Nghiên cứu quá trình phân hủy một số hợp chất thuốc kháng sinh bằng phương pháp quang hóa UV HOCl ClO

Nghiên cứu quá trình phân hủy một số hợp chất thuốc kháng sinh bằng phương pháp quang hóa UV HOCl ClO Nghiên cứu quá trình phân hủy một số hợp chất thuốc kháng sinh bằng phương pháp quang hóa UV HOCl ClO luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HÀ THỊ HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÂN HỦY MỘT SỐ HỢP CHẤT

THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP

QUANG HÓA UV/HOCl/ClO-

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HÀ THỊ HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÂN HỦY MỘT SỐ HỢP CHẤT

THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP

QUANG HÓA UV/HOCl/ClO- Chuyên nghành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Đào Hải Yến

Hà Nội - 2016

i

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG……….…… iii

DANH MỤC HÌNH……… iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TĂT TRONG LUẬN VĂN vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Khái quát về kháng sinh 3 1.2 Ciprofloxacin 5 1.2.1 Tính chất lí hóa học của Ciprofloxacin 5

1.2.2 Sự có mặt của CIP trong môi trường 7

1.3 Phản ứng quang hóa trong phân hủy các chất hữu cơ 8 1.4 Phương pháp phân tích thuốc kháng sinh CIP 12 1.4.1 Phương pháp trắc quang 12

1.4.2 Phương pháp điện hóa 13

1.4.3 Phương pháp ELISA 14

1.4.4 Phương pháp điện di mao quản 15

1.4.5 Phương pháp HPLC 15

1.4.6 Phương pháp LC/MS 16

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thiết bị - hóa chất 19 2.1.1 Thiết bị 19

2.1.2 Dụng cụ thủy tinh 19

2.1.3 Hóa chất 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.2.1 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho thiết bị HPLC-MS/MS trong phân tích thuốc kháng sinh Ciprofloxacin 20

2.2.1.1 Tối ưu hóa các thông số máy móc 20

2.2.1.2 Khảo sát các thông số đánh giá phương pháp 23

2.2.2 Phân tích các sản phẩm chuyển hóa của quá trình phân hủy CIP bằng hệ UV/HOCl/ClO- 27

2.2.2.1 Nghiên cứu quá trình phân hủy quang hóa của CIP bằng UV 28

ii

2.2.2.2 Nghiên cứu quá trình phân hủy quang hóa của CIP bằng UV/NaClO 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho thiết bị hplc-ms/ms 29 3.1.1 Kết quả khảo sát các thông số cho thiết bị HPLC-MS/MS 29

3.1.1.1 Khảo sát năng lượng đập mảnh colision energy (CE) 29

3.1.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit formic 31

3.1.1.3 Khảo sát thành phần pha động 32

3.1.1.4 Ảnh hưởng của tốc độ dòng 34

3.1.2 Khảo sát các thông số đánh giá phương pháp 35

3.1.2.1 Kết quả xác định LOD và LOQ của máy HPLC-MS/MS 35

3.1.2.2 Lập đường chuẩn xác định Ciprofloxacin 35

3.1.2.3 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích mẫu thực 36

3.1.2.4 Quy trình xử lý mẫu khi phân tích Ciprofloxacin trong nước 37

3.1.3 Kết quả khảo sát trên mẫu thực tế 38

3.3 Nghiên cứu quá trình phân hủy Cip bằng UV và bằng UV/NaClO 40 3.3.1 Quá trình quang phân UV của Ciprofloxacin 40

3.3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ đầu Ciprofloxacin đến quá trình phân hủy Ciprofloxacin bằng UV 40

3.3.1.2 Ảnh hưởng của pH đến quá trình phân hủy Ciprofloxacin bằng UV 41

3.3.2 Phân hủy CIP bằng hệ UV/NaClO 42

3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH đến quá trình phân hủy CIP bằng UV/NaClO 42

3.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaClO đến sự phân hủy của Ciprofloxacin 44

3.3.2.3 Ảnh hưởng của các ion vô cơ đến quá trình phân hủy Ciprofloxacin bằng NaClO/UV 46

3.3.3 Nghiên cứu các sản phẩm chuyển hóa của quá trình quang hóa Ciprofloxacin tại bước sóng 254 nm 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….………….59 PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các phân mảnh của CIP 16

Bảng 3.1 Phần trăm ion mẹ (CIP) còn lại theo sự tăng dần năng lượng đập mảnh 30 Bảng 3.2 Kết quả thời gian lưu thay đổi theo thành phần pha động 33

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát LOD và LOQ 35

Bảng 3.4: Dữ liệu đường chuẩn của Ciprofloxacin 36

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến độ thu hồi 37

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thể tích rửa giải đến độ thu hồi 37

Bảng 3.7 Độ thu hồi đối với mẫu nước cất thêm chuẩn CIP 50 µg/l 38

Bảng 3.8 Độ thu hồi và độ lặp lại của mẫu nước hồ nuôi tôm thêm chuẩn với nồng độ CIP 50 µg/l 39

Bảng 3.9 Hằng số tốc độ phản ứng biểu kiến bậc 1 kapp ở những nồng độ CIP và pH khác nhau 41

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH đến quá trình phân hủy CIP bằng UV/NaClO, [CIP] = 10 µM; [NaClO] =100 µM 44

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ Clo đến hằng số tốc độ phản ứng của phản ứng phân hủy CIP bằng quá trình UV/NaClO 46

Bảng 3.12 Phản ứng của các ion vô cơ với gốc ●OH và hằng số tốc độ phản ứng 46 Bảng 3.13 Hằng số tốc độ phân hủy CIP khi có mặt các ion vô cơ 47

Bảng 3.14 Các sản phẩm phụ của quá trình phân hủy CIP bằng hệ UV đã được định danh bằng LC-MS/MS 54

Bảng 3.15 Các sản phẩm phụ của quá trình phân hủy CIP bằng hệ UV/NaClO đã được định danh bằng LC-MS/MS 55

