Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây ôrô nước (acanthus ilicifolius l )

Bên cạnh đó, cũng có nhiều loại thuốc mà các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò dẫn đường hoặc từ những hợp chất thiên nhiên ban đầu, các nhà khoa học đã biến đổi cấu trúc để tạo ra những

trường đại học bách khoa hà nội

-

luận văn thạc sĩ khoa học

Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt

tính sinh học của cây ôrô nước

Luận văn này được thực hiện tại Bộ môn hoá Hữu cơ, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội và Phòng Xúc tác hữu cơ, Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, các anh chị và bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới:

TS Trần Thu Hương, người đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này

GS.TS Châu Văn Minh, Viện trưởng Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên, TS Phan Văn Kiệm cùng các cán bộ khoa học phòng Xúc tác hữu cơ đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Các thầy cô thuộc khoa Công nghệ Hoá học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở bên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu của tôi

Hà Nội, ngày tháng năm 2007

Lê Thị Hồng Nhung

MS: Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

EI-MS: Phổ khối va chạm electron (Electron Impact Mass Spectroscopy)

ESI-MS: Phổ khối lượng ion hoá phun điện (Electrospray Ionization Mass Spectroscopy)

NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

1H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

13C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (Cacbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Dept: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMBC: Heternonuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC: Heternonuclear Single-Quantum Coherence

δ(ppm): Độ dịch chuyển hoá học (parts per million)

Concetration)

VSVKĐ: Vi sinh vật kiểm định

DPPH: 2,2- diphenyl-1-picryl hydrazyl

4 Dung môi

DMSO: Dimetyl sunfoxit

EtOAc: Etyl axetat

cÆn chiÕt MeOH cña c©y A ilicifolius

Lời mở đầu

Y học cổ truyền phương Đông có một lịch sử lâu đời và là một kho tàng

y dược phong phú từ hàng nghìn năm Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền đang có những đóng góp to lớn vào việc phòng và chữa bệnh, làm tăng tuổi thọ của con người và nâng cao chất lượng cuộc sống Chính vì vậy, điều tra, nghiên cứu nguồn tài nguyên thực vật có tác dụng làm thuốc là nhiệm vụ đã và đang

đặt ra trước chúng ta Từ các nguồn nguyên liệu có sẵn trong thiên nhiên, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loại thuốc mới với những hoạt tính quý báu để chữa các bệnh thông thường cũng như các bệnh hiểm nghèo Có nhiều loại thuốc phải dựa hoàn toàn vào thiên nhiên vì bằng con đường tổng hợp hoá học không thành công hoặc giá thành sẽ rất cao Bên cạnh đó, cũng có nhiều loại thuốc mà các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò dẫn đường hoặc từ những hợp chất thiên nhiên ban đầu, các nhà khoa học đã biến đổi cấu trúc để tạo ra những hoạt chất mới có nhiều tính ưu việt hơn mà bằng con đường tổng hợp

hoá học không thể có được

Việt Nam là một nước có vị trí địa lý và khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thuận lợi cho hệ thực vật phát triển Điều này giải thích vì sao nước ta có thảm thực vật rất phong phú, với khoảng 12.000 loài, trong đó có tới 4.000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược Đó là một nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng quí giá và cũng là mục tiêu nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước

Một trong những họ thực vật được cha ông ta sử dụng rất nhiều trong y học là họ Ôrô (Acanthaceae) Cha ông ta sử dụng các loại cây thuộc họ này với mục đích chữa các bệnh như chữa đau lưng, thấp khớp, hen suyễn, thuỷ thũng, đái buốt, đái dắt, gan, đường ruột… Để giải thích điều này, các nhà

khoa học đã ứng dụng khoa học hiện đại để tìm ra thành phần hoá học của các cây thuộc họ Ôrô và họ đã tìm ra được nhiều chất có hoạt tính sinh học cao

Tiếp bước các nhà khoa học đi trước, luận văn của tôi tập trung vào việc nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ cây Ôrô nước (Acanthus ilicifolius L.) thuộc chi Acanthus, họ Ôrô (Acanthaceae)

Nhiệm vụ của luận văn gồm:

1 Phân lập một số hợp chất từ cây Ôrô nước

2 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được

3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học dịch chiết từ cây Ôrô nước

