Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn kháng vi nấm gây bệnh phân lập từ vùng rễ cây trồng ở việt nam và ứng dụng

Theo kết quả nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật, ở Việt Nam có khoảng 1000 loài vi sinh vật gây bệnh, điển hình như các loại bệnh héo vàng và héo xanh ở khoai tây, cà chua do vi khuẩn,

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM VIỆT CƯỜNG

LÊ VĂN NHƯƠNG

HÀ NỘI - 2009

Fusarium gây ra chi ếm tỷ lệ tương đối lớn [22] Fusarium oxysporum là một

trong các tác nhân gây bệnh chết héo, tắc mạch dẫn và thối rễ thối thân ở nhiều loại cây trồng như: lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bông

Nền nông nghiệp nước ta có vai trò rất quan trọng, nó không chỉ cung cấp lương thực, thực phẩm, mà còn tạo ra hàng hoá có giá trị xuất khẩu cao, đặc biệt là các cây công nghiệp như: tiêu, bông, cà phê… Tuy nhiên, năng suất và chất lượng cây trồng đã và đang phải đối mặt với rất nhiều vấn đề hết sức khó khăn, đặc biệt là bệnh cây trồng do nấm gây ra

Theo kết quả nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật, ở Việt Nam có khoảng 1000 loài vi sinh vật gây bệnh, điển hình như các loại bệnh héo vàng

và héo xanh ở khoai tây, cà chua do vi khuẩn, vi nấm gây ra.Trong số 24 bệnh lúa ở Việt nam, có tới 13 bệnh có nguồn gốc từ nấm, chủ yếu là nấm đạo ôn

(Magnaporthe grisea), khô v ằn (Rhizoctonia solani) và thối thân, thối rễ (F oxysporum) trong số đó F oxysporum là loài phổ biến thường gặp gây nên

bệnh thối rễ, thân và héo vàng lá cho nhiều loài cây Điển hình, năm 1997 ở Lục Ngạn-Lục Nam (tỉnh Bắc Giang) có nhiều cây vải thiều bị chết đột ngột,

nguyên nhân gây chết ở đây là do nấm gây bệnh thối cổ rễ Fusarium sp kí

sinh [19]

Nhờ khả năng hoại sinh chất hữu cơ mà F oxysporum có thể sống sót

qua các chu kì mùa vụ Chúng thường sống và phát triển tốt ở điều kiện khí hậu ấm, úng nước, phổ biến trong đất cát và axit, phát tán bào tử nhờ gió hoặc

nước Thường rất khó kiểm soát bệnh cây bằng các phương pháp đơn lẻ

Một vài phương pháp đã được sử dụng như thay đổi pH của đất, chế độ tưới tiêu, luân canh, bón phân và sử dụng thuốc diệt nấm nhưng viêc sử dụng thuốc diệt nấm lâu dài và có hệ thống dẫn đến ô nhiễm môi trường và sự kháng thuốc của tác nhân gây bệnh Đối mặt với vấn đề đó, việc sử dụng các tác nhân sinh học để kiểm soát dịch bệnh đã được các nhà khoa học trên thế

giới quan tâm nghiên cứu Trong những năm gần đây, rất nhiều nghiên cứu về

việc sử dụng vi sinh vật đối kháng để ức chế tác nhân gây bệnh cho cây từ đất

đã được tiến hành và một số chủng đối kháng đã được thương mại hoá

Phương pháp sử dụng vi sinh vật trong bảo vệ môi trường không những mang lại hiệu quả cao, an toàn, sản phẩm thu hoạch không ảnh hưởng tới người sử dụng, có lợi cho cân bằng sinh thái, mà còn làm giảm phần lớn lượng thuốc hoá học sử dụng Việt Nam là một nước nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, với đặc trưng khí hậu nóng ẩm, lượng mưa hàng năm lớn, là điều kiện thuân lợi cho các vi sinh vật mà điển hình là nấm bùng phát, gây hại cho cây trồng, dẫn đến tổn thất lớn cho sản xuất nông nghiệp Mỗi

năm chi phí trong việc phòng, trừ bệnh cây là rất cao mà phần lớn là sử dụng thuốc hoá học Trên thực tế phương pháp này có hiệu quả tức thời nhưng nếu

sử dụng lâu dài sễ dẫn đến tình trạng thoái hoá đất và kháng thuốc của các nguồn bệnh Vì vậy, biện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng sẽ là một trong

những giải pháp thiết thực để có một nền nông nghiệp bền vững

Với ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài”

N ghiên cứu một số chủng vi khuẩn kháng vi nấm gây bệnh phân lập từ vùng rễ cây trồng ở Việt Nam và ứng dụng.”

Mục đích nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn và định loại các chủng vi khuẩn mang tính

kháng F oxysporum và một số tác nhân gây bệnh ở cây trồng Xác định các

thông số lên men thích hợp: môi trường, nhiệt độ, thời gian, chế độ sục khí

- Nghiên cứu tách dòng và giải trình tự gen PhlD tham gia vào sinh

tổng hợp chất đối kháng

- Nghiên cứu thử nghiệm quy mô nhỏ để khẳng định hoạt tính kháng vi nấm gây bệnh của các chủng vi khuẩn có ích phân lập được, trong việc bảo vệ thực vật trước những tác nhân gây bệnh

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng kháng F oxysporum từ đất

trồng của một số loại cây: cà phê, bông, cà chua, lạc

- Tuyển chọn và xác định một số hoạt tính của các chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao

- Định loại bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen rpoB

và gen 16S ADN riboxom) và nghiên cứu quan hệ phát sinh loài của các chủng triển vọng

- Tách dòng và giải trình tự gen PhlD mã hoá cho diacetylphloroglucinol là hoạt chất có khả năng diệt nấm

2,4 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng triển vọng lên cây ở qui mô phòng thí nghiệm, thử nghiệm độ an toàn của các chủng nghiên cứu lên chuột nhắt trắng giống Swiss

- Xác định một sô thông số cơ bản như: nhiệt độ, pH của môi trường, thời gian lên men cũng như chế độ sục khí… ảnh hưởng đến quá trình lên men thu sinh khối để phục vụ cho quá trình sản xuất chế phẩm

- Nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn vào sản xuất thử nghiệm

chế phẩm đối kháng, thử nghiệm tác động của chế phẩm lên cây bông trong chậu vại và trên cây lạc và cà chua ở qui mô nhỏ trên đồng ruộng

Những đóng góp mới của luận án

1 Đã định loại được 4 chủng vi khuẩn có triển vọng bằng phương pháp sinh

học phân tử giải trình tự gen 16S ADN riboxom Đặc biệt đã ứng dụng phương pháp mới giải trình tự gen rpoB mã hoá cho tiểu phần β của ARN polymeraza để định loại 2 chủng vi khuẩn phân lập, góp phần làm phong phú ngân hàng gen Việt Nam

2 Đã tạo dòng và xác định được trình tự nucleotit của gen PhlD mã hoá cho

2,4-diacetylphloroglucinol, đây là một trong những hoạt chất quan trọng có khả năng diệt nấm tốt

3 Từ những nghiên cứu ban đầu cho thấy các chủng triển vọng không gây hại cho cây trồng và động vật Vì thế, chúng được ứng dụng vào sản xuất thử nghiệm chế phẩm đối kháng qui mô nhỏ trên đồng ruộng Đây là nghiên cứu rất có ý nghĩa trong thực tiễn, đặc biệt là trong việc chống lại các vi nấm gây bệnh ở cây trồng nhằm bảo vệ thực vật, hướng tới một nền nông nghiệp bền

vững

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 B ỆNH CÂY

1.1.1 Tác h ại của bệnh cây

Ở thế kỷ thứ 3 trước công nguyên Theophraste đã nói tới tác hại của

một số bệnh hại Những nghiên cứu về bản chất nguyên nhân gây bệnh cây và các biện pháp phòng trừ đơn giản đã được tiến hành từ thế kỷ 18 M.Tillet (1775) và B Prevost (1870) là những ngưởi đầu tiên nghiên cứu về bệnh than đen lúa mì Tác phẩm khoa học đầu tiên về bệnh cây, đặt nền móng ban đầu cho sự hình thành và phát triển môn khoa học này đã được Anton de Bary công bố vào năm 1853 Từ đó, khoa học bệnh cây được phát triển toàn diện

và sâu rộng Hội nghị quốc tế về bệnh cây lần thứ nhất được tổ chức tại Luân đôn (8/1968) đã đánh dấu một thời kỳ phát triển và hợp tác quốc tế nghiên cứu về bệnh cây trên toàn thế giới [17]

