Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tinh sạch và đánh giá ảnh hưởng của hợp chất prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng lưới nội chất tế bào

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng Prodigiosin từ Serratia marcescens trong phát triển thuốc. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu chuyên sâu nào về ảnh hưởng của Pg lên mạng lưới nội chất trong tế bào, cũng như sự đáp ứng của tế bào trong môi trường có chứa Pg.

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Lệ

TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỢP CHẤT

PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG Serratia marcescens

ĐẾN MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Lệ

TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỢP CHẤT

PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG Serratia marcescens

ĐẾN MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh

Hà Nội – 2020

từ chủng Serratia marcescens đến mạng lưới nội chất tế bào” là do tôi thực

hiện dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh Tôi xincam đoan tất

cả các kết quả trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung thực và chưa từng được công bố trên bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày 05 tháng 01 năm 2021

Học viên

Nguyễn Thị Lệ

sâu sắc tới TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh, cán bộ phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - thầy hướng dẫn khoa học, người đã định hướng và tận tâm hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Đồng thời, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm và các thầy cô, cán bộ Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Khoa học

và Công nghệ đã tham gia giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt hai năm học tập và nghiên cứu tại Học viện.Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt hai năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnhchia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiên tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận của mình

Hà Nội, ngày 05 tháng 01năm 2021

Học viên

Nguyễn Thị Lệ

ATF6 Activating Transcription Factor – 6 (yếu tố dịch mã)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao)

IRE1 Inositol Requiring Enzyme 1

mTOR mammakian Target Of Rapamycin

MTT 3 – (4 ,5 – dimethyl – 2 – thiazolyl) – 2,5 – diphenyl – 2H –

tetrazolium bromide

NA Nutrient agar (môi trường thạch dinh dưỡng)

NB Nutrient borth (môi trường canh thang dinh dưỡng)

Pg Prodigiosin

PERK PKR – like Endoplasmic Reticulum kinase (một loại protein

màng lưới nội chất mang hoạt tính kinaza)

Hình 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Serratia marcescensVTCC 910027 3

Hình 1.2 Các gen tham gia sinh tổng hợp prodigiosin ở một số chủng vi khuẩn 5

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử prodigiosin gồm ba vòng pyrol đặc trưng 6

Hình 1.4 Các con đường truyền tín hiệu của phản ứng cuộn gập protein 16

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn Prodigiosin 24

Hình 3.1 Bình chiết tế bào bằng hệ dung môi ethyl acetate + 1% HCl (A) và acetone (B) 29

Hình 3.2 Bình rửa dịch chiết Pg trong acetone rửa bằng ethylacetate và nước lần 1 (A) và lần 3 (B) 30

Hình 3.3 Bản TLC mẫu dịch chiết chủng S marcescens VTCC 910027 bằng hai dung môi acetone và acetate + 1% HCl 31

Hình 3.4 Kết quả TLC dịch chiết Pg bằng các hệ dung môi khác nhau 32

Hình 3.5 Kết quả TLC mẫu Pg tinh chế bằng hệ dung môi toluen và ethyl acetate tỷ lệ lần lượt 9:1 (A), 4:1 (B) và 7:3 (C) với cùng thể tích 34

Hình 3.6 Các phân đoạn đặc trưng của mẫu tinh sạch từ S marcescens VTCC 910027 lần 1 (A) và lần 2 (B) 35

Hình 3.7 Kết quả TLC prodigiosin tinh sạch lần 1 (A): LC1 – Dịch lên cột; 1, 2, 3 – phân đoạn sau tinh sạch; và lần 2 (B), 1, 2 – phân đoạn tinh sạch; C – Pg chuẩn 36

Hình 3.8 Kết quả chạy HPLC của dịch chiết Prodigiosin từ chủng Serratia marcescensVTCC 910026 (A) Pg chuẩn (B) 36

Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC của mẫu Prodigiosin tinh sạch 37

Hình 3.10 Phổ 1 H NMR 38

Hình 3.13 Điện di đồ phân tích RNA tổng số của các mẫu thí nghiệm bổ sung hàm lƣợng Pg khác nhau Giếng 1: ĐC (-); Giếng 2: ĐC (+); Giếng 3: Hàm lƣợng Pg 0.2 μg/ml 41 Hình 3.14Điện di đồ phân tích sự có mặt của mRNA Hac1s 1 – maker; 2 , 3 ,

4 – hàm lƣợng Pg 0,1 g /ml, 0,15 g /ml và 0,2 g /ml; 5 ĐC (+) DTT; 6 ĐC (-) knock out Ire1 41 Hình 3.15 Hàm lƣợng Pg đo đƣợc bằng đếm mật độ điểm ảnh 42

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Serratia marcescens VÀ HỢP CHẤT PRODIGIOSIN 3

1.1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens 3

1.1.1.1 Đặc điểm 3

1.1.1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens 4

1.1.2 Nguồn gốc, đặc điểm của prodigiosin 5

1.1.3 Tinh sạch và xác định cấu trúc của prodigiosin 6

1.1.4 Hoạt tính sinh học của prodigiosin 7

1.1.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 7

1.1.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của prodigiosin 8

1.1.5 Ứng dụng của prodigiosin 10

1.1.5.1 Ứng dụng của prodigiosin trong công nghệ thực phẩm 10

1.1.5.2 Ứng dụng của prodigiosin trong phát triển thuốc 11

1.1.6 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescens ở Việt Nam 12 1.1.7 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescens trên thế giới 12 1.2 ẢNH HƯỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT 14

1.2.1 Mạng lưới nội chất và hiện tượng ER stress 14

1.2.2 Stress lưới nội chất ở tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 17

1.2.3 Ảnh hưởng của Prodigiosin lên mạng lưới nội chất 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Hoá chất 21

2.1.3 Các loại môi trường nuôi cấy và đệm 21

2.1.4 Trang thiết bị 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Hoạt hóa Serratia marcescens 22

2.2.2 Hoạt hóa chủng nấm men KMY 1516 23

2.2.3 Lựa chọn hệ dung môi tách chiết prodigiosin 23

2.2.4 Xây dựng đường chuẩn prodigiosin dựa trên mật độ quang 24

2.2.5 Tinh chế prodigiosin bằng phương pháp sắc ký 25

2.2.5.1 Phương pháp sắc ký cột 25

2.2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 25

2.2.5.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp 26

2.2.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của prodigiosin lên mạng lưới nội chất tế bào 27

2.2.6.1 Phương pháp xác định hoạt tính β – galactosidase 27

2.2.6.2 Phương pháp tách chiết, tạo thư viện cDNA và đọc trình tự mRNA tổng số 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TÁCH CHIẾT PRODIGIOSIN 29

