Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài Luận án “Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng auxin, gibberellin, cytokinin trong rau xanh” là

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

LÊ VĂN NHÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN,

CYTOKININ) TRONG RAU XANH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội, 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

LÊ VĂN NHÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN,

CYTOKININ) TRONG RAU XANH

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Hà Nội, 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài Luận án “Nghiên cứu xây dựng và phát triển

phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn của PGS TS

Nguyễn Quang Trung và TS Vũ Đức Nam Các kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực, không trùng lặp và sao chép với bất kỳ công trình khoa học nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Nghiên cứu sinh

Lê Văn Nhân

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án, nghiên cứu sinh đã nhận được sự hỗ trợ và giúp đỡ từ nhiều cá nhân và tập thể; nghiên cứu sinh rất trân trọng và biết ơn sự hỗ trợ và giúp đỡ này

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến thầy giáo PGS TS Nguyễn Quang Trung, người đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Vũ Đức Nam, người luôn quan tâm, nhắc nhở, hướng dẫn và động viên tôi sớm hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ đã tạo điều kiện về mặt thời gian, cơ sở vật chất, trang thiết bị phục vụ cho việc nghiên cứu và thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ đã mời các giảng viên có nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên sâu giảng dạy cho các nghiên cứu sinh cũng như bố trí thời gian học tập linh hoạt và phổ biến các thông tin kịp thời tới nghiên cứu sinh

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khích lệ, cổ vũ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án

Con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới cha mẹ, vợ, con, các anh chị em

và người thân đã luôn động viên, khích lệ và cổ vũ con hoàn thành chương trình đào tạo nghiên cứu sinh

Xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

Lê Văn Nhân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Khái niệm chất kích thích sinh trưởng thực vật 3

1.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trưởng thực vật 3

1.2.1 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin 3

1.2.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin 6

1.2.3 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin 7

1.3 Vai trò chức năng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật 9

1.3.1 Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm auxin 9

1.3.2 Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm gibberellin 10

1.3.3 Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm cytokinin 11

1.4 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật 11

1.4.1 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin 11

1.4.2 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm gibberellin 14

1.4.3 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm cytokinin 15

1.5 Các nghiên cứu về dư lượng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật 17

1.6 Các phương pháp phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật 18

1.6.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 18

1.6.1.1 Thu thập mẫu 19

1.6.1.2 Chiết tách 19

1.6.1.3 Làm sạch và tinh chế mẫu 19

1.6.2 Phương pháp phân tích 20

1.6.2.1 Phương pháp phân tích các hợp chất auxin 21

1.6.2.2 Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin 22

1.6.2.3 Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin 23

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 25

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 25

2.1.2 Hóa chất thí nghiệm 25

2.1.2.1 Hóa chất 25

2.1.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 26

2.2 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2.2 Đối tượng phân tích 27

2.2.3 Thu thập mẫu 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu của quy trình phân tích 28

2.3.1.1 Phương pháp khảo sát điều kiện khối phổ 28

2.3.1.2 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng 28

2.3.2 Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu 30

2.3.3 Phương pháp xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích 32

2.3.4 Phương pháp đánh giá dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội 35

2.3.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng 36

2.3.5.1 Bố trí thí nghiệm 36

2.3.5.2 Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực vật đến sự phát triển của các loại rau 38

2.3.5.3 Phương pháp đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các loại rau 38

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu của quy trình phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong rau 40

3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích khối phổ 40

3.1.1.1 Khảo sát mức năng lượng phân mảnh của các ion 40

3.1.1.2 Khảo sát các hướng phân mảnh của các chất KTST 45

3.1.1.3 Khảo sát các thông số của nguồn ion hóa 56

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng 57

3.1.2.1.Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động 57

3.1.2.2 Khảo sát chế độ gradient của pha động 66

3.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu 69

3.3 Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích 74

3.3.1 Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau 74

3.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích 77

3.3.2.1 Đánh giá độ ổn định của chu kỳ đông/rã đông mẫu 77

3.3.2.2 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 79

3.3.2.3 Ảnh hưởng của nền mẫu 81

3.3.2.4 Hiệu suất thu hồi và độ chính xác của phương pháp phân tích 83

3.3.2.5 So sánh với một số phòng thí nghiệm 86

3.4 Kết quả đánh giá hiện trạng dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội 89

3.4.1 Số lượng mẫu rau phát hiện chứa các chất kích thích sinh trưởng thực vật 89

3.4.2 Số lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật phát hiện được trong các mẫu rau cải xanh 90

3.4.3 Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật phát hiện được trong các mẫu rau cải xanh 91

3.4.4 Sự tồn dư nhiều hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật trong mẫu rau cải xanh ở các khu vực nghiên cứu 93

3.5 Đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng 97

3.5.1 Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của một số loại rau xanh 97

