Nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo quản lạc sau thu hoạch ở tỉnh miền trung và bắc việt nam

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của Aspergillus flavus .... Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và khảo sát về tình trạng nhiễm nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM AFLATOXIN VÀ ĐỀ XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN LẠC SAU THU HOẠCH Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG VÀ BẮC

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

Hà Nội - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM AFLATOXIN VÀ ĐỀ XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN LẠC SAU THU HOẠCH Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG VÀ BẮC

VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 9540104

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS TS HÀ DUYÊN TƯ

2 PGS TS PHẠM XUÂN ĐÀ

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu bởi bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của tập thể hướng dẫn Các số liệu, kết quả nêu trong luận

án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Thay mặt tập thể giáo viên hướng dẫn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến các giáo viên hướng dẫn khoa học: GS TS Hà Duyên Tư - nguyên phó hiệu trưởng trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và PGS TS Phạm Xuân Đà - Cục trưởng Cục công tác phía Nam; Các thầy cô: PGS TS Lê Thanh Mai, PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, PGS TS Nguyễn Thị Minh Tú, TS Vũ Hồng Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô Bộ môn Quản lý chất lượng, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm đã đóng góp ý kiến và hướng dẫn tôi, các cán bộ phụ trách đào tạo - Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh

Tôi trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo và các đồng nghiệp công tác tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập dữ liệu, cung cấp tài liệu cần thiết cho luận án, cũng như có những ý kiến đóng góp quý báu trong quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS TS Phạm Anh Tuấn - Viện trưởng Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tận tình giúp

đỡ tôi về chuyên môn trong quá trình nghiên cứu

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu

Quá trình thực hiện luận án còn nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được

sự góp ý của Quý Thầy/Cô để bản thân có thể khắc phục những hạn chế và hoàn chỉnh luận án, đóng góp tích cực cho ngành

Trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận án

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC CÁC BẢNG xii

DANH MỤC CÁC HÌNH xiv

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

5 Những đóng góp mới của luận án 4

6 Cấu trúc của luận án 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Cây lạc 5

1.1.1 Giới thiệu chung về cây lạc 5

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lạc trên thế giới và Việt Nam 7

1.1.3 Quy định về mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc 11

1.2 Aspergillus trên lạc 12

1.2.1 Tình hình nhiễm nấm mốc trên lạc 12

1.2.2 Aspergillus flavus 14

1.3 Aflatoxin 16

1.3.1 Tính chất hóa lý của aflatoxin 16

1.3.2 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe 17

1.3.3 Các phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân tích aflatoxin 19

1.3.4 Tình hình nhiễm aflatoxin trên lạc 21

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin của A flavus 23

1.4.1 Ảnh hưởng của độ ẩm và hoạt độ nước 23

1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 28

1.4.3 Ảnh hưởng của nấm mốc đến chất lượng lạc trong quá trình bảo quản 29

1.4.4 Ảnh hưởng của môi trường không khí đến chất lượng lạc trong quá trình bảo quản 30 1.5 Các biện pháp kiểm soát aflatoxin nhiễm trong lạc và nông sản khô sau thu hoạch trên thế giới và Việt Nam 32

1.5.1 Kiểm soát chất lượng sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản 32

1.5.2 Đóng gói điều biến khí quyển 35

1.5.4 Bảo quản hoặc giảm nhiễm aflatoxin bằng phương pháp hóa học 38

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 43

2.1.1 Nguyên vật liệu 43

2.1.2 Hóa chất sử dụng 43

2.1.3 Thiết bị sử dụng chính 43

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 44

2.2 Phương pháp lấy mẫu 45

2.3 Phương pháp phân tích hóa lý 45

2.3.1 Xác định độ ẩm 45

2.3.2 Xác định hàm lượng aflatoxin 46

2.3.3 Đánh giá về mặt cảm quan của các mẫu lạc thu thập mùa thu năm 2013 50

2.4 Phương pháp phân tích sinh học 51

2.4.1 Xác định tổng số bào tử nấm mốc 51

2.4.2 Phân lập nấm mốc sinh độc tố từ lạc 52

2.4.3 Định danh nấm mốc Aspergillus flavus 52

2.5 Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc 54

2.5.1 Đánh giá trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập tại Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An vào mùa hè 54

2.5.2 Đánh giá mức nhiễm aflatoxin, nấm mốc trên lạc củ và lạc nhân vào mùa thu 54

2.6 Phương pháp công nghệ 55

2.6.1 Điều chỉnh độ ẩm của lạc thí nghiệm 55

2.6.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của Aspergillus flavus 55

2.6.3 Thiết kế thí nghiệm nghiên cứu các giải pháp và đề xuất một số quy trình nhằm giảm nhiễm aflatoxin trong lạc 61

2.7 Xử lý số liệu 62

2.8 Sơ đồ nghiên cứu 65

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 66

3.1 Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang 66

3.1.1 Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập vào mùa hè 66

3.2 Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc trên địa bàn huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang vào mùa thu 74

3.1.3 Phân lập và xác định chủng sinh aflatoxin trên lạc 78

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxim trên lạc của Aspergillus flavus BG1 84

3.2.1 Đánh giá sự thay đổi độ ẩm của các mẫu lạc trong các loại bao bì khác nhau 84

3.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển và sinh aflatoxin của chủng Aspergillus flavus BG1 trên lạc 85

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và sinh aflatoxin của Aspergillus flavus BG1 trên lạc 91

3.2.4 Ảnh hưởng của mức nhiễm A flavus đến sự sinh aflatoxin trên lạc 95

3.2.5 Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của A flavus BG1 99

3.2.6 Phân tích mối quan hệ của các yếu tố đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của A flavus BG1 101

3.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu hồi, quế đến khả năng ức chế sự phát triển của A flavus 107

3.3 Khảo nghiệm và đề xuất quy trình bảo quản nhằm tránh nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc 116

3.3.1 Khảo nghiệm quy trình bảo quản lạc nhân bằng giải pháp kiểm soát chất lượng trước khi bảo quản 116

3.3.2 Quy trình bảo quản lạc bằng đóng gói hút chân không 119

3.3.3 Quy trình bảo quản lạc nhân bằng cách sử dụng tinh dầu hồi, quế 122

3.3.4 Đề xuất quy trình bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm aflatoxin trong lạc 127

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 130

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133

PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM MỐC VÀ AFLATOXIN TRONG LẠC 1

1.1 Kết quả phân tích nấm mốc và aflatoxin trong lạc nhân thu thập vào mùa hè tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An 1

1.2 Kết quả phân tích nấm mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập vào mùa hè tại các tỉnh

Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An 3

1.3 Kết quả phân tích nấm mốc và aflatoxin của lạc rang húng lìu thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An 5

1.4 Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và AF trong lạc nhân thu thập vào mùa thu tại Bắc Giang 7

1.5 Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập vào mùa thu tại Bắc Giang 9

PHỤ LỤC 2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH AF TRÊN LẠC CỦA A FLAVUS BG1 11

2.1 Ảnh hưởng của độ ẩm 11

2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12

2.3 Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không 13

2.4 Ảnh hưởng của mức nhiễm A flavus đến khả năng sinh Aflatoxin trên lạc 14

2.5 Ảnh hưởng của tinh dầu quế đến khả năng phát triển của A flavus trên đĩa thạch 15

PHỤ LỤC 3 XỬ LÝ SỐ LIỆU 18

3.1 Phần mềm xử lý số liệu R 3.4.1 18

3.2 Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên lạc 19

3.2.1 So sánh mức nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên lạc nhân giữa các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang 19

3.2.2 So sánh mức nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên lạc củ giữa các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang 20

3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của A flavus và sinh aflatoxin trên lạc 21

3.3.1 Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của độ ẩm 21

3.3.2 Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của nhiệt độ 22

3.3.3 Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của mức nhiễm A flavus 23

3.3.4 Phân tích mô hình hồi quy tuyến tính đa biến 24

PHỤ LỤC 4 MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH AFLATOXIN 26

4.1 Sắc đồ phân tích aflatoxin trong nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm 26

4.2 Sắc đồ phân tích aflatoxin trong nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 27

4.3 Sắc đồ phân tích aflatoxin trong nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện hút chân không 27

4.4 Sắc đồ phân tích aflatoxin trong nghiên cứu ảnh hưởng của mức nhiễm A flavus BG1 28

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

AIC Akaike Information Criterion Tiêu chuẩn thông tin Akaike AOAC Association of Official

Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hóa phân tích

ATCC American Type Culture

Collection

Bộ sưu tập chủng của Mỹ

ATP Adenosine Triphosphate Adenosin Triphosphat

BIC Bayesian Information Criterion Tiêu chuẩn thông tin Bayesian BLAST Basic Local Alignment Search