3.2 XÁC ĐỊNH HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TINH SẠCH PRODIGIOSIN 32

3.2.1 Lựa chọn hệ dung môi thích hợp 32

3.2.2 Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp 33

3.3 TINH SẠCH PRODIGIOSIN QUA CỘT SILICAGEL 34

3.3.1 Tinh sạch 34

3.3.2 Xác định độ sạch của Pg bằng HPLC 36

3.3.3 Xác định độ sạch prodigiosin bằng phổ 1H 37

3.4 XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO 38

3.4.1 Ảnh hưởng của Prodigiosin đến protein màng Ire1 38

3.4.2 Xác định hàm lượng của Hac1 mRNA 40

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 KẾT LUẬN 44

4.2 KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

MỞ ĐẦU

Hiện nay, có nhiều phương pháp điều trị ung thư đã và đang được sử dụng trên thế giới như: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp nội tiết, liệu pháp miễn dịch, liệu pháp tế bào gốc, điều trị cá thể hóa, điều trị hướng đích, Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều tồn tại những tác dụng phụ nhất định Để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của khối u, hóa trị là biện pháp hiệu quả cả ở giai đoạn sớm và giai đoạn muộn của ung thư Việc nghiên cứu phát triển các thuốc chống ung thư mới với giá thành rẻ đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học

Prodigiosin (Pg) là chất chuyển hóa thứ cấp có màu đỏ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn dịch và ngăn cản sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư ở người Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng Prodigiosin từ

Serratia marcescens trong phát triển thuốc.Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có

nghiên cứu chuyên sâu nào về ảnh hưởng của Pg lên mạng lưới nội chất trong

tế bào, cũng như sự đáp ứng của tế bào trong môi trường có chứa Pg

Chính vì vậy tôi lựa chọn đề tài luận văn “Tinh sạch và đánh giá ảnh

hưởng của hợp chất Prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng

lưới nội chất tế bào”.Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa

học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 2018.332 Đề tài luận văn này nhằm mục đích sản xuất, tinh sạch được

106.02-prodigiosin từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens có độ tinh sạch cao, đánh giá ảnh hưởng của Pg này đến lưới nội chất tế bào

Trong các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính sinh

học của Pg tách chiết từ chủng Serratia marcescens, kết quả cho thấy Pg gây

độc dòng tế bào ung thư phổi LU – 1 với giá trị IC50 = 1,5 g/mL Bằng cách tiếp cận nghiên cứu cơ chế phân tử tác động của Pg đối với lưới nội chất tế bào nấm men chúng tôi sẽ tìm được cơ chế phân tử của Pg đối với tế bào ung thư và tế bào thường Việc sử dụng sinh vật mô hình là nấm men

Saccharomyces cerevisiae sẽ mang lại khả năng thành công cao hơn bởi hơn

40% trình tự gen bảo tồn ở nấm men được dự đoán là có mặt trong hệ gen

người, các cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở nấm men hoặc trong các tế bào khối u tồn tại tương tự với nhiều hơn hoặc ít hơn các chức năng trong tế bào con người.Các kết quả nghiên cứu này sẽ góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hưởng của Pg đến tế bào động vật

Toàn bộ thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Serratia marcescens VÀ HỢP CHẤT

động vật.Trong các loài vi khuẩn thì S marcescens là loài có khả năng sinh

tổng hợp Pg được biết đến sớm nhất và được tìm hiểu từ rất sớm Trong mười

loài Serratia thì chỉ có ba loài có khả năng sinh tổng hợp Pg là S plymuthica,

S rubidaea và một số nhóm S marcescens S marcescens hô hấp tùy tiện, do

đó nó có thể sinh Pg cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí.Tuy nhiên, sắc tố

đỏ chỉ xuất hiện trong một phần nhỏ của dịch nuôi cấy riêng biệt của các

chủng S marcescens Mỗi chủng có khả năng sảnxuất sắc tố khác nhau và

phụ thuộc vào nhiều yếu tố như môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH,

cacbon, nitơ và các muối vô cơ.Chủng vi khuẩnSerratia marcescenskhi nuôi

cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA)có màu đỏ, tròn, lồi, bề mặt bóng (hình 1.1)

Hình 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Serratia marcescensVTCC 910027

1.1.1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens

Khả năng sản xuất Pg của S marcescens tùy thuộc vào điều kiện nuôi

cấy, nguồn cacbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ “Chủng S marcescens sinh Pg

trong môi trường pH axit ở nhiệt độ 28oC và làm môi trường chuyển sang màu đỏ (Hình 1.1) Ở nhiệt độ 37o

C,S marcescens không sinh sắc tố đỏ.”

Sinh tổng hợp Pg bởi S marcescens MSK1 được cảm ứng chỉ bởi

methionine hoặc cysteine với sự có mặt của glucose “Sinh tổng hợp Pg được tối ưu đạt năng suất cao nhất trong môi trường chứa 0,45 manose, 0,01% methionine, 0,03% cysteine và 0,1% amonium chloride, pH 8 ở 28oC dưới điều kiện nuôi lắc 120 vòng/ phút trong 24 giờ [1].”

Shahitha và Poornima (2012)đã sử dụng các môi trường khác nhau và

các nhiệt độ khác nhau để nghiên cứu sinh tổng hợp Pg từ S

marcescens.“Sinh tổng hợp Pg cao nhất được quan sát thấy ở môi trường bột hạt lạc (37,6mg/ml) và môi trường bột hạt vừng (16,5mg/ml)khi so sánh với môi trường canh thang dinh dưỡng (NB) (0,51mg/ml) và môi trường canh thang dinh dưỡng có bổ sung glycerol (0,3mg/ml) ở 28oC, môi trường canh thang dinh dưỡng có bổ sung maltose (1,82mg/ml) Trong số dầu khác nhau, dầu lạc cho năng suất sắc tố cao (2,72mg/ml)[2].”

Môi trường canh thang dinh dưỡng có bổ sung glycerol được chọn là môi trường tổng hợp tốt nhất.”Hiệu quả của các thành phần môi trường và các thông số quá trình khác nhau như nguồn cacbon và nitơ, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi lắc và các chất bổ sung khác đã được khảo sát Hàm lượng Pg lớn nhất được sinh tổng hợp ở 25oC, pH 7 và thời gian nuôi lắc 48 giờ Bổ sung thêmmôi trường với maltose và peptone cho năng suất Pg cao nhất Ngoài ra, việc bổ sung thêm các chất như muối sắt, phosphat vô cơ cũng cho các kết quả khả quan”[3].”

ChủngS marcescens sinh tổng hợp Pg tốt nhất ở nhiệt độ28oC hoặc

30oC,“thỉnh thoảng chúng sinh tổng hợp Pg ở nhiệt độ thấp hơn như ở 25oC [3].”

Thời gian nuôi cấy các chủng S marcescens sinh tổng hợp Pg tối ưu

ngắn nhất “có thể là 24 giờ như S marcescens MSK1[1], 48 giờ như S

marcescens[3]; S marcescens S11[4]; 36 giờ như S marcescens MBB05[5];

dài hơn là 72 giờ như S marcescens SU – 10 [6], S marcescens[7], có thể tới

84 giờ như S marcescens SR1[8].”

Với các thành phần môi trường và các yếu tố nuôi cầy tối ưu,“các

chủng S marcescens được phân lập từ các nguồn khác nhau cho năng suất sinh tổng hợp Pg khác nhau Chẳng hạn chủng S marcescens 1,84527 mg/l [7], chủng S marcescens SR1 là 0,7651g/l [8].”

