Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRIỆU THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Triệu Thị Nguyệt

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược Học Quân sự - HVQY

TS Mai Thị Đàm Linh – Đại học Khoa học Tự nhiên

Hà Nội – Năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược học quân sự - Học viện Quân Y, người thầy đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị trong Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y vì các thầy cô và anh chị đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại phòng Tôi đặc biệt cảm ơn CN Vũ Nguyễn Quỳnh Anh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Hà Nội, 10 tháng 01 năm 2020 Học viên

Triệu Thị Nguyệt

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC HÌNH 8

DANH MỤC BẢNG 10

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về HBV 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại HBV 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV 4

1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV 5

1.1.4 Các protein HBV 7

1.1.5 Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe 10

1.1.6 Chu trình nhân lên của HBV 12

1.1.7 Con đường lây nhiễm của virus HBV 14

1.2 Tổng quan về viêm gan B mạn tính 15

1.2.1 HBV và viêm gan B 15

1.2.2 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới 16

1.3 Tình hình nghiên cứu HBV 18

1.3.1 Trên thế giới 18

1.3.2 Trong nước 21

1.4 Tính mới và tính sáng tạo của đề tài 23

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Vật liệu, hóa chất 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28

2.2.2 Thu thập, bảo quản mẫu 29

2.2.3 Tách chiết acid nucleic 29

2.2.4 Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương 29

2.2.5 Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 32

Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược: 34

Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược 35

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 36

Tối ưu thời gian luân nhiệt 36

Tối ưu nồng độ mồi 37

Tối ưu nồng độ probe 37

Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR 38

2.2.6 Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 38

2.2.7 Phân tích, xử lý số liệu 39

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 41

3.1.1 Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh 41

3.1.2 Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn

trước khi hoàn thiện 41

3.1.3 Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 42

3.1.4 Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA 44

3.2 Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 47

3.2.1 Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR 47

3.2.2 Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm 54

3.2.3 Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 56

3.3 Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR 57

3.3.1 Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 57

3.3.2 Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 61

3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB 64

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 67

4 CV Coefficient of Variation - Hệ số biến thiên

5 ER Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất

6 HBeAg Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e

9 HBV Hepatis B Virus – Virus viêm gan B

10 HBsAg Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên vỏ

của HBV

11 ME Meaning – Độ lệch phép đo

12 ORF Open Reading Frame – Khung đọc mở

13 NAs Nucleos(t)ide Analogues

14 RT-qPCR Reverse Transcription Realtime - quantitative

Polymerase Chain Reaction

15 rcDNA Relaxed circular DNA – DNA dạng vòng không

kín

16 SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn

17 pgRNA Pre-genomic RNA

18 UNG Uracil Deoxyribonucleic Acid Glycosylase

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [99] 5

Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV 7

Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [47] 14

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [47] 14

Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S 30

Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe 43

Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR 44

Hình 8: Panel độ nhạy 45

Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy 46

Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy 46

Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu 47

Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45°C 48

Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ

Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút 50

Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút 51

Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C 52

Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C 52

Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây 53

Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây 53

Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi 54

Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM 55

Hình 22: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,1 µM 55

Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn 59

Hình 24: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tuần 61

Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng 62

Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng 62

Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị 27

Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu 27

Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR 31

Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR 32

Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR 34

Bảng 6: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác nhau ở bước phiên mã ngược 35

Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR 56

Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR 56

Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 – 1,25 copy/phản ứng trong 10 lần chạy 57

Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn 59

Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo (ME) 60

Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR 63

Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính

ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính 64

MỞ ĐẦU

Nhiễm Hepatitis B virus (HBV) là một vấn đề y tế toàn cầu Mặc dù đã có sự phát triển các vaccine ngăn chặn bệnh hiệu quả cao từ những năm 1980 và việc bổ sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia, bệnh gan do nhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội Tính đến thời điểm hiện nay, trên thế giới, nhiễm HBV là nguyên nhân của 30% bệnh nhân xơ gan và 53% trong số họ tiến triển thành HCC, với khoảng hơn 200,000 và 300,000 người mang HBsAg chết mỗi năm tương ứng do xơ gan và ung thư gan

Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN 2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside (nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir, Tenofovir Peg-IFN vừa có tác dụng điều hòa miễn dịch vừa có tác dụng kháng virus trực tiếp, nhờ đó có thể duy trì sự ức chế HBV DNA sau khi ngừng điều trị ở một nhóm bệnh nhân Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV DNA và các biến chứng ở hầu hết các bệnh nhân Tuy nhiên NAs sẽ không ảnh hưởng tới sự tổng hợp RNA tiền bộ gen (pgRNA) của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính hay tổng hợp protein virus như HBsAg vì cccDNA không bị ảnh hưởng và vẫn giữ nguyên hoạt tính phiên mã Hệ quả là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh tái phát và hầu hết các bệnh nhân cần điều trị cả đời Không may là việc điều trị bằng thuốc NAs (như lamivudine) trong một khoảng thời gian dài có thể dẫn đến các đột biến kháng thuốc và một số nguy cơ nghiêm trọng khác liên quan tới gan Chính vì vậy, việc đánh giá được nồng độ của cccDNA ở các bệnh nhân điều trị NAs là vô cùng quan trọng giúp xác định thời điểm và hiệu quả của các loại thuốc kháng virus Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng các mẫu mô sinh thiết, gây khó khăn trong quá trình đánh giá lâm sàng

α-Chức năng cơ bản của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất

cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp

RNA Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV pgRNA gần đây đã được báo cáo là một dấu ấn sinh học mới đầy hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân CHB

Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vào loại cao nhất trên thế giới, nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nề tại nước

ta Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểm soát điều trị cũng như quản lý sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràng trong bối cảnh phổ biến của nhiễm HBV mạn tính Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào trong nước

đề cập đến dấu ấn tiềm năng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân CHB Chính vì

vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: Xây dựng và tối ưu quy trình

RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đối tượng là các bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng nucleoside ở Việt Nam

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về HBV

1.1.1 Đặc điểm phân loại HBV

Hepatitis B virus (HBV) là một thành viên của họ Hepadnaviridae [130]

Sở dĩ họ virus này có tên như vậy là bởi vì những virus này là nguyên nhân gây ra các bệnh về viêm gan (hepatitis) và genome là DNA Một số virus thuộc họ này có khả năng lây nhiễm ở các động vật có vú và chim; ví dụ bao gồm woodchuck HBV

và heron HBV HBV được biết đến nhiều nhất là virus có khả năng lây nhiễm ở người, và là một trong những nguyên nhân gây bệnh gan ở người [46]

Các virus thuộc họ Hepadnaviridae đều có những đặc điểm chung như sau [121]:

- Hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh bao gồm 2 sợi: sợi âm đầy