Tool

Công cụ BLAST

BMA Bayesian Model Average Mô hình trung bình Bayes

ECD Electron Capture Detector Bộ phát hiện bắt điện tử

Hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme

FAO Food and Agriculture

Organization

Tổ chức nông lương thế giới

FP Fluorescence Polarization Sự phân cực huỳnh quang

GRAS Generally recognized as safe Được thừa nhận chung là an toàn

Ký hiệu,

chữ viết tắt

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSCAS Hydrated sodium calcium

aluminosilicate

Thuỷ hợp natri canxi nhôm silicat

ITS Internal Transcribed Spacer Vùng đệm trong được sao mã

ISO International Organization for

Standardization

Tổ chức tiêu chuẩn hóa thế giới

KEBS Kenya Bureau of Standards Văn phòng tiêu chuẩn Kenya

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

MIP Molecularly Imprinted

Polymer

In dấu phân tử polymer

NAFDAC National Agency for Food and

Drug Administration and Control

Cơ quan hành chính và kiểm soát thuốc và thực phẩm

Biotechnology Information

Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia

polypropylene PCR Polymerase Chain Reaction “Phản ứng chuỗi trùng hợp” hay

“phản ứng khuếch đại gen”

PDA Potato Dextrose Agar Môi trường thạch khoai tây dextrose

SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfate

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

USDA United States Department of

Agriculture

Phòng nông nghiệp Hoa kỳ

YEP Yeast Extract Phosphate Chiết xuất nấm men Phosphate YPD Yeast Extract Peptone Dextrose Môi trường Peptone Dextrose

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Diện tích, sản lượng và lượng tiêu thụ lạc của Việt Nam 8

Bảng 1 2 Quy định mức tối đa cho phép nhiễm aflatoxin trong lạc 11

Bảng 2 1 Chương trình gradient phân tích aflatoxin 47

Bảng 3 1 Số lượng mẫu nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc nhân 67

Bảng 3 2 Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc nhân 68

Bảng 3 3 Số mẫu nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc củ 69

Bảng 3 4 Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc củ 70

Bảng 3 5 Số mẫu nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc rang húng lìu 71

Bảng 3 6 Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc rang 72

Bảng 3 7 Tỉ số nguy cơ nhiễm aflatoxin với tình trạng của mẫu lạc nhân thu thập tại Bắc Giang 76

Bảng 3 8 Tỉ số nguy cơ nhiễm aflatoxin với tình trạng của mẫu lạc củ thu thập tại Bắc Giang 77

Bảng 3 9 Nồng độ DNA sau khi tách chiết của các chủng 81

Bảng 3 10 Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế 82

Bảng 3 11 Khả năng sinh AF của ba chủng phân lập từ lạc 83

Bảng 3 12 Sự thay đổi độ ẩm của mẫu lạc nhân trong các bao bì khác nhau 84

Bảng 3 13 Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển của A flavus BG1 và sinh aflatoxin 85

Bảng 3 14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự phát triển của nấm mốc A flavus BG1 91

Bảng 3 15 Ảnh hưởng của lượng nấm mốc đến sự phát triển của A flavus BG1 95

Bảng 3 16 Ảnh hưởng của áp lực hút chân không đến sự phát triển của A flavus BG1 99

Bảng 3 17 Mối liên quan giữa mức độ sinh trưởng của A flavus BG1 và hàm lượng aflatoxin 102

Bảng 3 18 Bốn mô hình tối ưu và các thông số 105

Bảng 3 19 Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A flavus BG1 trên môi trường PDA với nồng độ tinh dầu quế khác nhau 108

Bảng 3 20 Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A flavus BG1 trên môi trường

PDA với nồng độ tinh dầu hồi khác nhau 110Bảng 3 21 Mức nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo thời gian 112Bảng 3 22 Mức nhiễm aflatoxin trên lạc có nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo thời gian 113Bảng 3 23 Mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian 114Bảng 3 24 Mức nhiễm aflatoxim trên các mẫu có nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian 115Bảng 3 25 Hàm lượng AFB1 (µg/kg) của lạc nhân bảo quản bằng kiểm soát quá trình 118Bảng 3 26 Kết quả hàm lượng aflatoxin B1 (µg/kg) của lạc nhân đóng gói hút chân không 121Bảng 3 27 Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu quế khác nhau theo thời gian 124Bảng 3 28 Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian 125Bảng 3 29 Tinh chi phí có và không sử dụng tinh dầu trong bảo quản lạc 126

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Hình minh họa giống lạc L14 9

Hình 1 2 Màu sắc của Aspergillus flavus: a-trên hạt; b-trên môi trường thạch Czapek Dox 14

Hình 1 3 Hình ảnh cuống bào tử Aspergillus flavus 15

Hình 1 4 Hình ảnh bào tử Aspergillus flavus 15

Hình 1 5 Cấu trúc hóa học của AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 17

Hình 1 6 Sự đồng hóa aflatoxin trong gan 18

Hình 1 7 Đẳng nhiệt hút ẩm của thực phẩm 24

Hình 1 8 Hoạt độ nước và sự ổn định của thực phẩm 25

Hình 1 9 Cân bằng hoạt độ nước và hàm lượng nước 26

Hình 1 10 Độ ẩm không khí trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013 27

Hình 1 11 Nhiệt độ trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013 29

Hình 1 12 Cơ chế tác động của tinh dầu lên tế bào vi sinh vật 40

Hình 2 1 Sắc đồ phân mảnh của các aflatoxin 48

Hình 2 2 Sắc đồ các điểm chuẩn Aflatoxin B1 49

Hình 2 3 Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB1 49

Hình 2 4 Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB2 49

Hình 2 5 Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG1 50

Hình 2 6 Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG2 50

Hình 2 7 Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm tới sự phát triển và sinh aflatoxin 57

Hình 2 8 Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và sinh aflatoxin 58

Hình 2 9 Mẫu thí nghiệm ảnh hưởng của mức nhiễm A flavus B1 58

Hình 2 10 Mẫu thí nghiệm điều kiện hút chân không 59

Hình 2 11 Mô hình thực nghiệm hút chân không 59

Hình 2 12 Đo kích thước đường kính A flavus 60

Hình 2 13 Thí nghiệm ảnh hưởng của tinh dầu trên lạc thí nghiệm 61

Hình 2 14 Mô phỏng phát hiện lạc nhiễm AF bằng đèn UV ở bước sóng 365 nm 62

Hình 2 15 Sơ đồ nghiên cứu 65

Hình 3 1 Các đĩa nuôi cấy: a) không có nấm mốc; b) và c) có nấm mốc và nấm men 67

Hình 3 2 Tỉ lệ nhiễm nấm mốc trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang 73

Hình 3 3 Tỉ lệ nhiễm Aflatoxin trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang 74

Hình 3 4 Mặt trước (a) và mặt sau (b) của đĩa nuôi cấy sau 3 ngày 78

Hình 3 5 Hình thái khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường SDA 79

Hình 3 6 Chủng phân lập từ lạc (a, b) và ATCC 204304 (c) cấy điểm trên SDA sau 5 ngày 79

Hình 3 7 Bọng nấm hình chùy đến cầu, thể bình 1 lớp (a), thể bình hai lớp (b); Bào tử nấm hình cầu đến gần cầu, màu xanh (c,d) 80

Hình 3 8 Ảnh hiển vi điện tử quét chủng nấm A1 80

Hình 3 9 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS; (+): Đối chứng A flavus ATCC 204304, (-): Đối chứng âm 82

Hình 3 10 Mẫu lạc nhiễm A flavus A1 phát huỳnh quang sau 10 ngày nuôi cấy ở 25 oC 83

Hình 3 11 Sắc đồ AFB1 của chuẩn (a) và mẫu (c); sắc ký đồ AFB2 của chuẩn (b) và mẫu (c) 84

Hình 3 12 Màu sắc của A flavus BG1 phát triển trên lạc có độ ẩm 10 % sau 1 tuần (b), 2 tuần (c), 3 tuần (d) và 4 tuần (e) 88

Hình 3 13 Biểu đồ AFB1 và AF tổng số trong các mẫu có độ ẩm khác nhau 89

Hình 3 14 Aflatoxin nhiễm trong các mẫu ở nhiệt độ khác nhau 93

Hình 3 15 Xác suất phân phối mật độ cho biến nhiệt độ (Temp) 94

Hình 3 16 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu thí nghiệm ảnh hưởng của mức nhiễm A flavus BG1 98

Hình 3 17 Kết quả phân tích AFB1 theo tuần trong thí nghiệm điều kiện hút chân không

101

Hình 3 18 Biểu đồ mối tương quan giữa các biến 104

Hình 3 19 Các mô hình được BMA lựa chọn 106

Hình 3 20 Khuẩn lạc phát triển trên các đĩa thạch 107

Hình 3 21 Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu quế 109

Hình 3 22 Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu hồi 111

Hình 3 23 Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát quá trình 117

Hình 3 24 Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng đóng gói hút chân không 120