Pg được tổng hợp thông qua hai con đường bao gồm: MBC Methoxy-2,2'-bipyrrole-5-carboxaldehyde) và MAP (2 – methyl – 3 – n – amylpyrrole) [9].Có hơn 30 gen liên quan đến sinh tổng hợp Pg ở vi khuẩn

(4-Serratia sp ATCC 39006,điều này cho thấy lợi thế sản xuất Pg của chúng so

với các vi sinh vật sản xuất Pg khác Mỗi chủng vi khuẩn mang các gen tham gia vào quá tình sinh tổng hợp Pg khác nhau (hình 1.2)

Hình 1.2 Các gen tham gia sinh tổng hợp prodigiosin ở một số chủng vi

khuẩn[10]

1.1.2 Nguồn gốc, đặc điểm của prodigiosin

Prodigiosin (Pg, PubChem CID: 5351169),“là chất chuyển hóa thứ cấp

có màu đỏ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn

dịch và chống ung thư[11,12]được sản xuất bởi vi khuẩn Serratia

marcescens, Rubidaea, Vibrio psychroerythrous, gazogenes, Pseudomonas magneslorubra, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra[13,14] Trong đó S marcescens có hiệu suất sản xuất Pg cao nhất và được nghiên cứu rộng rãi tại

nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Pg đóng vai trò như một chất chuyển

hóa thứ cấp của S marcescens, chức năng của nó đối với vi khuẩn vẫn chưa

được làm sáng tỏ Một số nghiên cứu cho rằng Pg liên quan đến hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và tăng cường sự bám dính vi khuẩn lên các bề mặt dẫn tới tăng cường phát tán vi khuẩn.”

Ba thành viên của nhóm“prodiginine bao gồm prodigiosin, undecylprodigiosin (UP) và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG HCl), có

đặc tính ức chế miễn dịch và tác động đến tự chết tế bào ung thưin vitro và in

vivo Hiệu ứng độc tế bào của chúng là do sự hiện diện của nhóm thế C – 6

methoxy Vòng A – pyrolđóng một vai trò quan trọng trong cả hai hoạt động nuclease và độc tế bào của Pg [15].”

Nhóm sắc tố prodiginine được đặc trưng bởi cấu trúc ba vòng pyrol[16] Cấu trúc hóa học của Pg đã được làm sáng tỏ bởi nhóm nghiên cứu của Wasserman (1960) và Hlden (1962)[10].”

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử prodigiosin gồm ba vòng pyrol đặc trưng[17]

Pg“được báo cáo là có đường cong quang phổ khác nhau ở pH axit và kiềm Trong môi trường axit, Pg có màu đỏ, đường cong quang phổ từ 510 -

535 nm(đỉnh phổ) Trong môi trường kiềm Pg biểu hiện màu cam, đỉnh phổ

470 nm Pg không tan trong nước, tan trong alcohol, ete, methanol, acetone, chloroform, DMSO và dễ bị phân hủy bởi ánh sáng.”

1.1.3 Tinh sạch và xác định cấu trúc của prodigiosin

Có nhiều phương pháp chiết và tinh sạch prodigiosin khác nhau.“Song

và cộng sự (2006) đã chiết và tinh sạch Pg từ chủng S marcescens sp KH –

95 từ chất hấp phụ bên trong sử dụng methanol đã axit hóa và tách pha với nước và chloroform Tiếp theo, chất được tinh sạch bằng sắc ký silica gel và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [18].Chất tinh khiết Pg được nhận dạng cấu trúc bằng phân tích NMR.”

Ramina và Samira (2009) đã tinh sạch prodigiosin từ dịch chiết thô

chủng S marcescens UCP1549 bằng phương pháp sắc ký cột sử dụng hệ

dung môi chloroform :methanol tỷ lệ 9:1.“Pg được tinh chế qua cột sắc ký (50x1cm) sử dụng silica gel làm chất hấp phụ Sau đó được hòa vào chloroform (100ml), rồi loại dung môi bằng cô quay Sản phẩm được nhận dạng bằng đo quang phổ UV ở bước sóng 700 - 200nm trong 95% ethanol và sau đó khối phổ sử dụng methanol Kết quả đo khốiphổ cho thấy khối lượng

phân tử của Pg từ chủng S marcescens được tách chiết bằng acetone và ethyl

acetate, tinh chế bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng TLClà 324 Da [19].”

Sắc“tố đỏ từ chủng S marcescens SU – 10hòa tan trong nước và

đượcchiết bằng ethanol và HCl (9,5:0,5) hay với acetone và ethyl acetate (1:1) Pg được tiếp tục tinh sạch bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng TLC Hệ dung môi ethanol: HCl được cho là có hiệu quả nhất để chiết Pg[6]

Pg đã được tinh sạch bằng sắc ký silica gel và được phân tích bằng H - NMR quang phổ.”

1.1.4 Hoạt tính sinh học của prodigiosin

1.1.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Hoạt tính kháng sinh của Pg được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1946.“Pg có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm mà không hề ảnh hưởng đến tế bào bình thường khác [20, 21] Năm 1969, Gerber cho rằng Pg không có hoạt

tính kháng các vi khuẩn Gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Escherichia

coli, Proteus vulgaris và vi nấm Candida albicans, Trichoderma koningi, Penicillium notatum [9].Tuy nhiên, sau này Pg được công bố là có có tác

dụng ức chế đối với Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,

Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumonia

nhưng hoạt tính kháng vi khuẩn gram dương cao hơn vi khuẩn gram âm [22] Trong khi tỉ lệ kháng kháng sinh thông thường (aminoglycoside, chloramphenicol, lincosamide, macrolide, quinolone, tetracycline) của

Staphylococcus aureus kháng oxacillin ngày càng tăng thì Pg được chứng

minh là có hiệu quả ức chế đối với chủng vi khuẩn gây bệnh này, hơn cả kháng sinh tiêu chuẩn [16] Do đó, Pg là một sản phẩm tự nhiên có tiềm năng ứng dụng cao trong điều trị nhiễm khuẩn.”

Cơ chế kháng khuẩn của Pg được lý giải bằng khả năng chui qua màng, xâm nhập vào trong tế bào và ức chế các enzyme DNA gygase, topoisomerase

I, II và IV, ức chế tổng hợp vật chất di truyền trong tế bào vi khuẩn chủ [9, 23]

1.1.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Prodigiosin

Pg được biết là gây ra apoptosis trong một loạt các dòng tế bào ung thư.“Pg đã được thử nghiệm chống lại hơn 60 dòng tế bào ung thư với giá trị

IC50 trung bình là 2,1 μM Chúng kích hoạt apoptosis trong các loại tế bào ác tính khác nhau nhưng có độc tính thấp trên các tế bào bình thường[24] Pggây ratự thực bào mạnh mẽ trong các dòng tế bào ung thư ở người bao gồm ung thư bạch cầu, ung thư máu, ung thư vú, ung thư đại trực tràng và ung thưdạ dày[25].Pg có thể ức chế tín hiệu Wnt/β-cateninvà kích hoạt hoạt động chống ung thư trong tế bào ung thư vú và có thể kích hoạt lại hoạt động phiên mã phụ thuộc họ p53 trong các tế bào ung thư ruột kết thiếu p53[14, 26].”