Dịch bệnh mốc sương khoai tây (Phytophthora infestans D B) đã phá

hại khủng khiếp ở Aixơlen vào những năm 1854-1847 Ở nước ta, từ năm

1957 đến nay đã trải qua nhiều đợt dịch bệnh đạo ôn hại lúa, bệnh bạc lá vi khuẩn, bệnh vàng lá virus, bệnh khô vằn,… gây tổn thất lớn về sản phẩm thu

hoạch, làm mất ổn định về năng suất của nhiều giống lúa tốt Bệnh mốc sương, bệnh xoăn lá, bệnh chết héo là những bênh thường xuyên gây thiệt hại

có khi tới 60-100% năng suất cà chua, khoai tây và một số cây trồng khác Tóm lại, tác hại của bệnh cây thể hiện ở các mặt sau đây:

- Làm giảm rõ rệt năng suất thu hoạch của cây trồng

- Làm giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và cất trữ

- Làm ảnh hưởng đến đất đai trồng trọt, cơ cấu giống cây trồng, chế độ luân canh, tính chất hoạt động của thành phần vi sinh vật đất, nhất là khi sử dụng nhiều thuốc hóa học độc hại để phòng trừ bệnh, xử lý đất trồng

Một số bệnh hại nông sản còn sinh ra những độc tố có ảnh hưởng xấu

trực tiếp đến sức khỏe và đời sống con người, gia súc khi sử dụng Độc

tố aflatoxin của bệnh mốc vàng hại lạc (Aspergillus flavus) có thể gây

bệnh ung thư gan của người và động vật

1.1 2 Định nghĩa bệnh cây

Một cây khỏe là cây sinh trưởng phát triển bình thường theo bản

chất di truyền vốn có trong những điều kiện sống phù hợp được thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu cần thiết Khi thể thống nhất này bị phá vỡ, cây trồng không thể sinh trưởng phát triển tốt, biểu hiện triệu chứng bên ngoài và bên trong các hiện tượng suy giảm sinh lý, ngừng trệ sinh trưởng, còi cọc,

giảm sút năng suất thậm chí gây chết lụi Tất cả những sự biến đổi không phù hợp của mô tế bào dẫn tới sự phân hủy chức năng sinh lý cấu tạo của cây dưới ảnh hưởng tác động ngoại cảnh bất lợi gọi là “quá trình bệnh lý” Điều cơ bản để xét tình trạng cây bệnh là phải căn cứ vào quá trình bệnh lý

có tính chất biến đồng, liên tục diễn ra ở trong cây

Có thể định nghĩa cây bênh như sau: “Bệnh cây là trạng thái không bình thường có quá trình bệnh lý biến động liên tục xảy ra ở trong cây do các yếu tố ngoại cảnh không phù hợp hoặc ký sinh vật gây ra, dẫn đến sự phá hủy chức năng sinh lý, cấu tạo, giảm sút năng suất, phẩm chất cây

trồng”

1.1.3 Khái ni ệm về đặc tính ký sinh và tính gây bệnh của vi sinh vật gây

b ệnh

1.1.3.1 Khái ni ệm về tính ký sinh

Vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm tác động vào cây bằng các con đường khác nhau:

- Chúng có thể sử dụng các vật chất dinh dưỡng của cây để thỏa mãn yêu cầu về đời sống của chúng

- Có thể xâm hại bộ rễ, hệ thống bó mạch của cây gây ra sự phá hủy quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng trong cây

- Chúng có thể sản sinh ra các hoạt chất sinh học, thực chất là các độc

tố và enzym để tác động phân giải và đầu độc tế bào cây trồng, phá hủy các enzym của cây cũng như các quá trình trao đổi chất trong cây

bệnh

1.1.3.2 Kh ả năng gây bệnh của vi sinh vật gây bệnh

Khả năng gây bệnh của vi sinh vật trên cây trồng do các đặc tính: tính xâm nhiễm, tính gây bệnh và tính độc quyết định

* Tính xâm nhiễm: Là khả năng công phá đột nhập của ký sinh vật vào bên trong cây, vượt qua các cản trở và phản ứng chống đối tự vệ của cây đến tiến hành bước đầu của quá trình xâm nhiễm

* Tính gây bệnh: Là khả năng sinh trưởng dinh dưỡng, phát triển lan rộng trong mô thực vật làm cho cây nhiễm bệnh, gây ra những tác động

bệnh lý và tạo ra triệu chứng bệnh đặc trưng

* Tính độc: Là khái quát cả hai khái niệm về tính xâm nhiễm và tính gây bênh, biểu hiện ở mức độ gây hại và mức độ lây nhiễm đối với loại cây ký chủ phân hóa trên những giống khác nhau trong loài cây đó Thông thường một loại ký sinh có tính xâm nhiễm cao và tính gây bệnh cao

sẽ là loại có tính độc cao Tuy nhiên cũng có một số trường hợp không hoàn toàn như vậy Hơn nữa, một loại ký sinh vật có thể có tính độc cao đối với một giống này mà không có tính độc đối với một giống khác trong cùng một loài cây đó Sự khác nhau về tính độc thường thể hiện ở các chủng sinh lý và

các nòi sinh học khác nhau của một loài ký sinh và đó cũng là một cơ sở để

xác định và phát hiện các chủng, nòi khác nhau của ký sinh vật

Nguyên nhân sinh vật gây bệnh cây chủ yếu nhất, phổ biến nhất là các loại virus, vi khuẩn, nấm ký sinh và một vài loại khác.[17]

1.2.1 Nấm mốc

Nấm mốc là vi sinh vật nhân thật, ở thể tản (thalophyte), tế bào không

có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin Nấm học (Mycology) được khai sinh bởi nhà thực vật học người Ý, Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) Nhưng theo giáo sư Eriksson Gunnan (1978), thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 - 1874) Theo Elizabeth Tootyll (1984), nấm mốc có khoảng 5.100 chi và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất [106]

Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ như động vật, thực vật, đặc biệt trên con người, cây trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa hoặc đã qua chế biến, bảo quản Một số là tác nhân gây bệnh, làm

hư các thiết bị thủy tinh bảo quản không tốt, nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp acit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật… đã được đưa vào sản xuất công nghiệp và có một số nấm được dùng làm đối tượng nghiên cứu về di truyền học

1.2.1.1 Hình thái và kích thước

Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ sợi chằng chịt phát triển rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm Nấm mốc có 2 loại khuẩn ti: khuẩn ti khí sinh mọc trên bề mặt môi trường, từ đây sinh ra những cơ quan sinh sản Khuẩn ti cơ chất mọc sâu vào môi trường Hai loại

khuẩn ty này đóng vai trò và nhiệm vụ khác nhau, khuẩn ty cơ chất có nhiệm

vụ như những chiếc rễ của cây xanh, còn khuẩn ty khí sinh lại đóng vai trò sinh sản là chủ yếu

1.2.1.2 Sinh sản

Hình 1.1 Sinh s ản bằng bào tử của nấm

Nấm mốc có 3 hình thức sinh sản chính:

*Sinh sản sinh dưỡng

- Sinh sản sinh dưỡng bằng khuẩn ti: là hình thức từ một khuẩn ti gãy

ra những đoạn nhỏ, trong những đoạn nhỏ này xuất hiện một hay nhiều tế bào hình cầu có màng dày bao bọc, bên trong có nhiều chất dự trữ Khi gặp điều kiện thuận lợi nó tiếp tục phát triển thành một hệ sợi nấm mới

- Sinh sản sinh dưỡng bằng hạch nấm: Hạch nấm thường có hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, màu tối Bên trong là một tổ chức sợi xốp và

thường là màu trắng, kích thước tuỳ theo loài Hạch nấm là một tổ chức giúp cho nấm sống qua những điều kiện ngoại cảnh bất lợi Sợi nấm tồn tại trong hạch không phát triển Khi gặp điều kiện thuận lợi hạch sẽ nảy mầm và phát triển bình thường

- Sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử dày: trên phần giữa của khuẩn ti hoặc phần đầu khuẩn ti hình thành tế bào có màng dầy bao bọc, bên trong chứa nhiều chất dự trữ Gặp điều kiện thuận lợi bào tử dầy sẽ nảy mầm thành một hệ sợi nấm Bào tử dầy thường là đơn bào, đôi khi là 2 hoặc nhiều tế bào

* Sinh sản vô tính

Sinh sản vô tính ở nấm mốc có hai hình thức:

- Bào tử kín: là bào tử hình thành trong một nang kín Từ một khuẩn ti mọc lên cuống nang, cuống nang thường có đường kính lớn hơn đường kính khuẩn ti Cuống nang có loại phân nhánh và có loại không phân nhánh Trên cuống nang hình thành nang bào tử Cuống nang có phần ăn sâu vào trong nang gọi là nang trụ Ở một số loài, bào tử nằm trong nang có tiên mao, khi nang vỡ, bào tử có khả năng di động trong nước gọi là động bào tử (Zoospore)