Hình 3 25 Quy trình bảo quản lạc nhân có sử dụng tinh dầu 123

Hình 3 26 Quy trình bảo quản lạc tổng quát 127

Hình 3 27 Mô hình băng tải kiểm tra phát hiện aflatoxin trong lạc 128

Hình 3 28 Máy đóng túi hút chân không 129

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Aflatoxin là độc tố vi nấm có thể bị nhiễm trong nhiều lương thực thực phẩm

Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới xếp aflatoxin vào nhóm chất có độc tính gây ung thư loại 1, là nguyên nhân chính gây ung thư gan, giảm miễn dịch và tình trạng còi cọc ở trẻ Aflatoxin nhiễm trong thực phẩm ảnh hưởng đến kinh tế và thương mại trong mọi giai đoạn trên thị trường tiêu thụ và xuất khẩu

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, đặc biệt là nấm mốc sinh độc tố aflatoxin [16, 105] Trong

số nấm mốc đã được phân loại có 30-40 % có thể sinh độc tố với liều lượng khác nhau Nhiều loài nấm mốc khác nhau có thể sinh ra cùng một loại độc tố Một loài nấm mốc cũng có thể sinh ra nhiều độc tố khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường và cơ chất [4] Lạc là cơ chất thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin [36, 110]

Cây lạc là cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới Lạc được dùng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp và là nguồn nguyên liệu cho các ngành phụ trợ khác Việt Nam có sản lượng lạc xếp thứ 15 trong số 118 nước trồng lạc [64] và có sản lượng lạc xuất khẩu đứng thứ 10 trên thế giới [126] Miền Bắc (Vĩnh Phúc, Bắc Giang) và Bắc Trung bộ (Thanh Hóa và Nghệ An) là khu vực có diện tích trồng lạc lớn nhất trong cả nước, chiếm tới 58,6 % tổng diện tích trồng lạc trong cả nước [11] Trong đó Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang là những tỉnh có sản lượng cao nhất khu vực này [18] Có nhiều giống lạc được trồng hiện nay nhưng cơ cấu giống sử dụng trong nông dân miền Bắc nhiều nhất là L14 và MD7 chiếm tỉ lệ 68,7 % [11], giống L14 có tính chống

đổ tốt, kháng bệnh, chịu hạn và chịu đất ướt tốt [3]

Sau thu hoạch lạc được bảo quản và tích trữ để phục vụ cho sản xuất và chế biến các sản phẩm trong công nghiệp, nông nghiệp và làm thực phẩm quanh năm Lạc có thể bị nhiễm nấm mốc và aflatoxin xuất phát từ: nhiễm trong quá trình trồng trọt, sơ chế và bảo quản Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh độc tố của nấm

mốc bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, môi trường không khí và tình trạng nhiễm nấm mốc ban đầu của lạc Ngoài ra, khả năng sinh aflatoxin trong lạc còn phụ thuộc vào loài nấm mốc bị nhiễm trong lạc

Tinh dầu có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật và chống nấm mốc [5,

95, 96, 111] Nhiều thành phần trong tinh dầu được cộng đồng châu Âu chấp nhận là chất tạo hương và được thừa nhận là an toàn [90]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và khảo sát về tình trạng nhiễm nấm mốc

và aflatoxin trong lạc nhưng chưa có nghiên cứu nào định danh đến chủng cụ thể để

từ đó tìm giải pháp bảo quản hạn chế sự phát triển và sinh độc tố của chủng phân lập được Đề tài này đã thực hiện nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin trong lạc, phân lập

và định danh nấm mốc sinh độc tố, sau đó tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin, nghiên cứu một số giải pháp bảo quản nhằm giảm nhiễm aflatoxin trên lạc, từ đó đề xuất quy trình bảo quản lạc sau thu hoạch

Xuất phát từ những phân tích trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo quản lạc sau thu hoạch ở các tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam"

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc tại một số tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam

- Đề xuất được giải pháp công nghệ bảo quản lạc có hiệu quả ngăn ngừa nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc

3 Nội dung nghiên cứu

Để đánh giá được thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc, từ đó đề xuất quy trình bảo quản lạc có hiệu quả ngăn ngừa nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc, đề tài đã nghiên cứu các vấn đề liên quan có nội dung chính như sau:

- Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc, aflatoxin trong lạc và một số yếu tố liên quan tại miền Bắc (Bắc Giang) và miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ An) Phân lập chủng sinh độc tố aflatoxin từ lạc

- Nghiên cứu các yếu tố (độ ẩm, nhiệt độ, mức nhiễm nấm mốc, áp lực hút chân không và thời gian) ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của chủng nấm phân lập được

- Khảo nghiệm và đề xuất quy trình giải pháp bảo quản lạc có hiệu quả ngăn nhiễm aflatoxin

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

- Qua các số liệu khảo sát và phân tích, đề tài đã đánh giá được thực trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc ở 3 vùng trồng lạc: Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang góp phần cảnh báo nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc; đã xác định được các yếu tố nguy cơ tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc Đây là cơ sở khoa học để có hướng bảo quản lạc sau thu hoạch có chất lượng ổn định Đề tài cũng phân lập và định danh được một số chủng sinh aflatoxin trong lạc, đánh giá khả năng sinh aflatoxin trong lạc của các chủng này, từ đó lựa chọn được chủng có khả năng sinh aflatoxin cao nhất để phục vụ cho nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng

- Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, mức nhiễm nấm sinh độc

tố đến sự phát triển và sinh độc tố của Aspergillus flavus, đã đưa ra được mô hình tiên đoán ảnh hưởng của các yếu tố độ ẩm và mức nhiễm Aspergillus flavus

đến khả năng sinh aflatoxin trên lạc theo thời gian

- Việc áp dụng có hiệu quả tinh dầu hồi và quế gợi ý cho các nhà khoa học mở rộng phạm vi sử dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học để hạn chế sự phát triển

và sinh aflatoxin trên lạc nhân của Aspergillus flavus

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc sinh độc

tố, điều kiện đóng gói hút chân không, nồng độ tinh dầu hồi/ quế, trong bao bì

đóng kín và bảo quản là cơ sở để đề xuất giải pháp công nghệ có tính khả thi trong điều kiện ứng dụng ở quy mô hộ gia đình tại Việt Nam

- Góp phần giải quyết được khó khăn của người dân do nấm mốc phát triển và sinh độc tố aflatoxin trong bảo quản lạc nhân, giảm tổn thất sau thu hoạch, gia tăng giá trị và sức cạnh tranh của lạc nhân Việt Nam

5 Những đóng góp mới của luận án

- Đã phân lập và định danh được một số chủng nấm mốc có khả năng sinh

aflatoxin từ lạc, trong đó xác định được Aspergillus flavus BG1 sinh lượng

aflatoxin cao nhất

- Nghiên cứu đã tìm ra được mối liên quan giữa các yếu tố chất lượng và tình trạng nhiễm aflatoxin trên lạc, tìm ra các yếu tố bất lợi có nguy cơ là nguyên nhân nhiễm aflatoxin trên lạc nhân và lạc củ

- Đã nghiên cứu đưa ra được mối quan hệ tuyến tính của các yếu tố ảnh hưởng

(độ ẩm và mức nhiễm A flavus BG1) tới mức nhiễm aflatoxin theo thời gian

- Đề xuất được giải pháp công nghệ bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát chất lượng trước bảo quản, đóng gói hút chân không và bảo quản bằng sử dụng tinh dầu quế, hồi với quy mô hộ gia đình đảm bảo hiệu quả kinh tế

- Bảo quản lạc bằng cách sử dụng tinh dầu hồi (quế) mở ra một hướng mới trong giải pháp bảo quản thực phẩm an toàn và thân thiện với môi trường

6 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 132 trang (không kể phụ lục), 32 bảng, 55 hình và 130 tài liệu tham khảo, được trình bày 4 chương trong 8 phần lớn: Mở đầu (4 trang); Tổng quan (38 trang); Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (23 trang); Kết quả và bàn luận (64 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang ); Danh mục các công trình đã công

bố của luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (11 trang); Phụ lục (28 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây lạc

1.1.1 Giới thiệu chung về cây lạc

Cây lạc (Arachis hypogaea Linn.) có tên bắt nguồn từ hai từ Hy lạp: Arachis là

họ đậu đỗ, hypogaea là dưới lòng đất, do quả lạc hình thành trong đất Lạc trồng rộng

rãi ở khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới và khí hậu ấm Ban đầu cây lạc được trồng ở Nam Mỹ, tiếp đó được thuần hóa ở Tây Ban Nha, người Tây Ban Nha đã mang lạc đến châu Âu, sau đó các nhà buôn đã mang lạc đến châu Á và châu Phi [61]