Khả năng“kháng ung thư của Pg được nghiên cứu trên tế bào ung thư

cổ tử cung bằng phân tích 3 – (4 ,5 – dimethyl – 2 – thiazolyl) – 2,5 – diphenyl – 2H – tetrazolium bromide (MTT) và neutral red uptake (NRU) cho thấy hàmlượng Pg càng tăng thì càng làm giảm tỷ lệ phát triển của dòng tế bào HeLa – 299.Kết quả này cho thấy Pg có hoạt tính kháng ung thư biểu mô

cổ tử cung ở người [27].”

Yongze Liu“và cộng sự đã tiến hành điều trị tế bào ung thư biểu mô vòm họng ở người bằng Pg, kết quả cho thấy prodigiosin có thể ức chế sự tăng sinh, di cư và xâm lấn của các tế bào ung thư biểu mô vòm họng [23].Pg cũng đã được xác định là một chất gây cảm ứng tự thực bào trong các tế bào

ung thư biểu mô khoang miệng [25] Năm 2010, Kavitha và cộng sự đã công

bố Pg có hoạt tính chống ung thư và hoạt tính tự chết mạnh đối với các tế bào

ung thư biểu mô cổ tử cung HeLa – 299[28] Pg tách chiết từ chủng S

marcescens SER1 có khả năng ức chế tế bào ung thư kháng thuốc như

MDR1, BCRP và MRP2[29].”

Cơ chế gây apoptosis của Pg hiện nay vẫn đang được làm sáng tỏ

Trong mô hình in vivo Pg đã được chứng minh nhắm đích các tế bào ung thư

một cách độc lập với p53 trong khi p53ít hoặc không có tác dụng đối với tế bào bình thường Ngoài ra, Pg có tác dụng ở các tế bào ung thư với kiểu hình

đa kháng thuốc và các khiếm khuyết trong con đường tự chết tế bào [30]

Pg liên kết với miền BH3 trong một số họ protein BCL – 2đóng vai trò quan trọng trong việc tự chết tế bào.“Đặc biệt, kết quả của Hosseini và cộng

sự năm 2013 cho thấy Pg có một ái lực lớn đối với MCL – 1, một thành phần chống sự tự chết của họ protein BCL – 2 Trong các tế bào khối u ác tính, các tác giả chứng minh rằng Pg kích hoạt con đường tự chết ty thể bằng cách phá

vỡ phức hợp MCL – 1/BAK [31].”

Pg“từ chủng S marcescens B – 1231 ức chế miễn dịch qua trung gian

tế bào lympho T như concanavalin – A, gây tăng sinh tế bào, đáp ứng tế bào lympho hỗn hợp, gây ra đáp ứng kháng thể phụ thuộc T ở các nồng độ không độc.Tuy nhiên, Pg không ảnh hưởng đến chức năng miễn dịch qua trung gian

tế bào lympho B như tăng sinh tế bào và sản xuất kháng thể đa dòng ở các nồng độ tương tự Prodiogiosin không gây chết đối với tế bào lympho trong ống nghiệm ở nồng độ 10 và 30 mg/kg thể trọngvà cũng không cho thấy độc tính với cơ quan bạch huyết trong cơ thể ở liều lượng trên[32].”

Những tác động của dịch nuôi chứa Pg từ chủng S marcescens 2170

(CS – 2170) đến sự sống sót của các dòng tế bào ung thư máu khác nhau (Jurkat, NSO, Hl-60 và Ramos) và các dòng lành tính (NIH 3T3 và MDCK)

đã được nghiên cứu.“Sử dụng thử nghiệm MTT cho thấy có sự giảm nhanh chóng (4 giờ) về số lượng các tế bào sống Kết luận từ mô hình phân mảnh DNA, nhuộm Hoechst và phân tích sự biểu hiện phosphatidylbởi FACS cho thấy hiệu ứng độc tế bào này là do quá trình tự chết Sự tự chết này bị chặn lại

khi sử dụng chất ức chế capase Z – VAD cho thấy có sự tham gia của capase

Sự tham gia của Pg trong quá trình tự chết này còn được tác giả chứng minh

bằng thí nghiệm sử dụng chủng đột biến S marcescens (OF, WF và 933) không sinh tổng hợp Pg qua phân tích quang phổ của Pg phân lập từ S

marcescens Những kết quả này chỉ ra rằng Pg là một thể ức chế miễn dịch,

gây ra tự chết trong tế bào ung thư tạo máu và không có độc tính đáng kể đối với tế bào lành tính Do đó Pg có khả năng sử dụng để điều trị ung thư[33].”

Pg đã được chứng minh là gây ra các stress trong tế bào như tổn thương DNA bằng cách ức chế topoisomerase I và II, thay đổi pH nội bào bằng điều chỉnh nồng độ H+/ Cl-, ức chế chu kỳ tế bào bằng cách điều chỉnh lại

Sam M.R và Pourpak R.S.cho rằng cơ chế làm chết tế bào ung thư của Pgbao gồm: cảm ứng phụ thuộc caspase, kích hoạt các con đường protein kinase và

khởi phát chu kỳ tế bào Prodigiosin có nguồn gốc từ Serratia marcescens có

thể làm tăng nồng độ caspase – 3trong các tế bào ung thư bạch cầu cấp tính.Ở

tế bào ung thư gan HepG2, nồng độ caspase – 3có thể tăng đến 330% sau 48 giờ xử lý với Pg [14, 34].Shu –YuCheng và cộng sự đã tiến hành điều tra cơ chế gây chết tế bào của Pg trong u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma multiforme), kết quả cho thấy rõ ràng Pg làm giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào và khả năng hình thành tế bào thần kinh của các dòng tế bào glioblastoma ở người U87MG và GBM8401.Hơn nữa, Pg với tín hiệu huỳnh quang đã được phát hiện trong mạng lưới nội chất và được tìm thấy để gây ra stress quá mức Những phát hiện này đã được xác nhận bằng cách quan sát sự hình thành punctaLC3 và nhuộm màu cam acridine Pg gây ra cái chết tế bào bằng cách kích hoạt con đường JNK và giảm con đường AKT/mTOR trong các tế bào glioblastoma [22]

1.1.5 Ứng dụng của prodigiosin

1.1.5.1 Ứng dụng của prodigiosin trong công nghệ thực phẩm

Ngày nay, nhu cầu về chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày càng cao Với ưu điểm về tốc độ sinh trưởng nhanh, thời gian thế hệ ngắn, vi sinh vật là một trong các nguồn sản suất sắc tố nhanh và hiệu quả nhất Trong

suốt những thập kỷ gần đây, người ta đã nghiên cứu lên men các chủng vi sinh vật sản xuất prodigiosin phục vụ ngành công nghệ thực phẩm Mặc dù các sắc tố của vi sinh vật nói chung có một số hạn chế về độ nhạy với ánh sáng, độ hòa tan, độ ổn định ngắn khi tiếp xúc với pH, nhiệt độ cao Tuy nhiên, các biện pháp như bao gói bằng kappa – carrageenanhay maltodextrin