Chương 1: Tổng quan

1.1 Vài nét về chi Acanthus, họ Acanthaceae [3]

Loài Ôrô (Acanthaceae) phân bố rải rác từ đảo Hải Nam - Trung Quốc

đến Malaysia, Thái Lan, ấn Độ và Mianma ở Việt Nam, Ôrô phân bố chủ yếu ở các tỉnh dọc theo bờ biển và ở vùng đồng bằng Nam bộ Cây ưa sáng, thường mọc thành bụi hay đám lớn bên bờ các kênh rạch và trên đất lầy lụt ở cửa sông Cây có thể sinh trưởng, phát triển tốt ở vùng nước lợ cũng như nước ngọt Do đó, ở các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc bộ như Hà Tây, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hà Nam…đôi khi cũng gặp Ôrô mọc rải rác ở các ao hồ và vùng

đồng bằng chiêm trũng

Cây ra hoa kết quả hàng năm Hạt giống phát tán nhờ nước, song chỉ có những hạt trôi dạt vào bờ mới có thể nảy mầm được Ôrô có khả năng tái sinh, chồi khỏe sau khi bị chặt

Acanthus L là một chi nhỏ có khoảng 25 loài, phân bố chủ yếu ở vùng

Địa Trung Hải, châu Phi và vùng nhiệt đới của châu á Bốn loài có ở Việt Nam thuộc chi này là A ebracteatus Vahl, A ilicifolius L., A intergrifolius T

Anders., A leucostachyus Wall

1.2 Cây Ôrô nước (Acanthus ilicifolius L.) [4]

mác, mép lượn sóng lớn, dài 15-20cm, rộng 4-8cm, có thùy nông và răng cưa không đều kết thúc bằng một gai nhọn sắc, hai mặt nhẵn, mặt trên bóng láng, mặt dưới nhạt Lá kèm biến thành gai

Cụm hoa mọc ở ngọn thân và đầu cành thành xim bóng, màu trắng hoặc ngà xanh xếp từng đôi một đối xứng nhau, mỗi hoa có một lá bắc to và hai lá bắc con cứng Đài có bốn răng giống lá bắc, hai răng ngoài to hơn Tràng hợp thành ống ngắn, môi trên teo đi, môi dưới xẻ ba thùy nông tròn, thùy giữa nhỏ Nhị bốn, bầu hai ô

Quả nang tròn, to bằng hạt ngô, màu nâu bóng, chứa bốn hạt dẹt

Cây mọc hoang ở dọc sông ngòi hoặc gần bờ bể Mùa hoa quả là tháng 10-11 trong năm

Hình 1.1 : Hoa và cây Ôrô nước (Acanthus ilicifolius L.)

 Tác dụng lợi tiểu: Thử trên chuột cống trắng 100 - 150g, được nhịn đói qua đêm, sáng hôm sau cho mỗi con uống NaCl 0,9% 5ml/100g Dùng cao khô Ôrô được chế biến từ dịch chiết cồn liều 250mg/kg thấy lượng nước tiểu tăng rõ rệt so với lô đối chứng

 Thử độc tính cấp: Dùng cao khô Ôrô nước tiêm trong màng bụng cho chuột nhắt trắng liều 1000mg/kg, chuột không chết

1.2.3 Các bài thuốc theo kinh nghiệm dân gian

Theo kinh nghiệm dân gian, Ôrô đã được cha ông ta sử dụng trong nhiều bài thuốc để chữa nhiều bệnh kể cả hiểm nghèo:

 Chữa gan lách sưng to: Ôrô 30g, cây thóc lép 12g, liên kiều 15g

 Chữa đau gan, nhuận gan, giải độc gan: Ôrô 30g, vỏ thân hay lá quao 30g

 Chữa tràng nhạc, u và bệnh hạch bạch tuyết: Ôrô 30g, thóc lép 12g, mỏ quạ 20g

 Chữa thấp khớp, đau lưng, nhức sương, tê bại: Rễ Ôrô 35g, canh châu 25g, quế chi 4g, rễ cây kim vàng 18g

 Chữa ho đờm, hen suyễn: Ôrô 30g, thịt lợn nạc 60-120g, nước 500ml

 Chữa táo bón, nước tiểu vàng: Rễ Ôrô 35g, vừng đen 30g, lá muồng trâu 18g

 Chữa rong huyết: Rễ Ôrô 35g, bồ hoàng 35g, kinh giới 18g

 Chữa ho gà: Hoa Ôrô 20g tẩm mật ong hay mật mía

 Chữa bệnh gan, thủy thũng, đái buốt, đái dắt, nhiễm khuẩn: Cả cây Ôrô 30-60g sắc uống

Ngoài ra, búp non và lá Ôrô đắp chữa rắn cắn hay lá Ôrô làm cao để chữa các bệnh viêm nhiễm thông thường Lá và ngọn Ôrô chườm nóng vào các chỗ đau nhức, thấp khớp và đau thần kinh