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone 4

Hình 1.2 Cân bằng acid base của nhóm Acidic quinolone 5

Hình 1.3 Các dạng tồn tại của PQ trong nước 5

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin 6

Hình 1.5 Cân bằng acid base của CIP 6

Hình 1.6 Sự ảnh hưởng của pH đến tỉ lệ phân bố của các dạng clo tự do 11

Hình 1.7 Hệ số hấp thụ phân tử mol của HOCl, OCl- và NH2Cl 12

Hình 1.8 Phức tạo thành giữa Fe(III) với Ciprofloxacin (λmax = 430nm) 13

Hình 2.1: Phổ phát xạ của đèn Vilber-Lourmart T-6L 27

Hình 2.2 Mô hình thí nghiệm quang hóa 27

Hình 3.1 Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin tại CE=18V 29

Hình 3.2 Sự phân mảnh của CIP 31

Hình 3.3 Kết quả sắc kí đồ của CIP theo % axit formic 32

Hình 3.4 Sắc kí đồ thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ pha động 33

Hình 3.5 Sắc kí đồ thể hiện ảnh hưởng của tốc độ dòng 34

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của CIP 36

Hình 3.7 Hiệu quả phân hủy CIP với các nồng độ đầu khác nhau 40

Hình 3.8 Mối quan hệ giữa hằng số tốc độ phản ứng với nồng độ đầu của CIP 40

Hình 3.9 Hiệu quả phân hủy CIP với các pH khác nhau 42

Hình 3.10 Mối quan hệ giữa hằng số tốc độ phản ứng với các pH khác nhau 42

Hình 3.11 Sự ảnh hưởng của pH đến tỉ lệ phân bố của các dạng clo tự do 42

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến quá trình phân hủy CIP bằng UV/NaClO 43

[CIP] = 10 µM; [NaClO] =100 µM 43

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ NaClO đến quá trình phân hủy CIP bằng UV/NaClO, [CIP] = 10 µM 44

v

Hình 3.14 Sự biến đổi nồng độ CIP theo thời gian chiếu xạ UV 254nm khi

có mặt các ion vô cơ, [CIP]=10M 48 Hình 3.15 Động học phân hủy của CIP chiếu xạ UV 254nm khi có mặt ion

vô cơ 48 Hình 3.16 Cơ chế chính phân hủy CIP bằng UV 49 Hình 3.17 Sự hình thành các sản phẩm phụ theo thời gian trong quá trình quang phân UV/CIP 50 Hình 3.18: Cơ chế phân hủy Ciprofloxacin trong hệ UV/NaClO 53

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TĂT TRONG LUẬN VĂN

ACN Acetonitrile Axeton nitrin

CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản

CIP Ciprofloxacin

CZE Capilary zone electrophoresis Điện di mao quản vùng ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent

Assay

ESI Electrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử

FQ Floroquinolone Họ kháng sinh

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

HPLC-MS High performance liquid

chromatography tandem mas spectrometry

Sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học cơ bản và ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantity Giới hạn định lượng

MLR Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa PDA Detector Photodiode Array

1

MỞ ĐẦU

Các chất ô nhiễm mới trong môi trường nước gần đây được quan tâm nghiên cứu là sự tồn dư của các chất kháng sinh và các mỹ phẩm sau khi được sử dụng bị thải loại vào môi trường Những chất ô nhiễm mới này được định nghĩa là những hợp chất chưa bao gồm trong các tiêu chuẩn về chất lượng nước, chưa được nghiên cứu trước đây, và có khả năng ảnh hưởng đến môi trường sinh thái và sức khỏe con người Các hợp chất kháng sinh tồn tại trong nước phần lớn do các tác động của con người và liên tục đươc thải vào môi trường, chúng có thể tác động đến các vi sinh vật, gây nên sự kháng thuốc, cũng như các sản phẩm chuyển hóa của chúng có thể

là những hợp chất có độc tính cao Các hợp chất kháng sinh này thường không xử lý được bằng các phương pháp xử lý nước truyền thống và vẫn còn tồn tại trong nước sinh hoạt dẫn đến nguy cơ tích lũy trong cơ thể con người

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu về dư lượng của các hợp chất kháng sinh trong nước tự nhiên cũng như nước sinh hoạt chưa được chú ý, việc ứng dụng Clo

để khử trùng được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như khử trùng nước, phun diệt trùng môi trường, phòng chống dịch bệnh, tuy nhiên cũng không nhiều những nghiên cứu về sự phân hủy cũng như các sản phẩm phụ của quá trình tiệt trùng nước có chứa những chất ô nhiễm hữu cơ mới

Ciprofloxacin (CIP), một Fluoroquinolone (FQ) thế hệ thứ hai và một trong những loại thuốc kê đơn nhiều nhất trên thế giới Nó đã được dùng trong thời gian bùng phát bệnh than vào năm 2001 và cũng đã được sử dụng để nhắm mục tiêu tác nhân sinh học của bệnh Legionnaire và thương hàn CIP là một loại FQs mạnh có liên quan đến tác dụng phụ nghiêm trọng bao gồm gân vỡ và tổn thương thần kinh

do cơn co giật Do những tác dụng bất lợi mà CIP gây ra nên nó đã được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây bởi vì nó đã được tìm thấy thường xuyên trong nguồn nước mặt, nước thải ở mức có thể gây ra sự kháng thuốc của nhiều loại vi khuẩn

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình oxy hóa tiên tiến (AOPs) và các ứng dụng hấp phụ là những phương pháp xử lý hữu hiệu cho việc làm giảm hoặc loại bỏ CIP trong nước và nước thải hoàn toàn Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng CIP nhạy cảm với những biến đổi quang hóa trực tiếp bởi sự tiếp xúc trực tiếp với UV

2

và bằng cách thêm chất xúc tác quang hóa như hydrogen peroxide (H2O2), và titanium dioxide (TiO2) vào dung dịch [5] Nghiên cứu hấp phụ CIP lên trầm tích ở dưới nước, đất và bùn cũng đã được tiến hành bởi nhóm nghiên cứu Carmosini et al., 2009

Nhìn chung, việc nghiên cứu sâu về các quá trình clo hóa kết hợp với chiếu

xạ UV còn chưa nhiều đặc biệt là với các đối tượng ô nhiễm mới như các hợp chất kháng sinh Các sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa các hợp chất này trong tự nhiên cũng như trong quá trình xử lý cũng chưa được nghiên cứu sâu Vì vậy chúng

tôi đề xuất đề tài ―Nghiên cứu quá trình phân hủy một số hợp chất thuốc kháng sinh

bằng phương pháp quang hóa UV/HOCl/ClO -‖ nhằm góp phần hiểu sâu hơn về bản chất của các quá trình này trong tự nhiên cũng như trong các quá trình xử lý nước

Phân loại

Kháng sinh được phân chia thành các loại sau:

+ Nhóm Beta lactam: các Penicilin, các Cephalosporin, Carbapenem,

Monobactam, các chất ức chế Beta lactam

+ Nhóm Aminosid: Streptomicin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin,