đã được áp dụng nhằm mục đích bảo quản Pg được lâu hơn Các nhà khoa học chỉ ra rằng độ ẩm, kích thước hạt và cường độ màu của prodigiosin không

bị ảnh hưởng nếu chúng được đóng gói bởi kappa – carrageenanvà maltodextrin [9].Theo cách này, prodigiosin đã được ứng dụng thành công làm chất màu cho sữa chua và đồ uống có ga

1.1.5.2 Ứng dụng của prodigiosin trong phát triển thuốc

Với hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào và ức chế miễn dịch nổi bật,

từ lâu Pg và các dẫn xuất của chúng đã được ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển thuốc Năm 1997 Sang Bae Han và cộng sự tại Viện nghiên cứu

khoa học và công nghệ sinh học Hàn Quốc đã tiến hành thử nghiệm in vitro

so sánh tác dụng dược lý của Pg với các thuốc ức chế miễn dịch đặc hiệu khác nhau của tế bào lympho T như cyclosporin A và tacrolymus Kết quả cho thấy

Pg có hiệu quả tương đương, thậm chí hơn cả cyclosporin A và tacrolymus đối với tế bào T [32] Nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu sử dụng Pg làm thuốc ức chế miễn dịch trong nghiên cứu lâm sàng và miễn dịch sau này.Năm 2009, một loại thuốc có bản chất là dẫn xuất của Pg là obatoclax (tên khác là GX15 – 070) đã được thử nghiệm lâm sàng pha I và II trong điều trị ung thư tuyến tụy và cho kết quả quả rất khả quan [30].Hiện nay, Pg cũng đang được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị ung thư tuyến tụy ở Trung Quốc dưới sự giám sát của Aida Pharmaceuical [35]

Nhìn chung, tiềm năng ứng dụng của Pg trong nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư hướng đích vẫn còn đang bỏ ngỏ Đây là một trong những hướng đi mới đầy triển vọng cho ngành công nghiệp dược phẩm trong tương lai

1.1.6 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescensở

Việt Nam

Ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu về Pg từ S marcescens và thử nghiệm

hoạt tính apoptosis của Pgđối với các dòng tế bào ung thư

Năm 2017, nhóm tác giả Nguyễn Thành Trung và cộng sự tại Viện

Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tìm thấy vi khuẩn S

marcescens trong thịt, trứng cơm tại Hà Tĩnh, Nghệ An, Quảng Ngãi [36]

Mặc dù tác giả đã đánh giá được khả năng sinh sắc tố đỏ của chủng vi khuẩn

này, tuy nhiên, các thông tin về dịch tễ học của S marcescens ở Việt Nam và

các hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư vẫn chưa được công bố

Kể từ năm 2014 đến nay, nhóm tác giả Nguyễn Sỹ Lê Thanh và cộng

sự đã phân lập được hai chủng S marcescens sản xuất Pg với hiệu suất cao làS marcescensVTCC 910026 (cao nhất 645mg Pg/L), và chủng S

marcescensM10 VTCC 910027 (cao nhất 485 mg Pg/L) Chế phẩm Pg thu

được có độ tinh khiết 98% với hệ dung môi n – hexan:toluen(1:1) kết hợp với

hệ dung môi toluen: ethyl acetate (9:1).Trong điều kiện in vitro chế phẩm Pg

này có khả năng ức chế mạnh dòng tế bào ung thư vú người MCF- 7(IC50 7,5 μM),dòng tế bào ung thư phổi LU – 1(4,6 μM), dòng tế bào ung thư vòm họng KB (9,5 μM), tế bào ung thư thanh quản Hep2 (27 μM) và dòng tế bào ung thư phổi (23 μM)[37]

Hiện tại Pg vẫn chưa được thử nghiệm trong điều trị ung thư tiền lâm sàng tại Việt Nam

1.1.7 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescenstrên

thế giới

Từ cuối thế kỷ XIX, Coley đã bắt đầu nghiên cứu về Pg và bệnh ung thư[38] Cho đến nay, rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như ứng dụng Pg trong điều trị tiền lâm sàng và lâm sàng

Năm 2002, Ruiz và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng gây chết, sự biến đổi hình thái biểu hiện của quá trình tự chết trên dòng tế bào ung thư dạ dày HTG – 1 bằng phương pháp MTT (3-(4,5 – dimethylthiozol – 2-yl)-2,5-diphenyl tetrezolium bromide), sự phân mảnh của DNA, nhuộm Hoechest

33342 và nghiên cứu về cấu trúc sợi actin Các tế bào được xử lý với Pg đã cho thấy có sự sụt giảm số lượng tế bào bởi quá trình apoptosis Phân tích hình thái tế bào xử lý bằng Pg cho thấy Pg gây ra co rút tế bào, ngưng kết nhiễm sắc thể, cấu trúc lại sợi actin, tách rời các tế bào từ chất nền nuôi cấy.Từ các kết quả trên cho thấy Pg tác động tới quá trình apoptosis trong tế bào ung thư dạ dày HTG – 1và Pg có khả năng được sử dụng như một loại thuốc hóa trị liệu mới [15]

Năm 2009, Eric và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm, đặc tính dược lý của của Pg và các dẫn xuất của Pg, bao gồm các dẫn xuất Pg tổng hợp mới có độc tính thấp hơn như GX15-070(Obatoclax)[39] Cơ chế đích phân tử của các hợp chất này đã cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị lâm sàng

Năm 2012, Mu-Yun Pan và cộng sự tại Viện Khoa học y sinh Đài Loan

đã chỉ ra rằng Pg làm chết tế bào ung thư bằng cách gây ra stress lưới nội chất dẫn tới apoptosis [30] Các con đường kích hoạt phản ứng stress lưới nội chất được Renata Sano và John C Reed thảo luận chi tiết trong “ER stress – induced cell death mechanisms”[40]

Năm 2017, Yenkejeh và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính của Pg trên dòng tế bào ung thư tế bào gan (HepG2) ở người và quan sát sự biến đổi hình thái tế bào, số lượng tế bào, ức chế tăng trưởng, biểu hiện sống sót, kích hoạt caspase – 3, tỷ lệ apoptosis bằng kính hiển vi soi ngược, buồng đếm tế bào, phương pháp MTT, Reverse Transcription – PCR, kiểm tra enzyme miễn dịch huỳnh quang Kết quả cho thấy sau prodigiosin đã làm biến dạng tế bào và phá vỡ các kết nối tế bào Đồng thời, hợp chất này ức chế tăng trưởng và giảm hoạt động trao đổi chất, ức chế tồn tại của mRNA, tăng kích hoạt caspase-3 ở các tế bào HepG2 Từ đó có thể thấy sử dụng Pg là một hướng tiếp cận mới trong điều trị hướng đích ung thư gan [34] Cơ chế điều chỉnh capase-3 của