1.3 Tình hình nghiên cứu [12, 22, 23]

Mọi thứ cây cỏ đều có chứa một lượng lớn các hợp chất hữu cơ Phần lớn các chất này cần thiết cho sự chuyển hóa bình thường trong cây và được gọi là các chất chuyển hóa sơ cấp, những hợp chất có hàm lượng gần như nhau trong tất cả các cây Ngoài các hợp chất này trong cây còn có những hợp chất hầu như chỉ có ở cây đó hoặc một số cây khác, gọi là chất chuyển hóa thứ cấp Trong phần này chúng tôi chỉ đề cập đến một số hợp chất thuộc chất chuyển hóa thứ cấp mà các nhà nghiên cứu đã tìm ra và một số lần đầu tiên được tìm thấy từ loài cây Ôrô nước này:

Bảng 1.1: Các chất đã được tìm thấy trong Ôrô nước

O O

Acanthicifoline

O

H N O

2- benzoxazolinone

O O OH

H2N

Adenoside

OR' RO

O

O O

OH

OH HO

HO

O HO

O HO

HO

OH OH

OH

O O

Syringic axit β-glucopyranosyl

este

HO O

OH O

O

CH3OH

OH OH

O

O

R2O HO

OH

HO HO HOIlicifoliosides B

O O

HO

HOH2C

(8R,7′S,8′R)-5,5′-dimethoxylariciresinol 4-O-β-glucopyranoside

O HO

O

O MeO

H

O

OH OH

OH OH

(+)-syringaresinol-O- β-glucopyranoside

OH

OH HO

O

OH

O O

O

OH OH

OH

OH OH

Verbascoside

OH MeO

HO

OMe

OH OH RO

OMe OH

MeO

R H

C O

2 5

7 9

10

R1 R2 R3(2R)-2-O- β-D-glucopyranosyl-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one H H H (2R)-2-O-β-D-glucopyranosyl-4-hydroxy-2H-1,4-benzoxazin- H H OH -3(4H)-one

(2R)-2-O-β-D-glucopyranosyl-7-hydroxy-2H-1,4-benzoxazin- OH H H -3(4H)-one

7-chloro-(2R)-2-O-β-D-glucopyranosyl-2H-1,4-benzoxazin- Cl H H -3(4H)-one

(2R)-2-O-β-D-glucopyranosyl-5-hydroxy-2H-1,4-benzoxazin- H OH H -3(4H)-one

OH OH

HO

O O HO

OH O

O

HO

OH

O HO

OH OH

HO O

từ 1-6 là ở trong vòng, bắt đầu từ vị trí nhóm propyl gắn vào, còn vị trí từ 7-9

là ở nhóm propyl, bắt đầu từ vị trí vòng benzen gắn vào

1 2 3

4

5 6

7 8 9

1' 2' 3'

4' 5' 6' 7' 8' 9'

Propylbenzen Lignan

Lignan tồn tại nhiều ở tự nhiên, trong nhựa cây của các họ thực vật từ rêu cho đến các loài cây hạt kín Một số loài cây chứa lượng lớn lignan và có giá trị cao như cây lanh (Linum ustatissimum), lúa mạch đen

Trong tự nhiên, hợp chất lignan thường chứa Oxi Và theo cách kết hợp oxi vào bộ khung, lignan được phân ra thành 8 phân nhóm chính:

Podophyllotoxin Secoisolariciresinol diglucosit

Hoạt tính sinh học điển hình của các lignan:

 Hoạt tính kháng virut: Hợp chất podophyllotoxin được chiết từ rễ

cây podophyllum là một trong những lignan có đặc tính chống virut mạnh (kể

cả virut HIV)

 Hoạt tính chống ung thư: Có rất nhiều hợp chất thuộc lớp lignan

có hoạt tính chống ung thư Secoisolariciresinol diglucosit được chiết xuất từ hạt lanh (Linum ustatissimum) đã nghiên cứu và thấy được khả năng ức chế tế

bào khối u ác tính ở trên chuột Các lignan trong hạt lanh đã được thử in vitro cho thấy nó có khả năng ngăn chặn sự di căn và phát triển của bệnh ung thư

vú ở người Và podophyllotoxin từ cây podophyllum cũng có hoạt tính chống

ung thư rất mạnh

 Hoạt tính chống oxi hoá: Một trong nhữg hoạt tính quan trọng

của lignan là hoạt tính chống oxi hoá như α-linolenic axit, secoisolariciresinol diglucosit và đã được thử in vitro

