Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh TT

Tính cấp thiết của luận án Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật được xem là một trong những giải pháp tốt trong nông nghiệp để thúc đẩy nhanh quá trình tăng trưởng của cây nhưng n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Lê Văn Nhân

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN,

CYTOKININ) TRONG RAU XANH

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 9.44.01.18

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2021

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Nguyễn Quang Trung Người hướng dẫn khoa học 2: TS Vũ Đức Nam

… năm 202…

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật được xem là một trong những giải pháp tốt trong nông nghiệp để thúc đẩy nhanh quá trình tăng trưởng của cây nhưng nếu lạm dụng các hóa chất này có thể dẫn đến sự tồn dư trong thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng từ nhiều năm nay Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp cũng diễn ra khá phổ biến ở Việt Nam, tuy nhiên, rất ít công trình công bố nghiên cứu về phương pháp phân tích và đánh giá dư lượng của các chất này trong các sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là rau xanh Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hòa sinh trưởng thực vật không có nhãn mác và nguồn gốc xuất xứ vẫn được nông dân truyền tai nhau sử dụng do hiệu quả nhanh chóng và vượt trội của chúng mang lại cho cây trồng Đây là một trong những nguyên nhân tiềm ẩn có thể gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm và

ô nhiễm môi trường liên quan đến dư lượng của các hóa chất sử dụng trong sản xuất nông nghiệp

Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực hiện đề

tài “Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích

một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh” Nghiên cứu này thành công sẽ là tiền đề cho việc

phát triển và ứng dụng phương pháp phân tích đánh giá dư lượng và thực trạng sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các loại rau xanh, các sản phẩm nông nghiệp và trái cây sản xuất ở nước ta cũng như nhập khẩu từ các nước trên thế giới Đây cũng

2

chính là cơ sở giúp các cơ quan chức năng, các nhà quản lý ban hành các chế tài và có phương thức giám sát việc sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp một cách hiệu quả, đảm bảo sự phát triển sản xuất, an toàn cho người tiêu dùng và môi trường sinh thái

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

 Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích đồng thời các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật trong rau xanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ bẫy ion

 Áp dụng phương pháp xây dựng được để phân tích, đánh giá hiện trạng sử dụng, mức độ tồn dư và khả năng tích lũy của một số chất kích thích sinh trưởng thực vật sử dụng trong rau tại một số quận/ huyện của Hà Nội

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1) Khảo sát các điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong rau, gồm: các điều kiện vận hành trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và các điều kiện của phương pháp xử lý mẫu

2) Xây dựng phương pháp phân tích và đánh giá các thông s ố của phương pháp

3) Đánh giá hiện trạng dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội

4) Đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực vật đến sự sinh trưởng và phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng trong rau xanh

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm chất kích thích sinh trưởng thực vật

Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) là nhóm các hợp chất hữu cơ như: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid, jasmonate, salicyclic acid và strigolactone ; có tác dụng kích thích quá trình sinh trưởng và phát triển của cây [1] Những chất này tác động lên sự sinh trưởng của cây trồng theo cơ chế: (1) Kích thích tăng trưởng thể tích tế bào ở lá, thân, quả [2-4]; (2) Kích thích hình thành tế bào mới, làm tăng cường sự nảy chồi, đâm rễ, ra hoa [5-7]; (3) Bổ sung và tăng cường hoạt động của các men trong quá trình sinh tổng hợp của cây bằng cách cung cấp thêm các chất vi lượng

như Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1]

1.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

- Auxin là một hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axit amin tryptophan, được xác định và phân lập về mặt hóa học vào những năm 1930 Auxin có trong tất cả các bộ phận của cây với các nồng

độ khác nhau, trong đó, nồng độ auxin ở mỗi vị trí là thông tin quan trọng của sự phát triển, được điều chỉnh chặt chẽ thông qua cả quá trình trao đổi chất và vận chuyển trong cây

- Gibberellin chính là các axit diterpenoid được tổng hợp từ terpenoid trong thể hạt và sau đó được biến đổi thành dạng hoạt hóa sinh học trong lưới nội chất và cytosol

- Cytokinin tham gia vào quá trình phát triển và biệt hóa tế bào, truyền tín hiệu tại chỗ và các vị trí khác nhau trong cơ thể với cơ chế vận chuyển tương tự như purin và nucleosit; đồng thời cytokinin ảnh hưởng đến tính ưu thế đỉnh, sự phát triển chồi nách và sự già đi của lá

- GAs điều hòa và ảnh hưởng đến các quá trình phát triển khác nhau của thực vật như: kéo dài thân, nảy mầm, ngủ của hạt, ra hoa, phát triển hoa và già đi của lá và quả

- Cytokinin tương tác trực tiếp với các auxin, kích thích sự phân chia tế bào và các quá trình chuyển hóa khác nhau của tế bào Cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ với các ADN và protein của thực vật, cho phép cây phát triển các mô khác nhau để thực hiện các mục đích khác nhau

