Luận văn tốt nghiệp đại học bách khoa hà nội 00011111

Những nghiên cứu trong việc phòng chống HIV cho thấy rằng các catechon chè xanh đặc biệt là EGCG có tác dụng : phá hủy các tế bào virut, ngăn ngừa virut tấn công vào các tế bào, làm chậm

MỤC LỤC

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4

1.1.SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ 4

1.1.1.Sinh thái học của cây chè 4

1.1.2.Phân loại các giống chè 5

1.1.3 Các vùng chè Việt Nam 7

1.1.4.Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam 8

1.2.HỢPCHẤTPOLYPHENOL 10

1.2.1.Giới thiệu 10

1.2.2.Nhóm các hợp chất catechin 10

1.2.3 Một số nhóm khác 13

1.2.4.Hoạt tính sinh học của polyphenol 13

1.2.4.1.Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol 13

1.2.4.2.Tác dụng đối với enzyme 14

1.2.4.3.Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm 14

1.2.4.4.Tác dụng đối với ưng thư 15

1.2.3.5 Tác dụng đối với các bệnh về tim mạch 16

1.2.3.6 Tác dụng đối với HIV/AIDS 17

1.3.ỨNGDỤNGCỦAHỢPCHẤTPOLYPHENOLTRONGCHÈ 17

1.3.1 Ứng dụng polyphenol trong công nghiệp thực phẩm 17

1.3.2 Ứng dụng polyphenol trong y dược 18

1.4.TÌNHHÌNHNGHIÊNCỨUSẢNXUẤTPOLYPHENOLTỪCHÈ 19

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 19

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 20

1.4.3 Công nghệ trích ly polyphenol từ chè 22

1.5.ĐÁNHGIÁCHẾPHẨMPOLYPHENOLTRONGCHÈ 26

1.5.1 Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC) 26

1.5.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol trong dịch

trích từ chè 28

1.5.3 Xác định thành phần catechin 29

1.5.4 Xác định vết dung môi bằng SPME/GC 29

1.5.5 Xác định độc tính cấp 29

1.5.6 Xác định tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung tư in vitro 30

1.6.KẾTLUẬN 30

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1.MỤCTIÊUNGHIÊNCỨU 31

2.2.ĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU 31

2.2.1 Các chè phế phẩm 31

2.2.2 Phương pháp trích ly TPC từ nguyên liệu 34

2.2.3 Phân tích đánh giá hàm lượng Polyphenol tổng (TPC) trong nguyên liệu 36

2.3.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 37

2.3.1 Quy trình trích ly polyphenol từ chè 37

2.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng dên quá trình trích ly 38

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng Polyphenol tổng (TPC) và hoạt tính chống oxy hóa trong dịch trích ly 41

2.3.4 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình 43

2.3.5 Phương pháp tinh chế polyphenol 48

CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 51

3.1. NGHIÊNCỨUCÁCYÊUTỐẢNHHƯỞNG 51

3.1.1 Ảnh hưởng của sóng siêu âm tới thiết bị trích ly 51

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố với hệ thống quy mô phòng thí nghiệm 52 3.2.XÁCĐỊNHCHẾĐỘCÔNGNGHỆTỐIƯU 58

3.2.1 Quy hoạch thực nghiệm 58

3.2.1.1 Phương trình hồi quy với hàm mục tiêu là TPC trong dịch trích 59

3.2.1.2 Phương trình hồi quy với hàm mục tiêu là hoạt tính chống oxy hóa trong

dịch trích 63

3.2.2 Tối ưu hóa quá trình trích ly 66

3.3. KIỂMCHỨNG 68

3.3.1 Tại quy mô phòng thí nghiệm 68

3.3.2 Tại quy mô bán sản xuất pilot 69

3.3.3 Khảo sát các yếu tố tại quy mô bán sản xuất (pilot) 70

3.3.3.1 Tốc độ khuấy 70

3.3.2 Khảo sát thời gian 71

3.3.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 72

3.3.4 Điểm tối ưu của quy mô pilot 73

3.3.5 Đánh giá 74

3.4.SẢMPHẨMCAOCHÈVÀPOLYPHENOLCHẾPHẨM 74

3.4.1 Polyphenol chế phẩm 74

3.4.1.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi/dịch chè : diclometan/dịch chè 74

3.4.1.2 Tỉ lệ dung môi ethyl acetate/dịch chè 76

3.4.1.3 Nồng độ dịch chè 77

3.4.1.4 Đánh giá 77

3.4.2 Cao chè 78

KẾT LUẬN 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1.Sơ lược về cây chè

1.1.1.Sinh thái học của cây chè[5], [10], [13]

Tên khoa học của cây chè : Camellia sinensis

Chè là loại cây sống xanh tươi quanh năm, sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới, ôn đới, có nguồn gốc hay trung tâm phân tán ở vùng Đông Nam Trung Quốc, phía Bắc Viêt Nam, phía bắc Ấn Độ

Cây chè sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉ có một thân chính, chia làm

ba loại : thân gỗ, thân bụi, thân nhỡ (bán gỗ) Cánh chè do mầm sinh dưỡng phát triển thành, trên cành chia làm nhiều đốt, chiều dài biến đổi nhiều từ 1÷10cm Đốt chè càng dài thì biểu hiện của giống chè năng suất cao Lá chè mọc cách trên cành, mỗi đốt có 1 lá, hình dạng và kích thước thay đổi tùy theo giống chè Lá chè có gân rất rõ, rìa lá có răng cưa Búp chè là giai đoạn non của một cành chè, được hình thành từ mầm sinh dưỡng, gồm có phần non trên đỉnh chưa xòe và hai hoặc ba lá

non.Kích thước búp chè thay đổi tùy theo giống và kỹ thuật canh tác Cây chè sau khi sinh trưởng 2÷3 tuổi bắt đầu ra hoa, hoa mọc từ chồi sinh thực ở nách lá

1.1.2.Phân loại các giống chè [5], [13], [16], [22]

Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hóa, nguồn gốc phát sinh cây chè, Cohen Stuart đã chia Camellia sinensis (L) O.Kuntze thành 4 loại : chè Trung Quốc lá to, chè Trung Quốc lá nhỏ, chè Shan, chè Ấn Độ

a Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinsesis var macrophylla)

Đặc điểm: Thân gỗ nhỡ cao tới 5m

trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên.Lá to,

dài 12÷ 15 cm, rộng 5 ÷ 7 cm, màu xanh

nhạt, bong.Năng suất phẩm chất tốt Nguyên

sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc)

Đặc điểm : Cây bụi thấp phân cành

nhiều.Lá nhỏ, màu xanh đậm, dài 3,5 ÷ 6,5 cm

Năng suất thấp, phẩm chất bình thường Khả

năng chịu rét ở nhiệt độ -12oC đến -15oC Phân

bố chủ yếu ở miền đông, đông nam Trung Quốc,

Nhật Bản và một số vùng khác

Hình 1.3: Chè Trung Quốc lá nhỏ

c Chè Shan (Camellia sinensis var Shan)

Đặc điểm : Thân gỗ , cao từ 6 đến 10m Lá to và dài 15 ÷ 18 cm, màu xanh nhạt Tôm chè có nhiều long tơ, trắng và mịn trông như tuyết Có khả năng thích

ứng trong điều kiện ấm ẩm, ở địa hình cao, năng suất cao, phẩm chất thuộc loại tốt nhất Nguyên sản ở Vân Nam (Trung Quốc), miền Bắc của Miến Điện và Việt Nam

Hình 1.4: Chè Shan

d Chè Ấn Độ ( Camellia sinensis var Assamica)