 Các hoạt tính khác: Ngoài ra lignan còn có một số hoạt tính mà

nhờ đó con người đã sử dụng chúng trong chữa các bệnh: thấp khớp, loét dạ dày, lão hoá xương, các bệnh về tiền mãn kinh, đái tháo đường, xơ vữa động mạch, tim, gan, thận

từ các axit amin trong quá trình phát triển của cây Ancaloit thường xuất hiện

ở dạng muối hoà tan được như citrat, malat, isobutylrat, benzoat, hay ở dạng kết hợp với tanin Các ancaloit không chứa nguyên tử Oxi thường dạng lỏng ở nhiệt độ thường còn có chứa nguyên tử Oxi thì dạng tinh thể rắn

Ancaloit có thể được hình thành từ chỉ một amino axit (hygrin, canthin), hai phân tử amino axit giống nhau (quinolizidin, benzylisoquinolin), hai phân

tử amino axit khác nhau (tubulosin) hay từ phân tử giống axit Quá trình chuyển hoá thành ancaloit có thể là quá trình oxi hoá allylic, ở mạch nối, vòng thơm hay quá trình este hoá, ete hoá Tất cả điều này đã giải thích sự đa dạng của cấu trúc ancaloit Dựa vào cấu trúc, ancaloit trong tự nhiên được chia thành các nhóm chính như sau:

 Chứa nitơ ngoài vòng : Loại này bao gồm một số ancaloit như

ephedrin, mescalin, colchinin,

 Dẫn xuất của pyrol : Họ hợp chất này gồm tetrahydro pyrol thay

thế như pyrolidin, N-metyl-pyrolidin, hydrin, cuhydrin

 Dẫn xuất của 1-metyl pyrolizidin : Một trong những hợp chất

quan trọng của nhóm này là platifilin, dạng dieste vòng platinexin và axit hai chức cis senesionic

 Dẫn xuất pyridin và pyperidin : Các hợp chất đại diện cho nhóm

này rất độc như cochin, colnichein, conhydrin, pelterin, ricinin, arecaidin

 Chứa vòng 5, 6 cạnh không ngưng tụ : Tiêu biểu của nhóm này là

nicotin có trong thuốc lá, anabazin

 Dẫn xuất tropan : Là hợp chất vòng có vòng pyrolidin và

piperidin ngưng tụ, ở dạng ghế và dạng thuyền như atropin và cocain

 Dẫn xuất indol : Một trong những ancaloit thuộc nhóm này là

gramin, triptamin và đặc biệt là serotonin

 Chứa vòng indol, vòng pyridin : Hợp chất quan trọng của nhóm

này như reserpin chữa huyết áp cao, ezerin

 Dẫn xuất của imidazol : Trong thiên nhiên người ta tìm được ít

ancaloit thuộc loại này chỉ có một số có trong thực vật ở châu Phi như pilocarpin

 Dẫn xuất chứa nhân purin : Các ancaloit quan trọng thuộc dẫn

xuất purin là cafein và theobromin

 Dẫn xuất của quinolin : Hợp chất thuộc nhóm này không nhiều

nhưng có ứng dụng rất quan trọng như quinolin, chinchonin, cuprein

 Dẫn xuất izo-quinolin : Các ancaloit này có công thức rất phức

OH N

H

O N

Hoạt tính sinh học tiêu biểu của các ancaloit:

 Làm dịu đau : Đây là hoạt tính sinh học mà có ở nhiều loại

ancaloit như morphin chiết xuất từ cây anh túc, caffein

 Tác động lên hệ thống thần kinh : Các ancaloit có thể gây kích

thích thần kinh giao cảm như ephedrin, kiềm chế thần kinh giao cảm như

yohimtin, chống tác động kiểu colin như atropin

 Chống ung thư : Đây là hoạt tính quan trọng và có ý nghĩa nhất

của các ancaloit Một vài ppm cũng đủ chống ung thư của các ancaloit được

tách từ cây dừa cạn Madagasca hay các ancaloit như vinblastine, ellipticine Ngày nay điển hình là các hợp chất ancaloit pyrolizidin, có tác dụng gây độc

tế bào gan và ung thư gan như idixin N-oxit được tách ra từ cây vòi voi, là 1 trong 6 chất được chọn đã qua sàng lọc dược lý, đưa vào thử nghiệm lâm sàng tại Viện ung thư Mỹ

 Ngoài ra các chất thuộc ancaloit còn có tác dụng như gây mê (cocain), chống sốt rét (quinin), chống vi sinh vật kiểm định (berberin)