Sự khác nhau giữa bào tử dày ở sinh sản sinh dưỡng và bào tử kín ở sinh sản vô tính: bào tử dầy chính là một hoặc một vài tế bào trong một sợi nấm hình thành màng dầy bọc lại Bào tử kín phức tạp hơn, có cơ quan mang bào tử là nang, có nang trụ, cuống nang

- Bào tử đính: là hình thức bào tử được hình thành bên ngoài cơ quan sinh bào tử chứ không nằm trong nang kín

* Sinh sản hữu tính

Các bào tử hữu tính ở nấm rất đa dạng, có thể kể đến bào tử noãn, bào

tử tiếp hợp, bào tử túi, bào tử đảm

Ngoài các hình thức trên, còn một số hình thức sinh sản khác nữa

Cùng một loài nấm mốc có thể có nhiều hình thức sinh sản khác nhau Ví dụ

như Fusarium có bào tử dày và bào tử đính Cách phát sinh bào tử khác nhau

cũng có thể có cùng ở một loại nấm [5],[9]

1.2.2 Khái quát về nấm gây bệnh

Thực vật bị tấn công bởi hàng trăm nguyên nhân gây bệnh khác nhau, trong đó các nguồn bệnh chủ yếu có nguồn gốc từ nấm, vi khuẩn và virut Bệnh hại chính trên cây trồng trong giai đoạn trước và sau thu hoạch do các nhóm như: Phytophthora, Xanthomonas, Erwinia, Pythium, Pseudomonas,

Fusarium, Aspergillus, Rhizopus Những dịch bệnh này trên thực tế có thể phá hủy toàn bộ vụ thu hoạch của các cây trồng quan trọng như: tiêu, cà phê, khoai tây, cà chua… Ước tính khoảng 40% cây trồng các loại bị hủy hoại bởi bệnh dịch thực vật [61][62]

Hiện nay, có hơn 80.000 loài nấm được biết có khả năng gây bệnh cho cây trồng, phần lớn sống theo kiểu bán hoại sinh, trong đó có một vài loài nấm có thể gây hại trên nhiều loại cây trồng [25] Nấm là sinh vật dị dưỡng, nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống lấy từ các chất hữu cơ, chúng tập trung ở các tầng đất phía trên do các chất hữu cơ ở đây phong phú Nấm chịu tác động chính của các yếu tố như: nồng độ ion H+, chế độ nước, nhiệt

độ, cấu trúc đất… Bệnh do nấm gây ra rất khó phòng trừ vì chúng có khả năng tồn tại lâu trong đất Hơn nữa, nhiều loài nấm có thể phát triển trong khoảng pH rất rộng, từ pH axit cho đến pH kiềm cao [8]

Cà chua là một loại rau quan trọng trên thế giới nhưng dễ bị nhiễm bệnh, nhất là trong thời kỳ nảy mầm Các loại nấm thường gây bệnh cho cà

chua gồm 8 loài Pythium, một vài chủng Rhizoctonia solani và Fusarium sp Pythium phát triển mạnh nhất trong hai giai đoạn : thời kỳ hạt nảy mầm đến thời kỳ cây non và thời kỳ cây bắt đầu tạo quả đến lúc quả chín Thời kỳ cây

ra hoa quần thể Pythium trong vùng rễ là thấp nhất Ngoài ra, nhiệt độ thấp,

độ ẩm đất cao vả tỷ lệ C/N thấp là những điều kiện tốt cho Pythium phát triển

[78]

Rhizoctonia solani còn gây bệnh thối rễ ở củ cải đường và làm giảm năng suất đến 25%(Mỹ) Nhưng thiệt hại về năng suất có thể lên đến 50% phụ thuộc vào lịch sử trồng trọt và môi trường xung quanh Ở Mỹ, năm 1998 có 27,2% diện tích trồng trọt bị nhiễm bệnh, năm 1999 là 23,7% Trong vùng tưới tiêu phía Tây của Mỹ, 42,3% năm 1998 và 30,4% đất trồng trọt năm

1999 bị nhiễm bệnh [57]

Hoa anh thảo cũng là đối tượng dễ nhiễm bệnh F oxysporum và R solani R solani không tạo bào tử, vì vậy hạch nấm là đơn vị phân tán và sống

sót Hạch nấm rất khó kiểm soát bởi thuốc diệt nấm [96]

Ngoài các loại nấm kể trên, Verticillium dahliae cũng là một loại nấm gây bệnh héo rũ và Phytophthora caetorum gây bệnh thối rễ cho dâu tây Tiểu hạch nhân (microsclerotia) của V dahliae sống trong mô già của những cây

chết có thể tồn tại trong đất vài năm, vì vậy không thể sử dụng biện pháp hoá học để tiêu diệt [105]

Lịch sử trồng trọt của một loại đất cũng là một chỉ thị tốt về sự rủi ro của bệnh Các loại cây như khoai tây, bông, bắp cải, củ cải đường, các loại rau kích thích mật độ V dahliae trong đất, vì vậy sẽ làm tăng sự nhiễm bệnh tiềm tàng trong cây Thời tiết cũng là nhân tố ảnh hưởng đến bệnh cây Những năm có mùa hè khô và ấm tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh héo dâu tây phát triển

Trong số 24 bệnh lúa ở Việt Nam thì có tới 13 bệnh phát sinh có nguồn

gốc từ nấm, chủ yếu là bệnh đạo ôn (Magnaporthe grisea), bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani), bệnh héo xanh (Ralstonia solanacearum) và bệnh thối thân, thối rễ hay còn gọi là bệnh đổ rạp (Fusarium oxysporum) [3] Trong các bệnh cây có nguồn gốc do nấm, F oxysporum là một trong những loài gây

thiệt hại nặng nề nhất cho cây trồng Chúng có khả năng thích ứng rất nhanh với những thay đổi điều kiện sống bằng cách thay đổi những đặc điểm hình

thái, sinh lý trong quá trình sinh trường và phát triển Ngoài ra, Fusarium còn

có thể sống trong đất một thời gian dài vì có khả năng sống hoại sinh, chống chịu với các hoạt động đối kháng của các vi sinh vật trong đất, kết quả đã dẫn đến sự gia tăng số loài trong những điều kiện địa lý, sinh thái khác nhau

1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý của Fusarium oxysporum

Chi Fusarium bao gồm trên 30 loài, trong đó loài F oxysporum là loài phổ biến và cũng là loài gây bệnh nguy hiểm ở thực vật, F oxysporum gây ra

hiện tượng tắc mạch dẫn của cây là nguyên nhân trực tiếp của bệnh thối thân, thối rễ ở một số cây như : Cà chua, khoai tây, bông, hồ tiêu, cà phê , bệnh ít khi xuất hiện sớm mà thường gây hại mạnh nhất vào giữa giai đoạn sinh

trưởng của cây Do đặc điểm và tính chất gây bệnh nguy hiểm của F oxysporum nên rất khó kiểm soát và tiêu diệt bằng phương pháp đơn lẻ, mà

chỉ có thể kết hợp một số biện pháp để kiểm soát được bệnh Biện pháp hóa học thường được sử dụng, tuy biện pháp này có hiệu quả ngay tức thời nhưng lại có nhiều nhược điểm đó là kích thích sự kháng thuốc của tác nhân gây bệnh [65][99]

Hình 1.2 Hình dạng khuẩn lạc của F oxysporum

F oxysporum là loại nấm đa bào phân nhánh, màu sắc tản nấm trắng phớt hồng Trong quá trình sinh sản chúng sinh ra hai loại bào tử khác nhau: Bào tử hậu và bào tử phân sinh

- Bào tử hậu (chlamydospore): Có màu sẫm, vỏ dày có hình ovan, được hình thành từ sợi nấm hay từ bào tử lớn

Bào tử phân sinh có hai loại:

- Bào tử loại lớn (macroconidia): Có hình lưỡi liềm hoặc bầu dục, ngắn thẳng hoặc cong nhẹ, thường có ba ngăn ngang, ổ màu da cam

Hình 1.3 Bào tử của F oxysporum

- Bào tử loại nhỏ (microconidia): Dạng đơn bào, hình elip hoặc quả thận, hình thành bọc giả trên cành đơn nhánh, không màu

Cành bào tử phân sinh nhiều nhánh, bào tử phân sinh mọc thành từng cụm 2 đến 3 chiếc trên đỉnh cành Kích thước tản phụ thuộc vào nhiệt độ Ở

250C tản phụ có kích thước khoảng 3.5 cm, ở 300C - khoảng 2.8 cm Tản có màu nhạt hoặc tím đậm Nấm vẫn có thể mọc được ở 420C trên các môi trường thông thường Dưới 200C nấm vẫn mọc, nhưng phát triển chậm Nhiệt

độ tối thích là 250C đến 300C, phát triển trong 4 - 5 ngày và ở độ ẩm rất cao 90% - 95% [57]

