng hỗ trợ phẫu thuật giúp cho bệnh nhân trung tiện, trợ tim, kháng khuẩn,… [2]

Trong các bài thuốc dân gian của các nước như: Ấn ðộ, Thái Lan,… các loài

thuộc chi Salacia nói chung và cây Salacia chinensis L thường ñược dùng ñể chữa

Phép thử in vitro và in vivo cho thấy cặn chiết methanol từ thân của loài Salacia chinensis ở Thái Lan có khả năng chống lại sự tăng quá mức ñường huyết

trong sucrose và maltose nạp của chuột, có tác dụng ức chế men α-glucosidase trong dịch ruột, ức chế men khử hóa aldose Hai hợp chất có tác dụng ức chế

α-glucosidase là salacinol (53) và mangiferin (52) ñã ñược phân lập từ thân

của loài cây này [31], [54], [55]

1.1.3 Vài nét về tình hình nghiên cứu cây Chóc máu (Salacia chinensis L.)

Trên thế giới, cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu hái tại Thái Lan và Ấn

ðộ bắt ñầu ñược nghiên cứu về hóa học từ năm 2002

Từ dịch chiết metanol 80% của thân cây Salacia chinensis L có nguồn gốc ở

Thái Lan, lần ñầu tiên Morikawa Toshio và cộng sự ñã phân lập và xác ñịnh ñược

cấu trúc hóa học của 3 triterpen khung friedelan ñặt tên là salason A (1), B (2), C (3), một norfriedelan-triterpen là salaquinon A (4) và một eudesman-sesquiterpen là

salasol A (5) vào năm 2003 Các hợp chất này ñã ñược thử nghiệm có tác dụng ức

chế men khử aldose lên thủy tinh thể của chuột [59] Cũng từ cây này, nhóm tác giả

trên ñã phân lập ñược thêm 2 friedelan-triterpen mới là salason D (6) và E (7) [8]

Nghiên cứu mới nhất (năm 2008), từ lá của loài Salacia chinensis thu ở Thái

Lan nhóm tác giả này ñã phân lập và nhận dạng ñược thêm 8 triterpen có các bộ

khung dammaran, lupan, oleanan ñặt tên là foliasalacin A1 (8), A2 (9), A3 (10), A4 (11), B1 (12), B2 (13), B3 (14), và C (15) [53]

Từ cặn chiết ethyl axetat của lá loài cây này nhóm tác giả trên ñã phân lập và xác ñịnh thêm ñược ba triterpen mới có khung D:B-friedobaccharan là foliasalacin

D1 (16), foliasalacin D2 (17) và foliasalacin D3 (18), cùng với 20 triterpen ñã biết khác là 3β-hydroxy-20-oxo-30-nor-lupan (19), 29-nor-lupan-3,20-dion (20), 20(29)- lupen-3β,15α-diol (21), betulin (22), 20(29)-lupen-3-on-28-ol (23), axit betulinic (24), 20(29)-lupen-3β,30-diol (25), 30-hydroxy-20(29)-lupen-3-on (26), 3β,20- dihydroxylupan (27), friedelin (28), 4-epifriedelin (29), friedelan-3-on-29-ol (30), octandronol (31), 12β-hydroxyD:A-friedooleanan-3-on (32), axit oleanoic (33),

erythrodiol (34), axit ursolic (35), uvaol (36), 19α-H-taraxastan-3β,20α-diol (37), isoursenol (38), và 3-dehydrohancokinol (39) [96]

Như vậy, loài Salacia chinensis L có nguồn gốc từ Thái Lan bắt ñầu ñược

các nhà khoa học Nhật Bản quan tâm nghiên cứu từ năm 2002 Cho ñến nay ñã có

38 triterpen có các bộ khung khác nhau ñã ñược phân lập và nhận dạng Dưới ñây là công thức của các chất phân lập từ loài cây này:

1

O

O

1 2 3 4 5 6 25 7 8 9 10

11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

23 24

27

28

29 30

26 OH

2

O

1 2 3 4 5 6 25 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

23 24

27

28 30

OH

CH2OH 29

3

H

H OH

34: R = CH2OH

35: R = COOH 36: R = CH2OH

39

Năm 2008, từ lá cây Chóc máu Thái Lan, Yi Zhang và cộng sự ñã phân lập và

nhận dạng ñược 7 hợp chất mới, ñó là các glycosid của Foliasalaciol E (40) và một

số glycosid khác [97]

Foliasalaciol E (40)

Foliasalaciosid E1 (41) Foliasalaciosid E2 (42)

Foliasalaciosid E3 (43) Foliasalaciosid F (44) Foliasalaciosid G (45)

Foliasalaciosid H (46) Foliasalaciosid I (47) Myrsinionosid D (48)

(8-hydroxy-1,5-glucopyranosid (51)

Các hợp chất mangiferin (52), salacinol (53), kotalanol (54) ñược phân lập từ

cây Chóc máu cho thấy khả năng ức chế chống lại một vài enzym chuyển hóa

cacbohydrat (maltose, isomaltose, α-amylose, và men khử aldose) [55]

52

Ở Việt Nam, cây Chóc máu chưa ñược nghiên cứu Sau ñây là tổng quan về hóa học, hoạt tính sinh học, và sinh tổng hợp của lớp chất triterpen, thành phần hóa học chủ yếu ñược tìm thấy trong loài cây này

1.1.4 Các hợp chất triterpen

Terpenoid là một trong những lớp chất trao ñổi thứ cấp tồn tại phổ biến trong thiên nhiên và có cấu trúc ña dạng nhất Các terpen ñược tạo thành từ các ñơn vị isopren (C5H8) Căn cứ vào số ñơn vị isopren hợp thành người ta phân biệt các monoterpen (10C), sesquiterpen (15C), diterpen (20C), sesterterpen (25C), triterpen (30C), tetraterpen (40C) và polyterpen

Về mặt cấu trúc hoá học, triterpenoid có công thức tổng quát C30Hn, ñược tạo bởi 6 ñơn vị isopren hợp với nhau bởi 2 mảnh C15 nối với nhau ở giữa theo cách

ñầu nối với ñầu Hợp chất hexa-en squalen (55) với cấu hình toàn trans là tiền thân

của tất cả các triterpenoid [5]

55

đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới tóm tắt các kết quả nghiên cứu

về triterpen Mahato và cộng sự ựã ựề cập ựến các phương pháp mới dùng ựể phân lập và nhận dạng chúng Các nghiên cứu về sự biến ựổi hóa học cũng như các phản ứng tổng hợp các triterpen Nhiều triterpenoid có khung mới ựã ựược phân lập hoặc tổng hợp từ năm 1977 ựến năm 2005 Hoạt tắnh sinh học lý thú của các triterpenoid này cũng ựã ựược mô tả [14], [43] [76], [77]

Nghiên cứu tổng quan về triterpenoid cho thấy có gần 200 bộ khung triterpen khác nhau có nguồn gốc từ tự nhiên, phần lớn các triterpenoid có cấu trúc 4 vòng giáp nhau (6-6-6-5) hoặc 5 vòng giáp nhau (6-6-6-6-5 hoặc 6-6-6-6-6), nhưng cũng tồn tại một số ắt các triterpenoid dưới các dạng mạch hở, một vòng, 2, 3 hoặc 6 vòng giáp [67]

Một trong những cách phân loại các triterpenoid là dựa vào sự khác nhau về bộ khung triterpen Một số khung triterpen chắnh là: triterpen mạch thẳng, triterpen khung hopan, khung lupan, khung friedelan, khung dammaran, khung oleanan, khung ursan, khung lanostan,Ầ [51], [67], [77]

Axit turbinaric (57), một dẫn xuất của secosqualen có ựộc tắnh với tế bào ựã

ựược phân lập từ loài Turbinaria ornata [25]

Axit turbinaric (57)