1.4 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

- Auxin được nghiên cứu sử dụng trong nhân giống cây trồng, nuôi cấy mô hoặc tế bào, thuốc diệt cỏ

- Gibberellin được ứng dụng nhiều trong kích thích sự nảy mầm của hạt, phản ứng với các điều kiện ức chế của môi trường, thúc đẩy

sự tăng trưởng quả, kéo dài thân, kích thích ra hoa, hình thành hạt

- Cytokinin được nghiên cứu ứng dụng trong việc gia tăng hàm lượng diệp lục, làm chậm quá trình già hóa của cây, gia tăng sự phát triển thân cây

1.5 Các nghiên cứu về dư lượng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

Ở Việt Nam, hiện chưa có nào công trình công bố về dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các sản phẩm rau xanh

và trái cây Tuy nhiên, trên thị trường, các thuốc kích thích sinh

5

trưởng thực vật được buôn bán và sử dụng với nhiều tên thương mại khác nhau như: siêu ra rễ, siêu trái, thuốc kích mầm, thần dược siêu tăng trưởng Bên cạnh đó, một số loại phân bón qua lá cho các loại cây trồng cũng chứa một hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật nhất định Bản chất của các thuốc kích thích sinh trưởng thực vật chứa các chất như: auxin, gibberellin hoặc cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng phát triển, gia tăng sinh khối cho cây trồng

1.6 Các phương pháp phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật

1.6.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

1.6.1.1 Thu thập mẫu

1.6.1.2 Chiết tách

1.6.1.3 Làm sạch và tinh chế mẫu

1.6.2 Các phương pháp phân tích

1.6.2.1 Phương pháp phân tích các hợp chất auxin

1.6.2.2 Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin

1.6.2.3 Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin

6

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

IAA, IBA, ICA, IP A, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR

và DHZR, Methanol, Acetonitrile, axit foocmic, axít Hydrochloric, Dichloromethane, 2-propanol Thuốc kích thích sinh trưởng thực vật

Gibber4TB

2.1.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc 1000 μg.mL-1, sau đó pha thành các chuẩn trung gian gồm: 100 μg.mL-1; 20 μg.mL-1; 1 μg.mL-

1 Từ chuẩn trung gian tiếp tục pha thành các chuẩn làm việc: 1, 5,

10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000 ng.mL-1

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc ba nhóm: auxin (IAA, IBA, ICA và IPA ), gibberellin (GA3, GA4 và GA7) và cytokinin (BA, iP, iPR, K, DHZR, tZ, tZR)

2.2.2 Đối tượng phân tích

- Các mẫu rau cải xanh (Brassica juncea) được sử dụng để khảo

sát, xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích

- Các mẫu rau xanh thu thập từ các mô hình sản xuất rau quy mô hàng hóa tại một số quận/huyện thuộc thành phố Hà Nội

- Các mẫu rau thí nghiệm phục vụ xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích: được thu thập ở ngày phát triển thứ 35 sau khi chuyển ra trồng trong các thùng xốp, bằng cách nhổ cả gốc, rửa sạch, cắt bỏ phần gốc, phần còn lại được đông cứng bằng nitơ lỏng cho đến khi được xử lý và phân tích

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu của quy trình phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong rau

2.3.1.1 Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích khối phổ

- Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 1μg.mL

-1/chất KTSTvào detector MS để xác định các ion phân tử và ion sản phẩm của các chất KTST theo các chế độ ion hóa âm (-) và ion hóa dương (+) Sau đó, khảo sát điều kiện của nguồn ion hóa với sự có mặt của pha động

2.3.1.2 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

a) Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động:

 Các cột nghiên cứu: cột Hypersil và cột Purospher

 Các dung môi pha động: MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA và hệ dung môi ACN (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA

b) Khảo sát các điều kiện phân tích khác:

 Tốc độ dòng, chế độ gradient

8

2.3.2 Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu

- Dựa trên cơ sở phương pháp tách chiết các hoocmon thực vật ở

loài cây Arabidopsis thaliana thuộc Họ Cải theo nghiên cứu của

Xiangqing và cộng sự sử dụng dung môi chiết 1-propanol/H2O/HCl (2 : 1 : 0,002, v/v/v) và Dichloromethane

2.3.3 Phương pháp xây dựng và xác nhận quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau

- Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh từ các kết quả nghiên cứu về điều kiện tách chiết mẫu và điều kiện phân tích của thiết bị sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ

- Xác nhận và thẩm định quy trình phân tích thông qua các thông số:

 Độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông mẫu

 Đường chuẩn

 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

 Ảnh hưởng của nền mẫu

 Độ thu hồi và độ chính xác của phương pháp

 Các loại rau thí nghiệm: rau cải xanh, rau mồng tơi và rau xà lách

 Hóa chất thí nghiệm: Thuốc kích thích sinh trưởng thực vật Gibber4TB, có chứa hoạt chất kích thích sinh trưởng GA3