1.4.3 Tritecpenoit [5, 19]

Tecpenoit là một nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử của nó được cấu tạo bởi một hoặc nhiều đơn vị isopren (CH2=C(CH3)-CH=CH2) Các tritecpenoit hợp thành một lớp rất lớn thuộc nhóm tecpenoit, có 30 nguyên tử cacbon, phân bố rộng rãi trong giới thực vật và đã có khoảng trên 500 tritecpenoit tự nhiên được xác định cấu trúc

Tritecpenoit có thể được chia thành 4 nhóm chính: tritecpen thực thụ, steroit, saponin và glycozit tim

 Tritecpen thực thụ: Những hợp chất này có vòng phức tạp,

thường tồn tại ở dạng chất kết tinh, không màu, có nhiệt độ nóng chảy cao Phổ biến nhất là dạng tritecpen năm vòng như hai axit tritecpen pentacyclic mới, axit mimusopic và axit mimusopsic, chứa bộ khung mimusopane, được phân lập từ hạt của Mimusops elengi (Sapotaceae):

 Steroit: Là những ancol thể rắn có cấu trúc 27-29 nguyên tử

cacbon, thuộc nguồn gốc động vật hoặc thực vật nhưng đều có một khung cơ bản xyclopentanoperhydro phenanthren và một chuỗi ngang với các nhóm metyl (loại ergostan) hoặc etyl (stigmastan) đặc biệt là ở C21 Tất cả sterol đều

có nhóm OH ở C3 Một số sterol có nhóm metyl gắn ở C4 hoặc C14, các chất này được gọi là metylsterol Sterol có dây nối đôi gọi là stenol, không có dây nối đôi gọi là stanol

Steroit phân bố rộng, chúng thường có mặt song song với ancaloit hoặc saponin steroit Có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các este, glycozit như stigmasterol (trong

đậu nành), β-sitoterol (trong mầm lúa mì), ergosierol (trong hạt, phấn hoa cây thốt nốt), cholesterol (trong thực vật cao cấp và một số loại tảo)

Ergosierol Stigmasterol

β-Sitoterol Cholesterol

 Saponin: Là những hợp chất glycozit của cả tritecpen thực thụ và

sterol Nó có trong khoảng 70 họ cây, như diosgenin có trong cây mía dò (Dioscorea), không tồn tại ở dạng tự do mà ở thể glycozit: dioscin là steroit saponin và diosgenin là aglycon của glycozit:

OH OH HO

O O

O

O

 Glycozit tim: Là một nhóm glycozit có cấu trúc steroit, có tác

dụng đặc biệt đối với bệnh tim Trong cây chúng tồn tại dưới dạng glycozit hòa tan trong các dịch tế bào Dưới tác dụng của các men hoặc axit loãng các glycozit thủy phân biến thành genin và các oza Chúng tan tốt trong nước, cồn loãng, rất ít tan trong các dung môi rất phân cực Glycozit tim phân bố trong khoảng 10 họ thực vật như oleandrin độc tố từ lá cây thuộc

họ Trúc đào (Apocynacea) gọi là Nerium oleander:

HO Me

Me

Me

OH

Oleandrin

Hoạt tính sinh học điển hình của các tritecpen:

 Hoạt tính chống u và ung thư: Điển hình ở đây là các tritecpenoit

năm vòng như axit ursolic có khả năng ức chế sự phát triển của u trong da chuột, axit 3-oxofriedelan-29-oic, 3-oxofriedelan-28-oic và 28,29-dihydroxyfriedelan-3-on thì lại có khả năng chống lại các tế bào ung thư biểu mô phổi một cách riêng biệt (ED50 là 0,21, 1,18 và 0,64 μg/ml), axit betulinic

ức chế một cách đáng kể hiệu quả xúc tiến của 2,50μg TPA khởi đầu bằng

50μg 7,12-dimetylbenzanthracene, este metyl axit Abiesenonic, một hợp chất tritecpen được điều chế từ abieslacton, đã ngăn chặn hiện tượng sản sinh nhân

tố gây u ở in vitro và in vivo

 Hoạt tính chống viêm nhiễm: Một triterpen 5 vòng 2α, 3β,

23-trihydroxy-olean-12-en mới được kiểm nghiệm qua đường miệng về hoạt tính giảm đau và chống viêm nhiễm Hoạt tính chống viêm được tìm thấy được ở các taraxasterol axetat, moretenol axetat, moretenol và neulupanol

 Hoạt tính kháng virut, kháng khuẩn : Tương quan hoạt động cấu

trúc chỉ ra rằng, mối liên kết axetal trong vòng A và nhóm cacboxyl trong vòng E cần phải cho hoạt tính chống HIV Suberosol, một tritecpen dạng lanostan C31 phân lập từ Pollyalthia subarosa (Annonaceae) ức chế sự tái tạo