+ Nhóm Lincosamid: Clindamycin, Lincomycin…

+ Nhóm Marcrolid: Erythromycin, spiramycin, Azithromycin,…

danofloxacin, enrofloxacin, difloxacin, sarafloxacin, ofloxacin, norfloxacin

+ Nhóm kháng sinh tổng hợp khác: Fosfomycin …

Kháng sinh họ Quinolone

Quinolone là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiễm

trùng ở người và động vật Mục tiêu chính của chúng là vi khuẩn bacterial enzyme DNA gyrase hay topoisomerase II Quinolone có thành phần hóa học là dẫn suất của axit nalidixic Dựa trên phổ kháng khuẩn của nó, quinolone được chia thành nhiều

4

thế hệ như:

- Quinolone thế hệ thứ nhất: cinoxacin, flumequine, axit nalidixic,

oxilinic,

- Quinolone thế hệ thứ hai: ciprofloxacin, enoxacin, fleroxacin,…

- Quinolone thế hệ thứ ba: balofloxacin, gatifloxacin, grepafloxacin…

- Quinolone thế hệ thứ tư: garenoxacin, clinafloxacin, gemifloxacin… Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa

N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic Các dẫn suất của quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử

N

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone

Tính chất acid - base nhóm quinolone:

Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính acid Một số quinolone có chứa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base Dựa vào pKa có thể chia nhóm quinolone thành hai loại: Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl quinolone (PQ)

- Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6,0 đến 6,9 Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion Thường AQ gồm những quinolone thuộc thế hệ thứ nhất

5

Hình 1.2 Cân bằng acid base của nhóm Acidic quinolone

- Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5,5 – 6,6 và

pKa2 khoảng 7,2 – 8,9 Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng

cation, dạng trung hòa và dạng anion

Hình 1.3 Các dạng tồn tại của PQ trong nước Fluoroquinolone là một nhóm kháng sinh thuộc họ quinolone trong đó có

một nguyên tử F gắn ở vị trí số 6 của hệ thống trung tâm Cả Quinolones và

Fluoroquinolones đều là thuốc kháng sinh có khả năng giết chết vi khuẩn

1.2 Ciprofloxacin

Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ

1.2.1 Tính chất lí hóa học của Ciprofloxacin

6

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin

Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol, methylene chloride Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa là 5,5 và 7,7

CIP là chất kháng sinh tổng hợp thuộc thế hệ thứ hai của các nhóm thuốc FQ Thuốc diệt vi khuẩn bằng cách kết hợp với các enzyme để dừng tổng hợp protein và DNA Nó được sử dụng điều trị cho nhiều bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn như xương

và nhiễm trùng khớp, viêm bàng quang cấp tính ở phụ nữ, bệnh nhiễm trùng đường

hô hấp dưới và trong một số trường hợp nhiễm trùng đường tiết niệu CIP là một loại kháng sinh được sử dụng một cách hạn chế, nhưng đến nay nó là một trong những loại kháng sinh được phân phối rộng rãi nhất tại Hoa Kỳ và Châu Âu

Trong môi trường axit (pH < 5,5) CIP bị proton hóa nên dạng cation chiếm

ưu thế Trong môi trường trung tính (5,5 < pH < 7,7) hydro tách khỏi nhóm carboxyl, dạng chiếm ưu thế là dạng trung hòa điện (zwitterionic) Trong dung dịch

có pH > 7,7 thì hydro gắn liền với nitơ trong vòng piperazine bị tách ra và các dạng anion của CIP trở nên phổ biến

7

1.2.2 Sự có mặt của CIP trong môi trường

Người ta ước tính rằng trên thế giới có khoảng 100,000-200,000 tấn thuốc kháng sinh được tiêu thụ mỗi năm Dược phẩm thâm nhập vào nguồn nước thông qua các nguồn khác nhau như nước thải bệnh viện, nước thải sinh hoạt của con người và nước thải từ các nhà máy dược phẩm công nghiệp CIP thường được tìm thấy trong rất nhiều các nguồn khác nhau và sự xuất hiện phổ biến của nó đã dẫn đến sự kháng thuốc của nhiều loại vi khuẩn trong môi trường tự nhiên Hiện chưa

có quy định rõ ràng, nhưng do tính độc hại của CIP mà việc xác định, đánh giá hàm lượng của nó trong môi trường nước mặt, trong nguồn thải của nhà máy xử lý nước thải, trong bùn thải,… đang trở thành vấn đề nhận được nhiều sự chú ý trên thế giới

Phần lớn các nghiên cứu liên quan đến vấn đề nêu trên đã được tiến hành ở

Ý, Tây Ban Nha, Thụy Sĩ, Trung Quốc, Mỹ và Đức Các nghiên cứu đều kết luận các loại dược phẩm đều có khả năng gây nguy hại đến môi trường và không dễ dàng

bị phân hủy trong các quy trình xử lý nước thải

CIP đã được phát hiện trong nhiều đối tượng khác nhau bao gồm nước thải, nước mặt, nước ngầm và nước biển ở một khoảng nồng độ rất rộng từ 0,02 μg/l cho đến vài mg/l CIP ở hàm lượng vết thì được tìm thấy trong phần lớn các vùng nước mặt bao gồm cả hồ và sông nhưng xuất hiện ở hàm lượng lớn ở những vùng sản xuất dược phẩm khối lượng lớn và các nhà máy xử lý nước thải Các quốc gia chưa

có các phương pháp xử lý nước tiên tiến cũng thường xuyên tìm thấy CIP với nồng

độ lớn trong nguồn nước mặt Sự xuất hiện của CIP ở mức vi lượng trong nguồn nước mặt là một nguy cơ đối với hệ sinh thái thủy sinh, góp phần vào việc gây ra sự kháng thuốc của nhiều loại vi sinh vật

Kolpin et al (2002)[17] đã phát triển năm phương pháp phân tích mới để đo nồng độ của 95 hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm trong nguồn nước mặt từ 139 con suối khắp 30 tiểu bang của Hoa Kỳ trong năm 1999 và 2000 Các mẫu được lấy ở nơi chất gây ô nhiễm có xác suất tồn tại cao nhất – nơi được xác định là dòng thải của khu đô thị và các khu chăn nuôi Các chất ô nhiễm được tìm thấy trong khoảng 80% các dòng suối CIP được phân tích bằng phương pháp LC/MS-ESI (+) và xác định

có mặt trong 345 mẫu với tần số 7,2 % trong khoảng nồng độ 0,02-0,03 μg/l

8

Bhandari et al (2008) [8] đã xây dựng được phương pháp định lượng CIP ở các loại đối tượng nguồn thải khác nhau trên nhiều miền của nước Mỹ bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và HPLC/UVFL Kết quả cho thấy nồng độ của CIP trong nguồn thải chung là 1,44μg/l và trong dòng thải biến động là 0,59 μg/l Nồng độ CIP là vào mùa hè cao hơn đáng kể so với mùa đông

