Nghiên cứu một số giải pháp sinh học trong công nghệ sản xuất nem chua

Những điểm mới của luận án  Sản xuất được chế phẩm từ tập hợp các chủng vi khuẩn lactic bản địa có hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp bacterioxin có tính kháng khuẩn tốt; có hoạt tí

TR ƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Phan Thanh Tâm

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GIẢI PHÁP

Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thực phẩm và đồ

uống

Mã số: 62.54.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

HÀ NỘI - 2008

Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Công nghệ Sau thu hoạch

Viện Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

Ph ản biện 3: PGS.TS Hà Thị Anh Đào - Viện Dinh dưỡng Quốc gia

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Vào hồi ….giờ … ngày … tháng … năm 2008

Có th ể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1 Phan Thanh Tam, (2003) “Study on effects of carbonhydrate‘s content

and source on lactic fermentation and sausages qualities” Proceedings

of the 8 th Asean Food Conference (AFC 03), Vol 2, p679 - 684

2 Phan Thanh Tam, Ha Hai Yen, Do Thi Hanh, Tran Lien Ha, (2005)

”Study on the Antimicrobial Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated

from nem chua (Vietnamese Fermented Meat)” Proceedings of Regional Symposium on Chemical Engineering 2005, Science and Technics Publishing House, Vol 1: Biotechnology and Food Engineering, p115-120

3 Phan Thanh Tam, Do Thi Hanh, Tran Lien Ha, Hoang Dinh Hoa, (2005) “Isolation and characterization of Lactobacillus plantarum H1.40, from Vietnamese tradition fermented meat (nem chua)” Proceedings of Regional Symposium on Chemical Engineering 2005, Science and Technics Publishing House, Vol 1: Biotechnology and Food Engineering, p121-126

4 Hoàng Đình Hòa, Phan Thanh Tâm, Phạm Thị Thu Hiền, (2006)

“Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chế phẩm từ tỏi (Allium

sativum) nhằm ứng dụng để bảo quản thực phẩm” Tuyển tập Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trường ĐHBK Hà Nội, Phân ban Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, trang 120 -125

5 Phan Thanh Tâm, Phạm Công Thành, Phạm Thị Thu Hiền, (2006)

“Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm tỏi trong công nghệ sản xuất nem chua nhằm nâng cao chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản” Tuyển

tập Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trường ĐHBK Hà Nội, Phân ban Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, trang 224 -229

6 Phan Thanh Tâm, Chử Thị Mai Phương, (2007) “Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện sinh tổng hợp bacterioxin của chủng Lactobacillus

plantarum H1.40 và các đặc tính của chúng” Tạp chí Khoa học và Công nghệ các Trường đại học kỹ thuật, số 61, trang 107-112

7 Phan Thanh Tâm, Phạm Công Thành, (2007) ”Khảo sát các yếu tố

công nghệ ảnh hưởng đến chất lượng nem chua” Tạp chí Khoa học và Công nghệ các Trường đại học kỹ thuật, số 62, trang 76 - 81

8 Hoàng Đình Hòa, Phan Thanh Tâm, (2008) “Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính thuỷ phân protein thịt cao nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua” Tạp chí Khoa học và Công nghệ

các Trường đại học kỹ thuật, số 64, trang 95 -100

9 Phan Thanh Tâm, Vũ Thị Nga, (2008) “Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua” Tạp chí Khoa học và Công nghệ các Trường đại học kỹ thuật, số 65, trang 105 - 109

1

1 Tính cấp thiết của đề tài

Các món ăn truyền thống dân tộc đang dần dần bị mai một do qui trình công nghệ sản xuất thủ công, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Trong số đó sản phẩm thịt lên men truyền thống “ nem chua “ hiện đang ở mức báo động về chất lượng do sự

ô nhiễm vi sinh vật cũng như sự lạm dụng các hóa chất bảo quản gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng Thêm vào đó hiện vẫn chưa có những tiêu chuẩn cụ thể để

ki ểm soát chất lượng cho nhóm sản phẩm này.

Hiện nay trên thế giới ngày càng quan tâm đến việc ứng dụng các thành phần kháng khuẩn có bản chất tự nhiên (Natural food antimicrobial systems) để nâng cao tính an toàn cho các sản phẩm thực phẩm, tuy nhiên ở Việt Nam vấn đề này gần như còn rất mới mẻ Chính vì vậy việc tìm ra các giải pháp như tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật có khả năng ức chế nhóm vi sinh vật gây hại, có khả năng lên men tốt, kết hợp với nguồn kháng khuẩn từ thực vật thay thế cho các hóa chất bảo quản độc hại để nâng cao chất lượng, kéo dài thời gian bảo quản cho nhóm sản phẩm này là hết sức cần thiết

2 Mục tiêu của đề tài

- Tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có khả năng lên men lactic nem chua tốt, sinh tổng hợp bacterioxin cao, thủy phân protein thịt tốt và đồng thời đóng vai trò như nguồn cung cấp probiotic cho cơ thể Kết hợp với nguồn kháng khuẩn từ tỏi nhằm nâng cao chất lượng và VSATTP cho sản phẩm này

- Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất nem chua an toàn, có tính khả thi cao,

dễ dàng áp dụng ở qui mô sản xuất vừa và nhỏ

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các sản phẩm nem chua nổi tiếng ở một số vùng miền trên cả nước được tiến hành khảo sát chất lượng và phân lập tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có đặc tính tốt Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm tỏi được thu nhận từ cùng

một giống tỏi trắng (Allium sativum) hiện đang được trồng phổ biến ở trong nước

Phạm vi áp dụng đề tài: nâng cao chất lượng cho sản phẩm nem chua (thịt lên men) ở mọi vùng miền trên cả nước, dễ dàng áp dụng ở qui mô sản xuất nhỏ, vừa, và công nghiệp

2

 Đã đưa ra những cảnh báo ban đầu về sự mất vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm nem chua trên thị trường Đó là sự ô nhiễm vi sinh vật và hàm lượng hóa chất bảo quản quá cao, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

 Đã nghiên cứu tìm ra các giải pháp, đặc biệt ứng dụng công nghệ sinh học như tìm được hỗn hợp chủng giống vi khuẩn lactic với các đặc tính sinh học tốt giúp định hướng quá trình lên men và kiểm soát được chất lượng Nguồn các hợp chất kháng khuẩn có bản chất từ thực vật (tỏi) cũng đã được khai thác sử dụng có hiệu quả Kết quả nghiên cứu một lần nữa đã chứng minh rằng trong chế biến thực phẩm không cần gia nhiệt vẫn có thể thực hiện được các qui trình sản xuất sạch và

an toàn

 Là công trình nghiên cứu tổng thể về quá trình công nghệ sản xuất nem chua, giải quyết trọn vẹn vấn đề từ khâu chủng giống đến khâu bảo quản sản phẩm và cuối cùng đề xuất một qui trình khả thi về sản xuất nem chua “an toàn “ Làm phong phú thêm khả năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn lactic

 Kết quả của đề tài là sự đóng góp tích cực trong việc xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cụ thể cho nhóm sản phẩm thịt lên men nói riêng và nhóm sản phẩm thực phẩm giàu protein lên men nói chung

5 Những điểm mới của luận án

 Sản xuất được chế phẩm từ tập hợp các chủng vi khuẩn lactic bản địa có hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp bacterioxin có tính kháng khuẩn tốt; có hoạt tính proteaza cao và hoạt tính probiotic để ứng dụng vào sản xuất nem chua

 Đã tìm được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum Inhibit Concentrate) của

ba chế phẩm tỏi đối với các vi sinh vật gây bệnh và ứng dụng có hiệu quả vào sản xuất nem chua

 Là công trình nghiên cứu có hệ thống các cơ sở khoa học cho sản xuất nem chua truyền thống ở Việt Nam nhằm nâng cao chất lượng, đảm bảo VSATTP và kéo dài thời gian sử dụng cho sản phẩm Kết quả góp phần đề xuất qui trình sản xuất

“nem chua an toàn” dễ dàng áp dụng ở các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ

6 Nội dung nghiên cứu:

1 Khảo sát đánh giá thực trạng chất lượng nem chua về thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm

3

hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn bacterioxin, có hoạt tính proteaza cao và tiềm năng probiotic nhằm ứng dụng làm chủng giống trong công nghệ sản xuất nem chua

3 Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm từ tỏi và ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua

4 Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ sản xuất nem chua ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt, chế phẩm tỏi và tối ưu các yếu

tố công nghệ nhằm nâng cao chất lượng và đảm bảo VSATTP

7 Cấu trúc của luận án

Luận án được trình bày trong 167 trang đánh máy gồm 3 chương với 52 bảng, 82 hình, đồ thị Phần kết luận, 149 tài liệu tham khảo, phụ lục

B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Thịt lên men và nem chua: Phân loại; Những biến đổi và sự chuyển hóa xảy ra

trong quá trình lên men thịt; Nem chua sản phẩm thịt lên men nổi tiếng Việt Nam và thực trạng vấn đề VSATTP của sản phẩm

1.2 Các giải pháp nâng cao chất lượng sản phẩm thịt lên men và nem chua

1.2.1 Ảnh hưởng các yếu tố công nghệ đến chất lượng sản phẩm thịt lên men, nem chua và giải pháp tối ưu các yếu tố

1.2.2 Giải pháp sử dụng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt trong công nghệ sản xuất thịt lên men và nem chua

Sử dụng bộ chủng giống vi sinh vật có lợi; vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacterioxin; vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza cao thuỷ phân protein thịt tốt; vai trò probiotic của vi khuẩn lactic và ứng dụng trong thịt lên men; Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic ứng dụng trong sản xuất thịt lên men

để từ đó tìm được các yếu tố cho chất lượng sản phẩm tốt nhất là một lời giải hết sức

có ý nghĩa và có tính khả thi trong điều kiện hiện tại

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Các mẫu nem chua dùng để phân lập vi khuẩn lactic cũng như để xác định thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng và vi sinh vật được thu thập từ một số cơ sở sản xuất có uy tín ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Thanh Hoá, và Vinh