HIV trong các tế bào lymphosite H9 với giá trị ED50= 3μg/ml, trong khi nó ức chế sự phát triển tế bào H9 không bị nhiễm với giá trị IC50=20μg/ml Epilupeol và epilupeol axetat thể hiện hoạt tính chống virut rõ rệt chống lại virut gây bệnh Ranikhet ở phổi gà Các tritecpen glycyrrhizic kết hợp với albumin được sử dụng trong quá trình xử lý các sản phẩm máu để vô hoạt hóa hay giết chết các virut gây nhiễm được tìm thấy trong các mô và các dịch

động vật như virut cytomegalo

Chương 2: Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu

2.1 Mẫu thực vật

Mẫu thực vật được thu hái vào tháng 10/2006 tại Hoà Bình và đã được

TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học Cành lá và vỏ cây được sấy khô

và xay nhỏ tuỳ theo mục đích sử dụng

2.2 Phương pháp chiết xuất [5]

Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết

và cách chiết Mỗi loại hợp chất có độ hoà tan khác nhau trong từng loại dung môi nên phải áp dụng các phương pháp chiết khác nhau đối với mỗi loại chất

đó Và chiết lạnh là phương pháp sử dụng thông dụng hơn cả, nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các loại dung môi thích hợp để hoà tan các chất

có trong nguyên liệu thực vật ở nhiệt độ thường

2.3 Các phương pháp phân lập [1]

2.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Chất cần phân tích được cho tương tác với hai pha tĩnh và pha động Pha

động ở đây là chất lỏng, chuyển mẫu qua vùng chứa pha tĩnh hấp thụ Tại đây chất cần phân tích sẽ tương tác với chất hấp phụ nhờ tính phân cực của chúng

Do sự tương tác này mà chất cần phân tích sẽ chuyển động chậm hơn trong hệ thống sắc ký Chất phân tích có ái lực yếu hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động nhanh hơn và đạt tới khoảng cách dịch chuyển lớn hơn so với chất có ái lực mạnh hơn Nhờ vậy mà các chất được phân tách trong quá trình chạy sắc ký ở các vị trí khác nhau

Sắc ký lớp mỏng ở đây thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merk 1,05715), RP18 F254 (Merk) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm, có thể dùng máy ultrachimiscope (254 nm),

đèn tử ngoại để bàn KP-IN (365 nm) hoặc dùng dung dịch thuốc hiện màu vanilin-sunfuric axit được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

2.3.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC)

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60G F254 (Merk 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm và 365nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun dung dịch thuốc hiện màu vanilin-sunfuric axit đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng để phát hiện vệt chất, xong ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silicagel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp

2.3.3 Sắc ký cột (CC)

Giống như phương pháp sắc ký lớp mỏng đây cũng là phương pháp tách dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực yếu sẽ ra nhanh hơn trong hệ thống sắc ký Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063nm (240-230 mesh) Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50μm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

trọng Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,5 ˚C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh khiết Khi điểm chảy xác định

được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu

Điểm chảy được đo trên máy Kofler micro- hotstage của Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4.2 Độ quay cực ([ α] D ) [6]

ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều kiện nhất định nào đó , do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần

Mặt phẳng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường

được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc với mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực

Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc α Tuỳ theo chất quang hoạt mà góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-) Độ lớn của góc quay α phụ thuộc vào nồng độ C (g/100ml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung môi) l, nhiệt độ t và chiều dài sóng λ:

[α]D =

100

] [ α tλ C l

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [6]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng Với việc sử dụng kết hợp các

kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác

định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau

Các số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ ) của các proton được xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức

độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất

 Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon Mỗi

nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm)

 Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại

cacbon khác nhau Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất

Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 thì nằm về phía đối diện trên phổ DEPT 135˚ Còn trên phổ DEPT 90˚ thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

 Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định

các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều

- Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của C và H trong

phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

- Phổ HSQC: Đây là phổ biểu diễn các tương tác của C và H liên kết trực tiếp với nhau trong phân tử Như ở phổ HMBC, nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

2.4.4 Phổ khối lượng MS (mass spectroscopy) [6]

Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hoá học các hợp chất

ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV Số liệu được ghi trên máy Hewlett Packarl 5989 B MS Engine của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Phổ ESI-MS: Còn được gọi là phổ khối lượng phun mù điện tử Phổ

này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS,

do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá

vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ phá vỡ Số liệu được đo trên máy