1.1.4.2 Triterpen khung hopan

Về mặt cấu trúc hóa học triterpen khung hopan (58) là những chất ựược tạo

thành bởi 5 vòng (6-6-6-6-5) bao gồm một vòng cyclopentan E giáp với hệ vòng

crisen (A, B, C, D) Các nhóm thế thường là các nhóm metyl ở vị trắ C-4α và β,

C-8β, C-10β, C-14α, C-18α, và một nhóm isopropyl ở vị trắ C-21α Cấu hình của

khung hopan ựều ở dạng trans-trans

1

2

3

4 5

6 7 8 9 10 11

12 13

14

15 16 17 18

21 22

27

28

29 30

Trong thiên nhiên các triterpen khung hopan ựược tìm thấy trong các chi

Polypodium (Polypodiaceae), Swertia (Gentianaceae), Ficus (Moraceae), Salacia

(Celastraceae), Ầ [17], [43], [51], [76], [77]

Năm 1976 từ loài Mallotus paniculatus, W-H Hui và cộng sự ựã phân lập ựược

một nor-triterpen khung hopan là 21α-H-22(29)-hopen-3β,30-diol (59) [37] Một

hopan triterpen là 29-nor-21α-H-hopan-3,22-dion (60) cũng ựược nhóm tác giả này

phân lập từ cây Rhodomyrtus tomentosa [36]

Từ loài Dương xỉ Cheiropleuria bicuspis, N Tanaka và cộng sự ựã phân lập

ựược 3 hopan triterpen đó là 22,25-dihydroxyhopan-1-on (61), 1α,11α

,22-trihydroxyhopan (62), và 1α,11α,22,25-tetrahydroxyhopan (63) [18]

Mới ựây, nhóm nghiên cứu của Guan Ye ựã phân lập và nhận dạng ựược một

hopan triterpen mới từ loài Dipentodon sinicus (Celastraceae) ở Trung Quốc ựó là

axit 3β-hydroxy-21(22)-hopen-30-oic (64) [28]

1.1.4.3 Triterpen khung lupan

Các triterpen khung lupan tồn tại tương ñối phổ biến trong tự nhiên Về mặt

cấu trúc hóa học các triterpen khung lupan (65) tương tự như khung hopan, cũng có

hệ vòng pentacyclic (6-6-6-6-5) với các nhóm thế thường là các nhóm metyl ở

các vị trí C-4α và β, C-8β, C-10β, C-14α nhưng khác với khung hopan, nhóm thế isopropyl của khung lupan ở vào vị trí C-19α còn trong khung hopan ở vị trí C-21, và thay vì nhóm metyl thường ở vị trí C-18α trong khung hopan thì trong khung lupan nó thường xuất hiện ở vị trí C-17β

Các triterpen khung lupan tồn tại tương ñối phổ biến trong những loài thực vật thuộc các họ sau ñây: Celastraceae, Moraceae, Betulaceae, Asclepiadaceae, Apocynaceae, Combretaceae, Araliaceae, Leguminosae, Ebenaceae, Rhamnaceae, [27], [61], [88]

65

Betulin hay 20(29)-lupen-3β,28-diol (22) là một hợp chất ñặc trưng cho khung

lupan, ñược phân lập lần ñầu tiên vào năm 1988 ðây là một triterpen có mặt trong

nhiều loài thực vật thuộc các họ khác nhau Các nghiên cứu cho thấy betulin có

nhiều hoạt tính như: hoạt tính gây ñộc tế bào, hoạt tính chống HIV, có tác dụng bảo

vệ gan và làm giảm khả năng gây ñộc của CdCl2 ở nồng ñộ thấp [27], [29], [96]

Axit betulinic (24), một triterpen khung lupan ñược phân lập từ thiên nhiên

hoặc bán tổng hợp từ betulin, và các dẫn xuất của nó là những hợp chất có hoạt tính chống ung thư và kháng HIV cao hiện ñang ñược quan tâm nghiên cứu về mặt dược

lý [44], [58]