3.5.1.1 Ảnh hưởng của GA 3 đến sự phát triển của rau cải xanh 97

3.5.1.2 Ảnh hưởng của GA 3 đến sự phát triển của rau mồng tơi 100

3.5.1.3 Ảnh hưởng của GA 3 đến sự phát triển của rau xà lách 102

3.5.2 Sự tích lũy của GA3 trong một số loại rau 105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN 111

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 112

TÀI LIỆU THAM KHẢO 114

PHỤ LỤC 128

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT TRONG RAU 128

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT 133

PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN 139 PHỤ LỤC 4 ĐƯỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ NGHIỆM 144 PHỤ LỤC 5 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU 145

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

kết với enzyme

MS Mass Spectrometry Khối phổ

(Chú thích: Tên hóa chất trong luận án đƣợc viết theo tên tiếng Anh)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin 5

Bảng 1.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin 7

Bảng 1.3 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin 9

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu về tác dụng của auxin đối với các loại cây trồng 13

Bảng 1.5 Một số nghiên cứu về tác dụng của gibberellin đối với các loại cây trồng 14

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu về tác dụng của cytokinin đối với các loại cây trồng 16 Bảng 3.1 Các điều kiện tối ưu hóa của khối phổ trong phân tích các chất KTST 42

Bảng 3.2 Các thông số của nguồn ion được tối ưu hóa 56

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát gradient của pha động 67

Bảng 3.4 Điều kiện gradient tối ưu sử dụng phân tích các chất KTST trong rau xanh 68

Bảng 3.5 Diện tích píc của các chất KTST và độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông 78

Bảng 3.6 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 81

Bảng 3.7 Độ lặp lại và độ thu hồi của các chất kích thích sinh trưởng thực vật 84

Bảng 3.8 Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 10 ng.mL-1 86

Bảng 3.9 Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 100 ng.mL-1 87 Bảng 3.10 Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 1000 ng.mL-1 88

Bảng 3.11 Số lượng các chất KTST phát hiện được trong các mẫu rau cải xanh 90 Bảng 3.12 Hàm lượng của các KTST phát hiện được trong các mẫu rau cải xanh 92

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm cytokinin 8

Hình 2.1 Quy trình tách chiết và phân tích các hoocmon thực vật trong mẫu cây thuộc Họ Cải theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự 30

Hình 2.2 Các khu vực nghiên cứu và thu thập mẫu rau 35

Hình 2.3 Thuốc kích thích sinh trưởng thực vật Gibber4TB 37

Hình 2.4 Mô hình thí nghiệm đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trưởng thực vật trong một số loại rau xanh 37

Hình 3.1 Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh ion của các chất KTST 41

Hình 3.2 Phân mảnh ion đặc trưng của các chất KTST ở điều kiện tối ưu hóa 44

Hình 3.3 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IAA 46

Hình 3.4 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IBA 47

Hình 3.5 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất ICA 47

Hình 3.6 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IPA 48

Hình 3.7 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA3 49

Hình 3.8 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA4 49

Hình 3.9 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA7 50

Hình 3.10 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất BA 51

Hình 3.11 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất DHZR 52

Hình 3.12 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iP 52

Hình 3.13 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iPR 53

Hình 3.14 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất K 54

Hình 3.15 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZ 54

Hình 3.16 Các hướng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZR 55

Hình 3.17 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Hypersil sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 58

Hình 3.18 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Hypersil sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1

59

Hình 3.19 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 60

Hình 3.20 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1 61

Hình 3.21 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 62

Hình 3.22 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1 63

Hình 3.23 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,5 mL.phút-1 64

Hình 3.24 Sắc ký đồ của các chất KTST được phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 1 mL.phút-1 65

Hình 3.25 Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong các mẫu rau xanh được phát triển và tối ưu hóa 70

Hình 3.26 Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình Xiangqing và cộng sự sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol 72

Hình 3.27 Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình mới xây dựng và phát triển sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol 73

Hình 3.28 Sơ đồ quy trình chiết và phân tích các chất KTST trong các mẫu rau 74

Hình 3.29 Sắc ký đồ của các chất KTST ở điều kiện gradient tối ưu 76

Hình 3.30 Đường chuẩn của các chất KTST trên nền mẫu rau cải xanh 79

Hình 3.31 Ảnh hưởng của nền mẫu đến tín hiệu của các chất KTST 82

Hình 3.32 Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh 90

Hình 3.33 Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ở các huyện nghiên

cứu 90

Hình 3.34 Sự phân bố hàm lượng của các chất KTST trong các mẫu rau cải xanh ở các khu vực nghiên cứu 94