đủ và sợi dương không đầy đủ

- Enzyme DNA polymerase

- Nhân lên thông qua mạch khuôn là pre-genomic RNA (pgRNA)

- Có mức độ đặc trưng về mô và loài cao

Việc nghiên cứu về các HBV từ lâu đã được quan tâm vì hai lý do Thứ nhất, các virus này có bộ gen rất nhỏ, tuy nhiên chúng vẫn có khả năng mã hóa các protein của virus và kiểm soát sự biểu hiện gen của virus Thứ hai, bộ gen DNA của các virus được nhân lên thông qua trung gian RNA Nói cách khác, sự nhân lên của virus bao gồm quá trình phiên mã ngược, vì vậy các virus thuộc nhóm này khác biệt rất lớn với các virus có bộ gen là DNA có khả năng nhân lên một cách trực tiếp DNA của virus được nhân lên thông qua trung gian RNA còn được tìm thấy ở các loài thực vật Những virus này, cùng với HBV còn được gọi là Pararetrovirus [46]

Các nghiên cứu về giải trình tự nucleotide của HBV được phân lập ở người trên khắp thế giới đã được thiết lập, 8 tuýp của virus HBV đã được xác định (A-H) dựa trên sự khác biệt về trình tự lớn hơn 8% và không vượt quá 17% [61, 102] Các

Tây Phi, và tuýp F xuất hiện ở cả Trung và Nam Mỹ Sự phân bố của tuýp G và tuýp H vẫn chưa rõ ràng, nhưng đã có những báo cáo cho rằng hai tuýp này đã xuất hiện ở Trung Mĩ và Nam Âu [54] Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng

có sự xuất hiện của các tuýp virus mới, như tuýp I là tuýp có độ tương đồng lớn với tuýp C là tuýp được phát hiện ở một số nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào và Đông Ấn [106]; và tuýp J được phát hiện ở một người Nhật Bản sống ở Borneo, là dạng tái tổ hợp giữa tuýp C và HBV ở vượn [102] Các tuýp A, B, C, D, F, I có thể được phân ra thành các nhóm nhỏ hơn dựa trên sự khác biệt khoảng 4% nucleotide

Có 44 nhóm các tuýp phụ: A1–6, B1–9, C1–16, D1–7, F1–4 và I1–2 [54, 84] Thêm vào đó, còn có một số dạng tái tổ hợp của các tuýp như đã kể trên, nhưng phần lớn

là các dạng tái tổ hợp B/C và C/D, trong khi các tái tổ hợp giữa các tuýp khác xảy ra

ít hơn các trường hợp kể trên [8]

1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV

Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm, tiểu thể hình ống (tubµLar particle) kích thước 22nm có chiều dài 40 - 400nm và tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Tiểu thể hình cầu nhỏ và hình ống là thành phần vỏ của HBV mà trong quá trình nhân lên tổng hợp dư thừa Đây chính là kháng nguyên bề mặt (HBsAg) Các tiểu thể này có thể đứng riêng rẽ hay đứng hợp với nhau thành từng đám, chúng không có khả năng lây truyền bệnh [48] Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Đây chính là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp:

- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein Lớp này có các kháng nguyên bề mặt (HBsAg) [28]

- Lớp lõi: Capsid đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi HBcAg Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng không kín, enzyme phiên mã ngược polymerase và protein kinase [28, 34]

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [100]

(A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane); (B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C)

Tiểu thể hình ống

1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV

Cấu trúc nucleocapsid HBV chứa bộ gen với chiều dài khoảng 3,2 kilobase (kb) và là phân tử DNA sợi đôi không hoàn chỉnh dạng vòng không kín hoàn toàn (relaxed circular DNA - rcDNA) [11, 17] Nucleocapsid là một cấu trúc nhị thập diện đều được hình thành bởi 240 phân tử protein capsid của virus với đường kính khoảng 27 nm, và mỗi một nucleocapsid chứa một bản sao DNA của virus và enzyme polymerase liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm [17, 58] Một vài protein của tế bào bao gồm protein kinase cũng được đóng gói vào trong cấu trúc nucleocapsid [17] Một trong những đặc điểm độc đáo của hệ gen HBV đó chính là

chiều dài, chiều dài của sợi dương cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu chính xác, thay đổi theo từng tuýp, từng dòng [30] Ngoài ra, cả sợi âm và sợi dương đều

có chung một điểm đặc biệt đó là cả 2 sợi đều là DNA dạng thẳng nhưng nhờ sự bổ sung giữa 2 sợi mà hình thành cấu trúc vòng rcDNA

Hệ gen của virus có chứa các khung đọc mở (open reading frame - ORF) xếp chồng lên nhau kí hiệu là S, C, P và X mã hóa cho bốn protein khác nhau [58] Cấu trúc xếp chồng lên nhau của các vùng mã hóa khiến cho virus có thể sử dụng hệ gen với hiệu suất 150% (Hình 2) [124]

- Gen PreS1/PreS2 và S (mã hóa cho 3 protein vỏ L-, M- và S)

- Gen precore/core (mã hóa cho protein nucleocapsid; HBcAg và các protein không cấu trúc; HBeAg)

- Gen polymerase (enzyme reverse transcriptase, RNase H)

- Gen X (mã hóa cho protein điều hòa X)

Các gen S và C nằm ở các ORF riêng có các bộ ba mã mở đầu khác nhau, tổng hợp các sản phẩm gen có chức năng khác nhau [30, 58] Các ORF S và C lần lượt kéo dài đến preS1 (preS1 và preS2) và vùng preC ở đầu 5’ Ở các vùng ORF xếp chồng lên nhau có sự xuất hiện của các gen điều hòa là 4 vùng khởi động (preC/C, preS1/S và X) và 2 trình tự tăng cường, các gen này cho phép sự biểu hiện của 7 protein khác nhau được phiên mã từ các bộ ba mã mở đầu khác nhau bởi ít nhất 5 mRNA khác nhau với đuôi tự do Sản phẩm phiên mã đầu tiên có chiều dài 0,7 kb mã hóa cho protein HBx; các sản phẩm phiên mã có chiều dài 2,1 kb và 2,4

kb lần lượt mã hóa cho M- và S-HBsAg, L-HBsAg [30] Sản phẩm phiên mã mã hóa cho cả protein core và polymerase là pregenomic RNA (pgRNA) Pregenomic RNA là mạch khuôn cho quá trình tổng hợp virus HBV và được phiên mã ngược để hình thành nên hệ gen DNA của HBV Như chúng ta đã biết, hệ gen của virus có chiều dài 3,2 kb, và chiều dài của pgRNA là 3,5 kb, tức là dài hơn hệ gen của virus,