Các triterpen khung lupan ñược phân lập rất nhiều từ các loài thuộc chi Salacia Từ

loài Salacia beddomei có 5 chất ñược phân lập ñó là: 20,29-epoxylupan-3,21-dion (66),

6β-hydroxy-20(29)-lupen-3,21-dion (67), 20(29)-lupen-3,21-dion (68), 21β

J D Connolly và cộng sự cũng có những tóm tắt về các hợp chất thuộc

khung này, chúng ñược phân lập từ rất nhiều loài thực vật khác nhau [17], [18]

1.1.4.4 Triterpen khung friedelan

Các friedelan triterpen tồn tại khá phổ biến trong thiên nhiên, về mặt cấu trúc

hóa học triterpen khung friedelan (71) có cấu tạo là hệ pentacylic (6-6-6-6-6) Trong

khung này các nhóm thế, thường là các nhóm metyl, ở các vị trí C-4β, C-5β, C-9β, C-13α, C-14β, C-17β, C-20α và β

71

Người ta ñã phân lập ñược các triterpen khung friedelan từ những loài thực vật

thuộc các họ: Celastraceae (chi Salacia, Catha, Elaeodendron, Kokoona, Prionostemma, Acanthothammus…), Cucurbitaceae (Momordica), Buxaceae

(Pachysandra), Euphorbiaceae (Euphorbia, Phyllanthus), Flacourtiaceae (Coloncoba, Phyllobotryon), Dimocarpaceae (Dimocarpus),… [10], [41], [51], [76], [77]

Bốn triterpen khung friedelan là 1-friedelen-3-on (72), friedelan-1,3-dion-7α-ol (73), friedelan-1,3-dion-24-al (74), và 7,24-oxido-friedelan-1,3-dion (75) ñã ñược

Tewari và cộng sự phân lập và xác ñịnh cấu trúc hóa học lần ñầu tiên vào những

năm 70 từ loài Salacia prenoides D.C [83], [84]

Trong lá và vỏ rễ của cây Maytenus aquifolium (Celastraceae) và Salacia campestris (Celastraceae) chứa rất nhiều friedelan Enzym cyclaza chứa trong lá cây

này có tác dụng chuyển ñổi chất cơ bản oxidosqualen thành triterpen 3β-friedelanol

(76) và friedelin (28) [42] Hợp chất (76) cũng ñã ñược phân lập từ loài Vitis trifolia

vào năm 2000 và ñược phát hiện có hoạt tính chống ung thư [49]

Năm 2001, Vieira Filho và cộng sự ñã phân lập ñược hai triterpen mới từ lá của

cây Austroplenckia populnea (Celastraceae) ñó là axit

3,4-seco-28-hydroxyfriedelan-3-oic (77) và axit 3,4-secofriedelan-3,4-seco-28-hydroxyfriedelan-3-oic (78) [90]

Năm 2003, từ rễ của cây Phyllanthus oxyphyllus, Somyote Sutthivaiyakit và

cộng sự ñã phân lập ñược axit 29-nor-3,4-seco-friedelan-4(23),20(30)-dien-3-oic

(79) có tác dụng chống oxi hóa mạnh [81]

76

1 2 4 5 6 25 7

9 10

11 1213 14 15 16 17 18 19 20 21 22

79

1.1.4.5 Triterpen khung taraxeran (friedooleanan)

Tương tự như khung friedelan cấu trúc hóa học của các triterpen khung

taraxeran (80) cũng là hệ 5 vòng (6-6-6-6-6) Trong khung này các nhóm thế

(thường là các nhóm metyl) ở các vị trí 4α,β, 8β, 10β, 13α, 17β, 20α,β Cấu hình khung taraxeran có dạng: trans-trans-trans-cis Cấu hình giữa khung A/B là trans, B/C: trans, C/D: trans, D/E: cis

80

Các triterpen khung taraxeran ñược tìm thấy trong một số loài: Bosistoa brassi (Rutaceae) [62], Tamarix aphylla (Tamaricaceae) [57],…