Đặc điểm : Thân gỗ cao tới 17 m, phân cành

thưa Lá dài tới 20 ÷ 30 cm, mỏng, mềm, thường có

màu xanh đậm Rất ít hoa quả Không chịu được rét

hạn Năng suất,phẩm chất tốt Trồng nhiều ở Ấn Độ,

Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) và một số vùng

khác

Hình 1.5: Chè Ấn Độ

Bốn loại chè trên đây đều có trồng ở Việt Nam, nhưng phổ biến nhất là Camellia sisensis var.macrophylla được trồng nhiều nhất ở các tỉnh Trung du với các tên gọi của địa phương (tùy theo màu sắc của lá) như Trung du lá xanh, Trung

du lá vàng… và Camellia sisensis var.Shan được trồng ở miền núi các tỉnh miền Bắc và miền Nam Tây Nguyên (Lâm Đồng); mỗi địa phương có các giống khác nhau như : Shan Mộc Châu, Shan Tham Vè, Shan Trấn Ninh… Ngoài ra các giống chè lai và nhập nội cũng được trồng phổ biến như giống PH1 (Phú Hộ), giống 1A, LPD 97, LDP1 (Lai), Hùng Đỉnh Bạch, Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên, Oolong, Kim Tuyên… cho năng suất và chất lượng cao Trong đó giống chè Trung Du chiếm khoảng (47%), tiếp đến là giống chè Shan (24%), giống chè PH1 (6%), các giống chè chất lượng khá (20%) và các giống chè mới chất lượng tốt khoảng (3%) [17]

1.1.3 Các vùng chè Việt Nam [5], [12], [13]

Việt Nam nằm trong vùng gió mùa Đông Nam Á, cái nôi của cây chè, khí hậu đất đai thích hợp với sinh trưởng cây chè Lượng nước mưa dồi dào 1700-2000 mm/năm Nhiệt độ 21-22,6oC, độ ẩm không khí 80-85% Đất dai tròng chè là loại phiến thạch sét và bazan màu mỡ phù hợp cho cây chè phát triển mạnh Hàng năm thời gian cho bụp lên tới 9 tháng Ở nước ta hầu hết các tỉnh đều trồng chè với tổng diện tích hiện nay đạt trên 130.000ha, nhưng sản xuất và kinh doanh chè chỉ có bị trí quan trọng tại 6 vùng chè tập trung dưới đây :

a Vùng chè Tây Bắc :

Miền núi phía bắc, bao gồm các tỉnh Lai Chât, Sơn La Đây là một vùng chè

cũ, vốn có của Việt Nam, trước khi người Pháp chiếm Đông Dương Là vùng núi cao nguyên hiểm trở, phần lớn diện tích ở độ cao dưới 1000m

Giống chè được trồng chủ yếu ở đây là : Giống chè shan và giống chè Trung

Du Trong đó, giống chè Shan phù hợp và phát triển tốt hơn , cho chất lượng cao hơn Hiên nay đã trồng thêm một số giống chè mới như LDP1, LDP2, TR777, Đại Bạch Trà

b Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn :

Bao gồm các tỉnh : Tuyên Quangm Hà Giangm Lào Cai, Hòa Bình và phía tây Yên Bái (Nghĩa Lộ, Văn Chấn), đây là một vùng chè rất quan trọng của Việt Nam Vùng này có hai trình độ sản xuất là quảng canh và thâm canh khác nhau rõ rệt Đó

là tiểu vùng chè rừng dân tộc và tiểu vùng chè đồi công nghiệp với trình độ thâm canh cao hơn

Sản lượng búp chè tươi chiếm 31,15% tổng sản lượng chè búp tươi cả nước Giống chè chủ yếu là chè shan và Trung du Hiện nay đã có một số giống chè mới như: Bát Tiên, Đại Bạch trà, TR777, LDP1… đang được trồng nhưng với diện tích nhỏ, nhằm khảo nghiệm để thay đổi cơ cấu giống chè cho phù hợp với đòi hỏi của người tiêu dùng

c Vùng chè Trung du Bắc Bộ

Vùng chè Trung du Bắc Bộ, nằm tại ranh giới giữa miền núi và miền đồng bằng Bắc Bộ, bao gồm các tỉnh Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, phía nam Yên Bái, Hà Tây, Hòa Bình và Hà Nội Đây là một vùng chè quan trong về diện tích và sản lượng

Sản lượng chè búp tươi chiếm khoảng 26,22% tổng sản lượng chè búp tươi cả nước Giống chè chủ yếu là chè Trung Du và một số giống mới như PH1, LDP1…

d Vùng chè Bắc Trung Bộ

Đây là một vùng chè lâu đời của Việt Nam, trước thời kỳ pháp thuộc người dân ở đây đã trồng và chế biến chè đơn giản gọi là chè Bạng (Thanh Hóa) Vùng này bao gồm các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh Các giống chè được trồng chủ yếu ở vùng này : chè Trung Du, PH1, và một số giống của địa phương (chè Gay của Nghệ An)

e Vùng chè Tây Nguyên

Đây là vùng có địa hình khá phức tạp, có nhiều núi và cao nguyên rộng và bằng phẳng Bao gồm các tỉnh : Lâm Đồng, Gia Lai-Kon Tum, và Đắc Lăc Giống chè chủ yếu của vùng này là chè Shan, chè Ấn Độ gieo bằng hạt Sản lượng chè búp tươi chiếm khoảng 31% tổng sản lượng chè búp tươi của cả nước, trong đó tỉnh Lâm Đồng có snar lượng chè búp tươi lớn nhất nước

f Vùng chè Duyên Hải miền Trung

Đây là một vùng chè dọc theo duyên hải Trung Bộ, trồng trên các sườn của dãy Trường Sơn thuộc các tỉnh Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi và gần đây là Bình Định

Vùng này do điều kiện khí hậu nắng nóng, gây ảnh hưởng xấu tới việc thực hiện quy trình công nghệ chế biến chè đenm nên chỉ tập trung và sản xuất chè xanh tiêu thụ trong nước là chính, chất lượng trung bình, sản lượng không nhiều

1.1.4.Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam [12],[17]

Ở Việt Nam, cây chè có khả năng thích nghi rộng từ các tỉnh Lâm Đồng đến

Hà Giang nhưng tập trung chủ yếu ở 6 vùng chè lớn : vùng chè Tây Bắc, vùng chè

Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn, vùng chè Trung Du Bắc Bộ, vùng chè Bắc Trung Bộ, vùng chè Tây Nguyên, vùng chè duyên hải miền Trung

Trong 10 năm (1995-2005), diện tích trồng chè đã tăng gấp 2 lần Hiện nay, Việt Nam là nước đứng thứ 5 trên thế giới về xuất khẩu chè với diện tích 130.000

ha và xuất khẩu sang 110 quốc gia và vùng lãnh thổ Tuy nhiên khâu chế biến, tiêu thụ sản phẩm của nước ta còn nhiều hạn chế nên nước ta vẫn xuất khẩu chè nguyên liệu thô là chủ yếu, điều đó làm cho giá chè Việt Nam chỉ ở mức 60%-70% giá chè bình quân của thế giới

Vì thế mục tiêu đặt ra của Bộ NN&PTNT là trong vòng 5 năm tới, ngành chè phải duy trì được tăng trưởng sản lượng đạt 6%/năm, kim ngạch xuất khẩu tăng ít nhất 2 lần so với hiện nay Ngành chè cần căn cứ vào nhu cầu thị trường để nhanh chóng tái cơ cấu và đa dạng hóa sản phẩm Trong đó, tập trung đầu tư, nâng cấp các nhà máy chế biến theo hướng hiện đại, sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng cao