đó chính là bản sao “dự phòng” của hệ gen virus [75, 95] Hai vùng gen với 11 nu lặp lại được gọi là DR1 và DR2 nằm ở đầu 5’ ở cả sợi âm và sợi dương và hai gen

này có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của DNA virus [33, 58] Hai trình

tự tăng cường (enhancer) kí hiệu là Enh1 và Enh2, giúp tăng biểu hiện của các sản phẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan [58]

Vùng ORF S mã hóa cho các protein bề mặt của virus, HBsAg có cấu trúc được phân chia và phân hóa tại các vùng preS1, preS1 và S với 3 bộ ba mã mở đầu AUG khác nhau [92] Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein

M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107]

Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV

1.1.4 Các protein HBV

Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và HBsAg Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hình thành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và protein này được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm cho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình thành cấu trúc của virion Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắc đến chi tiết hơn ở phần dưới đây

S-Kháng nguyên E

HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình sau dịch mã ORF precore Là

sự biểu hiện của protein này phụ thuộc vào vùng khởi động của bộ gen virus ORF HBeAg mã hóa cho một trình tự với đích là lưới nội chất (endoplasmic reticulum - ER) và đồng thời cũng dịch mã ra các peptide hướng ngoài ER, nơi mà protein sau khi hoàn thiện tồn tại ở dạng 15kD HBeAg - chính là các kháng nguyên được tiết ra

từ các tế bào nhiễm HBV [113]

Kháng nguyên bề mặt

HBsAg là protein vỏ của virion HBV Như sự tồn tại của HBsAg ở các virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tại trong huyết thanh của họ Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000 lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107] Có một số báo cáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg được tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cái bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30, 35] HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ các DNA tích hợp với bộ gen của người Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết được trạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107]

Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏ của virus Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV là kết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này S-HBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của virus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25]

Protein lõi (protein core)

Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai trò định hình cho virion Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ở dạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4 Khoảng 95% các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = 4 tạo nên khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp

Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên

vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có

sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16] Khoảng 34 - 36 axit amin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphoryl hóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạn trong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81]

Polymerase/Reverse transcriptase (RTase)

Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hình DHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA, cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99] Trong khi quá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải qua quá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo Protein polymerase (reverse transcriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạo thành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi Ở vùng N-terminal là vùng

TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình sao chép bộ gen virus Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bám vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là một domain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV Một vùng đệm thay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiên cứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến mà không làm thay đổi chức năng của P [86] Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằm trong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của

RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53]

RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mã ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âm này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA Domain này có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122] Hiện nay domain

là, các thành phần trong HBV RTase có thể được thay thế bằng các thành phần đồng hợp của HIV RTase [116]

Domain cuối cùng, P, là domain của enzyme RNase H Domain này chịu trách nhiệm cho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi

âm của hệ gen DNA Sự định hướng của các liên kết ion kim loại là rất quan trọng đối với hoạt tính của RNase H, đạt được qua 4 carboxylate được bảo toàn [103] Một vài nghiên cứu về domain RNase H cho thấy vai trò quan trọng của domain này trong việc đóng gói pgRNA [10]

Protein X

HBx là protein có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi HBV Protein này gồm có 154 axit amin, 17 kD và được mã hóa bởi ORF nhỏ nhất của HBV Đã có rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy những bằng chứng xác thực về vai trò cần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV Đặc biệt, có một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng HBx liên kết với cccDNA [13], và HBx là yếu tố cần cho quá trình phiên mã từ cccDNA [94] Ngoài ra còn một số nghiên cứu về các HBV ở động vật có vú cho thấy vai trò của các protein X đối với quá trình nhân lên của bộ gen virus [128] Những thử nghiệm về việc ức chế HBx đều cho thấy sự suy giảm

về mức độ nhân lên của virus HBV đã cho chúng ta thấy một điều rằng có thể HBx không thật sự cần thiết cho quá trình nhân lên của virus nhưng không thể nghi ngờ

gì về khả năng tăng cường mức độ nhân lên của virus [108] Quan trọng là, sự cần thiết của HBx đã được chứng minh trong các tế bào gan của người trực tiếp nhiễm HBV kiểu dại hoặc HBV có gen HBx bị bất hoạt [64]

1.1.5 Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe

a) Lựa chọn vùng trình tự ổn định, đặc hiệu cho HBV pgRNA làm đích thiết mồi/probe

HBV là virus rất được quan tâm từ nhiều thập kỷ trước, tuy nhiên cho đến nay HBV vẫn còn là một bí ẩn do hệ gen của HBV chứa nhiều biến dị di truyền và đột biến ngẫu nhiên Do đó, bước quan trọng trước khi lựa chọn vùng trình tự

pgRNA để thiết kế mồi, probe là phân tích tính đa dạng di truyền, các đột biến trong

hệ gen HBV để từ đó xác định được vùng gen ổn định, đặc hiệu nhất

Đa dạng di truyền của virus viêm gan B:

Như các virus khác, biến dị di truyền và sự tiến hóa của hệ gen là những yếu

tố quan trọng trong chu trình sống của virus HBV Tuy nhiên, khác với những virus

có hệ gen là DNA khác, HBV có những đặc tính riêng biệt làm chúng trở nên khác biệt với các virus đó Đáng chú ý là enzyme polymerase của HBV thiếu đi chức năng đọc sửa, và virus này có một bước trung gian qua RNA (pgRNA) trong chu trình nhân lên của chúng Hai đặc điểm này làm tăng khả năng xảy ra những sai số ngẫu nhiên trong suốt quá trình nhân lên của hệ gen virus, dẫn đến sự biến đổi của

hệ gen [19, 51, 52] Nói chung, tỉ lệ đột biến thay thế nucleotide của HBV ước tính vào khoảng 1,4 – 5,0 × 10−5 trên từng vị trí mỗi năm, gấp gần 10 lần so với những virus có bản chất hệ gen là DNA và RNA [76] Mặt khác, nhờ vào cấu trúc xếp chồng phức tạp của các khung đọc mở (open reading frame - ORFs) trong hệ gen của HBV, thuận lợi cho việc phát sinh các biến dị [74, 77]

Đột biến ngẫu nhiên:

Đột biến điểm ngẫu nhiên có thể xuất hiện ở những cá thể tùy thuộc vào áp lực chọn lọc khác nhau, như đã đề cập đến ở trên, hoặc xuất hiện trong quá trình nhân lên của hệ gen, phân cắt hoặc nối hệ gen virus hoặc quá trình ghép nối và sửa chữa của pgRNA [29, 98, 112] Các đột biến ở những vùng khác nhau trên hệ gen xuất hiện xuyên suốt các pha đặc hiệu trong quá trình lây nhiễm, ví dụ như đột biến xảy ra ở vùng precore (đột biến PC), ở vùng lõi nền vùng khởi động (đột biến BCP), thêm hoặc mất ở gen C, preS1 hoặc preS2, thay thế yếu tố quyết định kháng nguyên