Fick et al (2009) [16] đã thực hiện cuộc điều tra trên một khu công nghiệp sản xuất dược phẩm lớn ở Ấn Độ Nước thải từ 90 nhà máy sản xuất dược phẩm được xử lý bằng hệ thống xử lý nước thải chung công suất 1500 m3

/ngày, sử dụng một số phương pháp xử lý bao gồm cả xử lý sinh học và hấp phụ Các con sông ở thượng nguồn (đầu vào nhà máy xử lý) có nồng độ CIP khoảng 12 µg/l Sau khi qua

hệ thống xử lý, CIP được đo ở nhiều điểm tại hạ lưu con sông Tính từ nhà máy xử

lý cách hạ lưu 150 m đo được nồng độ CIP khoảng 2500 µg/l, cách hạ lưu 4km đo được nồng độ CIP là 1100 µg/l và cách hạ lưu 30km đo được nồng độ CIP là 10 µg/l Nghiên cứu khẳng định rằng việc xử lý và loại bỏ CIP trong nước thải không hiệu quả, do đó tăng cơ hội có mặt của CIP ở tất cả các nguồn nước có liên quan

Plosz et al (2010) [6] đã tiến hành một nghiên cứu để so sánh sự xuất hiện của CIP trong nước thải bệnh viện tại Brazil và sự xuất hiện của CIP trong nước thải ở châu Âu cũng như Hoa Kỳ Tại Hoa Kỳ, CIP trung bình trong dòng thải hạ lưu là 0,15 mg/l, mức trung bình trong nước thải là 0,06 mg/l và giá trị trung bình của nước bề mặt là 0,02 mg/l Nghiên cứu cho thấy, ở Brazil lượng CIP trong nước

bề mặt cao, bởi vì ở các bệnh viện và nhà máy xử lý nước thường thiếu kỹ thuật hiệu quả để loại bỏ CIP

1.3 Phản ứng quang hóa trong phân hủy các chất hữu cơ

Giới thiệu về phản ứng quang hóa

 Khái niệm: Phản ứng quang hóa (UV) là những phản ứng hóa học xảy ra trong đó năng lượng cần thiết cho phản ứng là bức xạ điện từ (năng lượng mặt trời vùng tử ngoại hay vùng khả kiến)

Tia tử ngoại (hay tia cực tím, UV) là sóng điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X Phổ của tia cực tím chia ra làm các phần: UVA (380-315 nm), hay gọi là sóng dài hay "ánh sáng đen" chiếm tới hơn 95% trong số những tia UV chiếu xuống mặt đất; UVB (315-280 nm) gọi là bước sóng

9

trung bình; và UVC (ngắn hơn 280 nm) gọi là bước sóng ngắn Trong phổ mặt trời, 5-10% bức xạ thuộc về vùng tia cực tím UV, trong khi đó tổng năng lượng mặt trời ngày nắng trung bình ở mức 5kWh/m2 thì đây là nguồn năng lượng lớn và gần như

vô tận

 Cơ chế của phản ứng quang hóa: được chia làm hai giai đoạn, giai đoạn một

là giai đoạn khơi mào, chất tham gia phản ứng hấp thụ bức xạ điện từ (một photon) thích hợp, chuyển lên trạng thái kích hoạt và có khả năng tham gia phản ứng mạnh

mẽ, có thể biểu diễn:

Trong đó: A● là trạng thái kích hoạt của A

A● có thể là nguyên tử, phân tử hay ion

A● sau đó có thể tham gia vào các quá trình sau:

- Phản ứng tỏa nhiệt: A● → A + E với E là năng lượng giải phóng (1.2)

- Sự chuyển hóa nội, động phân hóa: A● → B (1.9)

 Cơ chế quá trình phân hủy hợp chất hữu cơ bằng quang hóa

Dưới tác dụng của bức xạ UV thích hợp, các chất hữu cơ chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích Ở trạng thái kích thích, chúng rất dễ tham gia vào các phản ứng, đặc biệt là phản ứng oxy hóa – khử Chất hữu cơ hấp thụ năng lượng bức xạ UV lớn hơn năng lượng liên kết giữa các phân tử, do đó làm gãy mạch vòng hoặc gãy các mối liên kết giữa C-C, C-Cl hoặc nguyên tố khác trong cấu trúc phân tử của chúng và tạo ra các sản phẩm phụ

10

Quá trình phân hủy trực tiếp một chất hữu cơ bằng tia UV trong môi trường nước (nước cất, loại trừ các chất tác dụng phụ, các chất có tác dụng xúc tác) có thể xảy ra theo 4 quá trình:

1 Chất hữu cơ hấp thụ năng lượng hʋ từ các photon của UV và chuyển lên trạng thái kích thích:

H2O + R-R O● + R-R-O (oxi hóa) (1.13)

4 Do chất hữu cơ tồn tại trong môi trường nước, dưới tác dụng của UV, xảy ra phản ứng thủy phân:

R-R + H-OH→ R-H + R-OH (1.14)

 Hóa học cơ bản của Clo tự do trong nước

Clo là một chất oxi hóa và chất khử trùng truyền thống được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước và nước thải Nó tồn tại ở dạng khí (Cl2), dung dịch (HOCl, NaOCl) và dạng rắn [canxi hypochlorite, Ca(OCl)2] [12,13,14] Việc sử dụng clo tương đối kinh tế so với các phương pháp khác tuy nhiên nó có thể dẫn đến sự hình thành các sản phẩm khử trùng có hại như trihalomethanes (THMs) và haloacetic acids (HAAs)

Khi thêm khí Cl2 vào nước, một phản ứng thủy phân xảy ra để hình thành axit hypochlorous (HOCl), sau đó phân tách thành ion hypochlorite (OCl–), được thể hiện trong phương trình (1.15) và(1.16):