Theo điều tra hiện trạng sản xuất chế biến chè và đề xuất các định hướng 2030 cho thấy : Tổng sản lượng chè hàng năm của nước tả khoảng 800 nghìn tấn chè búp tươi Trong đó khoảng 37% sản lượng dành cho sản xuất chè xanh, còn 63% dành cho sản xuất chè đen Qua các công đoạn trong quy trình sản xuất, lượng chè xanh khô thu được chiếm khoảng 7-8% tổng lượng chè nguyên liệu Sản phẩm bao gồm : chè cánh (65%), chè mảnh(23%), chè vụn (10%) và chè bụi (2%) Từ đó có thể ước tính tổng lượng chè xanh vụn thu được hàng năm khoảng 8-10 nghìn tấn

Như vậy hàng năm trung bình trong cả nước có hàng chục nghìn tấn lá chè già, cẫng đốn bỏ không sử dụng và khoảng 8-10 nghìn tấn chè xanh vụn không có giá trị sử dụng cao Đó chính là nguồn nguyên liệu dồi dào và do đó cần nghiên cứu sử dụng các nguồn nguyên liệu thừa trên để khai thác các sản phẩm có giá trị kinh tế cao như : polyphenol và cao chè

1.2 HỢP CHẤT POLYPHENOL

1.2.1.Giới thiệu

Polyphenol là hợp chất có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl gắn trực tiếp vào vòng thơm, các vòng thơm này là benzen Cấu trúc hợp chất phenol là nền tảng của nhóm Hợp chất này thường có ở thực vật và tồn tại chủ yếu ở dạng este và glycosid hơn dạng tự do [81]

Nhóm các hợp chất polyphenol chủ yếu là hợp chất flavonoit, trong đó chia thành năm nhóm chính

1.2.2.Nhóm các hợp chất catechin

Hợp chất catechin trong chè đã được quan tâm nghiên cứu trong thời gian dài Trong các loại thực vật, catechin thường tồn tại ở trạng thái tự do hoặc ở dạng este với axit gallyc

Catechin của chè thuộc họ flavonoit, nhóm flavan-3-ol, phân tử có 15 cacbon bao gồm hai vòng 6 cacbon A và B được nối bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí 2, 3, 4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2, 3

Hàm lượng catechin trong búp chè cao nhất đạt đến khoảng 30% trọng lượng khô Trong các hợp chất catechin được tìm thấy trong chè, thành phần gallat chiếm đa số (trên 80% tổng catechin) EGCG là thành phần đặc trưng của chè do chỉ được tìm thấy trong chè, EGCG có thể chiếm đến hơn 50% tổng khối lượng các hợp chất catechin và khoảng 10% tổng khối lượng khô của chè, tiếp theo là EGC và ECG (chiếm khoảng 10-20% tổng catechin) Các hợp chất catechin (C,

EC, GC) còn lại có hàm lượng thấp và không phải là thành phần đặc trưng của chè do còn được tìm thấy trong ca cao, nho, táo, hành…, với mức độ phân bố rộng hơn Hàm lượng của các catechin trong lá chè luôn luôn thay đổi, phụ thuộc vào giống chè, thời kỳ sinh trưởng, bộ phận cây chè, vị trí các lá trên búp chè và các yếu tố khác về thổ nhưỡng, khí hậu, cách chăm bón Trên cùng một đốt chè tươi không phải lúc nào cũng đủ 7 loại catechin như đã nêu ở trên; lá càng non thì sự tổng hợp catechin càng mạnh, tuy nhiên số lượng các catechin trong lá non không đầy đủ như lá chè già [6]

 Tính chất vật lý và hóa học của catechin:

- Tính chất vật lý: Catechin là hợp chất không màu, dễ bị oxy hóa nhất là khi gia nhiệt trong môi trường acid, bị mất nước chuyển thành những sản phẩm có màu khác nhau Trong tự nhiên catechin tồn tại ở dạng aglycon Các catechin có phổ tử ngoại hấp thụ cực đại ở vùng 270- 280 nm, tan trong các dung môi hữu cơ phân cực

như: ethyl acetate, ethanol, methanol, aceton…

- Tính chất hóa học: Catechin tham gia vào phản ứng oxy hóa, phản ứng ester hóa, phản ứng shinoda, phản ứng tạo phức với kim loại

1.2.3 Một số nhóm khác [7], [15]

- Hợp chất anthoxanthin

- Hợp chất anthocyanin

- Hợp chất leucoanthocyanin

1.2.4.Hoạt tính sinh học của polyphenol

1.2.4.1.Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol

Tác dụng sinh học của các polyphenol chè hay của dịch chiết của chè được giải thích là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất chống oxy hóa Các gốc tự do được sinh ra và tích lũy trong quá trình số bng chính là nguyên nhân dẫn tới bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hóa

cơ thể con người [19] Một trong những cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để flavonoit thể hiện được hoạt tính sinh học của chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động Quá trình này diễn

ra theo cơ chế gốc tự do Tuy nhiên, hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm, cấu tạo hóa học của từng chất flavonoit cụ thể [1] Theo nghiên cứu của các nhà khoa học như Cross C.E (1987), Harman D (1984), Tauban L.B (1986), Wolford R.L (1983) và cộng sự [33], [48], [77], [82] đã cùng kết luận rằng: phần lớn các gốc tự do tạo thành trong thể con người là do phản ứng sinh hóa, chúng có thể nối kết với nhau và phá hủy các tế bào xung quanh của các phân tử khác Andrew L Stoll [75] giải thích thêm rằng: các gốc tự do có trong cơ thể con người là do cơ thể sản sinh trong tiến trình tự nhiên, do tế bào oxy hóa để tạo năng lực hoạt động Do đó khi đưa flavonoit vào cơ thể sẽ sinh ra gốc tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý ( viễm nhiếm, ung thư, laoox hóa…) [33], [48], [75], [77] chúng có khả năng giải tỏa các điện tử trên các mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động Các gốc tự do tạo nên bởi flavonoit phản ứng với các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào dây

chuyền phản ứng oxy hóa tiếp theo Kết quả là hạn chế quá trình bệnh lý do cắt đứt dây chuyền phản ứng oxy hóa

1.2.4.2.Tác dụng đối với enzyme [47]

Các flavonoit có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym động

vật trong các điều kiện in vitro và in vivo Khả năng tương tác với protein là một

trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất phenol, quyết định hoạt tính sinh học của chúng Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolyc và oxycacbonyl của các nhóm peptit để tạo thành lyên kết hydro Tính bền vững của liên kết phụ thuộc vào số lượng và vị trí các nhóm -OH và kích thước phân tử của hợp chất phenol [47] Các chất phenol nói chung khi ở dạng oxy hóa (quinon)

có khả năng liên kết với nhóm sunfuhydryl (SH) và nhóm (-NH) của lysin hoặc axit asparaginic trong phân tử protein enzym

1.2.4.3.Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm[25], [47]

Tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn của flavonoit đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh [47] Về tác dụng kháng sinh, một

số hợp chất anthocyanin, leucoanthocyanin và axit phenolic có ảnh hưởng lên vi

khuẩn Salmonella và thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt Hầu hết các chất này có khả

năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza Từ lâu lá chè đã được sử dụng điều trị một số bệnh viêm nhiễm như ghẻ lở, mụn nhọn, viêm họng… là những bệnh liên quan tới các chủng vi khuẩn có khản năng gây viêm nhiễm bên trong và bên ngoài Do vậy ban đầu đã xác định khả năng ức chế, kháng khuẩn của chế phẩm polyphenol chè xanh trên một số chủng vi khuẩn như : Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 39320, Salmonella typhi T239, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa ATTCC27853, Klebsiela pneumonia, Bacillus subtilis