AGILENT 1200 SERIES LC-MSD Trap của Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.5 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.5.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định

Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng sinh, ta tiến thành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các mẫu chiết theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlinck theo hai bước:

- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính

- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:

- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (Ec), Psenudomonas aeruginosa (Pa)

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (Bs), Staphylococcus aureus(Sa)

- Nấm sợi: Aspergillus niger (An), Fusarium oxysporum (Fo)

- Nấm men : Candia albicans (Ca), Sacharomyces cerevisiae (Sc)

Kháng sinh kiểm định bao gồm:

- Ampixilin đối với vi khuẩn Gr(+)

- Tetracylin đối với vi khuẩn Gr(-)

- Nystatin đối với nấm sợi và nấm men

Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng Saboraud dextros broth và Trypcase soya broth (TSB) Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm)

Mẫu thử được hoà tan trong trong dung dịch DMSO 100% với 4 - 10 thang nồng độ được pha loãng từ dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hoá được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị Meland (khoảng 108 vi sinh vật/ml) Để trong tủ ấm 370C trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 300C trong

48 giờ đối với nấm Sau đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC) Mẫu thô có MIC ≤ 200àg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50àg/ml là có hoạt tính

2.5.2 Hoạt tính chống ôxi hóa

Phương pháp tiến hành là phương pháp thử nghiệm DPPH thông qua phản ứng bao vây gốc tự do, phương pháp sàng lọc sơ bộ khả năng bẫy gốc tự do trên phiến 96 giếng Phương pháp dựa trên nguyên lý DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm

) ( ) (

h chỳngõmtớn OD

mõu OD tnghiờm

- Giá trị IC50: Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC% > 50%) sẽ được chọn

ra để thử nghiệm tiếp tìm giá trị IC50 Pha mẫu theo 5 thang nồng độ, dựa vào phương trình Table curve, thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử tính ra nồng độ của chất thử nghiệm mà ở đó 50% các gốc tự do được tạo bởi DPPH, được trung hòa bởi chất thử để tính giá trị IC50: 1/y = a + blnx (y: nồng độ chất thử, x: giá trị SC (%))

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả

3.1 Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu

Mẫu lá của cây Ôrô nước (15 kg tươi), được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 3 kg bột khô

3.2 Phân lập các hợp chất Từ lá ôrô nước (Acanthus

ilicicfolius L.)

Phần lá khô của A ilicifolius (3 kg) được đem nghiền nhỏ sau đó được

chiết với MeOH ba lần Phần dịch chiết được cô quay dưới áp suất giảm để tạo thành cặn chiết MeOH (90 g) Phần cặn chiết sau đó được hòa với nước và chiết với CHCl3 thu được cặn chiết CHCl3 (15 g) và cặn nước Phần cặn chiết CHCl3 được tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường, hệ dung môi gradien hexan-axeton (từ 50:1 đến 1:2 v/v) để chia thành 5 phân đoạn F1 (1,5 g), F2 (1,0 g), F3 (4,5 g), F4 (2,0 g) và F5 (3,0 g)

Hợp chất 7 (22 mg) được kết tinh từ phân đoạn F3 với hệ dung môi

hexan-EtOAc Phân đoạn F4 được sắc ký trên cột silica gel (Φ 20 x L 600 mm) với hệ dung môi rửa giải là hexan-EtOAc (15:1) rồi kết tinh lại được hợp chất 4 (35,0 mg) Phân đoạn F5 được tiến hành sắc ký trên cột silica gel (Φ 30

x L 600 mm) sử dụng hệ dung môi hexan-EtOAc (10:1) thu được hợp chất 6

(55,0 mg)

Phần dịch chiết nước của A ilicifolius được cho qua cột sắc ký trao đổi

ion dianion HP-20 với hệ dung môi gradien H2O-MeOH (100:0 - 0:100) tạo thành các phân đoạn FW1 (15,0 g), FW2 (15,5 g), FW3 (25,0 g), FW4 (5,7 g)

và FW5 (12,4 g) Phân đoạn FW3 được tiến hành sắc ký trên cột silica gel (Φ

60 x L 600 mm) rửa giải với hệ CHCl3-MeOH-H2O (60:10:5, v/v) nhận được

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất 1 đến 7

từ cặn chiết MeOH của cây A ilicifolius

F3 (4,5 g) F4 (2,0 g)

4

(35 mg)

Silica gel CC hexan: EtOAc (10:1)

6

(55 mg)

FW2 (5,7 g)

FW3 (25,0 g)

FW4 (15,5 g)