Hình 3.35 Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh 98

Hình 3.36 Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi 101

Hình 3.37 Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách 104

Hình 3.38 Sự tích lũy của GA3 trong các loại rau 108

MỞ ĐẦU

Nhu cầu sử dụng lương thực, thực phẩm và rau xanh ở Việt Nam ngày càng gia tăng Do đó, trong sản xuất nông nghiệp, người ta luôn tìm kiếm, nghiên cứu các giải pháp để nâng cao hiệu quả sản xuất cây trồng Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật được xem là một trong những giải pháp tốt trong nông nghiệp để thúc đẩy nhanh quá trình tăng trưởng của cây

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất có khả năng điều tiết sự sinh trưởng và phát triển của thực vật từ khi nảy mầm đến khi lão hóa và chết Trong tự nhiên, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn được gọi là các hoocmon sinh trưởng thực vật, là những chất được sinh ra trong cây Bằng con đường hóa học nhân tạo, nhiều hợp chất khác nhau, có hoạt tính tương tự với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tổng hợp nhân tạo và dùng để điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển của cây nhằm tăng năng suất và phẩm chất của cây trồng Có hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm: nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật (auxin, gibberellin và cytokinin ), có vai trò thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của thực vật và nhóm chất ức chế sinh trưởng thực vật (absicic, ethylen và các hợp chất phenol ), có chức năng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của thực vật để chuyển sang thời kỳ ra hoa, kết quả, hoặc chín

Trên thị trường, nhiều loại hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật được buôn bán và sử dụng ở các dạng khác nhau như: dạng bột, dạng lỏng hoặc dạng phối trộn cùng với các loại phân bón khác Trong đó, nhiều hóa chất được sản xuất ở Việt Nam, một số loại khác được nhập khẩu từ các nước trên thế giới và có cả những loại không nhãn mác, không có nguồn gốc xuất xứ Nếu không được quản lý chặt chẽ và

sử dụng đúng cách thì những chất này có thể tiềm ẩn những nguy cơ dẫn tới ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng từ nhiều năm nay Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp cũng diễn ra khá phổ biến

ở Việt Nam, tuy nhiên, rất ít công trình công bố nghiên cứu về phương pháp phân tích và đánh giá dư lượng của các chất này trong các sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là rau xanh Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hòa sinh trưởng thực vật không

có nhãn mác và nguồn gốc xuất xứ vẫn được nông dân truyền tai nhau sử dụng do

hiệu quả nhanh chóng và vượt trội của chúng mang lại cho cây trồng Đây là một

trong những nguyên nhân tiềm ẩn có thể gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm và ô

nhiễm môi trường liên quan đến dư lượng của các hóa chất sử dụng trong sản xuất

nông nghiệp

Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên

cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng

trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh” Nghiên cứu này thành

công sẽ là tiền đề cho việc phát triển và ứng dụng phương pháp phân tích đánh giá

dư lượng và thực trạng sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các

loại rau xanh, các sản phẩm nông nghiệp và trái cây sản xuất ở nước ta cũng như

nhập khẩu từ các nước trên thế giới Đây cũng chính là cơ sở giúp các cơ quan chức

năng, các nhà quản lý ban hành các chế tài và có phương thức giám sát việc sử dụng

các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp một cách hiệu

quả, đảm bảo sự phát triển sản xuất, an toàn cho người tiêu dùng và môi trường sinh

thái

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

 Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích đồng thời các hợp

chất kích thích sinh trưởng thực vật trong rau xanh bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ bẫy ion

 Áp dụng phương pháp xây dựng được để phân tích, đánh giá hiện trạng sử

dụng, mức độ tồn dư và khả năng tích lũy của một số chất kích thích sinh

trưởng thực vật sử dụng trong rau tại một số quận/ huyện của Hà Nội

Nội dung nghiên cứu của luận án:

1) Khảo sát các điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích các chất kích thích

sinh trưởng thực vật trong rau, gồm: các điều kiện vận hành trên thiết bị sắc ký

lỏng khối phổ và các điều kiện của phương pháp xử lý mẫu

2) Xây dựng phương pháp phân tích và đánh giá các thông số của phương pháp

3) Đánh giá hiện trạng dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các

mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội

4) Đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực vật đến sự sinh trưởng

và phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng trong rau xanh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm chất kích thích sinh trưởng thực vật

Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) là nhóm các hợp chất hữu cơ như: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid, jasmonate, salicyclic acid và strigolactone ; có tác dụng kích thích quá trình sinh trưởng và phát triển của cây [1] Những chất này tác động lên sự sinh trưởng của cây trồng theo cơ chế: (1) Kích thích tăng trưởng thể tích tế bào ở lá, thân, quả [2-4]; (2) Kích thích hình thành tế bào mới, làm tăng cường sự nảy chồi, đâm rễ, ra hoa [5-7]; (3) Bổ sung và tăng cường hoạt động của các men trong quá trình sinh tổng hợp của cây bằng cách cung

cấp thêm các chất vi lượng như Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1]