‘a’ của HBsAg, đột biến kháng thuốc lamivudine hay các loại thuốc kháng virus

khác xảy ra ở protein Pol và đã được nghiên cứu xuyên suốt Những loại đột biến này giúp cho virus có thể sống dai dẳng trong các tế bào gan và có khả năng trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch và áp lực của điều trị Dù sao, dựa trên lý thuyết là

tiến hóa, cho đến khi chúng vẫn là những kiểu gen không gây hại, ít nhất là ở những giai đoạn đầu của pha dung nạp miễn dịch, trong khi chúng được thay thế sau đó bởi các biến dị ở các giai đoạn sau của quá trình lây nhiễm [37]

Mặc dù hệ gen của HBV tồn tại nhiều biến dị, đột biến ngẫu nhiên song vẫn tồn tại một số vùng bảo thủ cho thiết kế mồi, probe Các vùng bảo thủ trong các vùng gen của HBV đã được khảo sát từ nhiều nghiên cứu trước Karinova và cộng

sự [50] đã tìm ra hai vùng được bảo thủ trong vùng gen S và X Hai vùng gen này

có liên quan đến sự sao chép của HBV và lây nhiễm tế bào gan Đặc biệt, vùng gen

X có liên quan mật thiết với HCC Trong nghiên cứu này, vùng gen S được lựa chọn là vùng có tỉnh ổn định và đặc hiệu cho HBV, vùng đích thiết kế mồi, probe

S Ngoài ra, vùng này cần thiết cho sự lắp ráp và bài tiết các hạt virus, tương tác với kháng nguyên bề mặt [85] Do đó, vùng đầu N-terminal của gen S được lựa chọn làm vùng gen đích cho thiết kế mồi, probe trong phản ứng RT-qPCR định lượng HBV RNA

1.1.6 Chu trình nhân lên của HBV

HBV là một tác nhân truyền nhiễm chủ yếu qua đường máu và dịch cơ thể Qua tương tác với thụ thể vận chuyển nhân tế bào và protein nhận, lõi capsid và relaxed circular HBV DNA (rcDNA) (hệ gen virus) được chuyển vào tế bào gan [47] Tuy nhiên, trước đó rcDNA được cải biến để chuyển thành dạng cccDNA (DNA dạng vòng mạch kép) Cơ chế chuyển đổi như sau: Đầu tiên, rcDNA được gắn với polymerase để khởi động quá trình Sau đó, loại RNA primer ở đầu 5’ sợi

dương, loại trình tự thừa r và protein P ở đầu 5’ sợi âm Bước tiếp theo là hoàn thiện sợi dương không hoàn chỉnh Cuối cùng, lai sợi âm và sợi dương với nhau hình thành cccDNA, cccDNA được chuyển vào trong tế bào gan [31]

Qua sự hình thành cccDNA trong lây nhiễm tế bào gan, sự nhân lên của virus trong tế bào gan như sau: cccDNA là khuôn phiên mã ra 5 loại RNA của virus cần thiết choc ho việc tạo các kháng thể và quá trình nhân lên của virus Sau đó, quá trình diễn ra trong bào tương phiên mã ngược pgRNA trong các nucleocapsid mới hình thành RcDNA có chứa nucleocapsid tiếp theo được bao gói trong hạt virus và được tiết ra dòng máu [115]

Hoạt tính phiên mã của cccDNA có thể được xác định qua đo tải lượng pgRNA trong tế bào gan Để tránh sinh thiết gan, các marker tự do trong huyết tương được sử dụng để đánh giá hoạt tính phiên mã của cccDNA trong dự báo đáp ứng điều trị CHB Thêm vào đó, HBV RNA được xác định có mặt trong máu ngoại

vi bệnh nhân CHB và quan trọng nhất là pgRNA được bao gói trong hạt virus PgRNA huyết tương phản ánh lượng pgRNA trong tế bào gan, vì vậy pgRNA trong huyết tương gián tiếp phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan [7]

Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [49]

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [49]

1.1.7 Con đường lây nhiễm của virus HBV

Theo WHO, HBV có thể tồn tại bên ngoài cơ thể ít nhất 7 ngày Trong khoảng thời gian đó, virus vẫn có khả năng lây nhiễm nếu như virus có thể xâm nhập vào cơ thể của một người không được bảo vệ bởi vaccine Quá trình ủ bệnh của virus HBV trung bình khoảng 75 ngày, nhưng có thể nằm trong khoảng từ 30

đến 180 ngày Virus có thể được phát hiện trong khoảng từ 30 đến 60 ngày sau khi

bị nhiễm virus và có thể kéo dài dai dẳng và phát triển thành viêm gan B mạn tính

Ở các vùng có mật độ lây nhiễm cao, HBV thường có xu hướng lây truyền từ

mẹ sang con trong khoảng thời gian mang thai, hoặc qua truyền thẳng (lây nhiễm qua máu người mang virus), đặc biệt là từ trẻ nhiễm virus sang trẻ không nhiễm trong khoảng 5 năm đầu Sự phát triển của viêm gan B mạn ở trẻ sơ sinh thường là

do người mẹ truyền sang trong khoảng thời gian mang thai hoặc trong 5 năm đầu đời

HBV còn lan truyền qua da hoặc niêm mạc với máu của người bị nhiễm bệnh

và một số dịch cơ thể, ví dụ như nước bọt, kinh nguyệt, dịch âm đạo và tinh dịch Lây truyền qua đường tình dục cũng có thể xảy ra, đặc biệt là người nam chưa tiêm vaccine có quan hệ tình dục với nhiều người người đồng giới và khác giới Nhiễm HBV ở người trưởng thành có ít hơn 5% là dẫn đến hình thành tình trạng viêm gan mãn tính Sự lây truyền của virus còn có thể xảy ra qua việc sử dụng lại kim và ống tiêm ở các trung tâm chăm sóc sức khỏe Thêm vào đó, sự lây nhiễm có thể xảy ra trong quá trình phẫu thuật, chăm sóc sức khỏe hay nha khoa, thông qua xăm hình hoặc qua sử dụng dao cạo hoặc những vật dụng tương tự có nhiễm với máu của người mang virus

1.2 Tổng quan về viêm gan B mạn tính

 Nồng độ ALT/AST tăng cao liên tục và kéo dài

 Sinh thiết gan cho thấy mức độ viêm gan vừa hoặc nặng

Viêm gan B mạn tính là hiện tượng viêm hoại tử gan do nhiễm HBV kéo dài trên 6 tháng Viêm gan B mạn tính chia thành 2 thể là HBeAg dương tính và HBeAg âm tính Viêm gan B mạn tính nếu không được điều trị có thể tiến triển thành xơ gan hay HCC [63]