Seco-3,4-taraxeron (81) phân lập từ cặn clorofoc của lá loài Alchornea latifolia

có hoạt tính gây ñộc tế bào trên 2 dòng Hep-G2 và A-431 [94]

Năm 1997 từ loài Adhatoda vasica Nees, Atta-Ur-Rahman và cộng sự ñã

phân lập ñược một triterpen mới khung taraxeran ñó là 3α

-hydroxy-D-friedoolean-5-en (82) và epitaraxerol (83) [11] Một nghiên cứu khác ñã phát hiện ra khả năng chữa bệnh alzheimer của hợp chất (83) có hoạt tính ức chế AchE với giá trị IC50

là 79µ M [63]

1.1.4.6 Sinh tổng hợp các triterpen

Trong tự nhiên các triterpen ñược tạo thành bởi sự ñóng vòng trực tiếp từ

squalen (55) hay oxidosqualen (56) Với sự ñóng vòng của các chất này theo các

cấu dạng khác nhau, ở các vị trí khác nhau sẽ tạo nên các cacbocation Tiếp theo ñó

là sự dịch chuyển các proton và các nhóm metyl khi có mặt các xúc tác H+ hoặc

OH- theo các cách khác nhau sẽ tạo thành các triterpen với các bộ khung khác nhau

Sơ ñồ 1.1 dưới ñây mô tả một trong những con ñường sinh tổng hợp các triterpen từ

squalen [40], [59], [67], [14]

Sơ ñồ 1.1: Sự hình thành các triterpen từ squalen

1.1.4.7 Hoạt tính sinh học của các triterpen

Các nghiên cứu về dược lý cho thấy hợp chất triterpen thể hiện hoạt tính sinh học rất ña dạng như hoạt tính chống ung thư và khối u, chống oxi hóa, kháng virut, kháng viêm nhiễm, bảo vệ gan, tiểu ñường, tim mạch, hạn chế sinh tổng hợp cholesterol,… Dưới ñây là các nhóm hoạt tính phổ biến ñược phát hiện thấy ở lớp chất này

a Hoạt tính kháng viêm

Các hợp chất triterpen 5 vòng ñược phân bố rộng rãi trong các loài thực vật, rất nhiều hợp chất ñã ñược sử dụng làm thuốc kháng viêm trong dân gian Dạng và cách thức kháng viêm của triterpen 5 vòng cũng ñã ñược nghiên cứu chi tiết [70]

Một hợp chất triterpen mới 2α,3β,23-trihydroxyolean-12-en ñã ñược thử nghiệm bằng ñường uống trên chuột, kết quả cho thấy có hoạt tính kháng viêm và giảm ñau Với cùng một liều lượng 100mg/kg thì khả năng giảm ñau trên chuột của triterpen này là 37% trong khi ñó aspirin là 85% [24]

Các hợp chất taraxasterol axetat và neulupanol cũng ñược phát hiện có hoạt

tính kháng viêm mạnh [77]

b Hoạt tính chống ung thư và khối u

Các nghiên cứu cho thấy khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư của các triterpen tương ñối ña dạng:

Axit 3-oxofriedelan-29-oic (84), axit 3-oxofriedelan-28-oic (85) và dihydroxyfriedelan-3-on (86) có khả năng gây ñộc ñối với các tế bào ung thư biểu

28,29-mô phổi dòng A-549 với giá trị ED50 = 0,21; 1,18 và 0,64µg/ml Ngoài ra hợp chất

85 còn thể hiện hoạt tính gây ñộc ñối với cả 2 dòng tế bào ung thư L-1210 (ED50 = 2,95 µg/ml) và KB (ED50 = 3,7µg/ml) [76]