Nguyên liệu tỏi được nghiên cứu là giống tỏi trắng hiện được trồng phổ biến

ở Việt Nam Bao bì PE sản xuất trong nước, sẵn có trên thị trường

Các chủng vi khuẩn chỉ thị: Lactobacillus plantarum JCM 1149 (Bộ sưu tập

giống của Nhật Bản), Chủng Lactococcus lactis subsp lactis ATCC 11454 (Bộ sưu tập giống của Mỹ) có khả năng sinh tổng hợp nisin [84]; Staphylococcus aureus ATCC 25923; Bacillus cereus ATCC10876; Listeria monocytogens 0704 (ĐH

Toulouse, Pháp); Ercherichia coli K12TG1 (Đại Học ENSBANA - Pháp); Salmonella typhimurium VSDTTW (Viện Vệ sinh dịch tễ TW)

2.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: MRS (Man Rogosa Sharpe), MPA (Meat Pepton Agar), OGYA (Oxytetracycline Glucose Yeast Agar); Staphylococcus aureus 110 (Difco); VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar); Glucoza Agar; …

2.1.2 Thiết bị

Nồi khử trùng, tủ cấy, tủ nuôi yếm khí (Nhật); tủ lạnh sâu (Nhật); Kính hiển

vi điện tử quét SEM: JCM- 4510LV (Nhật); Ly tâm lạnh ống to Sorvall Super T21 (Mỹ); Máy so màu quang phổ (Anh); Sấy chân không Vacutherm Heraeus

5

Shimadzu (Nhật); Thiết bị đo cấu trúc Texture Analysis RTC 1250 (Nhật),

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp vi sinh học

- Các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông dụng

Xác định số lượng Enterobacteriaceae theo phương pháp chuẩn F18 của Anh [77]; Số lượng S aureus theo phương pháp PCR theo [88], [94] Xác định vi sinh vật gây bệnh

2.2.2 Phương pháp hóa lý, hóa sinh

- Phân tích thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng theo TCVN; …

- Xác định hàm lượng nitrit trong nem chua theo AOAC 937.31; xác định nitrat theo TCVN 5247-1990

- Xác định hàm lượng axit amin tự do theo phương pháp đo mầu trực tiếp với ninhydrin [5]

- Đo cấu trúc (độ chắc) các mẫu nem chua bằng thiết bị đo cấu trúc Texture Analysis RTC 1250 (Nhật) với đầu đo Spherical Probes loại P/5S [63]

- Xác định hàm lượng histamin trong dịch nuôi cấy vi khuẩn và trong nem chua bằng HPLC theo phương pháp [3], [59], [63]

- Xác định thành phần các hợp chất kháng khuẩn của tỏi bằng GC-MS và HPLC theo phương pháp của Lawson [20], [93], [110]

2.2.3 Phương pháp toán học thực nghiệm: theo ma trận trực giao cấp 2, kết quả

được xử lý bằng phần mềm Nemrod 2000 và Design Experd 7.1.3

2.2.4 Phương pháp đánh giá cảm quan: theo phương pháp cho điểm chất lượng

tổng hợp của sản phẩm theo TCVN 3215-79 [26]

6

3.1 Khảo sát đánh giá thực trạng chất lượng nem chua về thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm

3.1.1 Thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng các mẫu nem chua

Tiến hành khảo sát 10 mẫu nem chua ở các thành phố lớn như Hà Nội, Thanh Hóa, Vinh và TP Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy hàm ẩm đa số các mẫu nem chua đều rất cao từ 62,83 - 71,01% cho thấy nem chua là sản phẩm thịt lên men nhanh và

có hàm ẩm cao nên việc kiểm soát chất lượng sản phẩm này là không hề dễ dàng Hàm lượng protein tổng số: 18,61 - 22,42%; Lipit: 2,61- 4,48 %; Gluxit:1,87 - 5,91

%; axit amin tự do: 259,33 - 368,63 mg/ 100g cho thấy quá trình lên men tạo thành các peptit và các axit amin dễ tiêu hóa hơn và tạo nên mùi vị đặc trưng cho sản phẩm; đạm amoniac NH 3 : 31,63 - 40,60 mg/ 100g sản phẩm, là chỉ tiêu gián tiếp đánh giá quá trình lên men không mong muốn bởi các vi sinh vật có hại Kết quả cho thấy nem chua có thành phần dinh dưỡng khá hài hòa, đặc biệt cung cấp một lượng axit amin tự

do khá cao nhờ quá trình thủy phân protein thịt

3.1.2 Khảo sát một số chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm các mẫu nem chua

3.1.2.1 Khảo sát hàm lượng muối bảo quản nitrat và nitrit trong các mẫu nem chua

Hình 3.1 Tổng hàm lượng muối nitrat, nitrit (tính theo nitrit) và muối

nitrit trong các mẫu nem chua (ppm)

HN1, HN2,HN3: Nem chua Hà Nội; Vinh: Nem chua ở Vinh-Nghệ An

TH1, TH2,TH3:Nem chua Thanh Hoá; HCM1, HCM2:Nem chua TPHồ Chí Minh NC: Nem chua nghiên cứu có sử dụng 365ppm NaN03 theo QĐ Bộ Y tế

7

phương lớn trong cả nước đều có hàm lượng muối nitrat, nitrit vượt quá nhiều lần qui định cho phép hiện đang áp dụng ở Việt Nam và đa số các quốc gia khác Mẫu cao nhất có tổng lượng nitrat và nitrit tính theo nitrit là 1564 ppm gấp gần 10 lần quy định của EU [63], [134] và 12 lần theo TCVN, trong đó riêng hàm lượng nitrit

là 683 ppm gấp 5 lần qui định EU và gấp gần 6 lần TCVN 7050-2002 [19]

3.1.2.2 Khảo sát thành phần một số loại vi sinh vật trong các mẫu nem chua

Kết quả 10/10 mẫu nem chua khảo sát ở các địa phương đều không đạt chỉ tiêu

về vi sinh vật, đặc biệt Enterobacteriaceae (10 4

-106 CFU/ g sản phẩm) và S aureus (10 3 - 10 5 CFU/ g sản phẩm) gấp vài chục đến hàng trăm lần cho phép theo tiêu chuẩn hiện đang áp dụng ở một số nước như Ailen [71] hay Úc và Niuzilân [72]

3.2 Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic từ nem chua có các đặc tính sinh học

t ốt: sinh tổng hợp bacterioxin, có hoạt tính thủy phân protein thịt tốt, có tiềm năng probiotic cao nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua

3.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin

và đặc tính của chúng

3.2.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin

Từ 108 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua có khả năng lên men lactic

tốt, sinh axit cao lựa chọn được 20 chủng có khả năng kháng cao với L plantarum

JCM 1149 Trong số đó có 12 chủng có khả năng kháng cao với 5 loại vi sinh vật gây

bệnh: S aureus ATCC 25923, S typhimurium VSDTTW, L monocytogen 0704, E

coli K12TG1 và B cereus ATCC 10876 theo phương pháp cấy chấm điểm Bằng phương pháp khuyếch tán thạch và loại trừ tác dụng của a xit, chỉ có 3 trong số đó có khả năng kháng với một số vi sinh vật gây bệnh và chủng H1.40 có khả năng kháng

cao nhất với cả 5 loại vi sinh vật gây bệnh nói trên (thể hiện ở hình 3.2 đến 3.5)

Thí nghiệm khẳng định khả năng sinh bacterioxin (hình 3.8) của hai chủng

H1.40 và chủng L lactis subsp lactis ATCC 11454 (chủng trong ngân hàng giống

của Mỹ được khẳng định có sinh nisin) cho thấy dịch nuôi cấy có chứa các thành phần kháng khuẩn của hai chủng này mất hoạt tính khi bị thuỷ phân bởi enzym proteaza K,

vì vậy có thể khẳng các thành phần kháng khuẩn này có bản chất là protein

Ảnh tế bào và khuẩn lạc chủng H1.40 thể hiện hình 3.9 và 3.10 cho thấy tế bào

có hình dạng que, sắp xếp đôi hoặc chuỗi Các đặc tính khác là: Gram (+), Catalaza (-), Sinh khí lên men glucoza (-); Định tên bằng kit API 50CHL (BioMérieux, France)

cho thấy chủng H1.40 thuộc loài L plantarum với độ tương đồng đạt 99,99%

ATCC 11454

Ghi chú:1,2: Vòng kháng S aureus của dịch nuôi cấy chủng ATCC11454 và H1.40; 3,4: enzym proteaza K+ dịch nuôi cấy chủng H1.40 và ATCC 11454 không có vòng

kháng với S aureus

Đặc điểm khuẩn lạc và hình dạng tế bào của chủng H1.40

Hình 3.9 Khu ẩn lạc chủng H1.40 Hình 3.10 Tế bào chủng H1.40 x 15.000

9

chủng H1.40 và ATCC 11454

Hai chủng vi khuẩn lactic H1.40 và ATCC11454 được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng, nhiệt độ 30 o C Động học sinh trưởng, khả năng lên men và sinh tổng hợp bacterioxin được thể hiện các hình 3.13 và 3.14 cho thấy cả hai chủng đều

có khả năng lên men chuyển hóa tốt thể hiện pH môi trường đạt 3,6 -3,8 sau 40 giờ nuôi cấy Hoạt lực bacterioxin cả hai chủng đạt cao nhất ở cuối pha logarit, bắt đầu chuyển sang pha cân bằng với chủng H1.40 là 384 AU/ml sau 24 giờ và chủng ATCC

11454 là 532 AU/ml sau 16 giờ nuôi cấy

0 1.5 3.0 4.5 6.0 7.5 9.0

3.2 1.3 Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp bacterioxin chủng H1.40 và ATCC 11454

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của hai chủng H1.40 và ATCC 11454 bằng ma trận Hadamard, và tiến hành tối ưu hóa bằng

ma trận thực nghiệm trực giao cấp 2 Kết quả xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu

sinh tổng hợp bacterioxin đối với chủng H1.40 là hàm lượng glucoza là 27 g/l, pH ban

đầu 7,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 33 o C và ở điều kiện này hoạt lực bacterioxin tăng lên: 547/384 = 1,42 lần Đối với chủng ATCC11454 là hàm lượng peptone là 15 g/l, pH ban đầu 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 31 o C, ở điều kiện này hoạt lực bacterioxin tăng lên: 678/532 = 1,27 lần