Các triệu chứng lâm sàng thường không nhiều và đôi khi khá mờ nhạt, gồm mệt mỏi, đau hạ sườn phải, vàng da và ngứa khi có tắc mật Khám lâm sàng thấy gan to mức độ vừa, đôi khi đau, có thể thấy lách to

1.2.2 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Nhiễm HBV là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu, ước tính khoảng

248 triệu người mang virus này trên toàn thế giới, trong đó tỉ lệ tử vong có thể lên đến 600,000 người/năm do các bệnh lý liên quan đến HBV [70, 78] Mặc dù đã có

sự phát triển của các vaccine ngăn chặn bệnh với hiệu quả cao từ những năm 1980

và việc bổ sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia, bệnh gan do nhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội

Hepatitis B virus (HBV) là virus thuộc họ Hepadnviridae và có đặc tính

phiên mã ngược từ RNA giống như các retrovirus Virus viêm gan B (HBV) là nguyên nhân gây ra nhiễm thoáng qua và mạn tính ở gan Nhiễm thoáng qua có thể gây nên một số bệnh lý nghiêm trọng, khoảng 0,5% người nhiễm thoáng qua có khả năng tử vong, viêm gan cấp tính Nhiễm viêm gan B mạn tính có thể có những hậu quả nghiêm trọng như: khoảng 25% bệnh nhân nhiễm viêm gan B mạn tính có thể tiến tới ung thư gan [12] Số bệnh nhân tử vong do ung thư gan liên quan đến HBV trên toàn thế giới có thể lên đến một triệu người mỗi năm [79]

Hiện nay trên thế giới ước tính có khoảng hai tỷ người đã từng nhiễm HBV, trong đó có 248 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính (dương tính với kháng nguyên bề mặt HBsAg) [78, 93] Tỷ lệ dương tính với HBsAg theo báo cáo là 3,6%, tuy nhiên tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào từng khu vực địa lý khác nhau Tỷ

lệ của viêm gan B mạn tính thấp hơn 2% ở các khu vực như Mỹ, Canada và Tây Âu; các nước có tỷ lệ trung bình (2-7%) như các nước ở Địa Trung Hải, Nhật Bản,

Trung Á, Trung Đông và một vài nước Nam Mĩ; và các nước có tỷ lệ cao (trên 8%)

là các nước ở Tây Phi, Nam Sudan [78, 93, 125]

Sự khác biệt dẫn đến tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính khác nhau ở từng khu vực trên thế giới phần lớn liên quan đến độ tuổi có mối liên quan nghịch với nguy

cơ tiến triển thành mạn tính Tỷ lệ tiến triển từ nhiễm HBV cấp tính sang mạn tính

là khoảng 90% đối với trường hợp nhiễm khi còn trong thai kỳ của người mẹ [97], khoảng từ 20 - 50% cho trẻ em từ 1 đến 5 tuổi [101, 117] và nhỏ hơn 5% ở giai đoạn trưởng thành [101]

1.2.3 Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam

Ở Việt Nam có rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV nước ta đứng hàng cao nhất thế giới Tần suất HBsAg dương tính ở người lớn từ 15 đến 21% thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người mang HBV mạn tính [2] Tỷ lệ mang anti-HBs trên 60%, tuy vậy tỷ lệ nhiễm HBV

ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng tác giả cũng khác nhau

HBV là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh liên quan đến gan và nó có thể dẫn đến viêm gan cấp tính và mạn tính [92] HBV có thể gây ra các biến chứng muộn như viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan; do đó nó vẫn

là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu [127]

Hiện nay, interferon-α (IFN) thông thường, interferon-α duy trì (Peg-IFN) và các thuốc kháng virus đồng đẳng nucleot(s)ide (NAs - nucleos(t)ide analogs) là các loại thuốc được chấp nhận cho điều trị viêm gan B mạn tính (CHB) Trong khi IFN

có khả năng kháng virus, chống sự tăng sinh của virus và hiệu ứng miễn dịch thì các loại thuốc kháng virus đồng đẳng nucleoside (như lamivudine, entecavir, telbivudine) và các loại thuốc kháng virus đồng đẳng nucleotide (như adefovir, tenofovir) lại có khả năng ức chế hoạt tính của DNA polymerase của virus HBV và khiến cho quá trình phiên mã ngược từ RNA sang DNA bị dừng lại [109] Mặc dù, các loại thuốc kháng virus đồng đẳng như vậy ức chế sự nhân lên của HBV, giảm

thuốc đang được sử dụng hiện nay có khả năng chữa khỏi nhiễm HBV do các loại thuốc đó đều hiếm khi có thể loại bỏ virus hoàn toàn [15, 109] Việc tìm ra phân tử đích hiệu quả của các loại thuốc kháng HBV mới hiện nay là vô cùng cần thiết để

có thể chữa trị khỏi cho bệnh nhân nhiễm HBV Các phân tử đích đó có thể là các phân tử nằm trong quá trình nhiễm và nhân lên của virus HBV [118] Vì vậy, việc hiểu về bản chất sinh học của virus HBV cũng như chu trình sống của virus này là rất cần thiết cho việc xác định những phân tử đích của các loại thuốc kháng virus và phát triển các loại thuốc kháng virus mới có khả năng chữa trị khỏi và loại bỏ hoàn toàn virus HBV

Anti-HBs: là kháng thể sinh ra do đáp ứng với kháng nguyên bề mặt của

HBV Anti-HBs là dấu ấn phản ánh tình trạng đã khỏi bệnh hoặc đã miễn nhiễm Anti-HBs xuất hiện khoảng 3 tháng sau khi bệnh khởi phát và thường khoảng 1-10 tuần sau khi HBsAg âm tính

 HBcAg: là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapsid (kháng nguyên lõi),

thường phát hiện trong nhân tế bào gan nhiễm HBV và không bao giờ xuất hiện trong máu

 Anti-HBc: là dấu ấn rất quan trọng để khẳng định bệnh nhân đã từng nhiễm

HBV, anti-HBc không được tạo ra trong tiêm chủng Đồng thời các lớp kháng thể của anti-HBc còn có ý nghĩa trong chẩn đoán giai đoạn cấp hay mạn tính của nhiễm HBV Trong giai đoạn viêm gan B cấp tính, anti-HBc IgM dương tính ở nồng độ

cao, sau đó sẽ giảm dần và biến mất trong giai đoạn mạn tính, lúc này chỉ còn HBc IgG dương tính Tuy nhiên anti-HBc IgM (+) trong các đợt kịch phát cấp tính của viêm gan B mạn tính

anti- HBeAg: có cùng nguồn gốc gen với HBcAg, HBeAg được tổng hợp vượt trội

trong giai đoạn nhân lên của virus, vì vậy kháng nguyên này có ý nghĩa trong đánh giá tình trạng tiến triển hay tiềm tàng của HBV trong cơ thể người bệnh và khả năng lây nhiễm (vợ/chồng, con)