FW5 (15,0 g)

Silica gel CC gradien hexan: axeton (50:1→ 1:1)

Sắc ký trao đổi ion, DIANION HP-20 MeOH : H 2 O (100:0 → 0:100)

Silica gel CC Sắc ký lặp lại, pha thường và pha đảo

Silica gel CC CHCl 3 -MeOH-H 2 O (60:10:5)

Cất loại dung môi

1,00); IR (KBr) νmax (cm-1): 3426 (br, OH), 2938, 2866 (CH), 1640 (C=O),

1057 (C-O-C); positive ESI-MS m/z: 661,0 [M+Na]+; negative ESI-MS m/z:

H-5′′-OCH3)

13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD): 158,14 1); 116,76 2); 131,19

(C-3); 132,01 (C-4); 131,19 (C-5); 116,76 (C-6); 130,59 (C-7); 127,00 (C-8); 176,50 (C-9); 100,50 (C-1′); 78,76 (C-2′); 78,65 (C-3′); 71,41 (C-4′); 78,69 (C-

5′); 62,39 (C-6′); 110,60 (C-1′′); 77,99 (C-2′′); 79,25 (C-3′′); 75,29 (C-4′′); 68,07 (C-5′′); 121,08 (C-1′′′); 108,46 (C-2′′′); 148,90 (C-3′′′); 142,10 (C-4′′′); 148,90 (C-5′′′); 108,46 (C-6′′′); 167,64 (C-7′′′) vµ 148,90 (2xOCH3)

4,07 (m, Hb-α), 2,81 (m, H-β); gèc caffeoyl: 7,08 (d, J = 2,0 Hz, H-2); 6,80 (d, J = 8,0 Hz, H-5); 6,97 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6); 6,29 (d, J = 16,0 Hz, H-

glucoz¬: 104,16 (C-1′); 76,16 (C-2′); 81,62 (C-3′); 70,38 (C-4′); 75,98 (C-5′); 62,34 (C-6′); rhamnoz¬: 102,98 (C-1′′); 72,03 (C-2′′); 72,31 (C-3′′); 73,77 (C-

β), 7,58 (d, J = 16,0 Hz, H-γ); glucoz¬: 4,34 (d, J = 7,5 Hz, H-1 ′); 3,33 (dd, J

= 7,5, 8,0 Hz, H-2 ′); 3,57 (dd, J = 8,0, 8,0 Hz, H-3′); 3,42 (dd, J = 8,0, 8,5

Hz, H-4′); 3,56 (m, H-5′); 4,51 (dd, J = 3,0, 12,0 Hz, Ha-6′); 4,37 (dd, J = 6,0,

12,0 Hz, Hb-6′); rhamnoz¬: 5,20 (d, J = 1,0 Hz, H-1′′); 3,42 (dd, J = 1,0, 3,0

Hz, H-2′′); 3,73 (dd, J = 3,0, 8,0 Hz, H-3′′); 3,42 (dd, J = 8,0, 7,5 Hz, H-4′′);

4,02 (m, H-5′′) vµ 1,26 (d, J = 6,0 Hz, H-6′′)

13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) δ: aglycon: 131,39 (C-1); 117,08 (C-2);

144,68 (C-3); 146,15 (C-4); 116,36 (C-5); 121,25 (C-6); 72,35 (C-α); 36,68 (C-β); gèc caffeoyl: 127,38 (C-1); 114,92 (C-2); 150,26 (C-3); 147,04 (C-4); 116,57 (C-5); 123,21 (C-6); 169,20 (C-α); 114,55 (C-β); 147,38 (C-γ);

glucoz¬: 104,39 (C-1′); 75,69 (C-2′); 83,97 (C-3′); 70,04 (C-4′); 75,42 (C-5′); 64,61 (C-6′); rhamnoz¬: 102,71 (C-1′′); 72,40 (C-2′′); 72,26 (C-3′′); 74,00 (C-

3.3.5 Hîp chÊt 5: (+)-Lyoniresinol 3a-O-β-glucopyranoside

Bét kh«ng mµu, ®iÓm ch¶y mp 178-179oC; [ ]25

D

α +22,7o (MeOH; c 1,00)

1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ: 2,63 (dd, J = 11,5, 15,0 Hz, Ha-1); 2,74 (dd, J = 5,0, 15,0 Hz, Hb-1); 1,72 (m, H-2); 3,67 (dd, J = 3,5, 11,0 Hz,

Ha-2); 3,56 (dd, J = 6,5, 11,0 Hz, Hb-2); 2,10 (m, H-3); 3,47 (dd, J = 4,0, 9,5