Theo nghiên cứu của Almajano và cộng sự [26] đã thấy hầu hết các polyphenol đều có khản năng kháng khuẩn Các polyphenol có thể hạn chế sự phát

triển của Clostridium và helicobacter pylori nhưng không có tác dụng đối với vi khuẩn đường ruột lactic

1.2.4.4.Tác dụng đối với ưng thư

Các kết quả thực nghiệm cho thấy một số flavonoit có tác dụng chống ung thư thông qua khả năng hoạt hoá các enzym trong gan có nhiệm vụ chuyển hoá các chất gây ung thư Những sản phẩm chuyển hoá thường có tính gây ung thư thấp hơn

Ngoài ra, các flavonoit còn tham gia trong việc phòng chống ung thư bằng khả năng chống oxy hóa, loại trừu các gốc tự do có thể gây tổn hại tế bào, chống lại quá trình sao chếp, chống sự tân sinh mạch mái, gây quá trình chết tế bào khi bị tấn công…

a Tác dụng ung với ung thư vú

Những nghiên cứu đã cho thấy việc sử dụng trà xanh với EGCG có thể có những ích lợi là bảo vệ chống lại các dạng ung thư, trong đó có ung thư vú Một nghiên cứu mới được thực hiện bởi Gu J.W và cộng sự [45] đã phát hiện ra rằng: dùng EGCG sẽ ức chế mạnh sự phát triển của khối u vú ở chuột cái Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng EGCG tác động trực tiếp đến cả những mạch máu của khối u và những tế bào khối u của ung thư vú ngăn chặn sự hình thành những mạch máu mới ở khối u vú, sự phát triển và di căn của những tế bào ung thư vú

b Tác dụng với ung thư phổi

Nhiều nghiên cứu cho kết quả: chất EGCG trong trà xanh làm chặn đứng sự hợp thành của chất 8-hydroxydeoxyguanosin [83], chất benzo (α) pyren, chất 4- methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanon và N-Nitrosodimethylamin [40], [42],

là những chất oxy hóa của chuỗi di truyền ADN trong phổi của loài chuột Vai trò

của EGCG trong trà xanh là chống lại sự họat động của quá trình oxy hóa làm tổn thương chuỗi di truyền ADN nghĩa là chống lại những sự đột biến của ADN và làm ức chế sự phát triển các bướu trong phổi

c Tác dụng ung thư gan

Kaufmann và cộng sự [54] trong nghiên cứu của mình đã chứng minh tác dụng của polyphenol chè xanh mà chủ yếu là EGCG đó là hạn chế sự thrombin-gây

ra bởi sự xâm nhập của tế bào ung thư gan (Hep-3B) và kích hoạt enzym p42/p44- MAPKinaza chuyển hóa chất gây ung thư gan tạo sản phẩm có tính gây ung thư thấp hơn Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư gan của EGCG chè xanh khảo sát cho thấy tỷ lệ của tế bào sống sót phụ thuộc vào liều lượng EGCG và dòng

tế bào

d Tác dụng đối với ung thư tuyến tiền lyệt, bàng quang và buồng trứng

Tiến sĩ Mukhtar và các cộng sự [ 2 8 ] đã cho thấy: trong tuyến tiền lyệt EGCG làm ức chế và ngăn chặn tận gốc nồng độ hoocmon I (IGF-I) phát triển mạnh làm ngăn chặn nguy cơ mắc tiền lyệt tuyến, đồng thời ngăn chặn các chất dinh dưỡng đến để nuôi tế bào ung thư Theo kết quả nghiên cứu của Albrecht và cộng sự [36] đã chỉ ra rằng: ở nồng độ 39 µM (tại giá trị IC50) đã hạn chế sự sản sinh nhanh tế bào ung thư trên dòng PC-3

e Tác dụng đối với tế bao ung thư da

Polyphenol có mặt trong chè xanh được biết tới như một lợi ích cho sức khỏe con người, có tác dụng chống lại tác động của tia cực tím gây ung thư da Rất nhiều loại kem dưỡng da, kem chống nắng được bổ xung polyphenol để bảo vệ sức khỏe

làn da và tế bào da [52] Các nghiên cứu trong cả môi trường in vitro và in vivo

đều chỉ ra tác dụng chống tia UV gây ung thư da của chè xanh

f Tác dụng đối với ung thư đường tiêu hóa, dạ dày và ruột

Các nghiên cứu của Yamane [84] trên chuột cho thấy khả năng ức chế của EGCG trên N-methyl-N’–nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) làm giảm ung thư dạ dày Ngoài ra, các catechin trong chè xanh có khả năng ức chế sự phát triển ung thư đường ruột bằng cách giảm bớt chất 1,2-dimethylhydrazin trong ruột loài chuột được dùng để thí nghiệm [85] Flavonoit chè xanh được coi như chất đặc hiệu trong việc chữa trị bệnh viêm ruột, kể cả viêm ruột mãn tính [49], [61],[68]

1.2.3.5 Tác dụng đối với các bệnh về tim mạch

Tác động bảo vệ của các flavonoit đối với các bệnh về tim mạch là do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxy hóa các lypoprotein tỷ trọng thấp dưới hình thức xơ vữa động mạch [38], [55], [86] Các nhà khoa học Nhật Bản cho biết

rằng nếu mỗi ngày người Nhật đều dùng trà xanh thì tỷ lệ chết vì bệnh ung thư và tim mạch giảm đi một cách rõ rệt Bằng cách uống 2-4 ly trà xanh mỗi ngày thì những rủi ro về bệnh tim mạch giảm đi 40-50%, còn đột quỵ thì sẽ giảm đi được 2/3 Uống trà xanh mỗi ngày là tăng lượng flavonoit trong máu của chúng ta lên đến 25%, nhưng nếu uống trà mà pha với sữa gọi là trà sữa thì tính chất chống oxy hóa của nó không còn hiệu quả nữa do protein trong sữa đã làm kết tủa tanin trong chè, làm cho nó mất tác dụng [79]

1.2.3.6 Tác dụng đối với HIV/AIDS

Gaby [80] đã chỉ ra rằng : quercetin có thể có giá trị trong điều trị hen suyễn

và tốt cho các bênh nhân bị tiểu đường và nhiễm HIV Trong các nghiên cứu trước

đó đã chứng minh rằng EGCG được tìm thấy trong chè xanh ức chế lây nhiễm HIV Những nghiên cứu trong việc phòng chống HIV cho thấy rằng các catechon chè xanh đặc biệt là EGCG có tác dụng : phá hủy các tế bào virut, ngăn ngừa virut tấn công vào các tế bào, làm chậm quá trình sinh sản của virut, bảo vệ toàn vệ, AND để giảm đột biến , bảo vệ chống lại thiệt hại thứ cấp từ virut, có hiệu quả với các loại thuốc kháng virut [44]

Như vậy, Polyphenol trong chè có nhiều hoạt tính sinh học quý giá, đặc biệt là EGCG Do vậy cần phải đặc biệt chú ý khai thác các hợp chất polyphenol trong chè nói chung và EGCG nói riêng nhằm phục vụ lợi ích cho sức khỏe con người

1.3 ỨNG DỤNG CỦA HỢP CHẤT POLYPHENOL TRONG CHÈ

1.3.1 Ứng dụng polyphenol trong công nghiệp thực phẩm

Ngày nay khuynh hướng sử dụng chất chiết chè xanh cũng như chè xanh trong chế biến thức ăn rất được phát triển Các loại bánh kem chè xanh, bánh gatô chè xanh, kem chè xanh, thạch chè xanh, mỳ ăn lyền chè xanh, sandwich chè xanh đang được tiêu thụ mạnh ở các nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ, Úc, Trung Quốc Việt Nam có các loại bánh nướng chè xanh, bánh dẻo chè xanh [9] và hiện nay đang nghiên cứu bổ sung polyphenol từ chè xanh vào một số sản phẩm khác

như sữa chua, bánh pudding, bánh sandwich [3]