Betulin (22), một triterpen có mặt trong nhiều loài thực vật thuộc các họ khác

nhau lại thể hiện hoạt tính gây ñộc tế bào trên 2 dòng HeLa và Hep-2 với cùng giá

trị IC50 là 40µg/ml Betulin cũng thể hiện hoạt tính chống HIV với giá trị IC50 là 6,1µg/ml Các nghiên cứu của Miura còn cho thấy betulin có tác dụng bảo vệ gan và làm giảm khả năng gây ñộc của CdCl2 ở nồng ñộ thấp 0,1µg/ml Cơ chế có thể là do

betulin thúc ñẩy sự tổng hợp các protein có tác dụng bảo vệ các tế bào khỏi ảnh hưởng của CdCl2 [19], [60]

Nghiên cứu gần ñây của Moriarity D M cho thấy lupeol (87) có hoạt tính gây

ñộc ñối với các dòng tế bào Hep-G2, A-431, H-4IIE với giá trị IC50 lần lượt là 77;

101 và 77,6µM Ngoài ra, lupeol còn ñược ứng dụng trong mỹ phẩm bảo vệ da do

có tính chất chống oxi hoá và kháng viêm [23]

84: R1 = COOH; R2 =H

85: R1 = H; R2 = COOH

86

87

c Hoạt tính kháng virus, kháng khuẩn

Epilupeol và epilupeol axetat thể hiện hoạt tính rõ rệt chống virut gây bệnh Ranikhet ở phổi gà [76]

Các axit ursolic, axit betulinic, axit salaspermic và axit pomolic cũng ñã thể hiện hoạt tính kháng virus HIV ở các giai ñoạn phát triển khác nhau Trong ñó hoạt tính kháng virus HIV của axit betulinic ñược biết ñến từ năm 1976, kết quả này thúc ñẩy việc bán tổng một loạt dẫn xuất mới của axit betulinic thông qua việc biến ñổi các nhóm chức 3-hydroxyl, 17-COOH, C-20 oxo-metylen, ñể tìm ra những chất mới

có hoạt tính kháng HIV cao hơn Kết quả ñã có hàng loạt các dẫn xuất mới ra ñời

trong ñó có axit dimetylsuccinyl) betulinic (88) và axit dimetylsuccinyl) dihydrobetulinic (89) có hoạt tính kháng HIV rất mạnh với giá trị EC50< 3,5.10-4µM trong trường hợp tế bào lympho H9 bị nhiễm cấp [30], [44], [45], [58], [99]

Cho ñến nay, các hợp chất triterpen trong thiên nhiên chưa thể hiện khả năng vượt trội so với các loại thuốc hiện tại về mặt dược lý, nhưng với những cấu trúc phong phú chúng ñóng một vai trò là các hợp chất dẫn ñường tốt cho việc phát triển các loại thuốc mới

1.2 Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.)

1.2.1 ðặc ñiểm thực vật

Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) có khoảng 100 chi và 260 loài phân bố trên

khắp các châu lục Chi Clerodendrum thuộc phân họ Viticoideae và là chi lớn nhất

họ Cỏ roi ngựa với hơn 450 loài, thường tìm thấy ở các vùng nhiệt ñới [4]

Cây Ngọc nữ biển còn có tên là Vọng ñắng, Chùm gọng hay Vạng hôi, tên

khoa học là Clerodendrum inerme Gaertn., thuộc chi Clerodendrum, họ Cỏ roi ngựa

(Verbenaceae)

Ngọc nữ biển là loài cây nhỏ, sống nhiều năm, mọc ñứng cao 1-2m, có khi mọc trườn dài tới 2-3m Cành không có lông, vỏ màu nâu tím, bóng Lá ñơn, mọc ñối, phiến nguyên, xoan bầu dục, không lông, có 5-7 cặp gân phụ, cuống dài 6-8mm Xim có 3 hoa, màu trắng, ñài hình ống, 5 lá ñài, tràng dài 4-5cm, thuỳ trắng tim tím, nhị dài thò ra ngoài, màu ñỏ tím Quả hạch có 4 khía, tròn, to (ñường kính 10-13mm) Cây ra hoa quanh năm, thường gặp vào tháng 5-7, quả chín tháng 9-11 ðây là loài cây sống phổ biến ở các nước ven biển nhiệt ñới Ở nước ta, cây mọc ở các vùng bờ biển và cửa sông từ Bắc vào Nam [3] Tên ñồng nghĩa của cây này là

Volkameria inerme L [4]

Hình 1.2: Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.)