Lạc được trồng rộng rãi tại Việt Nam cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao Lạc

là cây công nghiệp ngắn ngày được sử dụng trong công nghiệp, nông nghiệp và các ngành phụ trợ Trong công nghiệp lạc được dùng cho công nghiệp thực phẩm để chế biến bánh kẹo, ép lạc lấy dầu Dầu lạc còn được dùng cho các ngành công nghiệp khác như: làm chất dẻo, xi mực in, dầu diesel, làm dung môi cho thuốc bảo vệ thực vật Trong nông nghiệp, vỏ quả (chiếm 25 - 30 % trọng lượng quả) sau khi tách phần hạt được nghiền thành cám để dùng cho chăn nuôi Cám vỏ quả lạc có thành phần dinh dưỡng tương đương với cám gạo để nuôi lợn, gà vịt công nghiệp rất tốt Các phụ phẩm của hạt lạc như khô dầu lạc, thân và lá của lạc cũng được dùng làm thức ăn

chăn nuôi Ngoài ra, các vi sinh vật cộng sinh cố định đạm như Rhizobium vigna có

thể tạo nốt sần ở rễ một số cây họ đậu, trong đó lạc tạo được nốt sần lớn và khả năng

cố định đạm cao hơn cả, do tác dụng cải tạo đất tốt nên lạc là cây quan trọng nhất trong hệ thống luân canh cây trồng đạt hiệu quả cao

Hạt lạc (hay đậu phộng) là lương thực thực phẩm quen thuộc, là nguồn thức ăn giàu chất béo và đạm có giá trị dinh dưỡng cao trong bữa ăn hàng ngày của người dân Hạt lạc nằm trong vỏ mày, mỗi quả có từ 1 - 3 nhân Tỉ lệ vỏ mày khoảng 14 -

33 % Lạc nhân có vỏ mỏng màu hồng, nâu sáng, nâu đỏ hoặc đỏ thẫm Khối lượng 1.000 hạt dao động trong khoảng 300 - 1.300 g

Thành phần sinh hoá của lạc có thể thay đổi phụ thuộc vào giống, sự biến động của điều kiện khí hậu giữa các năm, vị trí của hạt ở quả khác nhau cũng ảnh hưởng đến thành phần sinh hoá của hạt lạc Hạt lạc chứa rất ít tinh bột

Các chất dinh dưỡng của hạt lạc chủ yếu ở dạng chất béo và protein

Hàm lượng chất béo khá cao - trung bình khoảng 50 % (chủ yếu ba axit béo oleic, linolic và palmitic) [8], trong đó 50 % acid béo đơn không no (MUFAs), 33 % Para formadehyde (PFAs) and 14 % acid béo bão hòa là hỗn hợp acid béo tốt cho tim mạch, và cung cấp năng lượng tốt đối với trẻ suy dinh dưỡng [112] Trong chất béo của lạc, Oleic acid chiếm tỉ lệ cao (38 - 54 %), sau đó đến Linoleic acid (29 - 37 %), Palmitic acid (10 - 13 %), Steric acid (2 - 3 %), còn lại các acid béo: arachidic, eicosenoic, behenic và lignoseric (1 - 3 %) [59, 92, 114]

Protein trong lạc chiếm khoảng 20 - 37 % [8] Lạc có chứa 20 acid amin và là lượng cung cấp arginine lớn, acid amin trong lạc có thể là nguồn bổ sung protein trong bữa ăn Protein trong lạc có hoạt tính nhũ tương hóa, khả năng nhũ tương hóa

ổn định, khả năng tạo bọt, khả năng giữ ẩm cao, tính hòa tan cao, và là thành phần nguyên liệu cung cấp protein cao trong công nghiệp thực phẩm Arginine hay L-arginine là acid amin cần thiết cho gan, da, khớp và các cơ khỏe mạnh Arginine giúp tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể; điều hòa hormone, đường máu và cải thiện khả năng sinh sản của nam giới; arginine còn là một trong những chất dinh dưỡng có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa [112]

Cacbonhydrat trong lạc chiếm khoảng 15,5 % [29] Cacbonhydrat trong lạc bao gồm chất xơ và tinh bột là hai dạng cacbonhydrat có ảnh hưởng thấp và ít tới đường huyết Hiệp hội tiểu đường Mỹ xếp lạc vào siêu thực phẩm của bệnh tiểu đường [112] Lạc có chứa nhiều vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, folat), các amino acid [29] Việc tiêu thụ 100 g lạc đáp ứng tới 75 % lượng Niacin khuyến nghị ăn vào hàng ngày (RDA), 60 % RDA của folat, 55,5 % RDA của vintamin E, 53 % RDA của thiamin,

35 % RDA của pantothenic acid, 27 % RDA của pyridoxin và 10 % RDA của riboflavin Nguồn niacin cao rất quan trọng cho chức năng của hệ thống tiêu hóa, thần kinh da, giúp chuyển hóa thực phẩm thành năng lượng và hỗ trợ chống bệnh alzheimer và sự giảm nhận thức Tiêu thụ lạc có thể cung cấp vitamin E giúp chống bệnh tim mạch Lạc cũng chứa folat là chất đặc biệt quan trọng đối với trẻ nhỏ và phụ

nữ có thai trong việc sản sinh và duy trì các tế bào [112] Hàm lượng α-, β-, γ- và

δ-tocopherol trong lạc tương ứng là 10,9; 0,5; 10,8 và 1,1 mg/100g (tính theo chất khô)[76]

Lạc còn là nguồn cung cấp các chất khoáng (kali, phospho, magnesi, mangan, sắt, natri, kẽm, đồng) [29] Tiêu thụ 100 g lạc có thể đáp ứng 127 % RDA đồng, 84

% RDA mangan, 57 % RDA sắt, 54 % RDA phosphor, 42 % RDA magnesi làm giảm chứng viêm và giảm nguy cơ hội chứng chuyển hóa và tiểu đường type II [112] Lạc có chứa các hoạt chất sinh học tốt cho sức khỏe như phenolic acid và flavonoid Phytosterol (sterol thực vật và stanol ester) là một nhóm các hợp chất tìm thấy trong màng tế bào hạt lạc có khả năng ngăn hấp thu cholesterol và giảm cholesterol trong máu [112] Phytoterol trong lạc giảm sự phát triển của khối u đến

50 % Resveratrol trong lạc cũng giúp ngừng cung cấp máu cho khối u phát triển và ngăn tế bào ung thư phát triển [112]

Do tác dụng của cây lạc đối với đời sống nên cây lạc chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới, là lương thực thực phẩm quan trọng thứ 13 và quan trọng thứ 4 trong số các loại hạt có dầu quan trọng nhất trên thế giới [51], đồng thời nhu cầu sử dụng và tiêu thụ lạc ngày càng tăng đã và đang khuyến khích đầu tư phát triển sản xuất lạc với quy mô ngày càng mở rộng ở các quốc gia trên thế giới

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lạc trên thế giới và Việt Nam

Lạc được trồng rộng rãi trên thế giới ở 119 nước, trong đó chủ yếu là châu Á (chiếm tỉ lệ 60,4 %), sau đó đến châu Phi (29,7 %), châu Mỹ (9,8 %) và châu Đại dương (0,1 %) Diện tích trồng lạc trên toàn thế giới năm 2012 là 25.563.601 ha, đến năm 2016 là 27.660.802 ha Sản lượng lạc trung bình trên thế giới năm 2012 là 42.020.180 tấn, đến năm 2016 là 43.982.066 tấn [64]

Sản lượng lạc của Việt Nam được xếp thứ 10 trên thế giới [126] Theo kết quả điều tra diện tích trồng lạc của các vùng trong cả nước cho thấy: ba vùng miền Bắc bao gồm đồng bằng sông Hồng (Vĩnh Phúc), Đông Bắc (Bắc Giang), Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa, Nghệ An) có tổng diện tích trồng lạc khoảng chiếm 58,6 % tổng diện tích trồng lạc trên cả nước Tổng diện tích sản xuất lạc khu vực miền Trung và khu vực miền Nam hàng năm chiếm tỉ lệ tương ứng 10,2 % và 19,6 % diện tích trồng lạc

cả nước [11] Theo số liệu của Tổng cục thống kê Việt Nam, sản lượng lạc trong cả nước năm 2012 là 470 nghìn tấn, với sản lượng theo địa phương từ 6,3 - 39,7 nghìn tấn Trong đó Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang là trong số các tỉnh phía Bắc và Bắc Trung bộ có sản lượng lạc cao tương ứng là 39,7; 25,6 và 28,3 nghìn tấn [18] Cho đến năm 2016, kết quả thống kê sản lượng lạc và tình hình tiêu thụ lạc tại Việt Nam như bảng 1.1