Ngày nay xu hướng bổ sung hợp chất này vào các sản phẩm thực phẩm chức năng đang rất được quan tâm Một số ứng dụng của các polyphenol chè xanh trong thực phẩm nhằm bảo vệ và tăng cường đối với các chức năng cụ thể, đặc biệt là dành cho các đối tượng dựa theo tình trạng sức khỏe [78] như:

- Thực phẩm điều hòa, tăng cường hệ thống miễn dịch

- Thực phẩm điều hòa lypit trong máu

- Thực phẩm điều hòa hàm lượng đường trong máu

là do tác động của cafein và vitamin C Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế kỷ

XX, việc nghiên cứu chi tiết về chè đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của chè là do sự có mặt của nhóm hợp chất flavonoit có rất nhiều trong chè xanh Trong y học lâm sàng, tác dụng của flavonoit rất đa dạng, sau đây là một số hướng ứng dụng chính:

- Đ i ề u trị bệnh nhiễm trùng: chống viêm da, loét dạ dày, viêm mật cấp và mãn tính, viêm gan, viêm thận mãn tính, thương hàn, lỵ, kháng nhiều loại vi khuẩn, chống nấm, ngứa, ban đỏ, mề đay…[14], [25], [43], [47], [76]

- Về phương diện miễn dịch học, có nhiều bioflavonoit có khả năng ức chế sự

phát triển của virut, giúp bảo vệ các tổ chức cơ thể khỏi ảnh hưởng của bức xạ, vì vậy được ứng dụng để chống phóng xạ [32], [39], [79], [80]

- Thông mật, lợi tiểu do làm tăng quá trình khử độc của gan, tăng nhanh quá trình trao đổi glucoza và hình thành glycozen [2]

- Điều hòa hàm lượng các dạng cholesterol trong máu, tránh nguy cơ xơ vữa mạch, củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch máu và tế bào, có tác dụng

dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết, phục hồi trương lực cơ tim, điều hòa nhịp tim và huyết áp, điều hòa chuyển hóa canxi [50], [51]

Một số flavonoit có tác dụng chống khối u lành và ác tính Tính chất này phụ thuộc vào sự có mặt và vị trí các nhóm thế liên quan đến khả năng ức chế quá trình oxy hóa [8], [24], [32], [40], [42], [45], [54], [58], [60], [62], [64]

Nhận thấy trên thế giới việc ứng dụng polyphenol chè xanh trong y dược, thực phẩm rất phát triển, nhưng ở Việt Nam thì việc nghiên cứu ứng dụng còn

ít

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT POLYPHENOL TỪ CHÈ

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay trên thế giới việc trích ly polyphenol chè xanh đã sử dụng nhiều kỹ thuật trích lý mới : phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng [65], [68], [69], [71] cho hiệu suất trích ly cao, rút ngắn thời gian và giảm chi phí năng lượng Phương pháp trích ly có sự hỗ trợ sóng siêu âm [46], [59], cũng được áp dụng Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn được ứng dụng nhiều ở Đức [74], Nhật [57], Trung Quốc [56] khắc phục được dư lượng dung môi trong sản phẩm, dung môi sử dụng không độc hại, thực hiện ở nhiệt độ thấp (400C), hoạt tính polyphenol cao, tuy nhiên hiệu suất không cao và chi phí cao, thực hiện ở áp suất cao (200-400 bar) nên thiết bị đắt tiền, đòi hỏi vận hành với độ an toàn cao và chưa phù hợp với việc chuyển quy mô

Như vậy nhìn chung các quy trình thu polyphenol trên cho hiệu suất thu nhận polyphenol cao nhưng nó chỉ phù hợp ở các nước phát triển có trình độ kỹ thuật công nghệ cao, tự chủ được các dung môi và hóa chất cơ bản

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước

a Viện Hóa học Công nghiệp

Từ những năm 1990, Viện đã sớm tổ chức triển khai nghiên cứu công nghệ sản xuất polyphenol chè xanh theo phương pháp truyền thống Kết quả nghiên cứu

đã được công bố trong các bài báo Đề tài nghiên cứu cấp viên 1995-1996, báo các tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài độc lập cấp Nhà nước ĐTĐL-2002/13[4] Phát triển kết quả các nghiên cứu này, viên đã đăng ký và thực hiện thành công dự án sản xuất thử nghiệm độc lập cấp nhà nước mã số DAĐL-2006/06; trong đó polyphenol chè xanh >80% là một trong 5 sản phẩm chính của dự án

Vào năm 2006 Viện Hóa hoc Công nghiệp đã bắt đầu cung cấp dịch chiết trà xanh cho Unilever Việt Nam phối chế vào các sản phẩm kem đánh răng và một số sản phảm mỹ phẩm khác, tuy nhiên về chủng loại sản phẩm và chất lượng cần có những cải tiến nhất định Đề tài thu được các kết quả : với kỹ thuật chiết bằng SCO2thu được chế phẩm polyphenol có hàm lượng 84,7% và lượng chế phẩm đạt 0,583%

so với nguyên liệu; với kỹ thuật chiết bằng dung môi hữu cơ thu được chế phẩm có hàm lượng polyphenol 51,2 % và lượng chế phẩm đạt 6-7% so với nguyên liệu Như vậy phương án chiết polyphenol chè xanh bằng SCO2 tỏ ra không phù hợp về mặt kinh tế Phương án chiết bằng các dung môi hữu cơ cũng có một số hạn chế như polyphenol thu được chưa có độ tinh khiết cao Kết quả nghiên cứu cũng chưa thấy đề cập sự ảnh hưởng của quá trình chiết đến hoạt tính sinh học của polyphenol

Đã tiến hành chiết tách polyphenol theo phương pháp CO2 siêu tới hạn (SCO2) với nguyên liệu được sử dụng là lá 3, lá 4, mảnh chè có kích thước 0.5-1.5 mm có độ

âm nhỏ hơn 4.5 % Nhóm nghiên cứu cũng tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly như : nồng độ co-solvent trong SCO2, áp suất, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi SCO2/nguyên liệu, thời gian trích ly Với phương pháp này nhóm nghiên cứu thu được kết quả về hàm lượng polyphenol tổng số đạt 84.7%, hàm lượng thu được của sản phẩm 0.583% , thời gian kéo dài 5 giờ tại áp suất 300 bar, nhiệt độ

59oC, nồng độ etanol/SCO2 là 10%

b Trường đại học Công nghệ Hồ Chí Minh [11], [67], [68], [69]

Tiến hành các nghiên cứu trích ly polyphenol từ chè xanh, phân lập một số catechin

và tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của chúng theo phương pháp trich thông thường và phương pháp trích với sự hỗ trợ vi sóng Một số yếu tố ảnh hưởng như dung môi (rượu-nước), tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/5-1/15), pH, nhiệt độ trích, thời gian trích và ngâm của hai phương pháp được khảo sát Nhận thấy ở cùng điều kiện khảo sát, phương pháp trích với sự hỗ trợ vi sóng cho hiệu suất cao với thời gian ngắn hơn (82.6% trong 360 giây) phương pháp trích ly thông thường (62.1% trong 180 phút) Dịch trích chè xanh theo phương pháp có hỗ trợ vị sóng có hàm lượng polyphenol (36%) cao hơn phương pháp thông thường Phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng hữu hiệu hơn phương pháp trích thông thường về chất lượng, thời gian và chi phí năng lượng

c Viện Công nghiệp thực phẩm- Trường Đại học Bách khoa Hồ Chí Minh

Viện Công nghiệp thực phẩm đã tiến hành nghiên cứu chiết polyphenol từ chè xanh thành phẩm và chế phẩm polyphenol chè xanh của nhóm nghiên cứu Nguyễn Văn Chung có hàm lượng polyphenol tổng đạt 75% [3] Nhóm nghiên cứu đã tiến hành chiết polyphenol theo phương pháp trích ly bằng cồn và cũng chưa nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hoạt tính sinh học của polyphenol