1.2.4 Cơ chế gây bệnh và biểu hiện

F oxysporum là loài nấm có phạm vi kí chủ rộng, có mặt ở hầu hết các

vùng trồng trọt trên thế giới Ở Hawaii, vật chủ của Fusarium là khoai tây,

mía, cây họ cà phê, hạt tiêu, bông Chúng gây bệnh đổ rạp ở nhiều loài thực vật như: cà phê, hạt tiêu, cọ dừa, lúa, cà chua, dưa chuột… Ví dụ: Ở cà chua, bệnh có thể làm chết 20 - 30% cây, có nơi bị nặng, tỉ lệ cây bị chết là 100% thậm chí có thể gây hại cho người và động vật do có độc tố mycotoxin [61]

Hình 1.4 Cây cà chua bị nhiễm F oxysporum

Có thể khái quát cơ chế gây bệnh của F oxysporum như sau: Đầu tiên

các sợi nấm tạo thành một dạng đặc biệt xâm chiếm và bám chặt lấy lớp biểu

bì của thực vật.Sau đó nó phát triển những sợi nấm mới càng lúc càng nhiều các đầu của sợi nấm tạo thành những đỉnh nhọn xuyên vào lớp biểu bì đồng thời nó tiết ra độc tố và một số enzim để phá hủy thành tế bào thực vật, xâm

nhập vào hệ mạch chủ của cây Sau khi xâm nhập, F oxysporum lan tràn khắp

thực vật nhờ một ống chứa đầy bào tử hoặc sợi khuẩn ty Sợi khuẩn ty tiến đến hệ thống xylem, từ đây chúng tiếp tục lan tới hệ thống gân lá, nhờ dòng nhựa, chúng đi tới toàn bộ hệ thống mạch của thực vật Nấm phát triển mạnh,

ảnh hưởng đến việc cung cấp nước và chất khoáng khiến cho lá cây chuyển sang màu vàng, bắt đầu từ rễ, thân phía dưới bị thối dần lên phía trên Quá trình héo rũ lan nhanh ngày qua ngày cho đến khi thực vật đổ rạp xuống và

kết quả là cây bị chết (hình 1.4) Như vậy, F oxysporum gây tác hại nghiêm

trọng đến sản xuất nông nghiệp, nhất là đối với cây lương thực và cây công nghiệp, ảnh hưởng tới năng suất và chất lượng mùa màng Bệnh biểu hiện rõ nét trong suốt giai đoạn từ khi cây ra hoa cho đến khi kết trái [62][75]

F oxysporum chỉ có thể bị kiểm soát hoặc tiêu diệt khi kết hợp một số

biện pháp như sử dụng hoá chất, điều chỉnh pH của đất, lượng nước, luân canh một cách thích hợp Biện pháp sử dụng hoá chất đem lại kết quả tức thời, nhưng có nhược điểm lớn là gây độc hại trực tiếp hoặc gián tiếp cho người sử dụng (các bệnh về đường hô hấp, tiêu hoá, ung thư ), tiêu diệt các sinh vật có lợi, nhanh chóng làm thoái hoá bạc màu đất, gây nên sự không bền vững của môi trường sinh thái [107] Vì vậy, việc tìm ra những giải pháp mới cho sự phát triển bền vững của nền nông nghiệp là nhiệm vụ của các nhà khoa học Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung

khuẩn Bacillus MSU- 127 lên Rhizoctonia gây bệnh thối đỉnh, rễ củ cải

đường, dịch bệnh được kiểm soát tốt hơn, sản lượng củ cũng như hàm lượng đường tăng cao so với khi chỉ sử dụng MSU- 127 [40]

Ngoài vi khuẩn đối kháng, các chủng vi nấm cũng được nghiên cứu sử dụng để ức chế tác nhân gây bệnh cho cây và một vài chủng đối kháng đã

được thương mại hoá Trichoderma viride kháng rất mạnh F oxysporum sp tracheiphilum và F oxysporum sp.lycopersici gây bệnh cho đậu tương và cà

chua Trichoderma viride có thể bao quanh sợi nấm của F oxysporum và làm

chúng gẫy ra từng đoạn mà nguyên nhân chủ yếu là do một loại kháng sinh

mà Trichoderma viride sinh ra Trichoderma viride có thể kiểm soát 64-74% bệnh héo rũ ở cà chua và 55-72% bệnh thối rễ ở khoai tây Không những thế,

khi xử lý hạt với Trichoderma viride lá cây xanh hơn, rễ khoẻ hơn và cây cao

hơn so với đối chứng [53]

Trong số các loài vi khuẩn đối kháng được nghiên cứu và ứng dụng

trong phòng trừ sinh học thì loài vi khuẩn sinh huỳnh quang Pseudomonas

được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất Nhóm này là thành viên quan trọng của tập đoàn vi sinh vật sống cộng sinh trên bề mặt rễ, có mối quan hệ đến

bệnh cây cũng như khả năng kích thích sinh trưởng của cây Một vài nhóm Pseudomonas t ạo 2.4- DAPG đã được xác định [4] Loài P fluorescens được

phát hiện từ lâu, và đã được nghiên cứu thử nghiệm ức chế đối với nấm gây

bệnh thối thân, thối rễ ở thực vật Khi sản sinh huỳnh quang, P fluorescens

cạnh tranh đối kháng những độc tố do nấm gây ra và ức chế quá trình phát triển sợi và bào tử của nấm, kết quả làm giảm tác hại gây bệnh cho thực vật,

an toàn với con người và vật nuôi [15]

Chủng P fluorescens NBRT 2650 được chọn dùng cho những nghiên cứu đối kháng vì khả năng ức chế F oxysporum f.sp ciceri, R bataticola và Pythium sp Thí nghiệm ngoài đồng ruộng tại Jhansi, Kanpur và Pantnagar

(Ấn Độ) cho thấy, số lượng hạt đậu xanh tăng trong lô xử lý với vi khuẩn Sau

khi kiểm tra mẫu đất người ta phát hiện quần thể P fluorescens NBRT 2650 vẫn tồn tại suốt mùa với mật độ 5.4- 6.4 log 10 CFU/g rễ [74] Chủng P fluorescens DR54, P fluorescens 94/96 cũng được sử dụng để kiểm soát R solari gây bệnh chết úng củ cải đường Vi khuẩn làm giảm khả năng tạo hạch nhân, phát triển sinh khối của nấm và tỉ lệ mắc bệnh chết úng của cây, chủng P.fluorescens 94/96 còn sinh viscosinamid, một lypopeptit vòng có khả năng

phòng trừ Pythium ultimum [42][46][102]

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, việc sử dụng biện pháp sinh học chống nấm gây bệnh bước đầu được nghiên cứu và áp dụng Việc bảo vệ cây trồng bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh đã thu được

những kết quả khả quan Nghiên cứu sử dụng chủng Streptomyces longisporus 198a để phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia salanacearum [1] Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm gây bệnh ở thực vật [11]

Định loại và nghiên cứu cơ chế kháng nấm F oxysporum gây bệnh ở cây trồng của một số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc

[13][14] Vi sinh vật kháng nấm gây bệnh và khả năng ứng dụng trong phòng trừ bệnh cây [3]

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học

Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số

cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho

thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm R solani ( gây bệnh thối rễ

trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây

bệnh khác như Sclerotium rolfsii, F oxysporum Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan Lợi

dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân

hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện

có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt ( TP Hồ Chí Minh) phân bón vi sinh của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả

Ngoài ra Trường Đại học Cần thơ còn phân lập và đã đưa vào sử dụng

vi khuẩn đối kháng Burkholderia cepacia TG 17 với nấm Rhizoctonia solani

gây bệnh đốm vằn trên lúa.