Bảng 1 1 Diện tích, sản lượng và lượng tiêu thụ lạc của Việt Nam

Năm Các thông số

2012 2013 2014 2015 Sơ bộ 2016

Nguồn: Tổng cục Thống kê việt Nam [20]

Qua bảng 1.1 ta thấy, mặc dù diện tích trồng lạc trên cả nước có giảm đi qua các năm, diện tích trồng lạc năm 2016 giảm 12,7 % so với năm 2012 Tuy nhiên năng suất tăng dần theo năm, năng suất năm 2016 tăng 7,9 % so với năm 2012

Các giống lạc mới đã góp phần nâng cao năng suất lạc, trong đó một số giống lạc mới có tiềm năng như: LO2, 1660, LVT, LO5, L14, LO8, MD7, L15, VD1 đã được đưa vào sản xuất [15] Cơ cấu giống được sử dụng trong sản xuất của nông dân miền Bắc nhiều nhất là L14 và MD7 chiếm tỉ lệ 68,7 %, tiếp đó đến giống sen lai, sen thất, L12, L18, L23, V78 [11] Giống lạc L14 là giống nhập từ Trung Quốc Cây có dạng thân đứng, lá xanh đậm, chống đổ tốt, kháng bệnh bạc lá, đốm nâu, gỉ sắt, đốm đen, chết ẻo Quả to, eo nông, gân quả nông, vỏ lụa màu hồng Khối lượng 100 quả khoảng 150 - 155 g, 100 hạt khoảng 55 - 58 g Thời gian sinh trưởng vụ xuân là 115

- 120 ngày; vụ thu và vụ đông là 100 - 105 ngày L14 là giống chịu thâm canh tốt, năng suất 40 - 45 tạ/ha Giống lạc MD7 có thời gian sinh trưởng 120 ngày trong vụ xuân, sinh trưởng tốt, cây cao 49,2 cm Khối lượng 100 hạt là 51 g, chịu hạn tốt, chịu đất ướt tốt Năng suất 35 tạ/ha, là giống yêu cầu thâm canh [3] Hình ảnh giống lạc

L14 như hình 1.2 (nguồn [28])

Hình 1 1 Hình minh họa giống lạc L14

Thời vụ trồng lạc ở các tỉnh phía Bắc [3]:

- Vụ xuân: gieo tốt nhất trong tháng 2 dương lịch, thu hoạch vào cuối tháng 6, trước khi bước sang tháng 7

- Vụ thu: gieo tháng 7-8, thu hoạch tháng 11-12

- Vụ đông: gieo tháng 8-9, thu hoạch tháng 12 năm trước tới tháng 1 năm tiếp theo

Tại miền Bắc và miền Trung, lạc thường được trồng luân canh với cây trồng màu vào vụ xuân hoặc đông xuân Điều kiện sinh thái trong mùa xuân của miền Bắc thích hợp cho lạc phát triển, do đó hầu hết diện tích đất màu ở khu vực này được nông dân sử dụng để trồng lạc xuân Tại Bắc Giang đa số các hộ dân trồng lạc trong tháng

2 (chiếm 78,9 %) Tại Bắc Trung Bộ đa số hộ dân trồng lạc từ giữa tháng 1 đến đầu tháng 2 (chiếm 83,2 %) [11] Theo kết quả tổng điều tra dinh dưỡng gần đây nhất, mức tiêu thụ hạt có dầu (lạc, vừng) trung bình của mỗi người là 2,37 g/người/ngày; khu vực tiêu thụ nhiều nhất là vùng Trung du và miền núi phía Bắc với mức trung bình là 5 g/người/ngày [6] Việc duy trì diện tích và sản lượng lạc tại Việt Nam qua các năm đã nói lên được khả năng thích nghi và vai trò của cây lạc trong nền kinh tế, đóng góp vào thu nhập của người nông dân nói riêng và thu nhập chung của nền kinh

tế quốc dân trong cả nước nói chung, đặc biệt là người dân miền Bắc và Trung bộ

Thống kê lượng lạc nhân xuất nhập khẩu của Việt Nam từ năm 2009 đến 2013 cho thấy lượng xuất khẩu giảm từ 55.921 tấn (năm 2009) xuống 8.477 tấn vào năm

2013 Trong khi đó, lượng nhập khẩu tăng từ 1.812 tấn (năm 2009) lên 5.000 tấn (năm 2013) [63], điều đó chứng tỏ nhu cầu tiêu thụ lạc của Việt Nam được duy trì không giảm

Mức nhập khẩu lạc của các nước trên thế giới theo tỉ lệ phần trăm lượng nhập khẩu trên toàn thế giới như sau: cao nhất là châu Âu (chiếm tỉ lệ 46,3 %), sau đó đến châu Á (30,8 %), châu Mỹ (14,6 %), châu Phi (7 %) và châu Đại dương (1,3 %) [62] Theo kết quả thống kê của ngân hàng thế giới từ năm 2002 đến 2010, thực phẩm của Việt Nam nhiễm mycotoxin bị từ chối nhập khẩu vào các nước như Mỹ, châu Âu

và Nhật bản tương ứng là 32, 23 và 7 lần [118]

Mycotoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm nói chung chủ yếu là aflatoxin Thực phẩm nhiễm aflatoxin đã gây nhiều tổn thất về kinh tế, Cục Dược và Thực phẩm của Nigeria đã tiêu hủy thực phẩm nhiễm aflatoxin trị giá 200.000 đô la Mỹ, việc đưa

ra quy định mức chấp nhận tối đa hàm lượng aflatoxin nhiễm trong thực phẩm của cộng động châu Âu vào năm 1997 đã ảnh hưởng đến xuất khẩu ngũ cốc, hoa quả khô

và các loại hạt ăn được của châu Phi làm tổn thất ước tính 400 triệu đô la Mỹ Nghiên cứu của ngân hàng thế giới cho thấy quy định của cộng đồng châu Âu về aflatoxin làm chín nước châu Phi tổn thất trong xuất khẩu ngũ cốc, hoa quả khô và hạt tới 750 triệu đô la Mỹ mỗi năm [52, 123]

Miền Bắc và Bắc Trung bộ là vùng có diện tích trồng lạc lớn nhất, trong đó các tỉnh có sản lượng lớn là Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An; Trung du và miền núi phía Bắc là những vùng tiêu thụ lạc nhiều nhất Vì vậy nghiên cứu thực hiện đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc tại các địa bàn này

L14 và MD7 là giống lạc được trồng phổ biến tại miền Bắc, với ưu thế về tính thích nghi và chống chịu sâu bệnh của L14 nên giống lạc này được trồng rộng rãi trên các tỉnh này, do đó L14 là giống lạc được sử dụng trong nghiên cứu này

1.1.3 Quy định về mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc

Theo tiêu chuẩn Việt Nam và tiêu chuẩn Codex về lạc, quy định số hạt lạc bị

mốc cho phép tối đa không quá 0,2 % khối lượng, nhân lạc mốc được xác định là

nhân có hình sợi mốc có thể quan sát bằng mắt thường [23, 41]

Phòng Nông nghiệp của Hoa Kỳ (USDA) quy định mức nhiễm nấm mốc trong lạc không vượt quá 100 MPN/g [121] Cục Dược phẩm và Thực phẩm của Philipin quy định mức nhiễm nấm mốc trong lạc phơi nắng (sun dried peanut) cho phép tối đa

là 102 CFU/g [65]

Việt Nam không quy định giới hạn cho phép mức nhiễm nấm mốc cho lạc, nhưng quy định với các sản phẩm “ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bột, miến, mì sợi” trong quyết định số 46/2007/QĐ-BYT, giới hạn cho phép tổng số bào tử nấm men - mốc là

103 CFU/g đối với sản phẩm có xử lý nhiệt trước khi sử dụng, và 102 CFU/g đối với sản phẩm dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng [2]

Quy định mức tối đa cho phép aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số (B1, B2, G1, G2) trong lạc trên thế giới và Việt Nam như bảng 1.2

Bảng 1 2 Quy định mức tối đa cho phép nhiễm aflatoxin trong lạc

Cộng đồng

châu Âu [117]

Lạc dùng để phân loại, hoặc xử lý vật lý, trước khi sử dụng cho con người hoặc làm nguyên liệu thực phẩm

Lạc và sản phẩm lạc đã chế biến, dùng cho

ăn liền hoặc nguyên liệu thực phẩm ăn liền

Việt Nam [1]

và CODEX

[42]

Ghi chú: “KQĐ” nghĩa là “Không quy định”