Cl2 (aq) + H2O ↔ HOCl + H+ + Cl- (1.15) HOCl ↔ H+ + OCl- (1.16)

hv

11

Một phần lớn các phân tử clo có thể hòa tan vào nước để tạo ra HOCl/OCltrừ trường hợp ở pH rất thấp và / hoặc nồng độ clorua cao Khi NaOCl được cho vào nước, HOCl/OCl-

có thể được tạo thành theo các phản ứng (1.17) NaOCl → Na+ + OCl- (1.17) Tổng lượng HOCl và OCl- được nói đến như là clo tự do có sẵn Các tỷ lệ tương đối của các dạng clo phụ thuộc vào nhiệt độ và pH của dung dịch Hình 1.6 minh họa ảnh hưởng pH đến tỉ lệ phân bố HOCl, ClO- ở 25°C, được xác định bằng cách sử dụng phương trình (1.15) và (1.16)

Kết quả là, pH thấp ưu tiên cho khử trùng clo Tuy nhiên, giá trị pH không nên giữ rất thấp, vì ở pH thấp hơn 4, HOCl có thể chuyển về dạng khí hòa tan Cl2

Ding Wang (2015)[10], đã nghiên cứu khảo sát các phản ứng dây chuyền quang hóa của các dung dịch HOCl và OCl- Trong môi trường kiềm ion OCl- là

12

dạng chiếm ưu thế, một vài các phản ứng quang phân ion OCl- ở 254, 313 và 365

nm đã được tác giả đề xuất, thể hiện trong các phương trình [1.18] tới [1.25]

OCl- + hυ → Cl- + O(3P) (1.18) OCl- + hυ → Cl● + O- (1.19) OCl- + hυ → Cl- + O(1D) λ < 320nm (1.20) O(3P) + OCl- → OCl2- (1.21) O(3P) + OCl- → OCl2- (1.22) O- + H2O ↔ OH● + OH- (1.17)

OH● + OCl- → OCl• + OH- (1.23)

O- + OCl- → OCl• + O2- (1.24)

Cl● + OCl- → OCl• + Cl (1.25)

1.4 Phương pháp phân tích thuốc kháng sinh CIP

Dựa vào cấu trúc và tính chất của CIP, có nhiều phương pháp xác định hàm lượng trong nền mẫu thực phẩm như phương pháp so màu, sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các đầu dò khác nhau như: đầu dò huỳnh quang, đầu dò UV, đầu

dò MS …

1.4.1 Phương pháp trắc quang

Phương pháp phân tích trắc quang do có độ nhạy, độ chính xác và độ chọn

lọc khá cao nên dung để xác định hàm lượng nhỏ, hàm lượng trung bình và hàm lượng lớn các nguyên tố trong nhiều đối tượng phân tích, phương pháp này được

độ khác nhau

Hình 1.8 Phức tạo thành giữa Fe(III) với Ciprofloxacin (λmax = 430nm)

Ngoài kim loại có thể dùng axit Chloranillic, tetracyanoethylene để tạo hình thành phức chất chuyển điện tích Phức của axit Chloranillic có bước sóng λmax =

520 nm Phức của tetracyanoethylene hình thành với Ciprofloxacin có λmax = 335

nm Quy trình này được ứng dụng trong việc xác định thuốc với độ chính xác 99,91% đến 100,40% tùy theo từng chất

1.4.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được sử dụng để phân tích CIP nhưng không phổ biến nhiều

14

M.I Rodríguez Cáceres,A Guiberteau Cabanillas, T Galeano Díaz, M.A Martínez Cañas với nghiên cứu ―Simultaneous determination of quinolones for veterinary use by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection’’ đã dùng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với đầu dò điện hóa (HPLC-ECD) đã cho phép xác định đồng thời ba fluoroquinolone (FQs) trong đó có Ciprofloxacin Các FQs được phân tách trên cột Novapack C-18 và phát hiện bằng thiết bị amperometric cell, hiệu điện thế giữa hai điện cực được thiết lập là +0,8V Chiết pha rắn đã được sử dụng để tách các chất phân tích trong mẫu thực Giới hạn phát hiện dưới 10 ng/g và hiệu suất thu hồi khoảng 90% cho cả ba chất

1.4.3 Phương pháp ELISA

ELISA (enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme Immuno Assay) là một kĩ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

 Kháng nguyên - antigen chưa biết được gắn trên một bề mặt

 Kháng thể - antibody biết trước được "rửa" qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với enzyme

 Thêm vào một cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu

có thể xác định được

Tuy nhiên, phương pháp ELISA chỉ là một phương pháp bán định lượng và

có độ chọn lọc và độ nhạy thấp Sử dụng phương pháp ELISA trong xác định dư lượng kháng sinh chỉ mang tính định tính, xác định có hay không dư lượng kháng sinh trong mẫu

Một số ứng dụng của ELISA như:

- Xác định nồng độ của kháng thể trong huyết thanh

- Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên

- Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm

- Xác định sự có mặt của dược phẩm

- Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học

15

1.4.4 Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản được sử dụng với một số tính chất ưu việt như hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được áp dụng để tách và xác định kháng sinh Ciprofloxacin trong một số đối tượng mẫu khác nhau

Francisco J Lara và cộng sự trong nghiên cứu ―Multiresidue Method for the Determination of Quinolone Antibiotics in Bovine Raw Milk by Capillary Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry‖ đã sử dụng phương pháp phân tích mới dựa trên điện di mao quản vùng kết hợp với khối phổ hai lần (CZE-MS/MS) cho việc xác định và định lượng đồng thời tám quinolone dùng trong thú y có trong sữa bò Các thông số khác nhau (ví dụ thành phần đệm tách và các điều kiện) đã được tối ưu hóa để có được một hệ thống tách đầy đủ và độ nhạy cao Kết quả khả quan thu được về độ tuyến tính (R2 nằm giữa 0,989 và 0,992) và độ chính xác (RSD dưới 18%) Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) cho Ciprofloxacin tương ứng là 6 và 24 ppb, thấp hơn dư lượng tối đa cho phép các chất này trong sữa, hiệu suất thu hồi 81-110% cho thấy tiềm năng của CZE-MS/MS để phân tích các kháng sinh quinolone quy định về chất lượng thực phẩm và các khu vực kiểm soát

an toàn

Piotr Kowalski và Alina Plenis đã nghiên cứu ― Simultaneous determination

of six quinolone antibiotics in poultry and porcine samples by capillary electrophoresis‖ Trong nghiên cứu này phương pháp điện di mao quản (CE) đã được dùng để xác định dư lượng của 6 quinolone (enrofloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lomefloxacin, norfloxacin, cinoxacin) trong thịt gà và cơ lợn Các mẫu được chiết pha rắn và cho qua cột C-18 trước khi phân tích bằng CE với đầu dò UV Phương pháp này xác nhận về độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ chính xác, hiệu suất thu hồi và sự ổn định Các đường tuyến tính của các quinolone với R2> 0,999, CC,