1.2.2 Hoạt tính sinh học và ứng dụng trong y học cổ truyền

Cây Ngọc nữ biển có vị ñắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải ñộc, tán

ứ, trừ thấp, dịch lá có tác dụng giải nhiệt, hạ sốt Trong dân gian, cây dùng ñể trị nhiều bệnh như phong thấp, ñau dạ dày, cảm mạo, sốt rét, viêm gan,… Lá dùng ngoài trị eczema, nấm tóc, chữa các vết thương chảy máu Vùng Cà Mau người ta dùng lá và rễ làm thuốc hạ nhiệt Quả và thân cây vạc mỏng, ngâm với rượu, mật

ong, trứng gà làm thuốc bổ trị ñau lưng [1]

Thực vật thuộc chi Clerodendrum từ lâu ñã ñược dùng làm thuốc trừ sâu thảo

mộc rất hiệu quả với tác dụng gây ngán ăn và ức chế sinh trưởng côn trùng Hoạt tính này thể hiện mạnh ở nhóm chất neo-clerodan diterpenoid ñã ñược phân lập

từ loài Clerodendrum inerme thu hái ở Ấn ðộ [13], [48]

Trong khi ñó este glucosid có tên là verbascosid ñược phân lập từ

Clerodendrum inerme thu hái tại Thái Lan lại có tác dụng giảm ñau và kháng khuẩn

mạnh [87]

ðặc biệt, từ lá Clerodendrum inerme, Fabiola Olivieri và cộng sự ñã phân lập

ñược một số chất có bản chất protein có khả năng kháng virus là CIP-29 và CIP-34, trong ñó CIP-29 có các tính chất của một polynucleotit adenosine glycosidase [20] Năm 2001, từ loài cây này các nhà khoa học cũng ñã phân lập ñược một protein là CIP-31 có hoạt tính cao [78]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu cây Ngọc nữ biển

Trên thế giới cây Ngọc nữ biển thu hái tại Thái Lan và Ấn ðộ ñã ñược nghiên cứu về hóa học cũng như hoạt tính sinh học Các chất phân lập ñược tập trung vào các lớp chất như: terpen, steroid, và flavonoid Dưới ñây trình bày tóm tắt các chất

ñã ñược phân lập từ loài Clerodendrum inerme Gaertn trên thế giới

1.2.3.1 Các iridoid glucosid

Năm 1994, Ihsan Calis và cộng sự ñã phân lập ñược các iridoid glycosid từ

dịch chiết methanol của lá Clerodendrum inerme Gaertn thu tại Ấn ðộ Tất cả các

chất này ñều ở dạng bột vô ñịnh hình, không màu, ñó là inerminosid A: (axit [5”-O-(8-hydroxy-2,6-dimetyl-2(E)-octenoyl)-β-D-apiofuranosyl]-mussaenosidic)

2’-O-(90); inerminosid B: (axit

2’-O-[5”-O-(8-hydroxy-2,6-dimetyl-2(E),6(E)-octadienoyl)-β-D-apiofuranosyl]-8-epi-loganic) (91) [38]

Ba iridoid biglycosid mới là inerminosid A1: (axit

2’-O-(β-D-apiofuranosyl)-mussaenosidic) (92); inerminosid C: octenoyl)-β-D-apiofuranosyl]-gardosid (94) và inerminosid D: (axit 2’-O-[5”-O-(p- hydroxy-benzoyl)-β-D-apiofuranosyl]-musscaenosidic) (93) cũng ñã ñược Ihsan Calis