Tại Tp HCM năm 2005, phân viện Công nghệ thực phẩm đã thực hiện đề tài cấp

bộ: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất polyphenol từ trà xanh Việt Nam” Tuy nhiên

kết quả đề tài mới đạt hàm lượng polyphenol trong chế phẩm ở mức 50 – 70% Năm

2008 Viện tiếp tục thực hiện đề tài : “Nghiên cứu cải tiến công nghệ và thiết bị để

nâng cao chất lượng catechin sản xuất từ trà xanh phục vụ cho nhu cầu xuất khẩu

và tiêu thụ trong nước” Nội dung nghiên cứu cải tiến quy trình công nghệ và thiết

bị sản xuất catechin từ trà xanh có độ tinh khiết ≥ 80% và ứng dụng quy trình công nghệ mới vào sản xuất thực nghiệm

d Nhóm nghiên cứu - Đại học Bách Khoa Hà Nội [21]

Nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm đã thực hiện trích

ly polyphenol từ chè xanh có hỗ trợ của siêu âm và đã đạt đã xác định điều kiện tối

ưu của quá trình trích ly là T=77˚C, thời gian trích ly 42 phút, pH =2.9, tỷ lệ dung

môi/nguyên liệu 10/1 tốc độ cánh khuấy là 442 vòng/ phút , tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu là 25/1 Hoạt tính chống oxy hóa là 57.29% % , hiệu suất đạt 73% Nhóm cũng

đã và đang nghiên cứu quá trình tinh chế polyphenol từ dịch trích, sử dụng dung môi chloroform (theo tỷ lệ 1:1), dung môi etyl acetat (theo tỷ lệ 2.5:1), nồng đô chè (15oBx)

Một nhóm nghiên cứu thuộc Viện công nghệ Hóa học cũng đã bước đầu nghiên cứu thực hiện trích ly polyphenol từ chè xanh có hỗ trợ của siêu âm và đã đạt đã xác định điều kiện tối ưu của quá trình trích ly là T=50˚C, thời gian trích ly

15 phút, tốc độ cánh khuấy là 439 vòng/ phút , tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu là 25/1 Hàm lượng polypheno trong dịch trích là 16,98% , hoạt tính là 61.06 % Hiệu suất quá trình trích ly đạt 90% Đến nay nhóm cũng đã và đang nghiên cứu quá trình tinh chế polyphenol từ dịch trích, sử dụng dung môi diclometan, dung môi etyl acetat và xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình Và cũng nghiên cứu chuyển quy

mô sang bán sản xuất (pilot)

Có thể nói việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm polyphenol từ chè xanh ở nước ta là một trong những nội dung có ý nghĩa, tạo ra các sản phẩm mới từ nông sản có giá trị cao nhằm bổ sung vào thực phẩm chức năng, cũng như trong y học Để làm được điều đó thì việc nghiên cứu xây dựng một quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh với các thông số công nghệ tối ưu và có tính ứng dụng cao là hết sức cần thiết

1.4.3 Công nghệ trích ly polyphenol từ chè [29], [37], [70], [73]

Trong các tài liệu nghiên cứu từ trước đến nay trên thế giới, tách polyphenol

từ chè xanh đều tiến hành theo phương pháp trích ly và theo nguyên tắc là sử dụng các dung môi hòa tan tốt polyphenol nhưng khó hòa tan các chất khác có trong chè như cất màu, chất sáp, protein và các thành phần không mong muốn Có thể tiến hành hai cách khác nhau:

- Loại chlorophyll, cafein trước, chiết tách polyphenol sau

- Chiết tách polyphenol trước sau đó mới loại bỏ chlorophyll

a Quy trình 1

Quy trình 1 tiến hành loại bỏ clorophyll cafein trước bằng dung môi clorofooc Sau đó trích ly dịch chè bằng dung môi cồn, thủy phân bằng axit HCl rồi chiết bằng etyl axetat

Cô chân không

Sấy chân không

e Quy trình 2

Hình 1.7 : Quy trình 2

Trích ly chè bằng dung môi là cồn, sau đó loại bỏ chlorophyll, cafein bằng dung môi diclemetan Tiến hành thủy phân bằng axit HCl rồi chiết polyphenol bằng etyl axetat

Nguyên liệu

Nghiền

Cô chân không

n Trích ly

Cô quay chân không

Dịch chè

Bột polyphenol Sấy chân không

Cô chân không Chiết polyphenol Thủy phân

Loại chlorophyll, cafein Diclometan

Cồn

Dịch chiết Diclometan

HCl

Diclometan

c Quy trình 3

Hình 1.6 :Quy trình 3

Trích ly dịch chè bằng dung môi là nước, thủy phân bằng axit HCl, sau đó chiết polyphenol bằng etyl axetat Sau đó mới loại bỏ chlorophyll, cafein bằng diclometan

Nguyên liệu

Nghiền

Thủy phân

Chiết polyphenol

Cô quay chân không

Loại chlorophyll, cafein

Cô chân không

Sấy chân không

HCl Nước

Etyl axetat

Nhận xét

Trong ba quy trình trên thì quy trình 1 và quy trình 2 ít được sử dụng hơn vì các lý do như sau :

- Sử dụng nhiều loai dung môi

- Hàm lượng dung môi trong sản phẩm cao

- Giá thành sản phẩm cao

Hiện nay quy trình 3 là phương pháp phổ biến được sử dụng tại Trung Quốc,

Ấn Độ, hay ngay sử dụng ngay tại Việt Nam vì có ưu điểm hơn so với hai quy trình

1 và 2 về độ an toàn cũng như giá thành sản phẩm, nhưng độ tinh khiết của chế phẩm chưa cao Tuy nhiên với cả ba quy trình đều chia ra làm hai giai đoạn : trích

ly và tinh chế Cả hai giai đoạn này đều có vai trò quan trọng và ảnh hưởng tới hàm lượng và hoạt tính sinh học của polyphenol

1.5 ĐÁNH GIÁ CHẾ PHẨM POLYPHENOL TRONG CHÈ

1.5.1 Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC)

a Phương pháp Lowenthal [21]

Đây là phương pháp chuẩn độ được sử dụng trong thời gian dài từ những năm 1903-1980, phương pháp này dựa trên phản ứng oxy hóa của hợp chất polyphenol (là hợp chất khử) bằng dung dịch kali permanganate (KMnO4) trong môi trường axit (H2SO4 98%) vơi sự có mặt của chất chỉ thị Indigo Carmine sẽ tạo thành CO2,

H2O, đồng thời làm mất màu xanh của Indio Carmine theo phản ứng sau :

polyphosphotungstate-kiềm nhẹ, sẽ bị khử thành sản phẩm muối phức molydenium-tungsten có màu xanh

 Nhận xét:

- Ưu điểm: Phương pháp cho độ chính xác khá cao, tiết kiệm thời gian

- Nhược điểm: Hóa chất đắt tiền, tiến hành phức tạp

- Polyphenol bao gồm nhiều chất thành phần, có phổ tử ngoại hấp phụ cực đại trong vùng 270-280nm, tan trong các dung môi phân cực Ethanol, methnol, etylacetate,…Dựa vào đặc điểm này, tiến hành phân tích hàm lượng EGC tại bước sóng λ = 270nm, pha động bao gồm những dung môi được trộn theo tỷ lệ thích hợp để tăng khả năng rửa giải các chất tan ra