1.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

1.2.1 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin

Auxin là một hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axít amin tryptophan, được xác định và phân lập về mặt hóa học vào những năm 1930 Auxin có trong tất cả các bộ phận của cây với các nồng độ khác nhau, trong đó, nồng độ auxin ở mỗi vị trí là thông tin quan trọng của sự phát triển, được điều chỉnh chặt chẽ thông qua cả quá trình trao đổi chất và vận chuyển trong cây Auxin hoạt động kết hợp hoặc đối lập với các hoocmon thực vật khác Ví dụ, tỷ lệ nhất định của auxin với cytokinin trong các mô thực vật có ảnh hưởng đến sự hình thành rễ của các cành giâm [8]

Cấu trúc hóa học của các hợp chất auxin được trình bày ở Hình 1.1 Ở cấp độ phân tử, tất cả các auxin đều là hợp chất có một vòng thơm và một nhóm axít cacboxylic Trong đó, indole-3-acetic acid (IAA) là một dẫn xuất của indole-3-acetic acid, là monocacboxylic acid, hợp chất chứa acetic acid được liên kết với nguyên tử cacbon C3 của indole IAA được xem là hợp chất quan trọng nhất của nhóm auxin, có vai trò tạo ra phần lớn các hiệu ứng auxin trong thực vật Là một auxin tự nhiên nên trạng thái cân bằng của IAA trong cây có thể được kiểm soát theo nhiều cách từ tổng hợp cho đến sự phân hủy các phân tử của nó tùy theo điều kiện môi trường [9]

Có 5 hợp chất auxin trong tự nhiên gồm: IAA, 4-chloroindole-3-acetic acid (4-CI-IAA), indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA) và phenylacetic acid (PAA) [10, 11] Bên cạnh đó, nhiều hợp chất tổng hợp có tính chất tương tự auxin như: Indole-3-carboxylic acid (ICA); α-naphthaleneacetic acid (α-NAA); 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T); 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (tordon or picloram); 2-Methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid (dicamba), β-Indolyaxetic acid (AIA) [10] Những auxin tổng hợp nhân tạo này cũng có khả năng kích thích sự phát triển của thực vật và đã được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và thương mại

Các đặc điểm, tính chất hóa lý như khối lượng mol phân tử, mật độ, diện tích

bề mặt, màu sắc, trạng thái, nhiệt độ nóng chảy và độ tan của một số hợp chất auxin được trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin (Nguồn:

PubChem)

Hợp chất KLPT

(g.mol -1 )

Mật độ (g.cm -3 )

Diện tích

bề mặt (Å2

)

Màu sắc, trạng thái

Nóng chảy ( o C)

mL

nhẹ trong dung môi

aceton, acetic acid, chlorofom

C; tan trong dung môi hữu cơ: methanol, aceton, chloroform,

dichloromethane

trong các dung môi

acetonitrile, benzene, etanol, isopropanol

hơi vàng

1.2.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin

Gibberellin (GAs) là nhóm hoocmon thực vật được phát hiện sau auxin, được tổng hợp trong các mô non của chồi, có thể có trong rễ, hạt đang phát triển và lá cây [12] Gibberellin chính là các diterpenoid acid được tổng hợp từ terpenoid trong thể hạt và sau đó được biến đổi thành dạng hoạt hóa sinh học trong lưới nội chất và

cytosol [13] Các gibberellin đều dẫn xuất từ bộ khung ent-gibberellan và được tổng hợp thông qua ent-kauren

Các gibberellin được đặt tên theo thứ tự phát hiện của chúng là GA1, GA2, GA3 GAn Trong đó, GA3 là gibberellin đầu tiên được mô tả cấu trúc và là chất có tác dụng sinh học lớn nhất Hiện nay, có 126 gibberellin được xác định từ thực vật, nấm và vi khuẩn với công thức phân tử không chứa nitơ [14] Gibberellin là các deterpene acid, với sự xuất hiện của cacbon 19 (C-19) hoặc cacbon 20 (C-20) Các gibberellin C-19, bị mất đi C-20, tại vị trí đó sở hữu một cầu lacton 5 thành viên liên kết với cacbon 4 và cacbon 10 Gibberellin C-19 được xem là dạng gibberellin

GA1

(C19H24O6)

GA3 (C19H22O6)

GA4 (C19H24O5)

GA7 (C19H22O5)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin

Gibberellin tan tốt trong dung môi hữu cơ nhưng tan kém trong nước Các đặc điểm hóa lý của một số gibberellin được trình bày trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin

Hợp chất KLPT

(g.mol -1 )

Mật độ (g.cm -3 )

Diện tích

bề mặt (Å2

)

Màu sắc, trạng thái

Nóng chảy ( o C)