(2’-O-[5”-O-(8-hydroxy-2,6-dimetyl-2(E)-và cộng sự phân lập (2’-O-[5”-O-(8-hydroxy-2,6-dimetyl-2(E)-và xác ñịnh cấu trúc [39]

Từ cây Clerodendrum inerme có nguồn gốc ở Thái Lan một iridoid glucosid mới

là sammangaosid C (95) cùng với các chất ñã biết thuộc nhóm megastigmane glucosid là sammangaosid A (96) và B (97) ñã ñược Tripetch Kanchanapoom và

cộng sự phân lập vào năm 2001 [87]

Dưới ñây là công thức của các iridoid glucosid và megastigmane glucosid ñược

phân lập từ loài Clerodendrum inerme Ấn ðộ và Thái Lan:

O O HO

OH OH

OH HO

OH OH HO

OH OH

OH

95

96 97

1.2.3.2 Các diterpenoid

Các neoclerodan diterpenoid cũng ñược Krishna Kumari và cộng sự phân lập

từ dịch chiết n-hexan của thân và lá loài Clerodendrum inerme thu hái ở Ấn ðộ ñó

là: clerodendrin B (98), 3-epicaryoptin (99), clerodendrin C (100), clerodendrin B axetat (101), 15-hydroxyepicaryoptin (102) Các hợp chất này ñã ñược thử nghiệm

hoạt tính ức chế sinh trưởng và gây ngán ăn ở côn trùng, kết quả cho thấy các hợp

chất 98, 99, 102 có tác dụng gây ngán ăn cho côn trùng và cả 5 hợp chất trên ñều có

tác dụng tốt trong việc ức chế sự sinh trưởng của côn trùng [48]

Năm 2005, tiếp tục những nghiên cứu về loài Clerodendrum inerme, Richar

Pandey cùng cộng sự ñã phân lập ñược ba neo-clerodan diterpenoid mới ñều ở dạng

khối nhớt ñó là inerme A (103), inerme B (104), epicaryoptin (105) cùng hỗn hợp epime 14,15-dihydro-15-hydroxy-3-epicaryoptin (106) [68] Như vậy ñã có 9 diterpenoid khung neo-clerodan ñược phân lập từ loài

14,15-dihydro-15β-metoxy-3-Clerodendrum inerme Gaertn

CH2OAcOAc O

AcO

R2

R1

105: R1 =H, R2 =OMe

106: R1, R2 =OH, H/ H, OH

1.2.3.3 Các steroid

Năm 1990, Toshihiro Akihisa cùng cộng sự ñã phân lập từ cây

Clerodendrum inerme ñược một hợp chất 4α-metylsterol mới là:

4α,24,24-trimetyl-5α-cholesta-7,25-dien-3β-ol (107) ở dạng dẫn xuất axetyl từ phần lipid

không xà phòng hoá của dịch chiết C inerme, cùng với 3 hợp chất ñã biết là:

4α-metyl-24β-etyl-5α-cholesta-7,25-dien-3β-ol (24β-etyl-25-dehydrolophenol) (108) ở dạng dẫn xuất axetyl, 4α-metyl-5α-ergosta-7,24(28)-dien-3β-ol (gramisterol) (109)

và 4α,14α-dimetyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (obtusifoliol) (110) [85]

Cũng từ loài Clerodendrum inerme hợp chất steroid-glycosid là

3-O-β-D-galactopyranosyl-(24β)-etylcholesta-5,22,25-trien (111) và clerosterol ñã ñược

Atta-Ur-Rehman và cộng sự phân lập vào năm 1997 [12]

Từ cặn chiết n-hexan của loài C inerme Ấn ðộ, Richa Pandey và cộng sự ñã

phân lập ñược hai sterol mới là: 4α-metyl-24β-etyl-5α-cholesta-14,25-dien-3β-ol

(112) và 24β-etylcholesta-5,9(11),22E-trien-3β-ol (113) cùng với 2 hợp chất ñã biết

là 11-pentacosanon, 6-nonacosanon và một diterpen là axit clerodermic [69]

H

H OH

H

OH HO HO

111