+ Yêu cầu nghiêm ngặt về độ tinh khiết của dung môi

+ Thời gian phân tích lâu

d Phương pháp Brussian Blue [21]

Là một phương pháp so màu, nhằm xác định hàm lượng tổng polyphenol trong mẫu chè Hỗm hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN)6 bị khử bởi các hợp chất polyphenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh

1.5.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol trong dịch trích từ chè [21]

sự thay đổi màu sắc từ màu tía sang màu vàng nhạt khi gốc tự do bị thu gom bởi các chất chống oxi hóa thông qua việc nhường nguyên tử hydro để tạo thành dạng DPPH – H bền

DPPH• + AH = DPPH-H + A•

AH: Phân tử nhường H

Xác định độ hấp thụ của hỗn hợp để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của mẫu thí nghiệm Độ hấp thụ giảm càng mạnh thì hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thí nghiệm thông qua khả năng nhường hydro càng lớn

b Công thức tính

Hoạt tính chống oxy hóa, đo bằng % quét gốc tự do DPPH được tính theo công thức sau:

% quét DPPH = 100 Trong đó: A0 là độ hấp thụ của mẫu kiểm chứng

Ax là độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm

1.5.3 Xác định thành phần catechin [21], [36], [87]

Thiết bị: Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100 kết hợp với Detector điốt phổ rộng (DAD) có thể ghi nhận cùng lúc độ hấp thụ của cả dãy sóng

Chuẩn bị mẫu : Mẫu được pha trong methanol, có nồng độ khoảng 5 mg/ml

Điều kiện phân tích :

- Bước sóng phát hiện λ = 280.8 nm

- Tốc độ dòng :1ml/phút

- Nhiệt độ cột :35oC

- Pha động :A (CH3COOH trong nước cất loại ion); B (Methanol)

- Chế độ rửa giải gradient :

1 phút : A (100%) B(0%)

27 phút : A(60%) B(40%)

30 phút : A(100%) B(0%)

1.5.4 Xác định vết dung môi bằng SPME/GC [21]

Nguyên tắc : Phương pháp vi chiết pha rắn kết hợp với sặc ký (GC) dựa trên cân bằng hấp thụ của chất phân tích trên bề mặt một sợi nhỏ đặc biệt, sợi này được làm bằng thủy tinh quang học và được bao phủ một bởi một lớp chất pha tĩnh là các polime kỵ nước như poliacrilat, polidimetyl siloxan…Các chất phân tích ở pha khí hay pha lỏng đi vào lớp polime phủ trên sơi theo ái lưc của nó đối với pha tĩnh bằng cách đưa sợi vào dung dịch hay không gian hơi để hấp lưu các chất, cuối cùng là đưa trực tiếp sợi này vào injector của máy sắc ký để giải hấp nhiệt và phân tích Như vậy mẫu được tiêm trực tiếp vào máy sắc ký để phân tích mà không cần sử dụng đến dung môi

1.5.5 Xác định độc tính cấp [21], [23]

Dựa theo nguyên tắc và phương pháp thử độc tính cấp của Abrams Tiến hành thí nghiệm thăm dò các liều dây độc trên động vật, ghi nhận các biểu hiện lâm sàn và

nhân xét kế quả dựa trên ngưỡng quy định gây độc với giá trị LD50=2000 mg/kg trọng lượng theo OECD – Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế thế giới quy định

1.5.6 Xác định tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung tư in vitro [21]

Nguyên tắc : Đánh giá tính độc tế bào của chế phẩm trên tế bào ung thhuw nuôi cấy bằng cách so sánh phần trăm sống – chết khi bổ sung chế phẩm vào môi trường nuôi cấy (sau thời điểm bắt đầu nuôi cấy tế bào 72 giờ) với mẫu đối chứng không có chế phẩm Tác dụng gây độc tế bào được thử với dòng tế bào ung tư phổi LU-1, ung thư tuyến tiền liệt LNCaP, ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF7 và ung thư tủy xương Sp2/20

1.6 KẾT LUẬN

Có thể nói việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm polyphenol từ chè xanh

ở nước ta là một trong những nội dung có ý nghĩa, tạo ra các sản phẩm mới từ nông sản có giá trị cao nhằm bổ sung vào thực phẩm chức năng, cũng như trong y học Mặt khác lượng nguyên liệu thừa (chè già, cẫng…) lại dư thừa quá nhiều Vì vậy cần phải tận dụng việc thu hồi các sản phẩm có giá trị như polyphenol, cao chè để phục vụ cho các mục đích về y học, thực phẩm Để làm được điều đó thì việc nghiên cứu xây dựng một quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh với các thông số công nghệ tối ưu và có tính ứng dụng cao là hết sức cần thiết Chính vì vậy mà trong luận văn này đã chọn đề tài :” Nghiên cứu tối ưu hóa và xác định chế độ làm việc tối ưu của thiết bị trích li polyphenol từ lá chè xanh thứ, phế phẩm có nâng suất tối đa 10kg/h có sự hỗ trợ của sóng siêu âm”

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Từ phân tích ở phần tổng quan trên mục tiêu nghiên cứu của đề tài này hướng tới :

- Hoàn thiện qui trình trích ly Polyphenol từ chè phế phẩm có hỗ trợ sóng siêu âm

- Nghiên cứu các thông số ảnh hưởng đến hàm lượng Polyphenol tổng (TPC) và hoạt tính chống oxy hóa

- Tối ưu hóa quá trình công nghệ Polyphenol từ chè phế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm

- Thực nghiệm kiểm chứng và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để xác định chế độ công nghệ thích hợp cho quá trình trích ly Polyphenol từ chè phế phẩm ở quy mô bán sản xuất (pilot)

- Đánh giá chất lượng chế phẩm và hiếu suất quá trình trích

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng được nghiên cứu trong luận văn này là chè phế phẩm lấy từ công ty chè Hiệp Khánh, tỉnh Hòa Bình

2.2.1 Các chè phế phẩm

a Chè mảnh

Chè mảnh là một trong các loại phế phẩm của chè Chè mảnh được sinh ra trong quá trình sản xuất sơ chế chè Thành phần chính của chè mảnh là các mảnh của lá chè hoặc búp chè vỡ ra trong quá trình rung lắc phân loại chè Thành phần chủ yếu lá chè nên hàm lượng polyphenol lớn nhất trong các phế phẩm của chè

 Chè mảnh thô (BPS)

- Thu được trong quá trình rung, sàng

- Dễ bảo quản, dễ trích ly do kích thước nhỏ đồng đều

c Cẫng lẫn chè

Hình 2.5 : Cẫng lẫn chè

Đặc điểm :

- Trong cẫng có chứa một hàm lượng polyphenol tổng đáng kể

- Dễ bảo quản nhất trong các phế phẩm chè

- Kích thước cẫng khá lớn, do vậy khi trích ly cần nghiền nhỏ mẫu

- Không thuận lợi cho quá trình trích ly, vì khó lọc

2.2.2 Phương pháp trích ly TPC từ nguyên liệu

Đối tượng đem đi khảo sát là BPS, PS, F BMF, cẫng lẫn chè, chè cám

Các mẫu chè trước khi đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng được đem

đi sấy khô để xác định độ khô

- Dung môi sẽ tiếp xúc trực tiếp với vật liệu rắn và tách chất cần tách trong vật liệu rắn lượng lỏng sẽ theo mao quản chảy xuống bình cầu Quy trình cứ lặp lại suốt như vậy trong suốt thời gian trích ly