1.2.3 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin

Cytokinin là hoocmon thực vật được phát hiện sau auxin và gibberellin, có khả năng thúc đẩy sự phân chia tế bào trong thân và rễ cây Cytokinin tham gia vào quá trình phát triển và biệt hóa tế bào, truyền tín hiệu tại chỗ và tới các vị trí khác nhau trong cơ thể với cơ chế vận chuyển tương tự như purin và nucleosit; đồng thời cytokinin ảnh hưởng đến tính ưu thế đỉnh, sự phát triển chồi nách và sự già đi của lá [17]

Cytokinin hoạt động phối hợp với auxin trong điều hòa sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Cytokinin là các hợp chất hữu cơ với thành phần cơ bản gồm các nguyên tố C, N và H Một số hợp chất thuộc nhóm cytokinin như: kinetin (K), zeatin (Z), 6-benzylaminopurine, diphenylurea, thidiazuron (TDZ), trans-

Isopentenyladenosine (iPR), Dihydrozeatin riboside (DHZR), Trans-zeatin riboside (tZR)… [18]

Cytokinin là các dẫn xuất của adenine với chuỗi bên ở vị trí N6 Cấu trúc và hình dạng của chuỗi bên gắn với vị trí N6 có thể ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính sinh học của cytokinin Tùy thuộc vào cấu trúc của nhóm thế N6, các cytokinin được

phân loại thành các cytokinin isoprenoid hoặc thơm Cấu trúc hóa học của adenine

và một số chất thuộc nhóm cytokinin được trình bày ở Hình 1.3

Adenin

(C5H5N5)

BA (C12H11N5)

K (C10H9N5O)

Diphenylurea (C13H12N2O)

Z

(C10H13N5O)

tZ (C10H13N5O)

iP (C10H13N5)

Thidiazuron (C9H8N4OS)

iPR

(C15H21N5O4)

DHZR (C15H23N5O5)

tZR (C15H21N5O5)

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm cytokinin

Các hợp chất hữu cơ thuộc nhóm cytokinin thường có màu trắng hoặc không màu và tan kém trong nước Đặc điểm, tính chất hóa lý của một số hợp chất cytokinin được trình bày trong Bảng 1.3

Bảng 1.3 Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin

Hợp chất KLPT

(g.mol -1 )

Mật độ (g.cm -3 )

Diện tích

bề mặt(Å2

)

Màu sắc, trạng thái

Nóng chảy ( o C)

1.3 Vai trò chức năng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

1.3.1 Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm auxin

Auxin đóng vai trò quan trọng trong việc điều phối nhiều quá trình sinh lý cần thiết trong chu kỳ sống của thực vật như: sự sinh trưởng, phát triển, sự ra hoa, hình thành củ, quả, hạt của thực vật Auxin có thể ảnh hưởng đến dòng của tế bào chất, sự di chuyển của chất lỏng trong tế bào và hoạt tính của các enzym khác nhau [19]

Nồng độ auxin ảnh hưởng đến quá trình quang dưỡng của cây, cho phép cây hướng về phía ánh nắng mặt trời để thu được nhiều năng lượng nhất Auxin kiểm soát quá trình này bằng cách tập trung về phía cây xa ánh nắng mặt trời Điều này tạo ra những thay đổi trong các tế bào, làm cong cây về phía ánh sáng [19]

Auxin tạo ra tính ưu thế ngọn ở nhiều loài thực vật, là sự phát triển sớm và nhanh của một mô phân sinh Auxin được giải phóng từ mô này ức chế tất cả các chồi mới mọc ra bên dưới nó Nếu ngọn cây bị cắt bỏ, sự điều hòa nồng độ auxin trong cây sẽ thay đổi, nhiều chồi mới sẽ mọc ra phía bên dưới, trong đó, có một chồi

sẽ phát triển mạnh hơn các chồi khác Sự điều hòa nồng độ auxin trong cây quyết định tốc độ phát triển và chiều cao của cây Hơn nữa, auxin kích thích sự ra rễ của các cành giâm, ngăn cản sự phát triển của chồi, tạo quả không hạt và hạn chế quả

rụng [19, 20]

1.3.2 Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm gibberellin

GAs điều hòa và ảnh hưởng đến các quá trình phát triển khác nhau của thực vật như: kéo dài thân, nảy mầm, ngủ của hạt, ra hoa, phát triển hoa và già đi của lá

và quả [14]

Các hạt giống ngủ đông thường rất ít hoặc không xảy ra hoạt động trao đổi chất Khi tiếp xúc với nước, quá trình trao đổi chất được thúc đẩy, tạo điều kiện cho phôi phát triển, giải phóng các phân tử gibberellin, sau đó chúng di chuyển đến lớp aleurone bao quanh nội nhũ, nơi dự trữ tinh bột, chất béo và protein cho phôi đang phát triển để tiến hành sản xuất các enzyme giúp tiêu hóa nội nhũ và cung cấp chất dinh dưỡng cho phôi hạt giống phát triển [14] Bên cạnh đó, gibberellin ảnh hưởng đến sự cân bằng của protein, do đó, kích thích sự phát triển và kéo dài của tế bào trong thân cây và giữa các lóng Sự thay đổi nồng độ gibberellin trong cây giúp cây phản ứng và thích nghi tốt hơn với sự thay đổi của các điều kiện môi trường, đồng thời điều hòa các quá trình sinh trưởng phát triển phù hợp [14]