CC cho các chất phân tích khoảng 3,2-16,9 ng/g và 3,5-20,3 ng/g tương ứng

16

thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất

Do cấu trúc của Ciprofloxacin có khả năng hấp thu bước sóng tử ngoại nên

có thể dùng phương pháp HPLC - đầu dò UV ở bước sóng 275nm

Nguyên tắc: mẫu sẽ được kích thích với nguồn sáng có bước sóng là 276nm, sau đó sẽ phát xạ ra bước sóng 442nm; đo cường độ chất ở bước sóng này theo nồng độ, từ đó tính nồng độ của mẫu

Bước sóng: λ kích thích: 276nm - 295nm; λ phát xạ: 442nm- 500nm;

Ưu điểm: Phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao, phân tích được các chất có nồng độ bé Do vậy, phương pháp này được nghiên cứu rất nhiều và được lựa chọn làm phương pháp chính trong tiêu chuẩn của Châu Âu

MS cho phép nhận danh và định lượng một cách rõ ràng về một hợp chất cụ thể

Với đầu dò MS nhóm fluoroquinolones có khuynh hướng tạo thành mảnh mẹ

và những mảnh con: [MH-H2O]+; [MH-CO2]+; [MH-H2O-NR]+; [MH-CO2-NR]+

Bảng 1.1 Các phân mảnh của Ciprofloxacin

[MH-H2O]+ M + 1(H) – 18(H2O) [MH-CO2]+ M + 1(H) – 44(CO2) [MH-H2O-NR]+ M + 1(H) – 18(H2O) – M(NR) [MH-CO2-NR]+ M + 1(H) – 44(CO2) – M(NR)

Phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao Phương pháp này rất phù hợp cho việc phân tích dư lượng chất kháng sinh trong nước bề mặt

17

Để có thể xác định riêng biệt Ciprofloxacin và các sản phẩm phụ cần phải sử dụng phương pháp tách trước khi xác định do đó trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn phương pháp HPLC-MS/MS để định lượng thuốc kháng sinh Phương pháp này có độ chọn lọc cao, độ nhạy cao và có thể phân tích hàng loạt mẫu nên rất thuận lợi cho việc xác định Ciprofloxacin trong nghiên cứu sự phân hủy của thuốc kháng sinh Mặt khác nó cũng là phương pháp hiện đại và đang phát triển mạnh trong các phòng thí nghiệm phân tích của các nước đang phát triển trên thế giới

Đã có một số công trình nghiên cứu về kháng sinh Ciprofloxacin được công bố như sau:

Theo nghiên cứu của B Delepine, D Hurtaud-Pessel và P Sanders,

―Simultaneous determination of six quinolones in pig muscle byliquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry‖ ,nghiên cứu này sử dụng phương pháp LC - MS để xác định dư lượng của 6 loại kháng sinh thuộc nhóm quinolone trong cơ lợn ở mức 7,5 g/kg Ion hóa học áp suất khí quyển (APCI) đã được sử dụng để kết hợp với LC-MS

Theo nghiên cứu của Chui-Shiang, Wei-Hsien Wang và Chinen Tsai

―Simultaneous Determination of Eleven Quinolones Antibacterial Residues in Marine Products and Animal Tissues by Liquid Chromatography with Fluorescence Detection‖ nghiên cứu này nhằm xác định dư lượng 11 loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm quinolone trong cơ động vật bao gồm thịt gà, thịt lợn, cá và tôm bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao với tia cực tím (UV) và phát hiện huỳnh quang (FLD) Kết quả cho thấy đã xác định được các quinolone với giới hạn định lượng tùy loại cơ dao động từ 5 ng/g đến 28 ng/g

Trong một nghiên cứu Alesha D LaFleur, Kevin A Schug ―A review of separation methods for the determination of estrogens and plastics-derived estrogen mimics from aqueous systems‖ nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá hiệu quả phân tích của các phương pháp phân tích hiện đại mục đích để tìm ra biện pháp phân tích tối ưu và tiết kiệm chi phí cho việc xác định các estrogen trong môi trường nước, báo cáo này cho thấy giới hạn phát hiện đối với HPLC APCI/MS là 0,5-1 ng/l, đối với HPLC-MS/MS là 0,1-10 g/l, đối với HPLC-UV là 1,6-4,7 ng/l

18

Với nghiên cứu của Yiruhan, Qiao-Jun Wang và cộng sự ―Determination of four fluoroquinolone antibiotics in tap water in Guangzhou and Macao‖, 4 kháng sinh floroquinolone (norfloxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin và enrofloxacin) trong nước đã được phân tích sử dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang Bước sóng phát hiện từ 280-450 nm, tốc độ dòng 1ml/phút với pha động là axit photphoric với trietylamin được điều chỉnh ở pH 2,5 và axetonitrin(85:15) Kết quả cho thấy các kháng sinh được phát hiện có nồng độ cao trong nước tại Guangzhou và Macao, giới hạn định lượng của các kháng sinh nằm ở khoảng 0,28 ng/l đến 0,83 ng/l Hiệu suất thu hồi đối với các kháng sinh là 61,4% đến 91,3% trong đó Ciprofloxacin là 92,6%

- Máy cất nước hai lần; Máy lọc ion

- Tủ sấy Memmert; Máy đo pH, máy li tâm Rotofix 32- Hettich

- Bồn siêu âm

- Cân phân tích độ chính xác 0,01mg

- Hệ thống chiết pha rắn có bơm chân không SPC 10-C, Chratec

- Cột chiết pha rắn: Water tC18 Plus, Phenominex SCX, Water Oasis HLB Plus

- Máy lắc Vortex mixer – Velp Scienfitica

- Hệ thiết bị phản ứng quang hóa

- Ống đong, phễu, giấy lọc

- Pipetman loại 200 µl, 1000 µl và đầu côn

- Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45 µm, bể siêu âm, tủ lạnh, tủ sấy,

và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác

2.1.3 Hóa chất

- Chuẩn ciprofloxacin: 99,9% Merck

- MeOH: Merck.; dichloromethane 99%: Merck

-Các acid của Merck : acid acetic 99,9%; acid formic: >99%; Trichloroacetic acid 99,9%