Đã có nhiều cơ sở tiến hành nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm Công nghệ Sinh học diệt sâu xanh, sâu khoang, muỗi Một số chế phẩm VSV đối kháng phòng chống bệnh đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ cho cây rau, cây công nghiệp đã được sản xuất nhằm thay thế thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học Một số công trình nghiên cứu đã được công bố Tuy nhiên, việc triển khai áp dụng vào thực tiễn sản xuất còn rất hạn chế

1.3 2 Vi khuẩn đối kháng

Có hơn 1.600 loài vi khuẩn có ích, chúng giữ vai trò quan trọng trong cải tạo đất và trong đời sống của cây trồng Chúng tham gia quá trình phân giải chất hữu cơ thành nguồn thức ăn cho cây trồng, làm tăng độ mùn, tơi xốp, háo khí, tăng cường khả năng giữ nước của đất, nhờ đó cây trồng hấp thụ dinh dưỡng tốt hơn, đồng thời góp phần bảo vệ cây trồng, giảm tác hại của kí sinh gây bệnh Trong tập đoàn vi sinh vật có ích, có một lượng lớn vi sinh vật đối kháng ngăn chặn hữu hiệu sự phát triển của sinh vật gây hại nói chung và của

nấm gây bệnh nói riêng [41][65] Một số vi khuẩn như: Bacillus spp.,

Streptomyces spp., P fluorescens … không gây bệnh được xác định là những

vi khuẩn đối kháng với các tác nhân gây bệnh [86]

Kiểm soát sinh học các tác nhân gây bệnh trong đất là kết quả tác động trực tiếp hoặc gián tiếp của vi khuẩn đối kháng thông qua một hay nhiều cơ chế khác nhau, những cơ chế này làm giảm mức độ lây nhiễm và mang lại nhiều kết quả mong muốn, có thể kể đến một số cơ chế kháng bệnh như sau:

+ Tổng hợp các chất kháng sinh: Liên quan đến khả năng ức chế hoặc phá hủy tác nhân gây bệnh nhờ hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn đối kháng Những sản phẩm này bao gồm các hợp chất bay hơi, các chất độc và chất kháng sinh Kết quả là chúng phá hủy các tác nhân gây bệnh

+ Cạnh tranh: Vi khuẩn đối kháng cạnh tranh trực tiếp với các tác nhân

gây bệnh về nguồn dinh dưỡng, oxi, không gian…, Ví dụ: P fluorescens có

thể tạo ra siderophore, một chất có khả năng liên kết mạnh với sắt, làm cho các sinh vật đất thiếu nguồn sắt cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng

+ Sinh enzyme: Vi khuẩn đối kháng lấn át tác nhân gây bệnh nhờ sự bài tiết phenol, chitinase, cellulase và các enzyme thủy phân tế bào khác

Hiệu quả kháng nấm gây bệnh cho cây trồng còn là do vi sinh vật có khả năng sinh 2,4 - diaxetyl phloroglucinol (DAPG), phenazin - carboxamit (PCN) [18][44]

1.3.3 Cơ chế tác động của vi khuẩn đối kháng

Việc phân lập và chọn lọc các chủng vi khuẩn đối kháng thường dựa vào những đặc tính sau:

- Có hoạt tính chitinaza cao

- Tạo IAA (chất kích thích sinh trưởng thực vật)

- Không độc đối với sức khoẻ con người và môi trường

- Mức độ kháng kháng sinh thấp

Sự đối kháng của vi sinh vật với nấm gây bệnh thông qua một số cơ chế như sau:

- Tiết ra chất kháng sinh

- Cạnh tranh Fe, hạn chế sinh trưởng nấm

- Chiếm trước vị trí, chất dinh dưỡng

- Gây cảm ứng khả năng bảo vệ của thực vật, kích thích thực vật sản sinh ra các chất diệt nấm

- Bất hoạt các yếu tố giúp cho nấm nẩy nầm

- Phân huỷ các nhân tố gây bệnh của nấm

- Ký sinh lên nấm gây bệnh và tiết ra enzyme ngoại bào phân huỷ thành

tế bào của nấm

Việc sử dụng vi sinh vật đối kháng trong việc hạn chế và loại trừ nấm gây bệnh dưới dạng chế phẩm ngày càng nhiều, đem lại lợi ích cho con người

và môi trường sống mà các phương pháp khác không có được như:

- Tính chọn lọc cao nên không ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái

- Không độc cho người và các loài thiên địch có ích

- Có khả năng ức chế các sinh vật đã kháng thuốc hoá học

Một số vi sinh vật không những tác dụng trực tiếp lên tác nhân gây bệnh, mà còn có khả năng tiết ra những chất kích thích cho cây tạo ra chất kháng bệnh như phytoalexin, một số chất có tác dụng kích thích sinh trưởng cho cây, tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, tăng năng suất cây trồng

Bên cạnh những tiềm năng và ứng dụng to lớn như đã nêu ở trên, phương pháp này vẫn còn tồn tại những nhược điểm:

- Thời gian phát huy tác dụng chậm

- Tác dụng không triệt để

- Hiệu quả của phương pháp này chịu ảnh hưởng lớn vào điều kiện ngoại cảnh, nên kết quả thu được không ổn định

1.3.4 Các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng kháng nấm

Sự phát hiện kháng sinh kháng nấm được tính từ năm 1939 khi Oxford

và cs báo cáo tách chiết được kháng sinh kháng nấm đầu tiên, griseofulvin

hoặc ”nhân tố xoăn” Griseofulvin được sinh ra bởi Penicillium griseofulvum

và P janczewskii Zal, ức chế sự phát triển của các loài khác nhau của các chi Epidermophyton, Microsporum và Trichophyton Thành viên đầu tiên của

nhóm kháng sinh kháng nấm polyen macrolid, tạm thời gọi là fungicidin, được phát hiện bởi Hazen và Brown (1950) và sau đó được đổi tên là nystatin

Từ năm 1950, hơn 90 thành viên của nhóm được mô tả và hàng năm được phát hiện nhiều hơn Tiếp theo là các lipopeptid vào những năm 1970 Từ đó, việc tìm những kháng sinh kháng nấm mới, an toàn hơn, phổ hoạt động rộng hơn với hiệu lực cao hơn dần được Kobayashi ADN Medoff 1977 phát triển Một nguyên nhân sự phát triển này chậm so với kháng sinh kháng khuẩn là, cũng giống như tế bào động vật, nấm là eukaryote, và vì vậy các chất ức chế sinh tổng hợp protein, ARN hoặc ADN của nấm cũng có nguy cơ độc hơn cho

tế bào chủ Nguyên nhân thứ 2 là, cho đến nay, tỉ lệ mắc bệnh nấm nguy hại

đến cuộc sống rất ít để gây áp lực cho các hãng dược nghiên cứu [43][49]

Để chống lại sự gây hại của nấm F oxysporum đối với cây trồng, các

chất kháng sinh: Teramixin, Biomixin đã được sử dụng ở các quốc gia khác nhau trên thế giới (Liên Xô, Anh ) [18] Ngoài những kháng sinh trên, thì một số loài vi khuẩn có plasmid mang gen mã hoá cho các chất kháng sinh tự

nhiên để chống lại nấm gây bệnh Dưới đây là công thức hoá học của một vài loại chất điển hình do vi khuẩn tổng hợp nên

Hình1.5 Cấu trúc hoá học của kháng sinh tự nhiên và là nhân tố kháng nấm

Cơ chế hoạt động của vi sinh vật đối kháng là khi vi khuẩn phát triển thành các khuấn lạc trên hoặc xung quanh rễ cây, chúng cạnh tranh các loại ion, nguồn dinh dưỡng, chuyển hoá sắt hydroxit không tan để cung cấp cho tế bào, hay loại trừ nơi kí sinh của vi sinh vật gây bệnh trong đất Các chất kháng sinh do chúng sinh ra còn là chất mang độc tính kháng lại quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, nấm gây bệnh [37][64]

2.4- DAPG là chất kháng sinh điển hình được hầu hết các loài

Pseudomonas sp sinh huỳnh quang cộng tác với thực vật tổng hợp nên (P fluorescens chủng Pf-5, CHA0, Q2-87, 2-79; P aureofaciens chủng 30-84)

2.4- DAPG có nhiều ưu điểm trong ứng dụng, nên rất được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [32]

Người ta cho rằng 2,4-DAPG được tạo ra từ monoacetylphloroglucinol (MAPG), và enzym acetyltransferase biến đổi MAPG thành DAPG Tiền chất của MAPG không được xác định, nhưng các nhóm hydroxyl xen kẽ nhau trên vòng phloroglucinol là thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp qua cơ chế polyketide Có 3 loại polyketide synthase (PKS) được biết Enzym loại 1 là những protein lớn, đa chức năng với các vùng xúc tác cho các bước sinh tổng hợp riêng biệt không lặp lại Ngược lại, PKSs loại II là tổ hợp của 4-6 protein chức năng đôi hoặc đơn có thể hoạt động lặp lại để lắp ráp phân tử polyketide Loại PKS III, là bản sao của các thành viên họ chalcone synthase (CHS) vàstilbene synthase (STS) từ thực vật [20][27]

Không giống như PKSs đa vùng (multidomain-type I) và đa protein (multiprotein- type II), enzymes CHS/STS đơn giản chỉ gồm homodimer của tiểu đơn vị 42 kDa đủ để xúc tác phản ứng ngưng tụ, kết tinh và đối với STSs, phản ứng loại gốc carboxyl (decarboxylation) cần để tạo ra những sản phẩm riêng biệt của chúng Những enzymes này khác với STSs I và II ở chỗ không

có thành phần protein vận chuyển acyl, thay vào đó chúng sử dụng CoA ester

của axit cacboxylic như nguồn đơn vị kéo dài Sự thiên vị này có thể giải thích sự vắng mặt của gen mã hóa protein vận chuyển acyl trong phl operon

so với những cái tìm thấy ở PKSs type II Hơn nữa, enzymes CHS/STS chỉ chấp nhận malonyl-CoA như đơn vị kéo dài, không như tổ hợp enzyme type I

có thể kết hợp nửa acyl nhánh [29]