3.2.1.4 Thu hồi bacterioxin hai chủng H1.40 và ATCC 11454 bằng kết tủa sunphat amôn

Kết quả bảng 3.12 cho thấy nồng độ sunphat amôn thích hợp để thu hồi bacterioxin cao nhất đối với chủng H1.40 là 60% và đối với chủng 11454 là 40% ( Kết tủa được hòa vào dung dịch đệm pH = 6,0 với H1.40 và pH = 2,5 với chủng 11454)

3.2.1.5 Nghiên cứu một số đặc tính bacterioxin của hai chủng H1.40 và 11454

- Hoạt tính bacterioxin của cả hai chủng đều bền ở pH từ 2 đến 6, giảm một chút ở

pH 7 và giảm mạnh ở pH 8 và mất hẳn ở pH 9 và 10

- Bacterioxin của cả hai chủng đều bền ở nhiệt độ 60 o

C - 80oC; ở 100 -121 o C hoạt tính bacterioxin giảm theo thời gian và gần như mất hẳn sau 30-60 phút

- Khi bảo quản hoạt tính bacterioxin của cả hai chủng này đều rất bền ở -20 o

C, khá bền ở 4 o C và ít bền ở nhiệt độ 30 o

C

- Môi trường NaCl 2% và NaNO 2 200ppm không ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của chủng H1.40 nhưng có ảnh hưởng ít nhiều đến chủng ATCC 11454 (làm trễ thời gian sinh tổng hợp cao nhất của chủng) thể hiện ở hình 3.15 và 3.16

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72

Thời gian(h)

OD0 pH0 (AU/ml) 0 OD1 pH1 (AU/ml) 1

OD

0 120 240 360 480 600 720

0 1.5 3.0 4.5 6.0 7.5 9.0

840

Hình 3.15 Ảnh hưởng của NaCl và

NaNO 2 đến khả năng sinh trưởng và

sinh tổng hợp bacterioxin của chủng

11

thịt nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua

3.2.2.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng thuỷ phân protein chất cơ và protein sợi cơ thịt

Từ 20 chủng vi khuẩn lactic kháng khuẩn tốt được phân lập từ nem chua (kết quả phần 3.2.1.1), tiến hành tuyển chọn chủng có khả năng thuỷ phân protein chất cơ thịt (sarcoplasmic proteins) và protein sợi cơ (myofibrillar proteins) Kết quả cho thấy trong số 20 chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn tốt có 12 chủng có khả năng thuỷ phân protein chất cơ, 8 chủng có khả năng thủy phân protein sợi cơ và trong đó 3 chủng có khả năng thuỷ phân cả hai loại protein mô cơ thịt tốt (thể hiện vòng không bắt mầu thuốc nhuộm Coomassi Brilliant Blue xunh quanh khuẩn lạc), đó là các chủng H1.3, H1.4 và H1.25 Kết quả được thể hiện rõ ở các hình 3.17 và 3.18:

Hình 3.17 Đường kính vòng thuỷ phân protein chất cơ

(sarcoplasmic proteins) của các chủng vi khuẩn lactic

Hình 3.18 Đường kính vòng thuỷ phân protein sợi cơ

(myofibrillar proteins)của các chủng vi khuẩn lactic

3.2.2.2 Điện di protein SDS-PAGE sản phẩm thuỷ phân protein sợi cơ thịt (myofibrillar proteins) bởi dịch chiết tế bào các chủng vi khuẩn lactic

Kết quả điện di protein SDS-PAGE sản phẩm thuỷ phân protein sợi cơ thịt bởi dịch chiết tế bào 3 chủng H1.3, H1.4, H1.25 được thể hiện trên hình 3.19 cho thấy các giếng 1,2,3 chứa sản phẩm protein sợi cơ đã bị thuỷ phân bởi hệ enzym proteaza của

chiết tế bào vi khuẩn lactic

Ghi chú: Giếng 1,2,3: SP thuỷ phân protein sợi cơ của dịch chiết tế bào chủng H1.3, H1.4, H1.25; Giếng 4: Dịch chiết protein sợi cơ thịt; Giếng 5:

Protein chuẩn

Bằng phương pháp Ason cải tiến xác định hoạt lực proteaza cho thấy chủng H1.4 có hoạt lực cao nhất (0,170 U/ml) được lựa chọn Chủng này có khả năng sinh tổng hợp proteaza cao nhất ở điều kiện nuôi cấy pH = 6, nhiệt độ 30 o C Môi trường có NaCl 2% và NaNO 2 200ppm không ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym proteaza của chủng này

Kết quả định tên đến loài chủng H1.4 bằng Kit API 50CHL Medium (BioMérieux, France) cho thấy chủng H1.4 là chủng L plantarum H1.4 với độ tương

đồng 99,9%

3.2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic cao

Từ hơn 108 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua tuyển chọn được 83/108 chủng (76,85%) có khả năng sống sót trong môi trường pH 2,5 và muối mật 1% sau 3 giờ và 75/108 chủng (69,44%) sau 24 giờ

Từ 75 chủng trên đã tuyển chọn được 64/75 chủng có khả năng sống sót trong môi trường PBS (có pH 2,5 và nghèo dinh dưỡng) sau 3h

Xác định nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) muối mật với các chủng tuyển chọn được

Tiến hành xác định khả năng sống sót trên môi trường MRS có nồng độ muối mật từ 1- 4% của 64 chủng trên, có 6 chủng chịu được nồng độ muối mật đến 4% (hình 3.23) trong đó chủng II7.4 vừa có khả năng chịu muối mật cao đến 4% và có tỷ

lệ sống sót cao nhất khi qua môi trường PBS (89,93%) (hình 3.24) được lựa chọn làm nguồn chủng giống có tiềm năng probiotic cao

13

6 6.5 7 7.5

I1.2 I2.2 I2.3 I3.1 I3.2 II7.4

Ảnh hưởng của NaCl và muối bảo quản NaNO 2 đến sự sinh trưởng, khả năng lên men

và hoạt tính của chủng II7.4

Môi trường nuôi cấy có NaCl 2% và NaNO 2 200ppm không ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng và đặc tính probiotic của chủng II7.4

Kết quả định tên đến loài chủng II7.4 bằng Kit API 50CHL Medium (BioMérieux, France) cho thấy chủng II7.4 là chủng L plantarum II7.4 với độ tương đồng 99,9%

3.2.4 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua

Đã xác định cả 4 chủng H1.40, 11454, H1.4 và II7.4 không có sự tương tác

ức chế lẫn nhau và đều không sinh histamin nên có thể ứng dụng làm chủng giống trong sản xuất nem chua Nghiên cứu sản xuất chế phẩm 4 chủng vi khuẩn lactic riêng

rẽ đã lựa chọn được thành phần chất mang phù hợp với quá trình sấy chân không cho

cả 4 chủng là: Sữa bột gầy/ glucoza/ thính là 10/ 20/ 70 với chế độ sấy chân không là

40o C sau 2 giờ, độ ẩm các chế phẩm đạt 7,82 - 8,02%, tỷ lệ tế bào sống sót là 36,45 - 41,71% Chế phẩm các chủng sau sấy có mật độ từ 10 9 - 10 10 CFU/ g chế phẩm và bảo tồn được hoạt tính sinh học của các chủng

3.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chế phẩm tỏi và ứng dụng trong sản xuất nem chua

Hoạt tính kháng các vi sinh vật gây bệnh của các chế phẩm tỏi: dịch chiết tỏi tươi, bột tỏi và dầu tỏi được xác định bằng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả cho thấy các chế phẩm tỏi có khả năng ức chế

14

đặc biệt chúng ức chế tốt các vi khuẩn gram (-), các nấm men gây hại… kết quả được thể hiện ở các bảng 3.31, 3.32, 3.33 và các hình 3.37 đến 3.40

3.3.1 Khả năng kháng khuẩn dịch chiết tỏi tươi

Bảng 3.31 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) của dịch chiết nước tỏi tươi

(AGE) với các vi sinh vật kiểm định (10 4 CFU/ ml) Thời gian,

10 ngày 20 ngày 30 ngày

I II III I II III I II III

I: AGE ở nhiệt độ thường; II: AGE ở 4 o C; III: AGE ở -20 o C

3.3.2 Khả năng kháng khuẩn tỏi bột

Bảng 3.32 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) của bột tỏi với các vi sinh vật

kiểm định (10 4 CFU/ ml) Thời gian bảoquản (tháng)

15

Hình 3.37 Hoạt tính kháng

L monocytogenes của tỏi bột Hình 3.38 E coli của tỏi bột Hoạt tính kháng

Hình 3.39 Hoạt tính kháng

S typhimurium của tỏi bột Hình 3.40 Hoạt tính kháng nấm men LĐ 4.2 của tỏi bột

3.3.3 Khả năng kháng khuẩn dầu tỏi

Bảng 3.33 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (mg/ ml) của dầu tỏi với các vi sinh vật

E coli K12TG1 0,4 S aureus ATCC 25923 0,7

B cereus ATCC 10876 0,2 Nấm men LĐ 4.2 0,1

L monocytogenes 0704 0,5 Nấm men TX 4.2 0,15

S typhimurium VSDTTW 0,5 L plantarum H1.40 1,2

3.3.4 Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm tỏi và sản xuất nem chua

Từ kết quả MIC của các chế phẩm tỏi với các vi sinh vật gây bệnh và với kết quả phân tích số lượng các loại vi sinh vật này hay gặp trong nem chua, tiến hành bổ sung các chế phẩm tỏi vào nem chua với hàm lượng: tỏi tươi (1-5%); tỏi bột (0,5-1,5%); dầu tỏi (0,02-0,06%) Kết quả cho thấy các chế phẩm tỏi đều không ảnh hưởng đến quá trình lên men nem chua Đã lựa chọn được hàm lượng chế phẩm tỏi phù hợp và

có khả năng ức chế tốt các vi sinh vật gây hại trong nem chua là: tỏi tươi 2%; tỏi bột:1,5%; dầu tỏi: 0,04%, trong đó tỏi bột được đánh giá cao nhất

lượng Enterobacteriaceae, S aureus, và nấm mốc được xác định tại các thời điểm lên

men Kết quả lựa chọn được thời gian lên men cho chất lượng tốt nhất là sau 30 giờ và mẫu bao gói PE hút chân không có chất lượng tốt nhất do có quá trình lên men lactic yếm khí triệt để

3.4.2 Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm lactic sinh bacterioxin và chế phẩm tỏi bột trong môi trường nem chua