100%

- Các công thức thí nghiệm xử lý thuốc Gibber4TB gồm các nồng

độ thuốc khác nhau: Đối chứng (0 mg.L-1), 10 mg.L-1, 30 mg.L

Excel 2016 (Redmond, WA, USA, Microsoft Corp)

10

3.1 Khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích

3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Bảng 3.1 Các điều kiện tối ưu hóa của khối phổ trong phân tích các

CE (V)

Ion

Ion k/đ

11

Các chất kích thích sinh trưởng thực vật được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng phổ khối theo chế độ ESI-MS2, trong đó bảy loại chất kích thích sinh trưởng: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, và GA7

được phân tích theo chế độ ion hóa âm [M-H]−, trong khi bảy loại chất kích thích sinh trưởng khác gồm BA, iP, iPR, tZ, K, DHZR và tZR được phân tích theo chế độ ion hóa dương [M+H]+ Các ion phân tử và ion sản phẩm tạo thành của mỗi hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật được xác định thông qua các chất chuẩn, và quá trình chuyển hóa từ ion mẹ sang các ion sản phẩm tương ứng với hướng phân mảnh chính đặc trưng cho từng chất kích thích sinh trưởng thực vật được lựa chọn trên cơ sở tối ưu hóa mức năng lượng phân mảnh

Bảng 3.2 Các thông số của nguồn ion được tối ưu hóa

6 Nhiệt độ ống mao quản oC 200

7 Điện thế ống mao quản

12

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng, có sự khác nhau về hiệu quả phân tách các chất kích thích sinh trưởng thực vật khi sử dụng các hệ dung môi pha động khác nhau trên cùng một cột sắc ký như nhau; và khi sử dụng cùng một chế độ dung môi pha động, các cột sắc ký khác nhau có khả năng phân tách các chất kích thích sinh trưởng thực vật khác nhau Trong đó, cột sắc ký Hypersil cho hiệu quả phân tách các chất nghiên cứu ở cả hai chế độ ion hóa âm và ion hóa dương tốt hơn so với cột Purospher Việc sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA cho kết quả phân tách các chất kích thích sinh trưởng thực vật tốt hơn so với pha động ACN (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA Sự kết hợp của cột sắc ký Hypersil và pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA cho kết quả phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật tốt nhất với tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, cường độ tín hiệu cao, chân píc hẹp và sắc nét Do đó, cột Hypersil

và pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA được lựa chọn và sử dụng để khảo sát các điều kiện phân tích khác phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này

Kết quả khảo sát điều kiện gradient của pha động trong phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật cho thấy: sự thay đổi của

tỷ lệ dung môi MeOH (+0,1% FA) với nước siêu sạch chứa 0,1% FA

và tốc độ dòng dung môi có ảnh hưởng rõ rệt đến tín hiệu của chất phân tích, hình dạng píc sắc ký và thời gian rửa giải của các chất kích thích sinh trưởng thực vật Trong các gradient được khảo sát, gradient 3 có điều kiện phân tách tốt nhất, với tín hiệu chất phân tích

rõ ràng, sắc nét, chân píc gọn, và các chất được rửa giải hoàn toàn,

13

do đó điều kiện của gradient này được lựa chọn sử dụng cho các

nghiên cứu tiếp theo

Bảng 3.4 Điều kiện gradient tối ưu sử dụng phân tích các chất PGR trong rau

Thời gian

(phút)

Tốc độ dòng (mL/phút)

(+ 0,1% FA)

MeOH (+0,1% FA)

3.2 Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu

Kết quả nghiên cứu cho thấy, có sự khác nhau về hiệu suất chiết giữa các chất kích thích sinh trưởng thực vật khác nhau sử dụng cùng một dung môi chiết; và sự khác nhau về hiệu suất chiết giữa các dung môi chiết khác nhau đối với cùng một hợp chất phân tích; trong

đó, việc sử dụng dung môi chiết 2-propanol cho hiệu quả chiết cao hơn so với dung môi chiết 1-propanol ở cùng điều kiện nghiên cứu Quy trình được xây dựng và phát triển sử dụng dung môi chiết 2-propanol có hiệu suất chiết trung bình đối với các chất kích thích sinh trưởng thực vật đạt 85,93±5,28% cao hơn quy trình sử dụng 1-propanol là 76,00±5,13% Các giá trị này cao hơn nhiều so với quy trình tách chiết các chất kích thích sinh trưởng thực vật theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự [83] sử dụng 2-propanol và 1-propanol lần lượt là 78,29±5,78% và 66,93±4,84% Đặc biệt, có 6 hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật có hiệu suất chiết cao hơn 90% là: GA3 đạt đến 95%, IAA đạt đến 94%, ICA đạt đến 92%, tZR