Aflatoxin được xác định là nhóm chất gây ung thư rõ rệt trên người [108] nên các cơ quan quốc tế và Châu Âu không thiết lập một lượng chấp nhận ăn vào hàng ngày cho aflatoxin, mức tối đa cho phép được thiết lập ở mức thấp có thể đạt được (ALARA) [42, 117]

1.2 Aspergillus trên lạc

1.2.1 Tình hình nhiễm nấm mốc trên lạc

Nấm mốc phát triển yêu cầu một nguồn cung cấp năng lượng ở dạng cacbonhydrat, chất béo từ thực vật, nguồn nitơ vô cơ hoặc hữu cơ, các kim loại ở lượng vết và độ ẩm đủ để sinh trưởng và sinh độc tố Nguồn cung cấp năng lượng từ

cơ chất đóng vai trò quan trọng trong việc tạo điều kiện hay ức chế sự phát triển của

của các chủng sinh độc tố Các chủng Aspergillus flavus sinh độc tố được phân lập

nhiều nhất từ lạc, hạt bông, sau đó đến gạo và cây cao lương [100]; 1.400 loài nấm được phân lập từ lạc của Ai cập, các nấm mốc này chủ yếu thuộc các giống như

Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus và Epicoccum; loài Aspergillus có mặt chủ yếu là A niger, A parasiticus, A flavus và A tereus [52], trong đó A flavus và

A parasiticus là các loài sinh aflatoxin chủ yếu [69]

Nấm mốc sinh AF phân lập được từ lạc chủ yếu là Aspergillus flavus [9, 97, 123] Kết quả thử khả năng sinh AF của các chủng Aspergillus phân lập được cho thấy A flavus sinh AFB1 và AFB2, trong khi A parasiticus sinh AFB1, AFB2, AFG1

210 mẫu lạc nhân thu được tại 5 tỉnh của Perak có hoạt độ nước trong khoảng

0,72 - 0,75 và mức nhiễm A flavus trong khoảng 1,0×102 đến 1,1×105 CFU/g,

161/210 mẫu nhiễm nhóm A flavus (chiếm tỉ lệ 77 %) [72]

270 mẫu lạc nhân thu thập tại Đông Ethiopia vào năm 2010 được phân tích cho

thấy tỉ lệ nhiễm nấm 50-80 % chủ yếu là các loài Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus ochaceus, Aspergillus paraciticus và Penicilium [31]

110 mẫu lạc nhân và lạc củ được lấy vào mùa ẩm tháng 2 năm 2004 tại miền Tây Java, Indonesia, gồm 53 mẫu lạc củ (13 mẫu lấy từ 12 hộ nông dân và 40 mẫu lấy từ 23 người thu mua) và 57 mẫu lạc nhân (7 mẫu lạc khô lấy từ người thu mua, 5 mẫu lấy từ 2 nhà buôn và 45 mẫu lấy từ 45 nhà bán lẻ trên thị trường truyền thống)

Tỉ lệ nhiễm A flavus cao nhất ở các nhà bán buôn cũng như bán lẻ (100 %), sau đó

đến các mẫu từ người thu mua (85-85,7 %) và hộ nông dân (84,6 %) [99]

Các nghiên cứu về tình trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc cho thấy lạc

bị nhiễm nấm mốc sinh AFB1 chủ yếu là Aspergilus flavus [56, 75]

Tại Việt Nam, kết quả định danh bước đầu các nấm mốc trên hạt lạc trong khu vực chợ Xuân Khánh, Thành phố Cần Thơ năm 2009 phát hiện được các loài:

Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum [9] Nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc vàng (A flavus) trên lạc thu thập tại nhà dân, chợ

và đại lý ở các miền Bắc - Trung - Nam cho kết quả tỉ lệ nhiễm nấm mốc vàng là 79,33 %, trong đó mức nhiễm nấm mốc vàng tại miền Bắc là cao nhất do đặc điểm khí hậu miền Bắc có độ ẩm cao, nóng ẩm thất thường [11] Các mẫu lạc thu thập tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam như Nghệ An, Hải Dương và Hà Nội được phân lập, thu

được 30 chủng A flavus và 3 chủng A niger, kết quả phát hiện bốn gen đích ver-1, omt-1, nor-1 và apa-2 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp AF bằng phản ứng PCR cho thấy có 19 chủng A flavus chứa cả bốn gen đích, 8 chủng A flavus chứa ít hơn bốn gen đích, 3 chủng A flavus và 3 chủng A niger không chứa bất kỳ gen đích nào Chủng A flavus sinh AF phát hiện cả bốn gien đích, không phát hiện gien đích nào trong hai chủng A niger và các chủng A flavus không sinh độc tố [17]

Như vậy nấm mốc sinh độc tố phát hiện trên lạc chủ yếu là A flavus và A parasiticus A flavus chủ yếu sinh AFB1 và AFB2, trong khi A parasiticus sinh

AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2

Qua kết quả nghiên cứu tình hình nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc cho thấy Aspergillus flavus là nấm sinh aflatoxin phổ biến trong lạc Do đó A flavus được

quan tâm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh aflatoxin trên lạc

1.2.2 Aspergillus flavus

Sự có mặt của Aspergilus flavus được phát hiện bước đầu thông qua những đặc

điểm hình thái mô tả khóm nấm mốc và bào tử nấm mốc dưới đây

Hình 1 2 Màu sắc của Aspergillus flavus: a-trên hạt; b-trên môi trường thạch Czapek Dox

Màu của khuẩn lạc thay đổi khi môi trường nuôi cấy thay đổi, A flavus trên các

môi trường PDA, SDA, MEA và thạch Czapecks có màu sắc khác nhau Trên môi trường PDA, khuẩn lạc có màu vàng xanh [97], ban đầu khuẩn lạc có màu trắng, sau

3 ngày nuôi cấy bào tử nấm có màu oliu và xanh lục đậm, viền xung quanh khuẩn lạc

có màu trắng, mặt sau của khuẩn lạc có màu vàng nhạt [83] Khuẩn lạc có màu xanh trên môi trường SDA [97], ban đầu khuẩn lạc có màu trắng, sau 4 ngày nuôi cấy bào

tử có màu vàng xanh và ôliu, viền xung quanh khuẩn lạc màu trắng, viền trắng sẽ mất

đi khi khuẩn lạc phát triển rộng ra và sinh nhiều bào tử, mặt sau tạo rãnh có màu nâu nhạt [83] Trên môi trường MEA khuẩn lạc có màu xanh lục [97], bào tử có màu ôliu

và xanh đậm, mặt sau của khuẩn lạc có màu nâu nhạt hoặc nâu sáng [83] Trên môi trường thạch Czapecks khuẩn lạc có màu vàng [97] Trên môi trường RBCA, bào tử

có màu vàng nhạt sau chuyển sang xanh đậm và ôliu sau 6 ngày nuôi cấy, mặt sau của khuẩn lạc không có màu; [83]

1.2.2.2 Bào tử nấm

Cuống bào tử (hình 1.3.a) phình ở đầu và chứa một số bào tử đính chứa các tế bào hình ống với chuỗi bào tử đính khô dài Đầu bào tử đính thường có hình cầu chia

thành nhiều ống (hình 1.3.b) (nguồn [109]) Cuống bào tử trong suốt và thô ráp, thể

bình 1 lớp hoặc hai lớp, vách cuống xù xì, cuống bào tử đính hình cầu hoặc hình quả

lê, bông tỏa hình tia hoặc đôi khi tạo cột (hình 1.6.c) (nguồn [47, 109])

Hình 1 3 Hình ảnh cuống bào tử Aspergillus flavus

Bào tử của A flavus có hình cầu đến gần cầu, màu xanh nhạt (hình 1.4.a) (nguồn [47, 109]) Khi sử dụng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Micoroscopy- SEM) có thể cho thấy rõ đặc điểm bào tử A flavus với bề mặt tương đối mỏng và hơi

xù xì, bào tử của A flavus có hình cầu đến hình elip (hình 1.4.b) (nguồn [102])

Hình 1 4 Hình ảnh bào tử Aspergillus flavus

1.2.2.3 Các phương pháp phát hiện Aspergillus flavus

Các phương pháp phát hiện A flavus dựa vào: 1) Đặc điểm hình thái: sự phát triển của A flavus trên môi trường thạch, dựa vào màu sắc và hình dạng của nấm; 2)

Khả năng sinh độc tố aflatoxin; và 3) so sánh với trình tự gen trên ngân hàng gen thế giới

Dựa vào đặc điểm hình thái của khuẩn lạc trên môi trường SDA, sau bốn ngày nuôi cấy bào tử nấm mốc có màu vàng-xanh và oliu, viền xung quanh khuẩn lạc màu trắng, viền trắng sẽ mất đi khi khuẩn lạc phát triển rộng ra và sinh nhiều bào tử, mặt sau tạo rãnh có màu nâu nhạt [83]