 Anti-HBe: sự chuyển đảo huyết thanh xảy ra khi anti-HBe từ âm tính chuyển

sang dương tính và HBeAg từ dương tính chuyển sang âm tính Hiện tượng này phản ánh sự nhân lên của HBV giảm dần hoặc chấm dứt

HBV DNA: dương tính trong các giai đoạn virus đang hoạt động và nhân lên

mạnh ở tế bào ký chủ Trong thực hành điều trị lâm sàng viêm gan B mạn tính, chỉ

số nồng độ HBV DNA có ý nghĩa quan trọng, là một trong các chỉ số quyết định liên quan đến quyết định điều trị, phác đồ điều trị cũng như tiên lượng sau điều trị

b) Các xét nghiệm định lượng hiện nay về dấu ấn virus học

 Định lượng HBV DNA

Phần lớn các xét nghiệm định lượng HBV DNA được sử dụng trên lâm sàng đều dựa trên nguyên lý khuếch đại chuỗi phản ứng polymerase (PCR) với ngưỡng phát hiện 50 – 200 IU/ml (250-1000 copy/ml) [80], và dải đo lên tới 4-5 log10IU/mL Gần đây, công nghệ PCR xét nghiệm HBV DNA với độ nhạy cải thiện (5-

10 IU/mL), cho phép mở rộng dải đo lên tới 8-9 log10 IU/mL [120] Tải lượng HBV DNA là một dấu ấn chủ yếu để đánh giá bệnh nhân viêm gan B mạn tính và làm cơ

sở để đưa ra biện pháp điều trị chống virus hiệu quả

Một khó khăn trong việc sử dụng nồng độ HBV DNA trong huyết tương để đánh giá là tìm ra giới hạn có ý nghĩa được sử dụng để xác định các chỉ định điều trị

và sự đáp ứng Do HBV DNA tồn tại trong cả huyết thanh của những người đã khỏi

đến sự tiến triển của bệnh gan và sự loại bỏ hoàn toàn virus là một một mục tiêu điều trị không thực tế Một giá trị chuẩn 20,000 IU/mL (105

copy/mL) được lựa chọn như một tiêu chuẩn chẩn đoán viêm gan B mạn tính tại hội nghị NIH 2000 [62] Tuy nhiên, viêm gan B mạn tính, xơ gan và HCC đã gặp ở những bệnh nhân

có nồng độ HBV DNA dao động nhiều từ không xác định được cho đến nồng độ > 2,000,000 IU/mL [26]

 Định lượng HBeAg và HBsAg

Ngoài nồng độ HBV DNA, một số khảo sát lâm sàng đã cung cấp bằng chứng cho thấy mối quan hệ giữa các kháng nguyên khác với virus, ví dụ như kháng nguyên e (HBeAg) và kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với quá trình tiến triển tự nhiên của bệnh cũng như bệnh nhân đáp ứng với điều trị kháng virus [14, 40, 89, 121] Theo đó, sự phát triển của những xét nghiệm định lượng các kháng nguyên quan trọng của virus bao gồm cả HBeAg và HBsAg đã trở thành một trọng tâm của giai đoạn tiếp theo trong nghiên cứu lâm sàng

Trong quá trình nhân lên của HBV, các sản phẩm protein như HBsAg có thể được tổng hợp dư thừa dẫn đến hiện tượng ở một số bệnh phẩm chúng ta thấy các tiểu thể kích thước nhỏ (32nm) hình cầu hoặc hình ống Đây là một trong những nguyên nhân giải thích tại sao việc định lượng nồng độ HBsAg trong máu ít có giá trị trong việc đánh giá mức độ hoạt động của HBV Tất cả các hạt HBV hoàn chỉnh cũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đều có trong máu và lưu hành trong hệ tuần hoàn

c) Phát hiện về dấu ấn phân tử HBV pgRNA huyết tương và vai trò của dấu

virus có tái tạo trong các tế bào hay không Sau đó, Colucci và CS đã sử dụng phương pháp lai Southern blot [27] và Hadchouel cùng CS sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ (in-situ hybridization) đã phát hiện HBV pgRNA không chỉ có ở những bệnh nhân HBsAg dương tính mà còn có ở những bệnh nhân HBsAg âm tính [38] Tuy nhiên, các phương pháp này chưa đủ độ nhạy để phát hiện các bản sao phiên mã ở những bệnh nhân bị nhiễm HBV với nồng độ thấp trong máu ngoại vi [38] Ngoài

ra, cũng có một số báo cáo về việc phát hiện HBV pgRNA trong máu ngoại vi bằng

kỹ thuật PCR, nhưng những báo cáo này thực hiện trên số lượng bệnh nhân không nhiều Do đó, mối quan hệ giữa HBV pgRNA trong máu ngoại vi và đặc điểm lâm sàng chưa được khảo sát ở những báo cáo trên

Những năm sau đó, Shi và CS đã sử dụng phương pháp Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) để phát hiện HBV pgRNA lưu hành trong máu ngoại vi của bệnh nhân [72] Kết quả là đã phát hiện được HBV pgRNA ở 19/57 (37,1%) bệnh nhân có HBsAg dương tính và 1/10 (10%) bệnh nhân

có HBsAg âm tính, trong khi đó 6 bệnh nhân khỏe mạnh đều không xuất hiện sự có mặt của HBV pgRNA Tần số của HBV pgRNA dương tính được phát hiện ở những bệnh nhân có mức ALT cao, HBeAg huyết thanh dương tính và mức độ HBV DNA ≥ 0,7 Meq/ml

Năm 2015, Louis và CS đã sử dụng kỹ thuật Realtime PCR có độ nhạy cao

để phát hiện và định lượng nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương của những bệnh nhân viêm gan B mạn tính [43] Kết quả là đã phát hiện được HBV pgRNA trong huyết tương của tất cả bệnh nhân viêm gan B mạn tính có HBeAg dương tính

và HBeAg âm tính Thêm vào đó, đã có nhiều báo cáo cho thấy phát hiện được HBV pgRNA có mặt trong huyết tương trong khi điều trị với NA [39, 41, 90, 126]

1.3.2 Trong nước

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng ở nước ta đứng hàng cao nhất thế giới Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21%

HBV mạn tính [3] Với diễn biến phức tạp trong điều trị bệnh viêm gan B mạn tính

và tiên lượng nặng nề của các biến chứng liên quan HBV về bệnh gan như xơ gan

và ung thư biểu mô tế bào gan, vấn đề quản lý, giám sát người nhiễm HBV mạn tính ở nước ta những năm gần đây rất được quan tâm nghiên cứu Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập về vai trò của các dấu ấn huyết thanh virus học trong dự báo đáp ứng điều trị và tiên lượng sau điều trị