Các thành viên liên họ CHS/STS của các protein ngưng tụ có kích thước tương đối khiêm tốn 40 + 47 kDa, hoạt động như các homodimers và lựa chọn tiêu biểu đơn vị bắt đầu là cinnamoyl-CoA và thực hiện ba chuỗi kéo dài (extensions) liên tiếp với malonyl-CoA Giải phóng tetraketide, tiếp

đến là tạo vòng (cyclization) và/hoặc loại gốc cacboxyl (decarboxylation) sinh

ra một chalcone hoặc một stilbene (Hình 1.6 a) Rõ ràng, CHSs thường gặp

ở thực vật bậc cao và xúc tác phản ứng enzym đầu tiên với flavonoids, các chất này có phạm vi hoạt động hoá sinh, sinh lý, và sinh thái biên độ rộng

Cấu trúc tinh thể X-quang của CHS2 từ cây họ đậu Medicago sativa

(cỏ linh lăng-alfalfa) mới đây đã được xác định và cung cấp thông tin cấu trúc quan trọng về cơ chế phản ứng của PKS thực vật [27]

Hình 1.6 Quá trình sinh tổng hợp của một số hoạt chất kháng nấm

a) chalcone và stilbene ở thực vật bậc cao;

b)THN ở Streptomyces griseus;

c) MAPG và DAPG ở Pseudomonas fluorescens và d) DHPG ở Amycolatopsis orientalis R.coenzyme-A (CoA) hoặc

nhóm cystein thiol điểm hoạt tính của enzym

Một khám phá thú vị của Funa và đtg, thuộc trường Đại học Tokyo là mô

tả enzyme giống CHS ở xạ khuẩn Streptomyces griseus [27] Gen rppA tương ứng CHS làm cho S griseus hình thành sắc tố nâu đỏ

Ủ malonyl-CoA với RppA tái tổ hợp mang đuôi poly-histidin để thuận lợi

cho việc tinh sạch protein, tạo ra 1,3,6,8-tetra- hydroxynaphthalen (THN, Hình 1.6 b) Quá trình oxy hoá THN sinh ra flaviolin, tiền chất của chất trùng hợp sắc

tố melanin Ủ đồng thời malonyl-CoA với p-coumaroyl-CoA hoặc acetyl- CoA

đã không cung cấp các sản phẩm khác, cho thấy RppA không phải là một CHS và malonyl-CoA đáp ứng như một đơn vị ban đầu

So sánh trình tự amino acid của RppA với CHSs cho thấy gốc cystein bảo

tồn tại vị trí 138 trong mô típ điểm hoạt tính Gốc này đã được chứng nhận là hoạt động như cysteine điểm hoạt tính, vì enzym đột biến với serine thay thế tại Cys 138 không có hoạt tính Do đó, như CHSs và STSs trong thực vật, chức năng của RppA Cys 138 như điểm hoạt tính của phản ứng ngưng kết, nó gắn đồng

hóa trị với đơn vị bắt đầu trước khi ngưng kết Chức năng in vivo của rppA tương quan với các sắc tố giống melanin trong S griseus đột biến rppA Đột biến này sinh ra các bào tử sắc tố chỉ khi được phục hồi với một plasmid mang gen rppA

Quá trình hình thành sắc tố này khác với quá trình hình thành sắc tố ở các

Streptomycetes khác, trong đó sắc tố bào tử polyketides được PKSs loại II sinh ra [27]

Polyketide 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) được tổng hợp bằng một protein giống CHS (Hình 1.6 c) Chất kháng vi sinh vật phổ rộng này do

Pseudomonas huỳnh quang liên kết với thực vật sinh ra Gen PhlD tương đồng

CHS là một thành phần của operon sinh tổng hợp phlACBD bao gồm một bộ ba

gen bảo tồn ở vi khuẩn và archaea Những nghiên cứu biểu hiện ở Escherichia coli đã chứng minh rằng cả bốn gen đều cần để tổng hợp cả mono- acetylphloroglucinol (MAPG) và DAPG Biểu hiện từng gen hoặc operon chưa

hoàn chỉnh đã cho thấy chỉ riêng PhlD không thể xúc tác cho tổng hợp MAPG,

mà phải hoạt động kết hợp với PhlACB PhlA và PhlC tương đồng với keto- synthases thiếu cystein và thiolase, tương ứng, trong khi PhlB không tương

đồng với các protein đã biết khác Bangera và Thomashow cho rằng các protein

này chịu trách nhiệm sinh ra đơn vị bắt đầu acetoacetyl-CoA cho PhlD Hơn nữa, các protein PhlACB cùng chuyển hoá MAPG thành DAPG Những nghiên

cứu biểu hiện in vitro với các protein tái tổ hợp là cần thiết để nghiên cứu

thêm về hệ thống sinh tổng hợp này

PKSs loại III, mà các chức năng chưa được biết đến đã có trong các dữ liệu và cho rằng quá trình sinh tổng hợp polyketide mới này có thể rất phổ biến ở vi khuẩn Cụm gen sinh tổng hợp nhóm kháng sinh vancomycin, chloroeremomycin chứa một gen tương đồng CHS (ORF27), mà nó có lẽ tham gia vào lắp ráp gốc 3,5-dihydroxyphenylglycine (DHPG), mà Williams

và các đồng nghiệp đã chứng minh vào năm 1982 (Hình 1.6.d) Biểu hiện của gen giống CHS được điều khiển bởi gen phytochrome ppr ở vi khuẩn quang

hợp tía Rhodospirillum centenum Vùng (domain) quang hoạt tính protein

vàng Ppr chứa chromophore 4-coumarate hoạt động trong CHSs thực vật như

một đơn vị ban đầu CoA thioester Mặc dù chức năng của PKS loại III của R centenum vẫn chưa được mô tả, có thể tự biện rằng nó có thể hoạt động như

một CHS thực thụ, vì vi khuẩn này có khả năng hiếm có là sinh ra phenylpropanoid p-coumarate Giải trình tự gen của vi khuẩn Streptomyces coelicolor, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus subtilis, và Deinococcus radiodurans đã xác định thêm các gen tương đồng CHS/STS với chức năng chưa được biết [27]

1.3.5 Những nghiên cứu về trình tự gen PhlD

Gen PhlD nằm trên ADN hệ gen một số loài Pseudomonas sp., Serratia sp , trong đó loài Pseudomonas sp được nghiên cứu nhiều hơn cả Gen PhlD có ở trong năm chủng Pseudomonas CHA0, Q2-87, Q8r1- 96,

1M1- 96Pf- 5 và đã được nhân lên bằng phản ứng PCR, với cặp mồi sử dụng

kí hiệu Phl2a và Phl2b Kích thước của đoạn gen thu được nằm trong khoảng

745bp- 1001bp [85] Gen PhlD đã được tách dòng và giải trình tự ở năm chủng vi khuẩn trên (trình tự gen của năm chủng được công bố ở ngân hàng gen với các số đăng ký tương ứng như sau : CHA0: AF214456, Pf- 5: AF214457, Q8r1- 96: AF207693, 1M1- 96: AF207692 và Q2- 87: U41818)

Dựa vào trình tự nucleotides của gen PhlD, các nhà khoa học đã thiết kế các

cặp mồi và với sự giúp đỡ của phương pháp PCR để xác định sự tồn tại của gen này trong các chủng vi khuẩn khác Các mồi có kí hiệu B2BF, BPF2, BPF3, BPR2, BPR3, BPR4 (bảng 1.1), trong đó mồi B2BF là mồi được thiết

kế bằng cách thêm bốn nucleotit vào đầu 5’ và một nucleotit vào đầu 3’ của mồi Phl2b [81][84]

Bảng 1.1 Thông tin và trình tự mồi của gen PhlD

ACC GCA GCA TCG TGT ATG AG

GAG GAC GTC GAA GAC CAC CA

ACC CAC CGC AGC ATC GTT TAT GAG C

ACA TCG TGC ACC GGT TTC ATG ATG

ACT TGA TCA ATG ACC TGG GCC TGC

GAG CGC AAT GTT GAT TGA AGG TCT C

GGT GCG ACA TCT TTA ATG GAGTTC

CCG CCG GTA TGG AGG ATG AAA AAG TC

2660- 2641 1915- 1934 2664- 2640 2550- 2527 2510- 2487 2067- 2091 2114- 2137 2036- 2061

53.5 54.7 65.6 62.4 62.1 60.0 55.8 63.4

Thực hiện phản ứng PCR với tổ hợp sáu mồi trên sáu chủng Pseudomonas sp., gen PhlD đều được nhân lên, nhưng chúng có sự khác biệt

về trình tự giữa các chủng nghiên cứu Cặp mồi B2BF và BPR4 nhân gen mã hoá 2.4- DAPG ở Pseudomonas sp hiệu quả nhất, kết quả thu được đoạn gen

có kích thước 629 bp Dùng phương pháp RFLP với ba enzym cắt khác nhau

là HaeIII, TaqI, MspI, cắt kiểm tra độ đa dạng của sản phẩm PCR, thu được các đoạn ADN có kích thước khác nhau [30][81]