- Khí N2; Nước cất hai lần có trao đổi ion

- NaClO 5% Merck

20

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc CIP 105 µg/ml: Cân 10,5 mg chuẩn gốc CIP trên cân phân tích, hòa tan trong MeOH Sau đó chuyển vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch với MeOH, ta được dung dịch CIP 105 µg/ml Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh tại 2-8oC

- Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc với nước trước khi phân tích

- Dung dịch axit formic 1M: Rút 7,6 ml axit formic (>99%) cho vào bình định mức 200ml, định mức đến vạch bằng nước cất hai lần đã loại ion.(A)

- Dung dịch ammoniac 1M: Rút 13,7 ml dung dịch amoniac 25% cho vào bình định mức 200 ml, định mức đến vạch bằng nước cất hai lần đã loại ion.(B)

- Dung dịch đệm formic: Trộn (A) và (B) có sử dụng máy đo pH, ta được các dung dịch đệm pH = 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 5,0

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho thiết bị HPLC-MS/MS trong phân tích thuốc kháng sinh Ciprofloxacin

2.2.1.1 Tối ƣu hóa các thông số máy móc

a) Hiệu chỉnh (Tuning)

- Trước khi phân tích mẫu thử chúng tôi hiệu chỉnh các tham số đầu dò khối phổ để bảo đảm hệ thống được tối ưu và hoạt động ổn định bằng cách tuning hệ thống Thời gian autotune thường kéo dài khoảng 18-25 phút Trong hệ thống máy sắc kí lỏng của hãng Agilent, chúng ta có thể hiệu chỉnh tự động với dung dịch chuẩn (mixed tune EI) do hãng cung cấp Mọi thứ sẽ tự động vì quá trình này được điều khiển bởi calibrant delivery system (CDS), trong suốt thời gian tune

- Thiết bị cũng đã được kiểm tra theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kết quả cho thấy độ nhạy của máy đạt chuẩn để có thể phân tích ở hàm lượng thấp

Các thông số cài đặt được đề xuất khi phân tích bằng LC - MS:

+ Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

+ Nhiệt độ cột: 300oC

+ Áp suất chân không cao (High Vac): 4; L26x10-5 Torr

+ Áp suất châ không (Rough Vac): 1,92 Torr

+ Thế áp vào ống mao quản (Capillary): 3840 V

+ Cường độ dòng điện của buồng (Chamber Current): 1,66 µA

+ Cường độ dòng điện tại ống mao quản (Capillary Current): 74 nA

+ Tốc độ bơm turbo (Turbo speed): 100%

+ Áp suất dòng khí N2 cho hệ phun sương (Nebulizer): 40,0 psi

b) Lựa chọn nguồn ion hóa

Đối với thiết bị HPLC-MS/MS của hãng Agilent, có hai cách để ion hóa mẫu

là ESI và APCI Ciprofloxacin là kháng sinh có tính phân cực cao, khối lượng phân

tử khá lớn Do đó, nguồn ion hóa phù hợp cho chất này là ESI Với nguồn ion hóa ESI, CIP được cung cấp proton bởi axit trong pha động để tạo thành ion mẹ có mảnh phổ là m/z = 332 Đưa trực tiếp chất chuẩn vào hệ thống (không qua cột sắc kí) để định danh xác định mảnh phổ

c) Khảo sát năng lượng đập mảnh colision energy (CE)

Đối với một chất phân tích, năng lượng đập mảnh đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra số lượng các ion con đủ lớn để định lượng chính xác nồng độ của chất phân tích Để khảo sát năng lượng đập mảnh, chúng tôi tiến hành bơm trực tiếp từng chuẩn ở nồng độ khoảng 0,250 µg/ml để xác định vị trí của Ciprofloxacin Sau

đó tăng dần thế CE từ 0V lên đến khi ion mẹ còn dưới 10%

d) Chọn thể tích bơm mẫu

Lượng mẫu được xác định bằng lượng thể tích bơm mẫu mà ta chọn Nếu thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng một cách tuyến tính Đến giới hạn Vmẫu>Vo nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng được nữa mà lúc đó pic sắc kí sẽ tù và doãng, không sắc nét nữa Vì vậy việc chọn được thể tích bơm mẫu hợp lí cũng là yếu tố quan trọng

Thông thường chỉ nên chọn thể tích bơm mẫu càng nhỏ càng tốt mục đích để tạo pic có độ sắc nét cao và tránh sự doãng pic, trong phân tích người ta có thể chọn

22

thể tích bơm mẫu trong HPLC là 10, 20, 50, 100 l trong đó thể tích bơm mẫu 20 l

là phổ biến nhất, do đó trong phân tích thuốc kháng sinh chúng tôi chọn thể tích bơm mẫu là 20 l (nếu lớn quá sẽ gây doãng pic) để khảo sát tìm điều kiện tối ưu cho quá trình tách và xác định kháng sinh Ciprofloxacin

e) Chọn pha tĩnh

Đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng pha tĩnh là cột sắc kí RP-C8 hay cột RP- C18 Kết quả cho thấy sử dụng cột RP-C8 thì thời gian lưu của chất sớm hơn rất nhiều so với cột RP-C18 tuy nhiên khả năng tách của cột RP-C18 là chọn lọc và rõ ràng hơn Cột Silica C18 tách tốt hơn cột Silica C8 nhưng thời gian lưu của C18 dài hơn vì kích thước lỗ xốp của hạt lớn hơn cột C8 do có đầu kỵ nước dài hơn (18C so với 8C) dẫn đến sự tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh trong loại cột này cũng lớn hơn so với C8 Đường kính cột càng nhỏ, lượng dung môi tiêu tốn càng ít, nhưng khó chế tạo Cột càng dài, cỡ hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt nhưng thời gian chạy lâu và áp suất cao Mặt khác trong cùng một loại cột thì chiều dài cột tách cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phân giải các chất Sau khi khảo sát nhận thấy cột Sunfire C18 kích thướt 150 4,6 mm đường kính hạt nhồi 5m tách kém hơn nhiều so với cột Ultra Aqueous C18 kích thước 2503,2mm đường kính hạt nhồi 5m Để tách được Ciprofloxacin và các sản phẩm phụ tạo ra trong quá trình quang phân thì cột tách phải có số lượng đĩa lí thuyết tương đối lớn vì thế trong điều kiện của phòng thí nghiệm thì chúng tôi chọn cột Ultra Aqueous C18 kích thước