Pg cũng được làm sáng tỏ bởi Mohammad Reza Sam và Somayyeh Ghoreishi năm 2018 [41]

Năm 2019, Chee – HooYip cũng đã thảo luận về triển vọng ứng dụng

Pg trong phát triển thuốc kháng sinh, chống sốt rét và chống ung thư trong điều trị lâm sàng [24]

Hiện nay, các nghiên cứu về prodigosin ngày càng nhiều và tập trung

theo hướng: sàng lọc các chủng S marcescens có hiệu suất sản xuất Pg cao;

tối ưu hóa quy trình lên men, tách chiết và tinh sạch Pg; thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào Từ đó mở ra nhiều hướng thử nghiệm cơ chế đích phân tử của

Pg trên các dòng tế bào ung thư khác nhau

1.2 ẢNH HƯỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT

1.2.1 Mạng lưới nội chất và hiện tượng ER stress

Mạng lưới nội chất (ER – Endoplasmic Reticulum) là hệ thống xoang dẹt gắn liền với màng nhân, tổng diện tích lưới nội chất chiếm hơn một nửa tổng số màng nội bào trong tế bào nhân thực Các xoang lưới nội chất chứa cacbohydrate, glycoprotein, enzyme khử độc… Dựa vào cấu tạo và chức năng, lưới nội chất được chia thành hai loại: lưới nội chất trơn – màng không gắn ribosome và lưới nội chất hạt gắn các hạt ribosome Trong đó, lưới nội chất hạt đóng vai trò quan trọng trong việc đóng gói các protein của tế bào

Các ribosome trên bề mặt lưới nội chất hạt tham gia vào quá trình xử lý

và phân loại protein Trong quá trình dịch mã tại ribosome, một peptide tổng hợp sẽ được định hướng đivào ER dựa trêntrình tự tín hiệu Sau đó, chuỗi tín hiệu được phân tách, và protein được giải phóng vào khoang của ER Protein sau khi được đưa đếnER để hình thành cấu trúc có thể được tiết ra ngoại bào hoặc tồn đọng trong ER Bất kể đích đến cuối cùng của protein là ở đâu, chúng cũng phải trải qua các quá trình khác nhau trong các xoang dẹt của lưới nội chất Chúng liên quan đến việc cuộn xoắn tạo thành cấu trúc bạc cao, tập hợp thành phức hợp đa đơn vị, hình thành liên kết disulfua, glycosyl hóa và

bổ sung glycolipid Khoảng một phần ba số protein trong tế bào là protein tiết, trong đó protein xuyên màng được trưởng thành trong ER Các chức năng của

nó đòi hỏi môi trường trong ER phải có tính oxy hóa và giàu canxi và các phân tử đóng vai trò cuộn xoắn protein khác Nhu cầu về số lượng protein tiết

và tốc độ tổng hợp protein tiết khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào Đặc biệt là các tế bào có chức năng bài tiết, chúng có cấu tạo giàu ER để đáp ứng nhu cầu của cơ thể Các protein tiết được cuộn xoắn bởi chaperones và các phân tử chuyển động khác, giúp gấp lại chính xác cấu hình ban đầu của chúng khi đi

qua ER Tuy nhiên, đôi khi các tế bào có thể gặp phải các điều kiện bất lợi khiến việccuộn xoắn protein ER quá nhiều Sau đó, các chức năng cuộn xoắn protein ER sẽ bị ảnh hưởng bởi các nhiễu loạn khác nhau như nhiễm virus, ung thư, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, viêm nhiễm, bệnh gấp protein

và các sai lệch khác ở cấp độ tế bào Điều này dẫn đến sự tích tụ của các protein không được cuộn xoắn hoặc cuộn xoắn sai trong lưới nội chất, được gọi là stress ER

Hiện tượng stress lưới nội chất được kích hoạt bởi nhiều yếu tố bao gồm thiếu glucose, sai hỏng glycoprotein, thiếu ion Ca2+ từ ống dẫn của lưới nội chất, tồn đọngcác protein không được cuộn xoắn hoặc các protein cuộn gập sai trong xoang ER [35, 42, 43]

Những sự kiện trong tế bào như thiếu oxy, thiếu glucose, thiếu hụt ion

Ca2+ trong ER, stress oxy hóa, nhiễm virus và đột biến làm suy giảm protein

có liên quan đến sự khởi đầu của stressER Tuy nhiên, tế bào đã phát triển một cơ chế để phát hiện những thay đổi này và khôi phục cân bằng nội môi bằng cách kích hoạt các đường dẫn truyền tín hiệu, được gọi là Unfolder Protein Respone (UPR) Quá trình này được bảo tồn từ nấm men sang người Ban đầu, hệ thống UPR cố gắng khôi phục cân bằng nội môi bằng cách tạo ra phiên mã của các enzyme cuộn gấp, chaperone, các chất oxy hóa và giảm quá trình dịch mã protein Trong trường hợp thất bại của quá trình thích ứng này

do stress kéo dài, UPR sẽ kích hoạt các con đường chết theo chương trình của

tế bào để loại bỏ các tế bào bị stress ER như một quá trình sinh lý bình thường Nếu sự chết theo chương trình này không kiểm soát được sẽ trở thành bệnh lý, dẫn đến mất tế bào ở các cơ quan thiết yếu [44] Do đó, UPR là một quá trình cơ bản thiết yếu trong việc kiểm soát chất lượng của protein không chỉ trong giai đoạn stress ER mà còn trong điều kiện tăng trưởng bình thường

Tế bào động vật có vú phản ứng với stress ER bằng cách kích hoạt phản ứngcuộn gập protein trong lòng lưới nội chất Phản ứngnày được cảm ứng bởi hai loại proein: protein liên kết miễn dịch có tên là BiP (binding immunoglobulin protein) và GRP78 (glucose regulated protein 78) Các protein không được cuộn xoắn này khiến BiP tách khỏi các protein màng lưới nội chất

là inositol requiring enzyme 1 (Ire1), PKR – like ER kinase (PERK) và activating transcription factor-6 (ATF6), từ đó kích hoạt các protein này[45]

PERK photphoryl hóa eIF-2α dẫn đến làm giảm dịch mã mRNA cục

bộ, đồng thời làm tăng dịch mã của một số mRNA, bao gồm cả yếu tố phiên

mã ATF6 ATF6 kích hoạt sự biểu hiện của một số gen bao gồm gen biểu hiện các chất vận chuyển axit amin, chaperone và homologous protein C/EBP (gọi chung là CHOP) CHOP cũng tạo ra biểu hiện của GADD34, liên kết với protein phosphatase 1 (PP1) để khử photphoryl hóa eIF-2α , do đó tiếp tục dịch mã.Ire1α có hoạt tính kép kinase và endoribonuclease Khi Ire1α bị photphoryl hóa sẽ kích hoạt hoạt tính endoribonuclease để cắt nối Xbp1 mRNA, tạo ra yếu tố phiên mã hoạt động sXbp1 Khi kích hoạt Ire1α cũng kích hoạt con đường Jun N – terminal kinase (JNK).Sau khi tách khỏi BiP, ATF6α chuyển đến khoang golgi và bị phân tách bởi protein nội bào tạo ra một yếu tố phiên mã hoạt động hòa tan (hình 1.4)