Ngoài ra, các phân tử gibberellin có liên quan và tương tác với các hormone thực vật khác trong cây Ví dụ, hàm lượng auxin có liên quan trực tiếp đến hàm lượng gibberellin trong cây và chúng thường bổ sung cho nhau, trong khi đó, ethylene có xu hướng làm suy giảm mức độ gibberellin trong cây

1.3.3 Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm cytokinin

Cytokinin tương tác trực tiếp với các auxin, kích thích sự phân chia tế bào và các quá trình chuyển hóa khác nhau của tế bào Sự hoạt hóa mạnh mẽ của cytokinin với các ADN và protein của thực vật cho phép cây phát triển các mô khác nhau để thực hiện các mục đích khác nhau [17] Cytokinin ảnh hưởng trực tiếp đến sự phân hóa chồi của thực vật, kích thích sự phát triển của chồi bên và sự giãn nở của lá bằng cách phân chia và mở rộng tế bào Bên cạnh đó cytokin còn kích thích tổng hợp chất diệp lục tạo ra sự chuyển đổi etioplast thành lục lạp và tăng cường mở khí khổng ở một số loài thực vật [18] Cytokinin làm chậm quá trình lão hóa các bộ phận trên cây thông qua việc duy trì hàm lượng protein và clorophin, giúp cây giữ được màu xanh lâu hơn Việc xử lý cytokinin giúp phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ và kích thích sự nảy mầm của hạt và củ Cytokinin kết hợp với auxin là giảm hiện

tượng ưu thế ngọn và tăng sự phân hóa chồi ở các loài thực vật Các cytokinin đóng

vai trò quan trọng trong việc giúp cây phát triển tốt ở điều kiện khô hạn, thiếu nước

[21, 22]

1.4 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

1.4.1 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin

Auxin là thành phần cơ bản trong kỹ thuật in vitro để nhân giống cây trồng

từ các tế bào, cơ quan hay toàn bộ cơ thể thực vật đồng thời loại bỏ các mầm bệnh bẩm sinh và tạo ra các cây không bị nhiễm virus [23] Nghiên cứu nuôi cấy rễ cây

cà chua in vitro cho thấy, cây phát triển không giới hạn nhờ vào việc sản xuất IAA

và cytokinin trong mô phân sinh ở đỉnh rễ Hơn nữa, các mẫu nuôi cấy mô thực vật đầu tiên là các mẫu cấy được cung cấp auxin hoặc do các khối u, sẹo của chúng sản xuất auxin hoặc do ứng dụng IAA từ bên ngoài vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, hiện nay, IAA tự nhiên ít được sử dụng trong nuôi cấy mô hoặc tế bào thực vật, thay vào đó là các auxin như: 2,4-D hoặc 1-NAA, được sử dụng một mình hoặc kết hợp với nhau Kỹ thuật này thường được áp dụng cho các dòng/chủng tế bào trong nghiên cứu cơ bản với các đối tượng cây trồng, ví dụ cây thuốc lá BY-2 và

Nicotiana tabacum L Ngoài ra, auxin ngoại sinh còn được ứng dụng trong việc tạo

rễ cho các cành giâm trong sinh sản vô tính [24]

Một số nghiên cứu ảnh hưởng của các auxin (IAA, α-NAA, 2,4-D ) đến sự sinh trưởng, phát triển và sản lượng của nhiều đối tượng cây trồng như: cà chua, ớt cay, cà tím, hành tây, rau cải mầm, cho thấy, việc xử lý các chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin làm thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của cây

về chiều cao, số lượng lá; gia tăng sinh khối và số lượng quả trên mỗi cây, tăng sản lượng cây trồng trên cùng một đơn vị diện tích và trong cùng một thời gian nghiên cứu [25-28]