Dựa vào màu sắc và hình dạng của A flavus: Các loài Aspergillus được xác định

dựa trên sự sắp xếp đầu bào tử, hình dạng và kích thước của bọng, cấu trúc và chiều dài của cuống, hình dạng, cấu trúc và màu của bào tử đính Đường kính của bọng trong khoảng 10 - 65 mm [45]

Khẳng định thông qua khả năng sinh aflatoxin: các loài A flavus khác nhau

được nuôi cấy trên môi trường thạch và quan sát dưới ánh sáng đèn UV ở bước sóng

365 nm lên huỳnh quang màu xanh dương [128]

Aspergillus flavus sinh ra một loạt các chất đồng hóa thứ cấp bao gồm aflatoxin,

cyclopiazonic acid, aflatrem, aflavin, kojic acid, aspergillus acid, neoaspergillic acid, b-nitropropionic acid và paspalinine Trong số đó aflatoxin là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe con người và động vật [45]

Để nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển và sinh độc tố của A flavus, việc phân lập và khẳng định chủng sinh độc tố aflatoxin trên lạc là cần thiết, từ đó nghiên cứu các giải pháp hạn chế sự sinh aflatoxin của chủng được phân lập

1.3 Aflatoxin

Aflatoxin là từ ghép của A = Aspergillus, fla = flavus và toxin = độc Afatoxin

là một nhóm khoảng 20 đồng phân, trong tự nhiên aflatoxin thường xuất hiện một nhóm 4 đồng phân chính (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) và hai sản phẩm đồng hóa là AFM1 và AFM2 được tách từ sữa của động vật có vú ăn phải thức ăn nhiễm aflatoxin [46] Các chất này có tính chất hóa lý như sau

1.3.1 Tính chất hóa lý của aflatoxin

Aflatoxin (B1, B2, G1, G2) được phân biệt bởi màu huỳnh quang của chúng dưới ánh sáng cực tím, aflatoxin có màu xanh dương (B = Blue) hoặc màu xanh lục (G = Green) Phổ hấp thụ cực tím của các đồng phân này tương tự nhau, ở bước sóng:

223, 265 và 363 nm [46]

Các đồng phân chính của aflatoxin có công thức phân tử là:

• AFB1: C17H12O6 • AFB2: C17H14O6

• AFG1: C17H12O7 • AFG2: C17H14O7

Với cấu trúc hóa học như hình 1.5 (nguồn [88])

Hình 1 5 Cấu trúc hóa học của AFB 1 , AFB 2 , AFG 1 , AFG 2 , AFM 1 và AFM 2

AFM1 và AFM2 là hai sản phẩm trao đổi chất hydroxy aflatoxin B1 và dihydroxy aflatoxin B2 AFB2 và AFG2 là dẫn xuất dihydroxy của AFB1 và AFG1 Với tác dụng của chất xúc tác hydro hóa, sau khi kết thúc quá trình hydrogen hóa AFB1 hấp thụ ba phân tử hydro và tạo dẫn xuất tetrahydrodeoxy, trường hợp quá trình hydrogen hóa giữa chừng AFB1 hấp thu một phân tử hydro sẽ tạo thành AFB2 AFB1 cũng phản ứng với nhóm hydroxyl dưới tác dụng xúc tác của acid mạnh Sự phân giải ozon làm phân giải AFB1 thành levulinic, succinic, malonic và glutaric acid Aflatoxin có thể bị phân hủy từng phần trong dung dịch cồn dưới tác dụng của ánh sáng và nhiệt [46]

4-1.3.2 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe

Aflatoxin (AF) ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật, làm giảm khả năng miễn dịch, kém tăng trưởng và thấp còi ở trẻ [74] Trẻ em ăn phải thực phẩm nhiễm AF kết hợp với dinh dưỡng trong khẩu phần ăn thấp cũng góp phần đáng kể trong việc nhiễm một số bệnh truyền nhiễm, ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch và

không tăng trưởng phát triển [55], việc phơi nhiễm AF cũng liên quan với tình trạng trẻ còi cọc và thiếu cân [70]

Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (IARC) phân loại AF là các chất gây ung thư thuộc nhóm 1 Thực phẩm thường nhiễm đồng thời AFB1 và AFB2 hoặc AFG1

và AFG2 Hoạt tính sinh học của AFB2 và AFG2 hạn chế, không đủ bằng chứng về tác dụng gây ung thư đối với động vật AFG1 ít gây đột biến hơn AFB1 AFM1 và AFM2 chỉ có trong sữa và các sản phẩm của sữa và ít gây ung thư hơn AFB1 [108] Ung thư là nguyên nhân chính của bệnh tật và tử vong [48] Thống kê tỉ lệ chết năm 2012 cho thấy ung thư gan là nguyên nhân chính thứ hai gây chết người do ung thư trên toàn thế giới Ung thư gan xếp thứ năm trong số các bệnh ung thư thông thường ở đàn ông (554.000 trường hợp chiếm tỉ lệ 8 % trên tổng số) và thứ chín trong các bệnh ung thư thông thường ở phụ nữ (228.000 trường hợp, chiếm 3 % tổng số)

Tỉ lệ ung thư gan cao nhất ở khu vực châu Á và châu Phi mà nguyên nhân chính là nhiễm virus viêm gan B, virus viêm gan C và do nhiễm AF [94] AF trong thực phẩm sau khi hấp thu qua dạ dày, tới gan AFB1 sẽ bị enzym microsomal đồng hóa thành các đồng phân khác nhau qua hydrôxyl hóa, thủy hóa, khử methyl và epoxit hóa như

AFM1, AFQ1, AFB2, AFP1 Cơ chế đồng hóa AF trong gan như hình 1.6 (nguồn [46])

Hình 1 6 Sự đồng hóa aflatoxin trong gan

Để xác định mức độ ảnh hưởng của AF trong lạc đối với sức khỏe, đánh giá phơi nhiễm AF trong khẩu phẩn ăn có chứa lạc cũng là vấn đề được quan tâm Đánh giá phơi nhiễm khẩu phần ăn với aflatoxin B1, orchatoxin A và fumonisin đối với người

lớn tại tỉnh Lào Cai, Việt Nam cho thấy phơi nhiễm khẩu phần ăn với aflatoxin B1

là 39,4 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày [34] Tuy nhiên trong báo cáo vắn tắt về đánh giá nguy cơ đối với mycotoxin trong chuỗi thức ăn của con người và động vật của cơ quan an toàn thực phẩm Pháp [129] và đánh giá của JECFA về mức cho phép ăn vào hàng ngày [125] cho thấy aflatoxin là nhóm được xác định là chất gây ung thư rõ rệt trên người nên các cơ quan quốc tế và Châu Âu không thiết lập một lượng chấp nhận

ăn vào hàng ngày đối với aflatoxin

Aflatoxin được phát hiện và định lượng bằng các phương pháp được giới thiệu dưới đây

1.3.3 Các phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân tích aflatoxin

Để kết quả phân tích phản ánh trung thực, đại diện chất lượng sản phẩm thì phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu phải được lựa chọn và áp dụng phù hợp Một số thuật ngữ về lấy mẫu được hiểu như sau:

- Lô hàng: Lượng xác định vật liệu (lạc hoặc sản phẩm lạc) mà từ đó mẫu được lấy ra và kiểm tra để xác định một (hoặc nhiều) đặc tính

- Mẫu ban đầu: Lượng vật liệu được lấy tại một thời điểm từ các điểm lấy mẫu riêng lẻ trong khắp lô hàng

- Mẫu chung: Mẫu gộp - Tập hợp của hai hoặc nhiều mẫu ban đầu, được lấy mẫu thực tế trong khắp lô hàng, được gộp lại và trộn đều

- Mẫu phòng thử nghiệm: Mẫu được chuẩn bị bằng cách trộn đều và chia mẫu chung để gửi đến phòng thử nghiệm và dùng để kiểm tra hoặc thử nghiệm Các phương pháp lấy mẫu quy định trên thế giới và Việt Nam như:

- Theo hướng dẫn của CODEX STAN 209 [39] và CODEX STAN 193-1995 sửa đổi năm 2015 [42]: lượng mẫu ban đầu phải từ 200 g trở lên, tùy theo số lượng mẫu ban đầu để lấy được lượng mẫu chung là 20 kg Để đảm bảo sự đồng nhất của mẫu, mẫu chung phải gộp từ nhiều phần nhỏ hoặc mẫu ban đầu thu thập từ nhiều vị trí khác nhau của lô Nếu mẫu chung nhiều hơn lượng muốn lấy thì ta phải trộn và chia nhỏ đến khi đạt được lượng mẫu phân tích Với mẫu ở trạng thái tĩnh, mẫu chung phải được gộp từ những phần mẫu ban đầu được lấy ngẫu

nhiên từ các vị trí khác nhau của lô Đối với các lô tĩnh được đóng trong những bao túi đơn lẻ, số túi lấy mẫu được tính theo công thức:

SF = (LT × IS)/(AS × IP) (1) Trong đó: SF - tần suất lấy mẫu hay số túi mẫu được lấy,

LT - trọng lượng của lô,

IS – khối lượng của mẫu ban đầu,

AS – trọng lượng của mẫu chung và

IP – trọng lượng của từng bao túi lẻ

Số lượng mẫu ban đầu, tùy theo khối lượng của lô, số mẫu lấy từ 10 đến 100 mẫu

- Quy định của cộng đồng châu Âu (EC) No 401/2006 [130]: lượng mẫu ban đầu khoảng 300 g, trường hợp mẫu đóng túi có khối lượng nhỏ hơn 300 g thì lấy 2 túi hoặc nhiều hơn Mẫu thử nghiệm từ 1 đến 10 kg

Mẫu lạc thu thập ngoài chợ có thể ở dạng đống, các dụng cụ chứa, hoặc đóng bao, túi bán lẻ Số mẫu ban đầu (n) được tính theo công thức:

n= Trọng lượng của lô × Trọng lượng của mẫu ban đầu

Trọng lượng của mẫu chung ×Trọng lượng của bao gói lẻ (2) Trong đó: Trọng lượng tính bằng kg

Số mẫu ban đầu n là số nguyên đã được làm tròn

Số lượng mẫu ban đầu, tùy theo khối lượng của lô, số mẫu lấy từ 10 đến 100 mẫu

- Theo hướng dẫn lấy mẫu của cơ quan tiêu chuẩn Anh [66]: lượng mẫu chung tối thiểu là 1 kg, số mẫu ban đầu từ 5 đến 100 mẫu

- Theo tiêu chuẩn Việt Nam [25]: lượng mẫu ban đầu tối thiểu là 400 g đến 3000g Mẫu phòng thử nghiệm từ 1 kg đến 10 kg Số mẫu ban đầu từ 10 đến 100 mẫu

Các quy định về lấy mẫu lạc để phân tích aflatoxin hiện hành, chưa có quy định hoặc hướng dẫn lấy mẫu lạc trên thị trường Các quy định về lấy mẫu trên thế giới

cũng như Việt Nam quy định số lượng mẫu ban đầu từ 5 đến 100 mẫu, lượng mẫu chung từ 1 kg đến 20 kg, lượng mẫu ban đầu từ 200 g trở lên

Sự có mặt của aflatoxin có thể được phát hiện bằng các thiết bị phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay), sắc

ký lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) hoặc các kit thử dùng để phát hiện aflatoxin [49], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [33] và Sắc ký lỏng khối phổ (LC-

MSn) [84] Ngoài ra, dựa vào đặc tính phát huỳnh quang màu xanh, aflatoxin B còn được phát hiện dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm lên huỳnh quang màu xanh dương, aflatoxin G lên huỳnh quang màu xanh lục [128] Kết quả phát hiện nhanh aflatoxin bằng TLC và ELISA trong các mẫu lạc thu thập trên thị trường và tại các nông trại ở Kenya phát hiện mức nhiễm từ 6,9 tới 88,7 ppb [49]

Aflatoxin được định lượng bằng các thiết bị TLC, HPLC, GC và LC/MS-MS Các mẫu lạc được phân tích hàm lượng AF đồng thời bằng TLC và HPLC, kết quả cho thấy độ thu hồi của kết quả phân tích bằng TLC là 79 % trong khi HPLC là

95 %; giới hạn phát hiện (LOD) của AF bằng HPLC là 0,4 g/kg trong khi TLC là 0,8 g/kg [128] Các mẫu lạc phân tích bằng HPTLC có LOD được xác định là 0,84

g/kg [91] Giới hạn định lượng (LOQ) của AF trong gạo và lạc phân tích bằng MS/MS được xác định trong khoảng 0,9-2 g/kg [84] LOQ gấp 3,3 lần LOD [26],

LC-do đó qua các kết quả nghiên cứu trên ta thấy LC-MS/MS là thiết bị hiện đại và có

độ nhạy cao, đáp ứng được yêu cầu kiểm soát mức độ nhiễm AF trong lạc

1.3.4 Tình hình nhiễm aflatoxin trên lạc

Aflatoxin nhiễm trong nhiều thực phẩm, trong đó lạc là cơ chất thích hợp cho nấm mốc phát triển và sinh aflatoxin

Tại Brazil, 101 mẫu thu thập tại 5 thành phố của bang Rio Grande do Sul từ năm

2009 và 2010, kết quả phát hiện có 14 % số mẫu có hàm lượng AFB1 vượt quá giới hạn cho phép (20 µg/kg) Trong khi kết quả đánh giá trong vòng 2 năm từ 2000 đến

2002, trong số 664 mẫu lạc và sản phẩm lạc phát hiện 31,3 % mẫu phân tích bị nhiễm

AF ở mức 92,1 đến 5476,0 µg/kg [85]

Nghiên cứu mức độ nhiễm AF trong lạc nhân tại 5 tỉnh của Perak (2003) được thực hiện trên 210 mẫu, kết quả có 129 mẫu phát hiện AFB1 trong khoảng 0,7 - 547,5 µg/kg (chiếm tỉ lệ 61 %), 118 mẫu phát hiện AFG1 trong khoảng 0,3 - 376,0 µg/kg (chiếm tỉ lệ 56 %), có 92 % nhiễm AF tổng số trong khoảng 0,3 - 762,1 µg/kg [72] Trong số 260 mẫu lạc nhân được lấy tại bang Kaduna ở Tây Bắc Nigeria (2015),

có 28,75 % số mẫu phát hiện nhiễm AF, trong đó có 9,2 % vượt quá ngưỡng cho phép (20 µg/kg) theo quy định của Cục Dược và Thực phẩm của Nigeria (NAFDAC) [75] 1.263 mẫu lạc và sản phẩm lạc thu thập tại miền Tây Nyanza và tỉnh Nairobi của Kenya (2013) để phân tích AF, kết quả có 37 % số mẫu vượt quá ngưỡng cho phép (10 µg/kg) theo quy định của Văn phòng tiêu chuẩn Kenya (KEBS), lạc củ có

tỉ lệ nhiễm AF thấp nhất với 96 % thấp hơn 4 µg/kg và 4 % hơn 10 µg/kg Hầu hết

AF nhiễm trong các sản phẩm bơ lạc (69 %) và lạc hỏng (75 %) [38]

110 mẫu lạc nhân và lạc củ được thu thập vào mùa ẩm tháng 2 năm 2004 tại miền Tây Java, Indonesia, trong đó có 53 mẫu lạc củ (13 mẫu lấy từ 12 hộ nông dân

và 40 mẫu lấy từ 23 người thu mua), 57 mẫu lạc nhân được lấy (7 mẫu lạc khô lấy từ người thu mua, 5 mẫu lấy từ 2 nhà buôn và 45 mẫu lấy từ 45 nhà bán lẻ trên thị trường truyền thống) Số mẫu lạc bị nhiễm AFB1 cao hơn ngưỡng cho phép của CODEX (15 µg/kg) có tỉ lệ cao nhất trong các mẫu lạc thu từ nhà buôn là 80 %, tiếp đến nhà bán lẻ (75,6 %), hộ nông dân (38,3 %) và người thu mua 30,0 và 14,3 %) [99] Nghiên cứu mức nhiễm AFB1 trong các mẫu lạc thu thập từ các tỉnh Hà Tây, Thanh Hóa, Nghệ An và Đồng Nai bảo quản sau 5 - 6 tháng phát hiện 41/200 mẫu nhiễm AFB1 (chiếm tỉ lệ 20,5 %); Tỉ lệ nhiễm AFB1 theo tỉnh Hà Tây, Thanh Hóa, Nghệ An và Đồng Nai tương ứng là 30 %, 20 %, 16 % và 16 %; khoảng nhiễm theo từng tỉnh tương ứng: 5 - 170 µg/kg; 3 - 90 µg/kg; 3 - 100 µg/kg; 3 - 90 µg/kg [11] Nghiên cứu mức độ nhiễm AF trong lạc và ngô tại 3 xã huyện Tân Kỳ, Nghệ

An đã thực hiện với 243 mẫu nông sản, có tới 232 mẫu (95,4 %) phát hiện AF, trong

đó có 56 mẫu (23 %) có lượng AF vượt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế Trong

đó số mẫu phát hiện nhiễm AF từ lượng vết với từng đối tượng là lạc vỏ (98,3 %), ngô bột (87,5 %) và ngô hạt (98,4 %) Trong 90 mẫu lạc vỏ phát hiện 98,3 % nhiễm