Hình 1.4 Các con đường truyền tín hiệu của phản ứng cuộn gập protein[45]

Cả 3 con đường truyền tin này phối hợp đồng bộ để tăng khả năng cuộn gập protein trong khoang lưới nội chất bởi chaperone, giảm protein bị thiếu và giảm tải protein mới vào lưới nội chất nhằm thiết lập lại sự cân bằng trong khoang bào quan này Tuy nhiên, hiện tượng ER stress kéo dài làm tăng hàm lượng oxy hoạt động (ROS) trong lưới nội chất và chuyển đổi bản chất thích nghi của phản ứng cuộn gập protein trong lưới nội chất thành phản ứng chết

tế bào, chủ yếu thông qua các con đường trung gian của Ire1, JNK và PERK, yếu tố phiên mã CHOP (phiên mã các gen liên quan đến cái chết của tế bào và kích hoạt JNK) [40]

1.2.2 Stress lưới nội chất ở tế bào nấm men Saccharomyces

cerevisiae

Nấm men Saccharomycescerevisiae có kích thước hệ gen nhỏ (khoảng

12Mb trên tổng số 16 nhiễm sắc thể[45], thời gian thế hệ ngắn, hơn 40% trình

tự gen bảo tồn ởnấm men được dự đoán là có mặt trong hệ gen người, các cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở nấm men hoặc trong các tế bào khối u tồn tại tương tự với nhiều hơn hoặc ít hơn các chức năng trong tế bào người[47]

Do đó S.cerevisiae được sử dụng làm sinh vật mô hình của sinh vật nhân

chuẩn trong nghiên cứu các khía cạnh sinh lý, sinh hóa, di truyền, và sinh học phân tử

Ire1α là protein xuyên màng loại I chức năng kép với các hoạt tính kinase protein Ser/Thr và hoạt tính endoribonuclease (RNase) Đây là nhánh

cổ điển và được bảo tồn nhất của phản ứng cuộn gập protein trong khoang lưới nội chất Ban đầu, gen Ire1 được phân lập từ sàng lọc các đột biến di

truyền của nấm menS cerevisiae được biết đến như một đặc trưng cần thiết

cho sự biểu hiện của chaperones lưới nội chất và thích nghi với stress lưới nội chất trong nấm men Sau đó, hai gen động vật có vú là Ire1α và Ire1β đã được xác định, với sự tương đồng đáng kể với nấm men ở đầu C và phân nhánh ở đầu N Ire1α và Ire1β khác nhau về trình tự axit amin vùng luminal không được bảo tồn, đặc biệt là liên quan đến protein BiP.Ire1α được biểu hiện rộng rãi ở khắp các tế bào, còn Ire1β chỉ biểu hiện giới hạn ở biểu mô ruột [48], hay niêm mạc đường hô hấp [49] Hai protein này khác nhau cả về mặt chức năng và tính đặc hiệu cơ chất theo miền RNase của chúng Ire1α có miền

lumal ER – terminal, vùng xuyên màng và miền carboxy – terminal mang cả hoạt tính xúc tác kinase và RNase Sau khi phân tách từ liên kết BiP, Ire1α làm giảm dần, chuyển nhóm photpho và kích hoạt RNase Hoạt tính RNase của Ire1α rất cần thiết cho việc cuộn xoắn protein Trình tự axit amin của vùng cảm biến, vùng kinase và vùng RNase trên Ire1α và Ire1β của con người

có độ tương đồng lần lượt là 48%, 80% và 61% so với nấm men [50]

Hoạt tính RNase của Ire1 ảnh hưởng đến yếu tố phiên mã Hac1 mRNA

ở nấm men và Xbp1 mRNA ở động vật có vú Ire1α kích hoạt yếu tố phiên

mã hộp Xbp1 thông qua một sự kiện nối exon không theo quy luật trong khi Ire1β làm giảm một phần sản phẩm dịch mã bằng cách cắt intron 28sRNA và Xbp1 [50] Sau khi kích hoạt, Ire1α cắt intron ở nucleotide thứ 252 của mRNA Hac1 dịch chuyển khung đọc mã và xuất hiện một codon kết thúc mới trong trình tự mã hóa [51]

Hơn nữa, Ire1α hoạt hóa cũng làm tăng các gốc oxy hóa tự do (ROS) gây ra stress lưới nội chất Khi Ire1α hoạt hóasẽ làm tăng hàm lượng ROS trong tế bào dẫn đến stress ER Sự mất cân bằng ROS trong tế bào gây ra cái chết của tế bào dẫn tới kết cục apoptossis [52]

Mặc dù chức năng của Ire1 rất đa dạng, tuy nhiên, chúng chủ yếu liên quan đến đáp ứng ER Sự khác nhau về loại mô tế bào, thuộc tính bệnh lý, cường độ stress và sự liên kết hay phân ly của các phân tử làm nhiệm vụ cuộn xoắn protein sẽ quyết định bản chất của hoạt động Ire1 Các phân tử protein màng ER linh hoạt này kiểm soát các chức năng khác nhau của tế bào, bao gồm sự hình thành tế bào, truyền tín hiệu, bài tiết và điều chỉnh nhiều bệnh mãn tính Sự biểu hiện Ire1 trong tế bào phải được điều hòa một cách nghiêm ngặt vì sự biểu hiện quá mức Ire1α và Ire1β ở động vật có vú gây ra quá trình apoptosis [53] Khi tình trạng stress càng nghiêm trọng, hoạt động của Ire1 càng tăng, điều này kích hoạt phân tử cảm ứng apoptosis và dẫn đến chết tế bào Các cơ chế điều hòa khác nhau của Ire1α trong các điều kiện sinh lý và các mức độ căng thẳng khác nhau vẫn chưa được làm sáng tỏ

Việc sử dụng sinh vật mô hình là nấm men Saccharomyces cerevisiae

giúp tiết kiệm được rất nhiều thời gian và chi phí nghiên cứu.Các kết quả

nghiên cứu của luận văn này sẽ góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến

tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hưởng của Pg đến tế bào động vật

1.2.3 Ảnh hưởng của prodigiosin lên mạng lưới nội chất

Prodigiosin kích hoạt cả ba nhánh tín hiệu của UPR gây ra stress ER

Pg ảnh hưởng cục bộ với ER và gây ra tự thực bào Năm 2012, Pan và cộng

sự báo cáo rằng đích tác động của Pg là yếu tố phiên mã CHOP và gây ra stress ER trong nhiều dòng tế bào ung thư vú ở người bởi cơ chế này CHOP được công nhận là một trong những trung gian phân tử trung tâm chịu trách nhiệm cho quá trình chết theo chương trình của tế bào do stress ER Việc ức chế BCL – 2 phụ thuộc CHOP là một bước trung gian của Pg để gây ra cái chết tế bào qua trung gian stress ER [35]