Các auxin được sử dụng như thuốc diệt cỏ là các axít hữu cơ có chứa vòng thơm và nhóm cacboxyl; và được đặc trưng bởi trọng lượng phân tử thấp Có 5 loại thuốc diệt cỏ auxin chính, gồm: phenoxy-cacboxylic acid (ví dụ, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid); benzoic acid (ví dụ, dicamba); pyridineacids (ví dụ, picloram, clopyralid); quinolinecarboxylic acid (ví dụ, quinclorac); và pyrimidine cacboxylic acid (ví dụ: aminocyclopyrachlor) Trong đó, 2,4-D được xem là thuốc trừ sâu đầu tiên trong các auxin tổng hợp được sử dụng như chất diệt cỏ, với khả năng giết chết thực vật chủ yếu theo 3 cách: (i) làm thay đổi độ dẻo của thành tế bào, (ii) ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein và (iii) tăng sản xuất ethylene Hiện nay, 2,4-D được sử dụng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, với chi phí thấp và hiệu quả sử dụng cao bởi nó không ảnh hưởng đến cây trồng, đồng thời giảm thiểu

sự phát triển của những cây cỏ kháng thuốc theo thời gian [29] Một số nghiên cứu ứng dụng các hợp chất auxin đến sự sinh trưởng, phát triển và hiệu quả sản xuất của

các loại cây trồng được trình bày ở Bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu về tác dụng của auxin đối với các loại cây trồng Auxin Nồng độ

[26]

Tăng số lượng nhánh, số lượng quả và khối lượng quả tươi

[32]

Tăng chiều cao, đường kính thân, tán cây rộng, số lá, đường kính, chiều dài, khối lượng bông và sản lượng

[33]

Tăng chiều cao cây, số lượng

lá, độ rộng tán cây, đường kính bắp, khối lượng và năng suất bắp

[34]

Giảm tình trạng mất khối lượng và hạn chế hư hỏng do các tổn thương

vàng

Tăng chiều dài của thùy lá và diện tích lá, sản lượng và chất lượng khoai

[36]

1.4.2 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm gibberellin

Bảng 1.5 Một số nghiên cứu về tác dụng của gibberellin đối với các loại cây trồng

[10]

Tăng chiều cao, số lượng lá,

số cành, số quả, số hoa, số chùm quả, đường kính quả, năng suất

[45]

Tăng số lượng nhánh, số lượng quả và khối lượng quả tươi

[32]

Tăng đường kính, chiều dài cồi, khối lượng bông, sản lượng và giảm thời gian sản xuất

[46]

Tăng chiều cao cây, số lượng lá, đường kính bắp và năng suất; giảm thời gian hình thành bắp

[47]

Tăng tỷ lệ nảy mầm, các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất, thời gian sản xuất ngắn

[48]

Rút ngắn thời gian ra hoa và

số ngày thu hoạch, tăng tỷ lệ hình thành quả

[30]

Tăng chiều cao, số lượng lá/cây, chiều dài lá và độ rộng lá

[49]

Tăng lượng hoa có nhụy được thụ phấn, số lượng và khối lượng quả

[36]

Trong số các gibberellin có hoạt tính sinh học, GA3 là gibberellin được nghiên cứu ứng dụng cho nhiều đối tượng cây trồng, cây ăn quả và cây cảnh bởi nó đóng vai trò quan trọng kích thích sự nảy mầm của hạt [37], phản ứng với các điều kiện ức chế của môi trường [38], thúc đẩy sự tăng trưởng quả [39], kéo dài thân [40], kích thích ra hoa [41], hình thành hạt của lúa mạch và tạo ra các hiệu ứng sinh

lý khác khi tương tác với các phytohormone khác trong cơ thể cây trồng [42] Bên cạnh đó, hỗn hợp GA4+7 được ứng dụng trong việc kiểm soát hình dạng, kích thước

và gia tăng chất lượng của trái cây [43] Việc xử lý GA4+7 có thể giúp kích thích sản xuất các hoa cái thụ tinh ở một số đối tượng cây trồng, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất, canh tác [44] Một số nghiên cứu ứng dụng các hợp chất gibberellin đến

sự sinh trưởng, phát triển và hiệu quả sản xuất của các loại cây trồng được trình bày

ở Bảng 1.5

1.4.3 Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm cytokinin

Việc sử dụng trans-zeatin, trans-zeatin riboside, 6-benzyladenine và các cytokinin khác có thể làm chậm quá trình lão hóa của thực vật [52] Kết quả ứng dụng cytokinin trên một số đối tượng cây trồng cho thấy, cytokinin ngoại sinh làm tăng độ mở khí khổng và tốc độ thoát hơi nước ở lá cây [53, 54] Hơn nữa, cytokinin giúp tích tụ chất diệp lục và thúc đẩy quá trình chuyển đổi nguyên bào thành lục lạp [1], đóng vai trò quan trọng trong duy trì diện tích lá xanh hoạt động quang hợp Cytokinin nội sinh được gia tăng thông qua việc cấy vi khuẩn sản xuất cytokinin vào cây để taọ ra cytokinin với các nồng độ nằm trong giới hạn sinh lý của cây [55] Xử lý cây trồng bằng vi khuẩn sản xuất cytokinin dẫn đến tăng hàm lượng cytokinin trong rau diếp và lúa mì giúp cây phát triển nhanh hơn ở cả điều kiện khô hạn cũng như được tưới đầy đủ [56] Các phản ứng của khí khổng đối với cytokinin ngoại sinh là đặc trưng cho loài và phụ thuộc vào nồng độ cytokinin [57] Các ứng dụng, nồng độ và tác dụng của các cytokinin ngoại sinh đối với các loại cây trồng được trình bày ở Bảng 1.6

Bảng 1 6 Một số nghiên cứu về tác dụng của cytokinin đối với các loại cây trồng

Ứng

dụng

Nồng độ (µM)

Loài cây trồng Hiệu quả Tài liệu

[58]

trình già hóa của lá cây

[59]

domestica Borkh.)