Năm 2012, Trần Ngọc Ánh công bố kết quả nghiên cứu về nồng độ HBsAg, HBV DNA huyết tương trên 279 bệnh nhân viêm gan B mạn tính Kết quả cho thấy nồng độ HBsAg trung bình 3,66 ± 0,44 log10IU/ml, HBV DNA trung bình 7,3 ± 1,67 log10 copies/ml Nồng độ HBsAg, HBV DNA cao hơn đáng kể ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tính HBeAg dương tính so với nhóm HBeAg âm tính, không

có sự liên quan giữa nồng độ HBsAg và HBV DNA (p = 0,231, r = 0,136) ở cả hai nhóm bệnh nhân [1]

Tuy nhiên, tác giả Phạm Hoàng Phiệt và Nguyễn Phương Thảo trong một công bố năm 2010 trên 97 bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính đã đưa ra nhận định khác Nhóm bệnh nhân nghiên cứu có HBV DNA ở mức cao và ALT > 60 IU/ml đã cho thấy nồng độ HBsAg có mối tương quan khá chặt chẽ với nồng độ HBV DNA

ở nhóm bệnh nhân có HBeAg dương tính, mối tương quan này chặt chẽ hơn ở thể viêm gan có HBeAg âm tính (r=0,6336;p=0,000 so với r=0,303;p<0,0287 tương ứng) [5] Kết luận này cũng được tác giả Hoàng Tiến Tuyên và CS xác nhận trong một nghiên cứu công bố năm 2017, đồng thời nhóm tác giả cũng nhận thấy không

có sự tương quan giữa nồng độ HBsAg, HBV DNA với hoạt độ ALT trên các nhóm bệnh nhân viêm gan mạn tính [4]

Tác giả Võ Triều Lý và CS năm 2015 đã công bố một nghiên cứu bước đầu về định lượng HBsAg giúp phân biệt người mang HBV không hoạt động (I) và viêm gan

B mạn tái hoạt (II) cho thấy HBsAg định lượng của nhóm I (inactive carrier) thấp hơn nhóm II (active carrier) có ý nghĩa thống kê HBsAg định lượng tại một thời điểm với

giá trị < 1000 IU/mL có thể giúp phân biệt người mang HBV không hoạt động và viêm gan B mạn tính tái hoạt [6]

Kết quả của các tác giả trong nước tương đối phù hợp với nhận định thu được từ các nghiên cứu trên thế giới về vai trò của HBsAg trong đáp ứng điều trị và tiên lượng bệnh viêm gan B mạn tính Tuy nhiên, nhiều báo cáo cũng đã đề cập về việc tạo ra một cách dư thừa lượng HBsAg trong huyết tương bệnh nhân viêm gan

B mạn tính làm giảm vai trò của yếu tố nồng độ HBsAg trong việc phản ánh nồng

độ cccDNA trong tế bào gan cũng như sự nhân lên của HBV [82], [96] Việc trị liệu các bệnh nhân viêm gan B mạn tính bằng các NAs mới có hoạt tính kháng virus cao như entecavir hay tenofovir làm giảm nhanh nồng độ HBV DNA huyết tương, điều này làm giảm vai trò về động học của HBV DNA đối với việc dự báo chuyển đảo HBeAg trong quá trình điều trị

Mặc dù các nghiên cứu trên thế giới gần đây đã đề cập đến vai trò của nồng

độ HBV pgRNA huyết tương trong dự báo chuyển đảo huyết thanh và đáp ứng virus bền vững sau điều trị bằng NA [115], [18] Việc giám sát quản lý nhiễm HBV mạn tính ở các cơ sở y tế trong nước hiện nay chủ yếu theo các hướng dẫn của một

số hiệp hội về bệnh gan lớn trên thế giới (AASLD - Hội nghiên cứu bệnh gan Mỹ, EASL - Hiệp hội nghiên cứu gan châu Âu, APASL - Hiệp hội nghiên cứu bệnh gan Châu Á Thái Bình Dương), chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá về các dấu ấn mới trong giám sát theo dõi và quản lý với các bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở Việt Nam Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố về quy trình định lượng tải lượng HBV pgRNA huyết tương cũng như vai trò của biến động tải lượng HBV pgRNA trong đáp ứng điều trị cũng như tiên lượng sau điều trị trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở Việt Nam

1.4 Tính mới và tính sáng tạo của đề tài

Mục tiêu điều trị của viêm gan B mạn tính là cải thiện chất lượng cuộc sống

và duy trì sự sống bằng cách ngăn chặn sự tiến triển của bệnh xơ gan, xơ gan mất

tiêu có thể đạt được nếu sự sao chép của HBV bị ức chế và duy trì liên tục Việc giảm nồng độ HBV DNA kèm theo hoạt động mô học của viêm gan B mạn tính làm giảm nguy cơ xơ gan và giảm nguy cơ HCC, đặc biệt trong những bệnh nhân xơ gan [59] Tuy nhiên, nhiễm HBV mạn tính không thể hoàn toàn bị loại trừ do sự tồn tại bền vững của covalently closed circular DNA (cccDNA) trong nhân của tế bào gan bị nhiễm HBV [21, 87] Hơn nữa, bộ gen HBV được tích hợp vào hệ gen của vật chủ và có thể phát sinh ung thư [20, 23, 83]

Các nghiên cứu trên thế giới và trong nước đánh giá vai trò của các dấu ấn virus viêm gan B như HBV DNA, HBeAg, HBsAg đã có đóng góp tích cực nhất định trong việc kiểm soát bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Tuy nhiên cho đến nay, chưa có một mô hình nào có thể dự báo đáp ứng virus sớm trong điều trị, dự báo đáp ứng virus bền vững sau kết thúc điều trị mang lại hiệu quả cao trong thực hành lâm sàng [60], [18], [105]

Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN 2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside (nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir, Tenofovir [32], [63] Sự ức chế dài hạn việc tái bản HBV bằng NAs làm giảm đánh

α-kể những biến chứng liên quan đến nhiễm HBV, tuy nhiên thời gian điều trị với các NAs không được xác định và với hầu hết bệnh nhân phải điều trị suốt đời [63] Ở một

số bệnh nhân được điều trị bằng NAs, sự chuyển đảo HBeAg huyết thanh có thể xảy

ra với sự biến mất của HBeAg và xuất hiện anti-HBe Đến nay, chuyển đảo HBeAg huyết thanh được công nhận là một dấu mốc quan trọng trong quá trình điều trị nhiễm HBV mạn tính, là điều kiện tiên quyết cho sự chuyển đảo HBsAg huyết thanh, cả hai đều đại diện cho sự thuyên giảm nhiễm HBV một cách ổn định và cho phép ngừng điều trị [32], [18] Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu trên thế giới và trong nước vẫn chưa thiết lập được các công cụ hiệu quả nhằm dự báo sự chuyển đảo HBeAg như một kết quả của quá trình điều trị với các NAs