Pg gây chết tế bào tự thực bào bằng cách kích hoạt con đường JNK Prodigiosin cũng điều chỉnh giảm đáng kể con đường AKT / mTOR và gây ra hoạt động caspase – 3[40].Prodigiosin có tương quan mạnh với calnexin – protein chaperone gắn màng ERliên quan đến stress ER [22] Tự thực bào là một phản ứng tế bào quan trọng để duy trì cấu trúc và chức năng của ER Thông thường, tực thực bào có cả tác động tích cực và tiêu cực Chẳng hạn, khi các tế bào ung thưrơi vào stress ở các mức độ khác nhau, phản ứng stress

ER cho phép sự sống của tế bào Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sựthực bàoquá mức gây chết tế bào thông qua các cơ chế khác hơn là chết theo chương trình và chết tế bào hoại tử Cheng và cộng sự (2018)đã quan sát thấy sự tích lũy của LC3 puncta, một dấu hiệu tự phát, tăng trong vòng vài phút sau khi ủ tế bào u nguyên bào thần kinh đệm với Pg Họ đã phát hiện các dấu hiệu stress ER được điều hòa theo biểu thức BiP/ GRP78 và sXbp1 trong

cả hai tế bào u nguyên bào thần kinh đệm U87MG và GBM8401[22] Những kết quả này đã chứng minh rằng prodigiosin nằm trong ER và gây ra stress

ER

Tác động đến phản ứng cuộn xoắn protein gây apoptosis đang là hướng

đi tiềm năng trong nghiên cứu thuốc điều trị ung thư hướng đích Trong nghiên cứu này, tôi cung cấp cơ chế prodigiosin gây chết tế bào nấm men

thông qua gây stress mạng lưới nội chất bởi sự tác động đến protein màng Ire1 và sự biểu hiện của Hac1 mRNA Những phát hiện của tôi trong luận văn này góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ

sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hưởng của Pg đến tế bào động vật và người

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu

Chủng vi khuẩn S marcescensVTCC910027 và nấm men KMY 1516

lưu trữ tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các chủng được giữ giống trong ống thạch nghiêng trên môi trường NA ở 4oC và bảo quản bằng glycerol 25% ở –80oC

2.1.2 Hoá chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là có độ tinh sạch cao thuộc các hãng uy tín như: Pg (Sigma), PBS trypsin – EDTA0,025% (Gibco, Mỹ), cao nấm men, cao thịt, peptone, glycerol, NaCl (Meck), dầu lạc (Việt Nam)

Các dung môi tuyệt đối được mua từ Trung Quốc: n-hexan, toluen, ethyl acetate, acetone Các dung môi như EtOAc, MeOH, n-hexan, acetone được cất lại và làm khan trên hạt rây phân tử (3A, 4A) trước khi sử dụng

2.1.3 Các loại môi trường nuôi cấy và đệm

Thành phần một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong

nghiên cứu được pha theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Các thành phần môi trường và đệm

SD lỏng 2% glucose, 0,66% yeast nitrogen base, 0,015% uracine

SD đặc 2% glucose, 0,66% yeast nitrogen base, 2% bactoagar,

0,015% uracine

NA 5g peptone; 3g cao nấm men; 5g NaCl; 15g agar; pH 7

NB 5g peptone; 3g cao nấm men; 5g NaCl; pH 7 – 7.5

Agarose 1,5% 1,5g agarose, 100ml TBE 1X

2.1.4 Trang thiết bị

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Box cấy vi sinh clean beach Trung tâm chuyển giao công nghệ, Việt

Nam Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ)

Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)

Máy đo pH Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc nuôi cấy Certomat HK(Đức)

Máy li tâm lạnh Miikro 22R Hettich (Đức)

Máy quang phổ UV – 2500 LaboMed Inc (Mỹ)

Máy cô quay Buchi Buchi (Đức)

Máy ly tâm Sorvall Legend XTR (Nhật)

Nồi khử trùng ES – 315 Tomy (Nhật)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hoạt hóavà lên men thu sinh khối chủng Serratia marcescens

Chủng S marcescens VTCC 910027lưu giữ trong glycerol 25% ở

-80oC được lấy ra đặt trong khay lạnh -20oC và chuyển vào buồng cấy Dùng tăm vô khuẩn lấy một ít tế bào từ ống giống cấy ria 3 pha trên đĩa môi trường

NA thạch Ủ đĩa ở 28oC trong 24 giờ sẽ xuất hiện khuẩn lạc màu đỏ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ nuôi trong 3ml môi trường NB có bổ sung 2% dầu vừng, lắc 200 vòng/ phút ở 28oC trong 24 giờ

Nhân giống cấp 1

Dịchnuôi giống (3%) được chuyển vào các bình tam giác có mấu chứa 500ml môi trường NB có bổ sung 2% dầu vừng, nuôi lắc ở 200 vòng/ phút ở

28oC trong 24 giờ

Giống sau khi được nuôi cấy trong bình tam giác được kiểm tra mức độ đồng đều của tế bào bằng cách soi dưới kính hiển vivà khẳng định mẫu là thuần khiết để chuyển sang nhân giống cấp 2

Nhân giống cấp 2

Chuyển 3% giống cấp 1 vào thiết bị lên men dung tích 3 lít chứa 2 lít môi trường NB có bổ sung 2% dầu vừng, nuôi cấy lắc 300 vòng/phút ở 28o

C trong 72 giờ, sau đó thu sinh khối để tách chiết Pg thô

2.2.2 Hoạt hóa chủng nấm menKMY 1516

Chủng nấm men KMY 1516được hoạt hóa trên đĩa thạch môi trường

SD ở 28oC từ 3 đến5 ngày Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào lọ chứa 3ml môi trường SD có bổ sung 1% uracil, nuôi lắc ở 28o

C trong 24 giờ Tiếp 5% giống vào bình tam giác chứa 150ml môi trường SD có bổ sung 1% uracil, tiếp tục nuôi ở 28oC trong 16 –18giờ

2.2.3 Lựa chọn hệ dung môi tách chiết Prodigiosin

Tách chiết prodigiosin từ chủng S marcescens VTCC 910027

Chiết lần 1

Dựa theo phương pháp của Shahitha và cộng sự 2012 [2]có cải biến

Sinh khối tế bào được cho vào lắc chiết trong acetone với tỉ lệ tế bào : acetone là 1 : 1 (w/v) Mẫu được chiết bằng cách lắc 150 vòng/ phút ở nhiệt

độ 28o

C trong 3 giờ, sau đó chuyển sang bình chiết để 15 phút cho lắng xuống Bình chiết được phân thành 2 lớp: lớp dịch nổi phía trên là dung môi chứa Pg, lớp cặn phía dưới là cặn tế bào còn lẫn Pg Thu dịch nổi phía trên, phần bên dưới còn lại mang đi ly tâm 4000 vòng/ phút/ 5 phút, thu dịch nổi, cặn đỏ còn lại mang đi chiết bằng acetone, lặp lại như ban đầu

Mẫu dịch chiết lần 1 và lần 2 được kiểm tra bằng TLC Tra mỗi mẫu

3 l, chạy với hệ dung môi toluen : ethyl acetate tỉ lệ 1:1 Bản TLC cho thấy