Tiến hành thí nghiệm:

- Cân chính xác 3gam mẫu của phế phẩm cần xác định hàm lượng polyphenol tổng cho vào túi lọc nạp vào thiết bị trích ly Thêm vào trong bình cầu 150ml nước cất

- Bật sinh hàn nước và thiết bị gia nhiệt Thời gian trích ly 10 giờ

- Các mẫu được làm lặp 3 lần để lấy kết quả

- Sau thời gian trích ly 10 giờ sẽ tháo lấy dịch trong bình cầu đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng

2.2.3 Phân tích đánh giá hàm lượng Polyphenol tổng (TPC) trong nguyên liệu

Polyphenol tổng (TPC) được xác định theo phương pháp Lowenthal

Bảng 2.1 : Số liệu TPC (Polyphenol tổng) của các mẫu chè

- Qua bẳng số liệu trên thấy hàm lượng polyphenol tổng trong mẫu BMF khá lớn so với các loại phế phẩm khác

- Kích thước mẫu nhỏ (1÷3mm) nên rất khả thi cho việc thực hiện quá trình trích ly

- Lượng phế phẩm trong quá trình sản xuất sinh ra rất lớn

- Tuy mẫu BPS có % polyphenol tổng lớn nhưng lượng phế phẩm trong quá trình sản xuất là nhỏ

Để nghiên cứu có tính nhất quán, và thu được hiệu quả thì đối tượng

nghiên cứu là loại chè BMF

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Quy trình trích ly polyphenol từ chè

Từ những quy trình trích ly được áp dụng trên thế giới hay trong nước, ( đã đề cập ở phần tổng quan), và từ những điều kiện thực tế có sẵn nên tiến hành thực hiện quá trình trích ly Polyphenol tổng (TPC) theo dưới đây:

Hình 2.9: Quy trình trích ly polyphenol từ chè

Bột polyphenol

Trích ly Nghiền Nguyên liệu

Loại chlorophyll, caffein

Tách, tinh chế polyphenol Trích ly

Chè phế phẩm được xử lý bảo quản được đưa vào giai đoạn đầu tiên trích ly lấy dịch Quá trình chiết lấy dịch chè được thực hiện bởi phương pháp trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm Phương pháp trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm được lựa chọn vì ưu điểm của nó đã được phân tích ở phần I : Tổng quan

Mặt khác dịch trích có chứa rất nhiều tạp chất nên phải được loại bỏ các tạp chất nhờ Clorofooc (hoặc diclometan), sau đó được tách và tinh chế polyphenol để thu được polyphenol tinh khiết

2.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng dên quá trình trích ly

a Ảnh hưởng của tốc đô khuấy trộn

Quá trình trích ly phụ thuộc rất nhiều vào chế độ thủy động của dung môi Khuấy trộn sẽ tạo nên sự tiếp xúc tốt hơn và đồng đều hơn giữa dung môi và vật liệu rắn, làm cho dung môi và vật liệu rắn liên tục chuyển động Đẩy nhanh quá trình thâm nhập của dung môi vào vật liệu rắn, làm tăng hiệu suất trích ly

Khảo sát tốc độ khuấy nhằm tìm ra vùng làm việc thích hợp Đảm bảo thu được polyphenol tổng là lớn nhất, quá trình trích ly đạt hiệu quả cao nhất

khối lượng – v/m) vào bình tam giác dung tích 250ml Được đưa vào bể siêu

âm giữ ổn nhiệt ở 500C lắp bộ cánh khuấy Thời gian trích ly 15 phút Tại mỗi điều kiện làm 3 lần thí nghiệm lặp Dịch sau khi chiết được đem lọc chân không loại bỏ tạp chất và đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng

và hoạt tính

b Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu rắn

Trong trích ly nói chung và trích ly có sử dụng sự trợ giúp của sóng siêu âm nói riêng thì lượng dung môi cho vào cũng rất quan trọng Vì nếu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu rắn ít có thể dẫn đến không chiết hết được hoạt chất cần (polyphenol), nhưng nếu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu răn nhiều quá thì sẽ làm tăng lượng tạp chất trong dịch trích ly và năng lượng tiêu tốn để tách cấu tử phân bố trong dung môi tăng Do vậy cần phải nghiên cứu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu rắn

để từ đó chọn được tỷ lệ thích hợp nhất cho quá trình trích ly Mục đích của việc nghiên cứu yếu tố này là đảm bảo tiết kiệm dung môi, tạo ra hiệu quả cao nhất cho cho quá trình trích ly

- Khoảng khảo sát tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu ( v/m) từ 5/1 đến 25/1

- Các thí nghiệm được tiến hành như sau: Cho 10 gam chè phế phẩm và dung môi nước ở nhiệt độ 500C theo tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu được khảo sát ( thể tích/ khối lượng – v/m) vào bình tam giác dung tích 250ml Được đưa vào bể siêu âm giữ ổn nhiệt ở 500C lắp bộ cánh khuấy Tốc độ khuấy 391 vòng/ phút Thời gian trích ly 15 phút Tại mỗi điều kiện làm 3 lần thí nghiệm lặp Dịch sau khi chiết được đem lọc chân không loại bỏ tạp chất và đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính

c Yếu tố nhiệt độ

Tăng nhiệt độ trích ly có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình trích ly, nó có ưu điểm

và nhược điểm như sau :

Ưu điểm :

- Làm giảm độ nhớt của dung môi

- Làm tăng độ tan và tăng tốc độ khuyếch tán của chất tan và dung môi

- Tăng hiệu suất của quá trình trích ly

- Làm tăng chi phí sản xuất vì tiêu tốn điện năng

Chính vì vậy cần phải chọn nhiệt độ trích ly thích hợp như sau:

- Khoảng nhiệt độ khảo sát từ 300C đến 700C

- Các thí nghiệm được tiến hành như sau: Cho 10 gam chè phế phẩm và dung môi nước ở nhiệt độ khảo sát theo tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 10/1 ( thể tích/ khối lượng – v/m) vào bình tam giác dung tích 250ml Được đưa vào bể siêu

âm giữ ổn nhiệt ở 500C lắp bộ cánh khuấy Tốc độ khuấy 391 vòng/ phút Thời gian trích ly 15 phút Tại mỗi điều kiện làm 3 lần thí nghiệm lặp Dịch sau khi chiết được đem lọc chân không loại bỏ tạp chất và đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính

d Yếu tố thời gian

Các hoạt chất trong nguyên liệu rắn thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn tạp chất nên quá trình khuyếch tán nhanh chóng đạt đến cân bằng Nếu thời gian trích ly kéo dài sẽ dẫn đến tỷ lệ hoạt chất trong dịch chiết không tăng (do đã hòa tan bão hòa) nhưng ngược lại tap chất sẽ khuyếch tán vào dịch chiết, làm tăng lượng tạp chất có trong dịch chiết Ngoài ra tăng thời gian chiết cũng đồng thời làm tăng chi phí sản xuất Mặt khác nếu thời gian trích ly ngắn sẽ làm cho quá trình trích ly đạt hiệu quả không tốt do các hoạt chất cần tách chưa tan hết vào dung môi

- Khảo sát thời gian trích ly từ 5 phút đến 30 phút

- Các thí nghiệm được tiến hành như sau: Cho 10 gam chè phế phẩm và dung môi nước ở nhiệt độ 500

C theo tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 10/1 ( thể tích/ khối lượng – v/m) vào bình tam giác dung tích 250ml Được đưa vào bể siêu

âm giữ ổn nhiệt ở 500C lắp bộ cánh khuấy Tốc độ khuấy 391 vòng/ phút Tại