Số lượng S aureus

4 5 6 7 8 9 10

Hình 3.63 Số lượng E coli trong các

mẫu nem chua có và không bổ sung vi

khuẩn gây bệnh và các chế phẩm

Hình 3.64 Số lượng S aureus trong các mẫu nem chua có và không bổ sung

vi khuẩn gây bệnh và các chế phẩm

Ghi chú: Mẫu 1: mẫu nem chua lên men tự nhiên (không bổ sung gì); Mẫu 2: Bổ sung E coli 10 6

CFU/ g và S aureus 10 6 CFU/ g; Mẫu 3: Bổ sung E coli 10 6 CFU/ g; S aureus 10 6 CFU/ g và chế phẩm tỏi 1,5%; Mẫu 4: Bổ sung E coli 10 6 CFU/ g; S aureus 10 6 CFU/ g và hai chế phẩm vi khuẩn

lactic sinh bacterioxin mỗi loại 10 6 CFU/ g;

Mẫu 5: Bổ sung E coli 10 6 CFU/ g; S aureus 10 6 CFU/ g; chế phẩm tỏi 1,5% và hai chế phẩm vi

khuẩn lactic sinh bacterioxin mỗi loại 10 6 CFU/ g;

Tiến hành bổ sung vi sinh vật gây bệnh, vi khuẩn lactic sinh bacterioxin và chế phẩm bột tỏi vào 5 mẫu nem chua Kết quả cho thấy khá rõ nét vai trò kháng khuẩn

17

chế các vi sinh vật gây bệnh Chế phẩm tỏi có vai trò ức chế ngay từ thời điểm ban đầu và ức chế cả nhóm vi khuẩn Gram (+) và làm giảm rõ rệt nhóm Gram (-) như

Enterobacteriaceae và E.coli , trong khi đó nhóm vi khuẩn lactic có vai trò ức chế

mạnh nhóm vi khuẩn Gram (+) như S aureus , B cereus và C perfringenes và khả

năng ức chế kéo dài trong thời gian bảo quản Hỗn hợp hai loại chế phẩm này có tác dụng đồng phối hợp nên mang lại hiệu quả ức chế rất hiệu quả Kết quả thể hiện rõ hình 3.63 và 3.64

3.4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nem chua

Nem chua là một hỗn hợp nhiều cấu tử rắn và không thể thanh trùng trước khi lên men nên chất lượng bị ảnh hưởng đồng thời của rất nhiều yếu tố Kết quả khảo sát bằng ma trận Hadamard với 7 yếu tố và 8 hàm mục tiêu chất lượng nem chua đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng nhất đó là: Hàm lượng chế phẩm vi khuẩn lactic, hàm lượng glucoza, hàm lượng nitrit, hàm lượng muối ăn, hàm lượng bột tỏi, và nhiệt độ lên men Và 4 yếu tố ảnh hưởng nhất (hàm lượng chế phẩm, hàm lượng glucoza, hàm lượng nitrit và nhiệt độ lên men ) được tiến hành tối ưu hóa bằng ma trận thực nghiệm qui hoạch trực giao cấp 2

3.4.4 Tối ưu hóa các yếu tố công nghệ trong sản xuất nem chua

Ma trận qui hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 được thiết kế với 4 biến (nhiệt độ lên men; hàm lượng glucoza; hàm lượng NaNO 2 ; và hàm lượng chế phẩm vi khuẩn lactic) và 8 hàm mục tiêu chất lượng nem chua Kết quả tìm được hàm mục chất lượng nem chua phụ thuộc vào các biến yếu tố như sau:

Phương trình hồi quy hàm pH:

Y 1 (pH) = 4,58 - 0,25X1+ 0,049X3 - 0,13X4 + 0,011X 1 - 0,033X 2 - 0,033X 3 -

0,10X4 - 0,044X1 X 2 - 0,031X 1 X 3+ 0,11X1 X 4 + 0,019X 2 X 3 + 0,031X 2 X 4 ;

Hệ số tương quan bội R 2 = 0,9717;

Phương trình hồi quy hàm axit amin tự do (mg/100g):

Y 2 (axit amin tự do) = 405,55 + 15,10X1 - 1,08X 2 + 4,81X 3+ 9,84X4 - 7,96X 1 -

15,79X2 - 7,96X 3 + 7,57X 4 - 9,76X1 X 2 - 5,61X 1 X 3 - 1,67X 1 X 4 - 0,51X 2 X 3 + 4,77X 2 X 4 + 14,96X3 X 4 ; Hệ số tương quan bội R2 = 0,8742 ;

Phương trình hồi quy hàm lượng NH 3 (mg/ 100g):

18

0,94X 3 X 4 ; Hệ số tương quan bội R2 = 0,8715 ;

Phương trình hồi quy của hàm cấu trúc (g):

Y 4 (Cấu trúc) = +374,19 +92,8X1 + 10,39X 2 + 5,68X 3 - 5,88X 4 + 25,14X 1 21,75X 2 + 74,91X3 -54,42X42 + 3,59X 1 X 2 + 23,41X 1 X 3 - 2,88X 1 X 4 + 21,66X 2 X 3 + 9,22X 2 X 4 - 4,34X 3 X 4 ; Hệ số tương quan bội R2 = 0,9064 ;

-Phương trình hồi quy hàm cảm quan:

Y 5 (cảm quan) = 17,76 + 1,16X1 + 0,26X 2 + 0,42X3 + 0,39X4 - 0,4X 1 - 0,83X2 + 0,18X 3 - 0,83X4 - 0,24X 1 X 2 - 0,13X 1 X 3 + 0,058X 1 X 4 – 0,15X 2 X 3 + 0,26X 2 X 4 + 0,29X 3 X 4 ; Hệ số tương quan bội R 2 = 0,9105 ;

Phương trình hồi quy hàm Enterobacteriaceae (log CFU/ g):

Y 6 (Enterobacteriaceae) = 3,6 - 0,26X1 + 0,045X 2 - 0,32X3 - 1,06X4 - 0,041X 1 +

0,64X2 - 0,073X 3 + 0,3X 4 + 0,2X 1 X 2 - 0,021X 1 X 3 + 0,091X1 X 4 - 0,034X 2 X 3 - 0,29X 2 X 4 + 0,4X3 X 4 ; Hệ số tương quan bội R2 = 0,9090;

Phương trình hồi quy hàm Staphylococcus aureus (log CFU/ g):

Y 7 (S aureus) = 2,82 - 0,31X1 - 0,19X2 - 0,22X3 - 0,58X4 + 0,35X1 + 0,3X2 +

0,3X3 + 0,38X4 - 0,02X 1 X 2 + 0,041X 1 X 3 - 0,26X1 X 4 - 0,14X 2 X 4 + 0,21X3 X 4 ;

Hệ số tương quan bội R 2 = 0,9121;

Phương trình hồi quy hàm nấm mốc (log CFU/ g):

Y 8 ( Nấm mốc ) = 3,01 - 0,059X1 + 0,059X 2 - 0,17X3 - 0,020X 4 + 0,013X 1 X 2 -

0,15X1 X 3 + 0,19X1 X 4 - 0,11X2 X 4 + 0,05X 3 X 4 ;

Hệ số tương quan bội R 2 = 0,8551;

Bằng phần mềm Design Experd tối ưu hóa chập mục tiêu, kết quả cho hàm chập mục tiêu D = 0,866 thể hiện hình 3.65 cho chất lượng nem chua thỏa mãn cao nhất các chỉ tiêu và giá trị các biến cũng như giá trị các hàm mục tiêu được thể hiện ở các bảng 3.40 và 3.41

Bảng 3.40 Giá trị các biến tại giá trị tối ưu Các biến X 1 (Nhiệtđộ) X 2 (Glucoza) X 3 (Nitrit) X 4 (Chế phẩm)

Giá trị biến mã hóa 0,38 0,08 1,00 0,29 Giá trị biến thực 31oC 1,5% 150 ppm 6x106 tb/g

100g)

Cấu trúc (g)

Cảm quan

teriaceae

Enterobac-(logCFU/g)

S aureus

(logCFU/g)

N ấm mốc (logCFU/g)

4,46 412,06 27,07 500 18,83 2,95 2,72 2,78

1 1 1 1 0.887967 0.880694 1 1 1 0.973369 0.954023 0.478895

0.866008

Desirability

A B C D pH Aa NH3 Luc Camquan Entero Staphy Moc Combined

Hình 3.65 K ết quả hàm chập mục tiêu D (Desirability) với phương án tối ưu 3.4.5 Nghiên cứu chế độ bảo quản nem chua

Tiến hành làm mẫu nem chua theo các yếu tố đã được tối ưu, mẫu được bao gói bằng PE có hút chân không (TƯ-PE) và mẫu gói bằng lá chuối (TƯ-LC) Mẫu đối chứng không bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic và bột tỏi, được gói bằng lá chuối và

ký hiệu là (ĐC), nhiệt độ lên men 31 o C Sau 30 giờ lên men các mẫu được bảo quản ở

3 điều kiện: nhiệt độ môi trường; 10 o

C và 2oC Tiến hành phân tích các chỉ tiêu sau hóa lý, cảm quan, vi sinh vật tại thời điểm 30 giờ lên men và sau thời gian bảo quản 5,

10, 15, 20 và 30 ngày, đồng thời so sánh với mẫu nem chua trên thị trường Hà Nội (HN) có cùng thời gian lên men, kết quả thể hiện bảng 3.42, 3.43

Kết quả cho thấy chất lượng các mẫu nem chua sau thời gian 30 giờ lên men (thời điểm kết thúc quá trình lên men và đạt độ chín “ sinh hóa “ có thể sử dụng) có sự khác biệt giữa các mẫu Các mẫu tối ưu là (TƯ-PE), (TƯ-LC) có quá trình lên men tốt

pH giảm nhanh, mẫu (ĐC) có pH giảm chậm và hàm lượng đạm amoniac cao hơn hẳn Về chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh 2 mẫu (TƯ-PE) và (TƯ-LC) thấp hơn hẳn đặc

20

theo Ailen [71], Úc và Niuzilân [72] do được cấy hệ vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn cao và chế phẩm bột tỏi vì vậy 2 mẫu này cũng có hàm lượng NH 3 thấp nhất và axit amin tự do cao nhất (do vai trò vi khuẩn lactic thủy phân protein thịt cao) Đối với