1.3.6 Quá trình mã hoá 2,4- DAPG trong hệ gen vi sinh vật

Chi vi khuẩn sinh huỳnh quang Pseudomonas có khả năng tổng hợp

nên chất trao đổi thứ cấp 2,4- DAPG Quá trình tổng hợp này được nghiên

cứu kỹ nhất ở chủng Pseudomonas fluorescens Q2-87 Sáu gen được đặt tên

là phlA, phlC, phlB, PhlD, phlE và phlF được xác định trên đoạn ADN 7,2 kb

từ chủng vi khuẩn này Mỗi gen biểu hiện sự tương đồng đáng kể với các gen được biết khác, biểu thị nguồn gốc tiến hoá chung và đưa ra giả thuyết các cơ

chế điều khiển, tổng hợp và tiết DAPG PhlA, phlC và phlB hoạt động cùng

nhau và có vai trò kép trong tổng hợp 2,4-DAPG

Đầu tiên, cả 3 đều cần và có thẩm quyền chuyển MAPG thành 2,4 –DAGP Thứ hai, chúng cũng cần thiết cho sự tổng hợp MAPG, có lẽ bằng

cách xúc tác phản ứng ngưng kết cần thiết để cung cấp mồi cho PhlD

Phân tích trình tự cũng chỉ cho những hiểu biết hạn chế về chức năng

của các gen này PhlB không có cả motif nhận biết và sự tương đồng với các protein đã biết khác PhlA cũng không có cystein quan trọng có trong vùng hoạt tính của enzym ngưng kết Liệu phlA có hoạt động như nhân tố kéo dài

chuỗi hay không, điều này cần được xác định [27][33]

Chỉ có phlC mang các đặc điểm cấu trúc đặc trưng cho enzym ngưng

kết và những tính chất này tương ứng với vai trò cả trong tổng hợp mồi và

acetyl hoá MAGP PhlE giữ được các tính chất cấu trúc của chất thấm của màng nguyên vẹn và nó có chức năng xuất DAGP hoặc MAGP Kết quả thí

nghiệm cho thấy phlF là chất điều hoà âm tính cho sinh tổng hợp DAGP và liệu nó có tham gia vào quá trình điều chỉnh sự biểu hiện của phlE hay không

vẫn còn là vấn đề cần xem xét

Các gen phl từ chủng P fluorescens Q2-87 có phương thức sinh tổng hợp polyketide duy nhất và bảo thủ trong các loài Pseudomonas huỳnh quang liên kết với thực vật Điều lạ lùng là các gen tương đồng của phlA, phlC, và phlB được tìm thấy trong genome của Archaebacteria nhưng không có (ít nhất

cho đến thời điểm này) trong Eubacteria, trong khi các gen tương đồng với

PhlD có trong genome của Eubacteria của Bacillus và Mycobacterium, cũng như trong thực vật Sự sắp xếp không bình thường của các gen phl, rõ ràng từ

các nguồn khác nhau, có thể do bản chất của phản ứng được xúc tác CHSs thực vật sử dụng các sản phẩm mạch vòng của phenylpropanoid như các mồi,

và trong vi khuẩn yêu cầu phân tử mồi thẳng, đơn giản hơn, có thể dẫn đến sự tuyển mộ thêm 3 gen khác trong operon Việc đòi hỏi cả 4 protein cho tổng

hợp MAPG và phlA, phlC, phlB để chuyển hoá MAPG thành 2,4-DAPG đưa

ra giả thuyết là những protein này hoạt động như một phức hệ để các phản ứng vận chuyển cơ chất xảy ra dễ dàng hơn

Qúa trình sinh tổng hợp DAPG được điều khiển bằng nhóm gen chức năng, sau đó được nhận biết và trình tự mã hoá diễn ra như sau:

những dẫn liệu về di truyền chỉ ra rằng, CHS được tạo ra từ gen PhlD nhưng

không phải bắt đầu từ acetyl- CoA mà với acetoacetyl- CoA, được tổng hợp đồng thời với việc tổng hợp các protein khác trong nhóm gen [67][69][80][81][101]

1.4 ĐỊNH LOẠI VI KHUẨN BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ 16S ARN

RIBOXOM VÀ RPOB

1.4.1 Phân loại vi sinh vật

Trong hệ thống phân loại – loài được coi là đơn vị phân loại cơ sở Người khởi đầu phân loại các nhóm vi sinh vật là nhà khoa học Thụy Điển Linneaus (1707-1778) Do đặc điểm của vi sinh vật khác so với động vật và thực vật, chúng sinh sản chủ yếu là vô tính nên sự thay đổi di truyền có thể xảy ra rất nhanh bởi đột biến Vì thế, việc phân loại không thể không thận trọng và định nghĩa loài cũng khác định nghĩa loài ở thực vật và động vật Theo Brock(2000) thì: “Loài vi khuẩn là tập hợp các chủng có quan hệ gần gũi(có trình tự rARN 16S tương đồng > 97% và tỷ lệ lai ADN> 70%) đủ để phân biệt với các chủng khác và được công nhận là một đơn vị phân loại.”

Các đặc điểm chung trong phân loại vi sinh vật bao gồm các đặc điểm hình thái, cấu trúc tế bào, các đặc tính sinh lý, sinh hóa Ngày nay nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã cho phép đi sâu nghiên cứu đặc tính về mặt di truyền, góp phần bổ sung thêm cho phương pháp phân loại nhờ các đặc điểm truyền thống [67]

Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là trong lĩnh vực Công nghệ Sinh học và sinh học phân tử, đã mở ra hướng mới trong phân loại vi sinh vật Nếu như trước đây theo phương pháp

cổ điển, người ta thường dựa vào những đặc điểm như hình thái, cấu trúc, sinh

lý, sinh hoá thì ngày nay, phương pháp xác định trình tự 16S ARN riboxom là

một công cụ đắc lực giúp cho các nhà phân loại học trong việc định loại chính xác hơn nữa các chủng vi sinh vật Ngoài ra, phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên giải trình tự đoạn gen mã hoá cho tiểu phần β của ARN

polymeraza (rpoB) đang là một trong những phương pháp hiệu quả trong định

tên vi khuẩn và được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng

1.4.2 Phát sinh loài dựa trên tiêu chuẩn 16S ARN riboxom

Năm 1985, Emile Zuckerll và Linus Pauling đã đưa ra một ý tưởng mạnh bạo rằng các phân tử có thể là ‘‘những bằng chứng của lịch sử phát triển’’ Mười năm sau, Carl Worse sử dụng phương pháp xác định trình tự gen mã hoá 16S ARNr, đây là một chỉ số quan trọng trong xác định mối liên

hệ chủng loại phát sinh giữa các nhóm vi khuẩn

Việc định loại vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng dựa trên việc phân tích trình tự các gen đặc trưng của chúng ngày càng được ứng dụng rộng rãi Trong số các gen được dùng như một marker trong định loại vi khuẩn, trình tự gen mã hoá cho 16S ARN ribosom được hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng

Hiện nay các nhà khoa học cho rằng, mức độ giống nhau về trình tự 16s ARNr phản ánh khoảng cách quan hệ giữa các cá thể Bởi vì cấu trúc ARNr chịu những áp lực rất lớn, hệ quả cần thiết để nó có cấu trúc bậc hai chính xác

và tác động qua lại với các protein khác nhau tạo riboxom chức năng Tần số thay đổi trình tự các gen mã hoá ARNr ít hơn so với genom (hệ gen) và có thể xác định quan hệ họ hàng qua rất nhiều khoảng cách tiến hoá Vì vậy ARNr hoạt động như một ‘’đồng hồ phân tử’’ và cho phép xác định chính xác khoảng cách phát sinh loài [36],[90]

* Vai trò của riboxom

Sự giải mã xảy ra ở riboxom Mỗi riboxom gồm hai bán đơn vị lớn và

nhỏ Khi không có sự tổng hợp protein, mỗi bán đơn vị tồn tại riêng rẽ trong

tế bào chất Riboxom ở nhóm nhân sơ gồm hai bán đơn vị 50S và 30S hợp thành thể ribô 70S (S = Svedberg, là đơn vị đo độ lắng của riboxom khi đem

ly tâm) Ở nhóm nhân thật hai bán đơn vị 60S và 40S hợp thành riboxom 80S Mỗi bán đơn vị có các phân tử rARN riêng Các rARN này kết hợp với các protein để tạo thành các bán đơn vị Riboxom của nhóm nhân sơ có các rARN 23S, 16S và 5S trong khi riboxom của nhóm nhân thật có các rARN 28S,18S, 5.8S và 5S (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Các thành phần của roboxom ở nhóm nhân sơ và nhân thật

rARN 23S (2900Nu) rARN 5S (120Nu)

rARN 16S (1540Nu)

rARN 28S (4800Nu) rARN 5.8S (160Nu)

rARN 18S (1900Nu)