Sự suy giảm mạnh về nồng độ HBV DNA huyết tương ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tính khi được đơn trị liệu bằng NAs đã được nhiều nghiên cứu đề cập [32], [111] Tuy nhiên việc ức chế tổng hợp DNA không ảnh hưởng trực tiếp tới nguồn cccDNA trong nhân tế bào gan bị nhiễm, do đó hầu như không loại bỏ hoàn toàn được cccDNA trong thực hành lâm sàng [71] và khi ngừng điều trị, người ta lại thấy sự phục hồi trở lại của HBV DNA trong huyết tương người bệnh Một số nghiên cứu cho thấy nồng độ HBsAg cũng là một yếu tố tiềm năng trong tiên lượng đáp ứng điều trị và tiên lượng các biến chứng gặp phải trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính [44], [96], [24] Tuy nhiên, việc HBsAg được tạo ra một cách dư thừa trong máu ngoại vi nên HBsAg cũng chưa phản ánh chính xác cccDNA trong nhân

tế bào gan và điều này làm giảm vai trò của yếu tố nồng độ HBsAg trong các tiên lượng về sự nhân lên của HBV

Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vào loại cao nhất trên thế giới [56] và nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nề tại nước ta Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểm soát điều trị cũng như quản lý hạn chế sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràng trong bối cảnh phổ biến của nhiễm HBV mạn tính và sự phức tạp, khó khăn trong điều trị một cách triệt để các bệnh gan liên quan đến HBV Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào trong nước được thực hiện nhằm làm rõ hơn những vấn đề hết sức tiềm năng về ý nghĩa lâm sàng của tải lượng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính Các nghiên cứu trên thế giới về định lượng HBV pgRNA vẫn còn tiến hành với số lượng bệnh nhân chưa nhiều Chính vì vậy, cần thiết phải xây dựng một quy trình định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đối tượng là các bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng nucleoside ở nước ta

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân viêm gan B mạn tính (CHB) Cỡ mẫu (n = 77) được xác định theo phương pháp nghiên cứu lâm sàng, nhóm bệnh nhân này được sử dụng để đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA sau quá trình tối ưu và đánh giá nhằm đánh giá quy trình trên mẫu bệnh nhân CHB Đồng thời, so sánh với các quy trình định lượng HBV pgRNA trên thế giới hiện nay Nhóm chứng: 50 người khoẻ mạnh

để xây dựng panel độ đặc hiệu Ngoài ra, sử dụng 5 mẫu bệnh nhân viêm gan C Quá trình tối ưu quy trình RT-qPCR sử dụng các mẫu chuẩn dương sẽ thiết kế ở phần sau đây

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu: Chẩn đoán nhiễm HBV mạn tính: Bệnh nhân viêm gan vi rút B mạn tính được xác định theo tiêu chuẩn của Hiệp hội gan mật Mỹ - 2018 [104]:

 HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti-HBc IgG (+)

 HBV DNA ≥ 105 copy/mL ở nhóm HBeAg (+) và ≥104 copy/mL ở nhóm HBeAg (-)

 ALT tăng liên tục hay từng đợt

Tiêu chuẩn chọn nhóm chứng:

Nhóm chứng là những người khỏe mạnh bình thường, không có bệnh lý về gan Các đối tượng nghiên cứu thuộc nhóm chứng đều được khám và xét nghiệm chức năng gan và các dấu ấn của virus viêm gan trước khi thu thập mẫu máu

Tiêu chuẩn loại trừ:

Loại trừ những bệnh nhân ra khỏi nhóm bệnh nhân nghiên cứu khi có các tình trạng sau:

+ Đồng nhiễm virus viêm gan khác hoặc HIV

+ Bệnh nhân có tổn thương gan do nguyên nhân khác: rượu, do thuốc,

do hóa chất, do bệnh gan tự miễn

+ Bệnh nhân đang trong giai đoạn thai kỳ và đang cho con bú

+ Bệnh nhân mắc các bệnh kết hợp như đái tháo đường, viêm đường mật

+ Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Vật liệu, hóa chất

Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị

1 Máy đo nồng độ DNA Mỹ

2 Máy vortex Hàn Quốc

3 Máy ly tâm Hàn Quốc

4 Tủ an toàn sinh học cấp độ Hàn Quốc

Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu

1 Hóa chất dùng trong tách chiết RNA tổng

số

2 Hóa chất dùng trong phản ứng RT-qPCR

1 Quantitect probe master mix QIAGEN

4 Nước khử deion DNA/RNAse Free Thermo Scientific

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết lập tiêu chuẩn

lựa chọn mẫu

Tối ưu quy trình

RT-qPCR

Thiết kế mồi, probe

Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen đích

Đánh giá quy trình

Thiết lập quy trình RT-qPCR

Thiết lập chứng dương, bộ mẫu chuẩn

2.2.2 Thu thập, bảo quản mẫu

- Quy trình thu thập mẫu, lưu trữ bảo quản:

+ Quy trình thu thập bảo quản mẫu được áp dụng cả ở khu vực điều trị bệnh

nhân và phòng xét nghiệm

+ Các mẫu máu ngoại vi được bảo quản lạnh 4°C - 8°C và chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu, được gán mã riêng biệt

Quy trình kỹ thuật lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi: Mẫu máu tĩnh mạch

ngoại vi với thể tích 5 ml/người được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA Trong vòng 2 giờ sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến labo, tách huyết tương bằng ly tâm 1500 g trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylen Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -80°C đến khi phân tích

2.2.3 Tách chiết acid nucleic

RNA huyết tương được tách chiết bằng bộ kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit (QIAGEN) sử dụng quy trình tách máu và dịch cơ thể theo khuyến cáo của nhà sản xuất, sau đó được xử lý bằng DNase I, RNase-free (Thermo Fisher Scientific) để loại bỏ DNA trước khi tiến hành tách chiết RNA Thể tích huyết tương được sử dụng để tách chiết RNA là 500 µL và thể tích RNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µL

2.2.4 Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương

a) Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV-RNA trong huyết tương bệnh nhân CHB

Xác định được vùng bảo tồn là vùng gen S (kích thước khoảng 1200 nu, vùng N-terminal là vùng bảo tồn hơn cả (đã chứng minh ở phần tổng quan), vùng này được đánh dấu để thiết kế mồi, probe Bước tiếp theo là đánh giá tính đa hình, đột