2 mẫu (HN) và (ĐC) chỉ tiêu về vi sinh vật đều vượt ngưỡng cho phép (10 4 đến 10 6 CFU/ g ) gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng (bảng 3.43)

Bảng 3.42 Đánh giá chỉ tiêu hóa lý và cảm quan các mẫu nem chua sau

30 giờ lên men và sau thời gian bảo quản

Tổng số vi khuẩn lactic (log CFU/ g SP)

22

ch ế phẩm tỏi và tối ưu các yếu tố công nghệ

Hình 3.74 Qui trình công nghệ sản xuất nem chua sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học, chế phẩm tỏi và tối ưu hóa các yếu tố

Bao gói PE hút chân không, h oặc lá chuối

Bảo quản ở 2 o C, thời hạn sử dụng ít nhất 30 ngày Lên men 31 o C, 30 giờ

Thái miếng

Xay nhuyễn Glucoza 1,5%

NaCl 1,2% Thính 2,0% Bột tỏi 1,5% NaNO 2 150ppm VTM C 500 ppm Chế phẩm BIO-NC 6x10 6 CFU/ g

23

1 Khảo sát sơ bộ chất lượng sản phẩm nem chua ở một số thành phố lớn trên

cả nước cho thấy có sự ô nhiễm vi sinh vật ở ngưỡng rất cao đặc biệt

S aureus (103 - 105 CFU/ g SP) và Enterobacteriaceae (104 - 106 CFU/ g SP) Hàm lượng hóa chất bảo quản NaNO 3 , NaNO 2 của các mẫu đều vượt ngưỡng cho phép rất nhiều lần (gấp 5-10 lần)

2 Tuyển chọn được bộ chủng giống vi khuẩn lactic có các hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua gồm có:

- Chủng L plantarum H1.40 sinh tổng hợp bacterioxin có phổ kháng khuẩn được nhiều loại vi sinh vật gây bệnh hay gặp trong thực phẩm: S typhimurimum, S aureus, B cereus, L monocytogens, E coli,…

- Chủng L plantarum II7.4 có tiềm năng probiotic cao

- Chủng L plantarum H1.4 có hoạt tính proteaza thuỷ phân protein thịt

tốt

Các chủng đều có khả năng lên men lactic tốt, chống chịu được môi trường có NaCl và NaNO 2 của nem chua

Điều kiện nuôi cấy tối ưu để nâng cao khả năng sinh tổng hợp

bacterioxin của chủng L plantarum H1.40 là môi trường MRS với hàm

lượng glucoza là 27g/l; pH ban đầu 7,5; nhiệt độ nuôi cấy 33 o C và đối với

chủng L Lactis subsp lactis ATCC 11454 là môi trường MRS với hàm

lượng pepton là 15g/l; pH ban đầu 6,5; nhiệt độ nuôi cấy 31 o C Đã nghiên cứu một số đặc tính của các bacterioxin này là tương đối bền nhiệt; bền ở

pH từ 2 - 6; và bền khi bảo quản ở điều kiện - 20 o C Điều kiện nuôi cấy

chủng L plantarum H1.4 sinh tổng hợp proteaza cao là môi trường MRS, pH

ban đầu là 6,0 và nhiệt độ nuôi cấy là 30 o

C

3 Chế phẩm các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học ứng dụng vào sản xuất nem chua được sản xuất với thành phần chất mang phù hợp là thính gạo rang 70%, sữa bột gầy 10%, glucoza 20% Chế độ sấy thích hợp là sấy chân không 40oC trong thời gian 2 giờ, độ ẩm cuối cùng chế phẩm < 8%, mật độ tế bào sống sót 10 9

- 1010 CFU/ g chế phẩm Sau 6 tháng bảo quản ở

- 20oC hoạt tính của chế phẩm giảm không đáng kể

24

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với các vi sinh vật gây bệnh của tỏi tươi (Aqueous Garlic Extract) là 7,8 ÷ 15,6mg/ ml; tỏi bột (Garlic Powder) là 1,76 ÷ 3,47 mg/ ml và dầu tỏi (Garlic Oil) là 0,1 ÷ 0,7 mg/ ml Chế phẩm bột tỏi 1,5% cho hiệu quả khá tốt khi ứng dụng vào sản xuất nem chua

5 Bằng lời giải bài toán 8 mục tiêu với 7 yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm trong quá trình sản xuất nem chua, đã tìm được điều kiện chung mà tại đó kỳ vọng của người sản xuất muốn sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất là: Hàm lượng glucoza 1,5%; hàm lượng muối bảo quản NaNO 2 150 ppm; hàm lượng bột tỏi 1,5%; chế phẩm khuẩn lactic BIO-NC với mật độ là 6 x

106CFU/g sản phẩm gồm 4 chủng (H1.40/ 11454/ H1.4/ II7.4 với tỷ lệ 1/ 1/ 1/ 1); nhiệt độ lên men 31 o C; thời gian lên men 30 giờ; bao gói bằng túi PE hút chân không (hoặc lá chuối) và chế độ bảo quản nem chua tốt nhất là ở

2oC sau 30 ngày vẫn cho chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu

6 Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất nem chua an toàn có sử dụng các chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học, chế phẩm tỏi và tối ưu các yếu tố công nghệ Chất lượng nem chua sản xuất theo qui trình nghiên cứu đạt yêu cầu về VSATTP, đặc biệt các chỉ tiêu về vi sinh vật và kéo dài thời hạn sử dụng thêm ít nhất 15 - 20 ngày so với mẫu sản xuất của thị trường ở cùng điều kiện bảo quản Qui trình sản xuất nem chua nghiên cứu vẫn giữ được đầy đủ các yếu tố truyền thống nhưng đã được cải tiến nâng cao và kết hợp hài hòa với tính bán công nghiệp nên dễ dàng áp dụng ở qui

mô sản xuất nhỏ, vừa và công nghiệp

KIẾN NGHỊ

- Triển khai ứng dụng rộng rãi qui trình sản xuất nem chua an toàn sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học, chế phẩm tỏi và tối ưu các yếu tố công nghệ ở qui mô vừa, nhỏ và qui mô công nghiệp

- Nghiên cứu đánh giá hương vị của nem chua nghiên cứu so với các mẫu nem chua trên thị trường bằng các phương pháp phân tích hiện đại

- Nghiên cứu thu hồi tách chiết và tinh sạch bacterioxin từ chủng L

plantarum H1.40 nhằm ứng dụng trong bảo quản và chế biến thực phẩm

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

An toàn thực phẩm luôn là vấn đề thời sự của các quốc gia, ở Việt Nam vấn đề này còn cấp bách hơn bao giờ hết bởi mức độ nguy hại mà nó gây ra cho sức khoẻ cộng đồng

Theo báo cáo mới nhất về tình hình ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây cho thấy càng ngày số vụ mắc và số người thiệt hại không giảm mà còn tăng lên qua từng năm Từ năm 2000 đến năm 2006 trên cả nước có 1358 vụ ngộ độc thực phẩm với 34.411 người mắc

và 379 người tử vong, (con số báo cáo thường rất nhỏ so với trong thực tế) Điều tra dịch tễ học trong khoảng thời gian từ 2002 đến năm 2007 cho thấy nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm phần lớn là do vi sinh vật (chiếm cao nhất là 40,24%), trong đó nguồn thức ăn từ thịt

và sản phẩm thịt đứng thứ hai sau nấm độc [1]

Ở Việt Nam, nem chua là sản phẩm thịt lên men cổ truyền được nhiều người ưa chuộng Công nghệ sản xuất sản phẩm này mang đầy đủ những cơ sở khoa học và được lưu truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác Đây là sản phẩm giàu dinh dưỡng, hương vị hài hoà, thơm ngon Trong quá trình sản xuất, sản phẩm không phải trải qua công đoạn xử lý nhiệt nên phần lớn các chất dinh dưỡng, các vitamin, các axit amin trong thịt không mất đi

Trong sản xuất truyền thống, quá trình lên men tự nhiên nem chua phụ thuộc nhiều vào hệ vi sinh vật tự nhiên có trong nguyên liệu và môi trường Vì vậy việc duy trì chất lượng ổn định cho sản phẩm không dễ dàng Hơn nữa, quá trình sản xuất không có giai đoạn gia nhiệt, thịt nguyên liệu lại là môi trường giàu dinh dưỡng, pH từ 5,8 - 6,2, độ ẩm của sản phẩm khá cao (70%) nên các vi sinh vật gây hại rất dễ phát triển Đặc biệt khi mà quá trình giết mổ và vận chuyển bảo quản nguồn nguyên liệu thịt ở Việt Nam còn thủ công và không đảm bảo vệ sinh nên mức độ ô nhiễm các vi sinh vật gây bệnh ở ngưỡng rất cao Hiện nay trên thị trường, nhiều cơ sở sản xuất vì lợi nhuận kinh doanh muốn sản phẩm để được lâu

nên đã bổ sung quá liều lượng cho phép các muối bảo quản (NaNO2, NaNO3), gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khoẻ người tiêu dùng [18]

Hiện nay trên thế giới người ta luôn quan tâm đến chất lượng VSATTP trên khía cạnh tìm ra các giải pháp tăng tính an toàn cho sản phẩm thực phẩm bởi các thành phần có bản chất tự nhiên và không có hại đối với sức khỏe Bacterioxin từ vi khuẩn lactic (nhóm vi sinh vật được coi là an toàn) luôn là vấn đề nóng hổi được quan tâm và ngày càng được ứng dụng nhiều Bacterioxin là các hợp chất có bản chất protein nên dễ dàng bị phân hủy bởi hệ

enzym proteaza trong hệ thống tiêu hóa con người, do vậy không gây nguy hại đến sức khỏe Tuy nhiên cho đến nay ngoài nisin, một bacterioxin được sinh tổng hợp từ