Ở nhóm nhân sơ, đầu 5’ của mARN bám vào bán đơn vị nhỏ, sau đó

sẽ liên kết phần này với bán đơn vị lớn ARN thông tin bám vào bằng sự bắt cặp bazơ của rARN và một tín hiệu của mARN (thường là

AGGAGGU), gần đầu của mARN Tín hiệu này gắn trong khe của bán đơn vị nhỏ, rồi đến mã mở đầu AUG nằm cách đó vài bazơ trên mARN Các protein chuyên biệt gọi là yếu tố mở đầu tham gia vào quá trình này Khi

việc liên kết với bán đơn vị lớn hoàn tất thì sự giải mã có thể bắt đầu AUG mã hóa cho methionin vì methionin luôn là acid amin đầu tiên trong suốt quá trình giải mã Về sau, một enzim khác tách methionin ra khỏi đầu của chuỗi polypeptid (hình 1.8)

Hình 1.8 Mô hình chức năng của riboxom

Ở nhóm nhân sơ vì không có màng nhân, quá trình phiên mã không

bị tách biệt với riboxom và các yếu tố giải mã khác trong tế bào chất, nên riboxom có thể bám vào một đầu của phân tử mARN và bắt đầu giải mã tạo ra protein, trong khi ARN polymeraza vẫn phiên mã phần thông tin còn lại từ NST

Theo các nhà khoa học, dung lượng phát sinh loài của phân tử 23S ARNr lớn hơn nhiều so với phân tử 16S rARN Tuy nhiên, trình tự đã được xác định hoàn chỉnh của phân tử 23S là rất ít, trong khi đó trình tự 16S rARN

là khá phong phú Lần xuất bản thứ tư của cả ‘’Bergey’s Manual of Determinative Bacteriolory’’ và ‘’The prokaryote’’ đều dựa vào cây 16S rARN làm cơ sở cho quan hệ phát sinh loài tương ứng của vi sinh vật Chính

vì vậy, phương pháp giải trình tự 16S ARNr là phương pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại vi khuẩn [11][82]

1.4.3 Sử dụng gen rpoB trong định loại vi khuẩn

1.4.3.1 Giới thiệu chung về ARN polymeraza

Enzym ARN polymeraza có mặt trong tất cả các tế bào vi khuẩn và có nhiệm vụ đọc thông tin di truyền mã hóa trong ADN, nói cách khác, nó tham

gia vào quá trình phiên mã, cung cấp nguyên liệu cho quá trình tổng hợp

protein nhờ các riboxom Ở sinh vật nhân chuẩn, ARN polymeraza có ba loại:

- ARN polymeraza I: Tổng hợp rARN 45S, sau đó hình thành các phân tử: rARN 28S; rARN 18S; rARN 5,8S Đây là các phần chính cấu tạo nên riboxom

- ARN polymeraza II: Tổng hợp tiền thân mARN, snARN

- ARN polymeraza III: Tổng hợp tARNs, rARN 5S và các sARN nhỏ khác trong tế bào và tế bào chất

Ở sinh vật nhân sơ, ARN polymeraza là một phân tử tương đối lớn xúc tác cho việc tổng hợp các phân tử mARN Phân tử này gồm 5 tiểu phần (khoảng 400 Kdal), đó là:

- α2: Tiểu phần cấu tạo nên enzym và nhận ra các nhân tố điều hòa (41Kdal)

- β: Tiểu phần này tham gia hoạt động xúc tác tổng hợp của ARN (155 Kdal)

- β’: Nối với ADN một cách không đặc hiệu (165 Kdal)

- ω: Chức năng đến nay vẫn chưa được biết rõ, tuy nhiên nó được biết

đến là có chức năng bảo vệ hoặc đi kèm với tiểu phần β’ ở M smegmatis

Để nối với vùng promotơ đặc hiệu, ARN polymeraza đòi hỏi một tiểu phần khác đó là δ Nhân tố δ làm giảm ái lực của ARN polymeraza với phần ADN không đặc hiệu, làm tăng ái lực phần đặc hiệu với một số vùng promotơ Nếu thiếu nhân tố δ thì ARN polymeraza khởi động phiên mã một cách tuỳ tiện Do vậy, enzym gốc hoàn chỉnh có 5 tiểu phần: α2, β, β’, ω, δ (khoảng 480 Kdal), với chiều dài 55A0 [6][23][38]

Sinh vật nhân sơ có nhiều operon kiểm soát rARN khác nhau, nhìn chung, sự khác nhau giữa các tiểu phần của rARN rất ít (<1%), bởi vậy nó

thường được dùng để nghiên cứu phát sinh chủng loại và đa dạng sinh thái

[34][56] Gen rpoB mã hóa cho tiểu phần của ARN polymeraza ở vi khuẩn được chứng minh là một marker hiệu quả trong định loại vi khuẩn như: Vi

khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Treponema, Mycobacterium [34][39][72] Ngoài ra, việc so sánh trình tự gen rpoB bước

đầu được ứng dụng trong nghiên cứu phân loại nhiều loài vi khuẩn cổ [24][34][38]

1.4.3.2 Cấu tạo và vị trí gen rpoB

rpoB là một gen có kích thước lớn, vào khoảng 3.500bp, mã hóa cho

1.100 axit amin Gen rpoB đã được nhiều nhà khoa học chứng minh là một gen chỉ thị (marker) hữu ích trong định loại vi khuẩn do chúng có những đặc

Do kích thước lớn, trong nghiên cứu, người ta thường chỉ giải trình tự

một phần của gen rpoB, đoạn gen này có trình tự bảo thủ cao ở hai đầu và khoảng 300 - 751bp Gen rpoB với những ưu điểm nổi bật hơn hẳn như trình

bày ở trên, đã được chứng minh là một marker tin cậy và hiệu quả trong định loại vi khuẩn cũng như trong các nghiên cứu về đa dạng sinh thái [34][91]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn từ đất ở vùng rễ cây bị

bệnh của cây tiêu, bông và cà chua, được thu thập ở Đắc Lắc và Gia Lâm

Thời gian và địa điểm phân lập được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Địa điểm và thời gian bắt đầu phân lập

Bộ TA cloning Kit của hãng Invitrogen (gồm vector pCR 2.1 đã mở vòng

có dầu dính là timin, T4-ligaza, đệm ligaza 10X); bộ BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) sử dụng cho phản ứng đọc trình tự ADN; chỉ thị ADN chuẩn (Invitrogen); các enzym hạn chế (New

England Biolab); Taq ADN polymeraza (Perkin Elmer); …

Các cặp mồi để khuếch đại gen 16s rADN (16sF, 16sR), gen rpoB (rpoF,rpoR) và gen PhlD mã hoá cho 2,4-diacetylphloroglucinol (PhlF,PhlR)

do chúng tôi thiết kế được đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen

Giống chuột nhắt trắng Swiss, nguồn cung cấp là Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương

Các chủng vi sinh vật kiểm định Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Ralstonia solanacearum được cung cấp bởi Viện Bảo vệ thực vật

2.1.3 Hóa ch ất và thiết bị

- Các loại hóa chất: Tris base, EDTA (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển); X-gal; IPTG; methanol và các hóa chất thông dụng khác được mua từ các hãng New England Biolabs, Merk/BDH Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ)…

- Các loại thiết bị: Máy xác định trình tự nucleotit tự động – ABI 3100 Avant (Applied Biosystems, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech – Thụy Điển); máy quang phổ tử ngoại – Diode Array Spectrophotometer 8452 A (Hewllet Parkart, Mỹ); máy ly tâm AvantiTM30 (Beckman, Mỹ); máy ly tâm Eppendorf (Đức); máy PCR-PTC 100 (MJ Research, Mỹ); bộ điện di ADN (Advance Tech, NHật bản); bộ điện di protein (Bio-Rad, Mỹ); máy soi ADN (Bio-Rad, Mỹ); máy hút chân không – Speed Vac Sc 110A (Savant, Mỹ); máy đo pH Meter Dlta 320 (Mettler Toledo, Thụy Sĩ);…

Môi trường và dung dịch dùng cho quá trình phân lập, tuyển chọn được thống kê ở phụ luc

+ Dung dịch dùng cho quá trình tách ADN

Dung dịch III:

Axit axetic 11,5mM Kali axetat 3M Dung dịch I và III khử trùng và giữ ở 4oc, dung dịch II pha mới trước khi sử dụng

- Đệm TE Tris-HCL(pH 8): 10mM EDTA(pH 8): 1mM