2503,2mm đường kính hạt nhồi 5m máy HPLC Từ đó tìm những điều kiện khác

để tối ưu hóa việc tách các chất trên

f) Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng - thành phần pha động

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột C18 của hãng Agilent (có tiền cột bảo vệ) Một trong những thông số ảnh hưởng đến thời gian lưu là tốc độ dòng của pha động Nếu tốc độ dòng quá cao, pha động đi qua cột nhanh chất phân tích chưa kịp tương tác với pha tĩnh, gây sự trùng lặp các peak sắc kí và sai lệch kết quả, peak có thể ra ngay đầu cột hoặc áp lực lớn hơn khả năng chịu đựng của cột, gây hỏng cột Nếu tốc độ dòng quá chậm, chất phân tích ở trong cột lâu dẫn đến thời gian phân tích kéo dài, peak bị tù, lãng phí thời gian Đối với đầu dò MS tốc độ dòng thường

23

không cao vì nó gây ảnh hưởng đến quá trình ion hóa trong nguồn ESI, dung môi pha động không kịp bay hơi hết trước khi vào bộ phận phân tích khối phổ sẽ làm đầu dò mất ổn định gây nhiễu nền Do vậy chúng tôi khảo sát tốc độ dòng ở giá trị 0,3 và 0,5 ml/phút

Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thời gian lưu của chất phân tích là pha động và thành phần pha động Vì Ciprofloxacin là kháng sinh phân cực nên pha động được chọn là những dung môi phân cực như: nước, methanol, ACN Ngoài ra pha động còn được thêm một lượng nhỏ axit formic nhằm mục đích cung cấp proton H+ cho quá trình proton hóa

Để khảo sát thành phần pha động, chúng tôi sử dụng hệ pha động gồm kênh A-Acetonitril và kênh B- nước và axit formic 0,1% với tỉ lệ các kênh A:B là 10:90; 15:85; 20:80

g) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit formic

Ciprofloxacin là kháng sinh có tính lưỡng tính, có khả năng phân li nhận ion

H+ để tạo ra dạng ion dương, cũng có thể cho ion H+ tạo ra dạng ion âm hoặc ở dạng trung hòa, nên chúng chịu ảnh hưởng lớn của nồng độ axit Trong đề tài này, pha động được sử dụng có chứa axit formic để tạo ra ion mẹ mang điện tích dương cho nên việc khảo sát nồng độ axit formic là hết sức cần thiết

2.2.1.2 Khảo sát các thông số đánh giá phương pháp

a) Xác định LOD và LOQ của máy HPLC-MS/MS

Giới hạn phát hiện (LOD) của một thiết bị là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể phát hiện bởi thiết bị này

Giới hạn định lượng (LOQ) của một thiết bị là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể định lượng bởi thiết bị này

24

LOQ = 3 * LOD

Cmin: nồng độ nhỏ nhất cho vào pha động

LOD: giới hạn phát hiện của thiết bị

LOQ: giới hạn định lượng của thiết bị

S: tín hiệu; N: nhiễu nền

Tương tự , MLOD- MLOQ Xác định trên mẫu thực tế theo công thức sau:

hoặc : MLOQ = 3 * MLODTrong đó:

V (ml) là thể tích định mức cuối cùng; m (g) là khối lượng mẫu

Cmin: là nồng độ nhỏ nhất của chất chuẩn cho vào mẫu trắng

S: tín hiệu; N: nhiễu nền

MLOD: giới hạn phát hiện của phương pháp

MLOQ: giới hạn định lượng của phương pháp

- Giới hạn phát hiện (MLOD) của một qui trình là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể phát hiện bởi qui trình này

- Giới hạn định lượng (MLOQ) của một qui trình là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể định lượng bởi qui trình này

b) Dựng đường chuẩn của Ciprofloxacin

Dựa trên những báo cáo trước đây về Ciprofloxacin, chúng tôi dựng chuẩn theo phương pháp ngoại chuẩn với 05 điểm chuẩn từ 2 µg/l đến 105 µg/l

c) Khảo sát trên mẫu thực tế

Do dư lượng kháng sinh CIP trong nước mặt là tương đối thấp nên đòi hỏi cần có một quy trình xử lí mẫu hợp lí để tách các kháng sinh này

Các tài liệu tham khảo hiện nay khi phân tích kháng sinh trong môi trường nước thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn với cột ―hydrolytic – lipophilic balance‖ (HLB) Đây là loại cột có khả năng lưu giữ tốt các chất bán phân cực Trong nghiên cứu nay chúng tôi sử dụng cột Oasis HLB 220 mg của hãng Water để chiết và làm giàu kháng sinh trong mẫu nước thực tế theo quy trình của tổ chức bảo

vệ môi trường Mỹ-EPA method 1694

Các yếu tố ảnh hưởng đến độ thu hổi như : pH, tốc độ bơm mẫu, dung dịch rửa giải cũng đã được khảo sát lại và tối ưu hóa

Chuẩn bị mẫu: Mẫu nước được lọc bằng giấy lọc thô để loại bỏ các hạt có kích thước lớn có thể làm tắc cột chiết pha rắn

Hoạt hóa cột Oasis HLB: Cột chiết pha rắn HLB sử dụng bộ chiết mẫu tự động Tốc độ dòng là 5 ml/phút, thời gian 100 phút

Sau khi hút hết 500 ml mẫu, côt chiết pha rắn được rửa bằng 10 ml nước cất, làm khô bằng cách hút chân không ở 15 mmHg trong thời gian 30 phút

Các chất kháng sinh được rửa giải ra khỏi cột chiết bằng 6 mL MeOH với tốc

độ 2 giọt/giây

Cô cạn hoàn toàn dung dịch rửa giải bằng khí N2

Định mức lại bằng nước cất chính xác đến 1 ml và bơm 10l vào hệ thống HPLC-MS/MS để xác định và định lượng CIP

d) Xác định hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của phương pháp trên mẫu thực tế

26

- Mẫu blank là mẫu không chứa CIP, đã được kiểm tra bằng cách chạy trên thiết bị

- Mẫu thêm chuẩn: Lấy một thể tích mẫu nhất định V(ml) mẫu nước mặt thực

tế, thêm khoảng 50 µg/l chất chuẩn; lắc đều

- Xử lí mẫu và thực hiện phân tích trên các thiết bị theo các điều kiện đã khảo sát Khi đó hiệu xuất thu hồi được xác định theo công thức:

+ Độ thu hồi được tính theo công thức: R =(A-B)/Cx100