Lactococcus lactis subsp lactis (L lactis subsp lactis) được sản xuất thành công ở dạng chế phẩm và được bán trên thị trường, thì chưa có một loại bacterioxin nào khác được thương mại hóa mà mới chỉ được ứng dụng dưới dạng chế phẩm vi sinh vật nhưng với số lượng rất còn hạn chế và ở Việt Nam thì vấn đề này gần như còn rất mới mẻ Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra chủng vi sinh vật có các đặc tính quí báu như sinh tổng hợp bacterioxin, có hoạt tính probiotic… để sản xuất chế phẩm ứng dụng trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm trong bối cảnh mất an toàn nghiêm trọng như hiện nay là một việc làm rất có ý nghĩa Bên cạnh đó các thành phần kháng khuẩn có bản chất tự nhiên từ thực vật hiện cũng đang rất được quan tâm bởi tính an toàn và dễ khai thác sử dụng Trong

số đó tỏi được coi như một nguồn tiềm năng to lớn với những tính chất quí báu về khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cũng như vai trò là một gia vị không thể thiếu trong một số sản phẩm thực phẩm Việc nghiên cứu sử dụng các nguồn kháng khuẩn có bản chất tự nhiên từ thực vật cũng như từ vi sinh vật nhằm ứng dụng nâng cao chất lượng sản phẩm đặc biệt sản phẩm thịt lên men là một hướng đi cần thiết

Giữ lấy những nét độc đáo của công nghệ cổ truyền đồng thời phát hiện những điểm bất cập đang tồn tại trong qui trình sản xuất nem chua hiện tại để từ đó áp dụng những thành tịu mới của khoa học công nghệ hiện đại, cải tiến những thiếu sót nhằm nâng cao chất lượng, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho nhóm sản phẩm này là một việc làm không chỉ có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn lớn mà còn mang tính xã hội và nhân văn rất lớn

Với mong muốn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

"Nghiên c ứu một số giải pháp sinh học trong công nghệ sản xuất nem chua "

Mục tiêu của đề tài

- Tuyển chọn được bộ giống vi sinh vật có khả năng lên men lactic nem chua tốt, sinh tổng hợp bacterioxin cao, thủy phân protein thịt tốt và đồng thời đóng vai trò như nguồn cung cấp probiotic cho cơ thể Kết hợp với nguồn kháng khuẩn từ tỏi nhằm nâng cao chất lượng và VSATTP cho sản phẩm này

- Xây dựng được qui trình sản xuất nem chua an toàn, có tính khả thi cao, có thể áp dụng ở qui mô nhỏ

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các sản phẩm nem chua nổi tiếng ở một số vùng miền trên cả nước được tiến hành khảo sát chất lượng và phân lập tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có đặc tính tốt

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm tỏi được thu nhận từ cùng một giống

tỏi trắng (Allium sativum) hiện đang trồng phổ biến ở nước ta

Phạm vi áp dụng đề tài: nâng cao chất lượng cho sản phẩm nem chua (thịt lên men) ở mọi vùng miền trong cả nước, dễ dàng áp dụng ở cả qui mô sản xuất nhỏ, vừa và công nghiệp

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

 Đã đưa ra những cảnh báo ban đầu về sự mất vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm nem chua trên thị trường Đó là sự ô nhiễm vi sinh vật và hàm lượng hóa chất bảo quản quá cao, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

 Đã nghiên cứu tìm ra các giải pháp, đặc biệt ứng dụng công nghệ sinh học như tìm được hỗn hợp chủng giống vi khuẩn lactic với các đặc tính sinh học tốt giúp định hướng quá trình lên men và kiểm soát được chất lượng Nguồn các hợp chất kháng khuẩn có bản chất từ thực vật (tỏi) cũng đã được khai thác sử dụng có hiệu quả Kết quả nghiên cứu một lần nữa đã chứng minh rằng trong chế biến thực phẩm không cần gia nhiệt vẫn có thể thực hiện được các qui trình sản xuất sạch và an toàn

 Là công trình nghiên cứu tổng thể về quá trình công nghệ sản xuất nem chua, giải quyết trọn vẹn vấn đề từ khâu chủng giống đến khâu bảo quản sản phẩm và cuối cùng đề xuất một qui trình khả thi về sản xuất nem chua “an toàn “ Làm phong phú thêm khả năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn lactic

 Kết quả của đề tài là sự đóng góp tích cực trong việc xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng

cụ thể cho nhóm sản phẩm thịt lên men nói riêng và nhóm sản phẩm thực phẩm giàu protein lên men nói chung

Nội dung nghiên cứu:

1 Khảo sát đánh giá thực trạng chất lượng nem chua về thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm

2 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua có các hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn bacterioxin; có hoạt tính proteaza cao

và có tiềm năng probiotic nhằm ứng dụng làm chủng giống trong công nghệ sản xuất nem chua

3 Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chế phẩm từ tỏi và ứng dụng trong công nghệ sản xuất nem chua

4 Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ sản xuất nem chua ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học tốt, chế phẩm tỏi và tối ưu các yếu tố công nghệ nhằm nâng cao chất lượng và đảm bảo VSATTP

Cấu trúc của luận án

Luận án được trình bày trong 167 trang đánh máy gồm 3 chương với 52 bảng, 82 hình, đồ thị: Chương 1 Tổng quan; Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu; Chương 3 Kết quả

và thảo luận; Phần kết luận, kiến nghị; Tài liệu tham khảo với 149 tài liệu tham khảo và phần phụ lục

Những điểm mới của luận án

 Sản xuất được chế phẩm vi sinh vật từ tập hợp các chủng vi khuẩn lactic bản địa có hoạt tính sinh học tốt: sinh tổng hợp bacterioxin kháng khuẩn tốt; có hoạt tính probiotic và hoạt tính proteinaza cao để ứng dụng vào sản xuất nem chua

 Đã tìm được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibit Concentrate) của ba chế phẩm tỏi đối với các vi sinh vật gây bệnh và ứng dụng có hiệu quả vào sản xuất nem chua

 Là công trình nghiên cứu có hệ thống các cơ sở khoa học cho sản xuất nem chua truyền thống ở Việt Nam nhằm nâng cao chất lượng, đảm bảo VSATTP và kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm Kết quả góp phần đề xuất qui trình sản xuất “nem chua an toàn” dễ dàng

áp dụng ở các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ

CH ƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Thịt và các sản phẩm từ thịt có vai trò rất lớn cho nhu cầu dinh dưỡng của con người, nó đáp ứng 15% nhu cầu về năng lượng, 30% nhu cầu protein, 22% chất béo, nhiều loại vitamin và một số chất vi lượng [78] Trong số các sản phẩm từ thịt thì thịt lên men còn được xem như một nguồn thực phẩm chức năng bởi nó bổ sung nguồn dinh dưỡng và vi sinh vật có lợi cho cơ thể [58]

Thịt lên men (fermented meats) là sản phẩm thu được từ quá trình lên men lactic một số đường có mặt trong hỗn hợp thịt do hệ vi sinh vật sẵn có trong thịt và môi

trường hoặc được bổ sung từ bên ngoài vào, với sự có mặt của muối, các tác nhân bảo quản, và gia vị

Sản phẩm thịt lên men rất thông dụng có mặt ở nhiều nước trên thế giới, châu Âu là nơi sản xuất và là thị trường tiêu thụ lớn nhất Những nước sản xuất nhiều sản phẩm thịt lên men nhất là Đức, Ý, Tây Ban Nha và Pháp, ở các nước này 20 đến 40% lượng sản phẩm thịt chế biến có thể được xếp vào nhóm thịt lên men Riêng về xúc xích lên men bán khô thì không những được sản xuất nhiều ở châu Âu mà còn được sản xuất nhiều ở một số nước vùng Đông Nam Á và Trung Quốc Lịch sử ra đời của nó ở những vùng này đều lâu đời như nhau, khoảng 2000 năm trước đây [39]

Các sản phẩm thịt lên men được phân loại theo nhiều phương thức, theo thành phần, cấu trúc (xúc xích lên men, jămbon,…), theo mức độ lên men (chín nhanh, chín vừa, chín

chậm)… Trong các nhóm sản phẩm thịt lên men thì xúc xích lên men là dạng phổ biến và

có vị trí quan trọng nhất Ngày nay trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều loại xúc xích lên men khác nhau, riêng ở Đức đã có tới khoảng 350 loại [33] Dựa vào hàm lượng nước, có thể chia xúc xích lên men thành các nhóm [39]:

- Nhóm có độ ẩm cao (moist): có thủy phần lớn hơn 50%

- Nhóm bán khô (semi-dried): có thủy phần 35-50%

- Nhóm khô (dried): có thủy phần 20-35%

Theo phân loại như trên thì nem chua Việt Nam có thể được xếp vào nhóm xúc xích lên men có độ ẩm cao; giống như một số sản phẩm thịt lên men ở vùng Đông Nam Á (như

nham của Thái Lan) được bao gói trong lá chuối, lên men tự nhiên (không cấy chủng) ở

nhiệt độ tương đối cao 25-35oC, thời gian lên men ngắn và không qua xử lý nhiệt nên thời hạn sử dụng hạn chế (Hình1.1)

Hình 1.1 Một số hình ảnh các sản phẩm thịt lên men trên thế giới và Việt Nam

Quá trình lên men thịt là quá trình chuyển hoá kỵ khí đường thành axit lactic được thực hiện bởi một số loài vi sinh vật, trong đó vi khuẩn lactic đóng vai trò chủ đạo Đồng thời đó là quá trình chín sinh hóa của protein, lipit… bởi hệ thống enzym và hệ vi sinh vật

để tạo nên một sản phẩm có hương vị hài hoà và rất đặc trưng Những biến đổi chính trong quá trình lên men thịt để hình thành nên đặc tính cuối cùng của sản phẩm bởi vai trò của vi sinh vật, hệ enzym, vai trò các gia vị, phụ gia cũng như tác động của các yếu tố công nghệ được thể hiện theo sơ đồ hình 1.2

1.1.2.1 Sự biến đổi pH và hàm lượng axit trong quá trình lên men thịt

Giá trị pH của thịt giảm nhanh chóng do vi khuẩn lactic có trong thịt chuyển hoá đường thành axit lactic Quá trình lên men lactic chuyển hoá đường theo hai phương thức: lên men đồng hình (tạo ra sản phẩm chính là axit lactic chiếm 90-98%) và lên men dị hình (ngoài axit lactic còn có thể tạo ra các axit hữu cơ khác, etanol và CO2) [4]

Hình 1.2 Sự biến đổi sinh hóa các chất trong quá trình lên men thịt [58]

Sự phát triển và trao đổi chất của vi khuẩn lactic làm giảm pH nhanh chóng ngay trong ngày đầu tiên của quá trình lên men xúc xích Đại lượng pH được xác định bằng sự tác động qua lại của axit lactic, amoniac, hàm lượng nước và khả năng đệm của protein thịt Do đó pH phụ thuộc vào nguồn gluxit, hoạt động chuyển hóa lên men của hệ vi sinh vật và khả năng đệm của thịt Demeyer và Vandekerkhove đã thiết lập phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của pH vào hàm lượng lactat, NH3 (milimol/ 100g protein) và hàm lượng nước (g/ 100g protein) trong xúc xích lên men như sau :

ở giá trị pH trên 5,4 trừ khi hoạt độ nước awthấp hơn 0,9 Vì vậy giá trị pH là yếu tố quyết

HUN KHÓI (có hoặc không) MUỐI,GIA VỊ

CÁC HỢP CHẤTTẠO VỊ

CÁC HỢP CHẤT TẠO HƯƠNG THƠM

Sự chuyển hóa bởi VSV

Thuỷ phân protein (enzym thịt, VSV )

Thuỷ phân lipit (enzym thịt, VSV)

Sự chuyển hóa bởi VSV (Vi khuẩn lactic, cầu khuẩn, men,mốc)

Quá trình tự oxi hoá ( lipolysis, Fe,

a w , NO, E h … )

Sự biến đổi bởi VSV của các sản phẩm oxi hóa

định tới độ chắc trong loại xúc xích lên men bán khô có độ axit cao; và mức aw là yếu tố quyết định chủ yếu trong loại xúc xích lên men khô có độ axit thấp Sự giảm giá trị pH đi cùng với sự giảm khả năng hòa tan protein và thúc đẩy khả năng tạo gel [33]

1.1.2.2 Sự biến đổi màu sắc

Quá trình tạo màu của các loại xúc xích lên men theo đường hướng tương tự như các sản phẩm thịt khác có chứa nitrit Tuy nhiên giá trị pH thấp có ảnh hưởng mạnh tới sự mất

ổn định ban đầu của myoglobin và sự tăng tốc độ tự oxi hóa thành metmyoglobin Do đó phải bổ sung các chất chống oxi hóa như axit ascorbic, axit glutamic…và nên xử dụng nitrit

là nguồn trực tiếp Tuy nhiên ở pH thấp tạo điều kiện hình thành NO để tham gia phản ứng với các dạng sắc tố thịt để tạo thành hợp chất làm bền màu thịt (nitrozomyoglobin) Các chất béo và sự có mặt với lượng lớn H2O2do một số loại vi khuẩn sinh ra gây ảnh hưởng bất lợi đối với màu sắc, thúc đẩy sự tạo thành metmyoglobin có mầu nâu [28], [39]

1.1.2.3 Sự thuỷ phân protein trong thịt

Trong quá trình lên men thịt, do tác động của hệ enzym proteaza trong thịt và của hệ

vi sinh vật mà protein chất cơ và protein sợi cơ đều bị thuỷ phân thành dạng ngắn hơn là peptit và các axit amin nên hàm lượng của các protein này giảm mạnh theo thời gian lên men, kéo theo là sự tăng hàm lượng các peptit và axit amin tự do Trong quá trình chín của xúc xích lên men hàm lượng peptit và axit amin tăng làm tăng hàm lượng chất khô lên khoảng 1% Peptit và axit amin tạo ra hương vị đặc trưng cho sản phẩm và có vai trò như thành phần tạo hương vị Khả năng phân giải mạng lưới protein thịt trong 22 ngày lên men tăng từ 73,8% tới 78,8% và khả năng tiêu hóa protein tăng từ 92% lên 94,1% [39], [143]

Hoạt tính thuỷ phân protein của những chủng vi sinh vật khởi động yếu hơn so với enzym trong mô thịt (Endopeptidaza, Cathepsin B, B+L và H, Exopeptidaza) Tuy nhiên việc cấy những chủng này vào xúc xích cũng dẫn tới tăng lượng axit amin so với khi không

cấy Những enzym proteaza của Lactobacillus bao gồm phần lớn là những proteinaza bám

trên thành tế bào chuyển hoá protein thành oligopeptit

1.1.2.4 Sự thuỷ phân lipit

Tương tự như sự phân huỷ protein, dưới tác dụng của các enzym có trong thịt, các triglyxerit và photpholipit bị phân huỷ và giải phóng ra các axit béo phân tử lượng lớn Đặc biệt là làm tăng lượng axit béo tự do lên tới xấp xỉ 5% tổng lượng axit béo Hoạt tính phân

giải lipit của lipaza của LAB yếu hơn rõ rệt so với của Micrococcus [58], [143]

1.1.2.5 Sự thay đổi hoạt độ nước

Hoạt độ nước (aw) được quyết bởi việc bổ sung hay loại trừ nước bằng các chất hòa tan (đặc biệt là NaCl) và việc bổ sung chất béo Nem chua khác với các loại xúc xích lên men khác bởi hàm lượng chất béo rất thấp do được làm chủ yếu từ thịt lợn nạc, việc sử dụng

bì lợn chần thái sợi và thính đều có vai trò giảm aw Giai đoạn đầu hoạt độ nước awgiảm đến

0,96 tạo điều kiện thuận lợi cho LAB, Micrococcus và Staphylococcus phát triển trong giai

đoạn khởi động của quá trình lên men [33],[58]

Sự giảm của awcủa xúc xích lên men trong quá trình làm khô ảnh hưởng rõ rệt đến

sự sống sót và phát triển của các vi sinh vật có hại, và có ảnh hưởng rất mạnh tới độ chắc của xúc xích và hoạt động của các enzym trong quá trình chín [33],[58]

1.1.2.6 Sự tạo thành hydroperoxit (H2O2 )

Hydroperoxit là một trong những chất chuyển hoá quan trọng được sinh ra bởi LAB

Nó tạo ra các hoạt động đối kháng Mức độ sinh ra hydroperoxit là khác nhau giữa các chủng và phụ thuộc vào sự có mặt của oxi Sự tạo thành H2O2 trong các sản phẩm thịt lên men có tác động hai mặt: tác dụng tốt là kháng khuẩn và tác động không tốt là làm xẫm màu

sắc, tạo mùi vị không mong muốn Điều này được giải thích do H2O2 hoạt hoá metmyoglobin, có lẽ tạo các gốc cation porphyrin Các gốc này khởi đầu cho quá trình peroxit hoá lipit Chính vì vậy quá trình lên men thịt nên tiến hành ở điều kiện yếm khí thì tốt hơn bởi LAB là các vi khuẩn yếm khí hoặc vi hiếu khí [63]

1.1.2.7 Sự biến đổi hương vị

Những thành phần dễ bay hơi góp phần tạo ra hương thơm cho xúc xích lên men, đó

là các axit hữu cơ do vi sinh vật tạo ra; sự tạo thành các peptit và các axit amin từ quá trình thủy phân protein thịt; sự biến đổi các axit amin và peptit thành các rượu, aldehyt và axit có mùi thơm; các sản phẩm biến đổi của quá trình oxi hoá lipit, như sự este hoá của các nhóm acyl trong phân tử hoặc sự khử các aldehyt Tất cả các hợp chất này đều có vai trò quan trọng trong việc tạo hương và vị của sản phẩm Hương vị của xúc xích lên men còn phụ thuộc vào những điều kiện chín và công thức sản phẩm, vào việc bổ sung gia vị, hun khói, hoặc làm chín bề mặt với nấm men và nấm mốc… [39], [63], [64], [143]

1.1.2.8 Sự tạo thành các amin sinh học (Biogenic amine)

Các amin sinh học là dẫn xuất của các axit amin sau quá trình decacboxyl (khử nhóm CO2) Tiêu biểu cho nhóm này có thể kể đến histamin, tyramin, cadaverin,

putrescin…Đây là những hợp chất có mùi khó chịu và dễ gây dị ứng, ngộ độc cho người sử dụng [27]

Trong quá trình lên men thịt một số chủng có thể thực hiện quá trình chuyển hóa này

và đây cũng là nguyên nhân làm hỏng chất lượng xúc xích lên men Các nguồn vi sinh vật

có khả năng khử CO2 tạo thành amin là Enterococcus, Carnobacterium, Pseudomonas,

Enterobacteriaceae, Micrococcus và một số LAB [59],[63] Bên cạnh đó nhiều báo cáo cho

thấy các chủng khởi động Lactobacillus có vai trò ức chế sự hình thành các amin sinh học

này Chính vì vậy việc lựa chọn nguồn nguyên liệu có chất lượng vệ sinh tốt và lựa chọn những chủng khởi đầu phù hợp góp phần hạn chế những amin sinh học trong sản phẩm [46], [74], [76], [120], [135], [143]

1.1.2.9 Hệ vi sinh vật thịt và sự thay đổi trong quá trình lên men thịt

Lactobacillus và Micrococcus là những quần thể chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật ban đầu Sau đó số lượng vi khuẩn lactic tăng từ 106 đến 108,109 CFU/ g và ổn định trong

suốt quá trình lên men Loại LAB chiếm ưu thế là Lactobacillus, Pedicoccus,

Lactococcus,…S ự giảm pH của môi trường kéo theo sự giảm đáng kể Pseudomonas và các

vi khuẩn Gram (-), các vi khuẩn gây thối, gây bệnh và gây hư hỏng Một số loài nấm men phát triển ở mật độ trung bình từ 104 đến 106 CFU/ g Tiêu biểu trong nhóm nấm men là

Debaryomyces Sự phát triển của nấm men đã tạo ra một số sản phẩm bậc hai có ảnh hưởng tốt, làm tăng hương vị cho sản phẩm Nấm mốc cũng phát triển tuỳ thuộc vào công nghệ và

loại bao bì Trong các loài nấm sợi thì Penicillium chiếm hơn ưu thế hơn cả trong các loại

thịt lên men [39], [48], [50], [143]

1.1.2.10 V i sinh vật bất lợi trong sản phẩm thịt lên men

Vi sinh vật gây hư hỏngthịt

Vi khuẩn chủ đạo trong quá trình lên men thịt là các chủng thuộc nhóm LAB và

Micrococcus Sự xuất hiện các loại vi sinh vật khác ngoài hai nhóm trên đều liên quan đến các quá trình lên men không mong muốn và gây hư hỏng sản phẩm, ví dụ như

Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Brochothrix thermosphacta…Ngoài ra bất kỳ loài nào của Salmonella, Listeria và Clostridium đều gây nguy hại do chúng mang nguy cơ gây bệnh

Số lượng vi sinh vật có trong thịt là một chỉ số quan trọng phản ánh chất lượng của

nó Nếu đạt đến 107 - 108 CFU/ g hoặc trên 1cm2 bề mặt thì thịt đã bị kém phẩm chất Sự thối rữa của thịt xảy ra cả trong điều kiện hiếu khí cũng như kỵ khí Các vi khuẩn hiếu khí

gây thối rữa thường gặp là : Proteus vulgaris (P vulgaris); Bacillus subtilis (B subtilis); B

mesentericus; B megatherium Còn các vi khu ẩn kỵ khí gây thối rữa thì có: Clostridium

perfringens (C perfringens) ; C putrificum ; C sporogens Các vi sinh vật hiếu khí gây hiện tượng nhầy nhớt ở thịt gồm Pseudomonas, Enterobacteriaceae, [17], [30], [52]

Nhóm vi sinh vật gây bệnh

Các vi sinh vật điển hình gây bệnh hay xuất hiện trong thịt và đặc biệt các sản phẩm thịt lên men là:

 Staphylococus aureus (S aureus)

Loài vi khuẩn này có khả năng chống chịu được nồng độ cao của muối ăn và nitrit nhưng lại kém phát triển trong môi trường có pH và nhiệt độ thấp Vì lý do đó chúng phát triển tương đối khó khăn trong môi trường thịt lên men Mặc dù vậy chủng này vẫn có thể phát triển tốt ở giai đoạn đầu quá trình lên men khi pH chưa kịp giảm xuống đủ thấp Đây chính là nguy cơ làm hỏng sản phẩm khi lên men ở nhiệt độ cao Như vậy hai yếu tố quan

trọng kiểm soát lượng S aureus trong suốt quá trình lên men chính là: hoạt tính của chủng khởi đầu và pH ban đầu Tuy S aureus là một đối thủ cạnh tranh yếu ở nhiệt độ thấp, trong điều kiện yếm khí và độ pH thấp, nhưng S aureus vẫn là nguyên nhân chủ yếu gây hư hỏng

ở các sản phẩm thịt lên men S aureus có thể phát triển trong suốt giai đoạn thích ứng (lag

phase) của quá trình phát triển của Lactobacillus và đạt đến số lượng lớn ở lớp ngoài của xúc xích [39], [103], [123] Có ít nhất năm enterotoxins được sản sinh ra Chúng chịu được papain, trypsin, chymotrypsin, bền nhiệt, nhưng lại bị phá huỷ nhanh chóng khi có mặt các tác nhân khử (ascorbat, nitrit) Để ngăn ngừa sự lây nhiễm chéo loại vi sinh vật này từ các đối tượng khác sang thực phẩm thì các biện pháp vệ sinh là rất cần thiết Trong một sản

phẩm thực phẩm khi S aureus tăng lên vượt quá giới hạn 106 CFU/ g thì tiết ra độc tố đủ để gây bệnh cho con người (bệnh viêm ruột) [71], [72], [104], [105], [121], [123]

 Enterobacteriaceae

Họ vi khuẩn này bao gồm nhiều loại vi khuẩn có trong ruột của người và động vật,

bao gồm cả Coliform, Escherichia coli (E coli) và cả vi khuẩn gây bệnh như Salmonella và

Shigella…Đặc điểm của nhóm này là có khả năng chống chịu được axit trong môi trường thịt lên men Theo Comi và cs [48] cho thấy với các mẫu xúc xích lên men tự nhiên ở vùng

Đông Bắc Ý số lượng Enterobacteriaceae dao động khá lớn từ 1,69 - 6,67 log CFU/ g

Lượng vi khuẩn nhóm này là chỉ thị đánh giá chất lượng vệ sinh và sự ô nhiễm sau chế biến của thực phẩm Sự tăng lượng vi khuẩn đường ruột trong sản phẩm thịt lên men có

thể do hai nguyên nhân: thứ nhất do kiểm soát ban đầu về vi sinh vật chưa tốt; thứ hai do pH giảm chậm trong quá trình lên men thịt và liên quan đến chủng khởi đầu [41], [71], [72]

Trong nhóm này có hai loại hay được để ý đến nhất đó là: Salmonella và E coli

Salmonella được báo cáo là gây độc đối với sự tiêu dùng salami ở Úc, Ý và hầu hết hiện nay là ở Anh, nhiều nhất là sản phẩm salami-snack, một loại sản phẩm có thời gian chế

biến rất ngắn Tuy nhiên Samonella không có khả năng phát triển trong xúc xích lên men nếu sự nhiễm tạp của nó thấp, đáng chú ý là Salmonella không được tìm thấy trong thân thịt

động vật nếu sản xuất trong điều kiện vệ sinh tại các lò mổ hiện đại [42], [43], [52], [119] Trong các dạng salami được sản xuất ở Úc, sự axit hóa bởi các chủng khởi động có ảnh

hưởng một cách rõ rệt hơn đối với Salmonella so với sự axit hóa bởi glucono-δ-lactone [33]

E coli là trực khuẩn Gram (-) không tạo bào tử, yếm khí tùy tiện Có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 4- 50oC Nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 37oC, bị tiêu diệt ở 60oC trong 2- 3 phút pH tối ưu là 4,4; aw tối ưu là 0,95 vì vậy chúng có thể tồn tại trong môi trường thịt lên men Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, và có khả năng khử nitrat thành nitrit [123]

 Bacillus cereus

Thịt và các sản phẩm thịt cũng dễ bị nhiễm B cereus Ngoài ra B cereus còn có thể

bị nhiễm từ các nguồn gia vị và các thành phần khác khi cho vào xúc xích lên men Loại này thường nhạy cảm với điều kiện pH và hoạt độ nước thấp của xúc xích lên men [52], [63]

 Clostridium perfringens

Nhóm này được phân thành 5 typ từ A-E theo sự hình thành ngoại độc tố

C perfringens thường xuất hiện trong các sản phẩm thịt nấu chín nhưng sau đó lạm dụng giữ ở nhiệt độ cao dưới 60oC, nhưng loại này thường nhạy cảm với môi trường axit cũng như các yếu tố khác của thịt lên men [52], [113]

 Clostridium botulinum

Đây là vi khuẩn yếm khí nghiêm ngặt đặc trưng trong các sản phẩm thịt nên còn gọi

là “vi khuẩn độc thịt“ Trong môi trường thịt lên men khi pH thấp hơn 5,0 thì loại vi khuẩn này bị ức chế mạnh Sự phát triển và sinh độc tố của vi khuẩn này bị kìm hãm bởi nhiều yếu

tố, pH< 4,7 (đối với vi khuẩn thủy phân protein ), pH < 5 (các vi khuẩn không thủy phân protein), NaNO2, muối ascorbat, các vi khuẩn lactic…[52], [113]

 Listeria monocytogenes

L monocytogenes là vi khuẩn G (+) không sinh bào tử gây độc cho thực phẩm Nó đặc biệt nguy hiểm cho trẻ em, người già, phụ nữ mang thai Nó phát triển được ở pH thông thường của xúc xích lên men khô và có thể tồn tại trong điều kiện nhiệt độ thấp khi bảo

quản Giải pháp mới để giảm nguy cơ của L monocytogenes trong xúc xích lên men là sử

dụng chất kháng khuẩn đặc biệt (bacterioxin) tạo ra bởi các chủng vi khuẩn lactic được sử

dụng làm nguồn chủng giống Liều gây nguy hiểm đối với người tiêu dùng khi nhiểm L

monocytogenes là 100 CFU/ g đối với thực phẩm ăn liền [63], [71], [72]

Sự tạo thành độc tố nấm mốc (mycotoxin)

Nấm mốc sinh mycotoxin được phân lập cả trong loại xúc xích lên men được làm chín bởi mốc và cả trong loại bị nhiễm mốc không mong muốn Một số nghiên cứu cho thấy rằng sự tạo thành mycotoxin bị ức chế bởi nhiệt độ bảo quản thấp, mức aw giảm và ở các sản phẩm có hun khói Vai trò của các chủng khởi động cho thấy ở nhiệt độ thấp cả

Lactobacillus và Pedicoccus đều cho thấy khả năng ức chế sự tạo thành aflatoxin [33]

Việc lạm dụng nhiệt độ trong quá trình bảo quản dẫn đến sự phát triển của nấm mốc

và sự chuyển hóa lactat bởi nấm mốc, điều này làm tăng giá trị pH đến một mức sẽ tạo điều kiện cho sự phát triển và sinh độc tố của nấm mốc Do vậy việc khống chế nhiệt độ trong quá trình bảo quản là vô cùng quan trọng

1.1.2.11 Tính an toàn và những nguy cơ của sản phẩm thịt lên men

(a) Tính an toàn:

Tính an toàn của sản phẩm này được quyết định bởi rất nhiều yếu tố như nguyên liệu ban đầu, vai trò các phụ gia, gia vị hay những biến đổi hóa lý, hóa sinh, hóa học của sản phẩm trong suốt tiến trình công nghệ (lên men, chín, làm khô hay sấy và hun khói…) [36], [63], [64], [138]

- Thịt nguyên liệu được kiểm soát VSATTP tốt đạt các chỉ tiêu về chất lượng, đặc biệt sự ô nhiễm vi sinh vật ban đầu đạt trong ngưỡng cho phép;

- Vai trò của muối ăn (NaCl) cùng với muối bảo quản của nitrit (NaNO2): muối ăn làm giảm hoạt độ nước; đầu tiên kìm hãm hoặc làm chậm sự phát triển của nhiều vi khuẩn trong khi

lại tạo thuận lợi cho sự phát triển của LAB và Staphylococcus khởi động Nitrit đóng vai trò

quan trọng ở giai đoạn đầu của quá trình lên men và tạo sự ổn định hệ vi sinh vật của sản

phẩm, đặc biệt là ức chế Salmonella do vai trò của nitrit dưới dạng axit nitrơ không hoà tan

(HNO2) cản trở ion trong thành tế bào vi khuẩn và xáo trộn chức năng của enzym vi khuẩn,