Thay đổi hàm lƣợng diệp lục

[60]

acuminata)

Tăng hàm lƣợng diệp lục

[61]

100 Súp lơ (Brassica

oleracea L.)

Làm chậm quá trình già hóa

[64]

1-100 Cây mía (Acer

saccharum)

Tăng độ dẫn của khí khổng

[67]

10 Cà tím (Solanum

melongena)

Tăng hàm lƣợng diệp lục và độ dẫn khí khổng

[68]

10 Poa pratensis L Tăng độ dẫn khí

khổng và tỷ lệ quang hợp

1.5 Các nghiên cứu về dư lượng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

Hiện nay, các hóa chất nông nghiệp, đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng thực vật đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rau xanh và cây ăn quả ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới Tuy nhiên, bên cạnh hiệu quả và công dụng của các hợp chất này mang lại, thì việc sử dụng các hợp chất này cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Dưới đây là một số nghiên cứu về dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các sản phẩm trái cây và rau xanh ở một số nước trên thế giới

Dư lượng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật: GA3; α-NAA; 2,4-D

và Ethephon (Eth) trong 154 mẫu trái cây (gồm: đào, nho, lê, mận, mơ, ổi, táo, vả, chà là và xoài) và 112 mẫu rau xanh (gồm: cà rốt, bắp cải, rau diếp, cà chua, dưa chuột, xà lách rocket, rau molekhia và cần tây) được thu thập tại một số siêu thị chính ở các quận/huyện: phía Đông, phía Tây, miền Trung, Giza, Eldoki, Embaba, Bolack EI Dakror, EI Omrania, Mariotia và Kerdasa thuộc Giza Government, Hy Lạp đã được nghiên cứu [71] Kết quả phân tích cho thấy, có 101 mẫu trái cây (65,6%) phát hiện dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật Mức độ dư lượng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật được so sánh với Giới hạn dư lượng tối đa (MRLs) theo Tiêu chuẩn của Châu Âu [72] Số lượng mẫu trái cây chứa dư lượng GA3, α-NAA; 2,4-D và Eth cao hơn MRLs lần lượt chiếm 71%, 63%, 69% và 53% Trong các mẫu rau xanh, phát hiện có 68 mẫu tương đương 60,7% có dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật: GA3; α-NAA; 2,4-D và Eth Trong đó, số mẫu rau chứa dư lượng các chất kích thích sinh trưởng cao hơn so với MRLs được xếp theo thứ tự: 2,4-D (74%) > NAA (66%) > ethephon (45%) > gibberellin (44%) [71]

Trong một nghiên cứu khác, dư lượng của 6 hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật gồm 2,4-D, gibberellins, 4-CPA, thiadiazuron, forchlorfenuron và paclobutrazol và 8 hợp chất thuốc trừ sâu: carbendazim, pyrimethanil, metalaxyl, triadimefon thiophanate, prochloraz, dimethomorph and difenoconazole diệt trừ nấm trong 96 mẫu trái cây, trong đó có 24 mẫu táo, 16 mẫu nho, 15 mẫu dưa hấu,

11 mẫu chuối, 10 mẫu đào, 10 mẫu vải và 10 mẫu quả việt quất thu thập tại một số siêu thị của thành phố Hàng Châu, Trung Quốc Kết quả nghiên cứu cho thấy, có

29% số mẫu phát hiện các thuốc trừ sâu và chất kích thích sinh trưởng thực vật, trong đó, forchlorfenuron là một trong các hợp chất phổ biến được tìm thấy; và chỉ

có 1% số mẫu có dư lượng cao hơn so với MRLs theo quy định của Trung Quốc [73] Theo Lu và cộng sự [74] đã phát hiện dư lượng của GA3 (0,05 mg/kg) trong cây mía đường thí nghiệm ở huyện Hưng Nghĩa, tỉnh Quý Châu, Trung Quốc Tuy nhiên, giá trị này thấp hơn giới hạn dư lượng tối đa theo tiêu chuẩn của Mỹ quy định (0,15 mg/kg) [75]

Ở Việt Nam, hiện chưa có nào công trình công bố về dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các sản phẩm rau xanh và trái cây Tuy nhiên, trên thị trường, các thuốc kích thích sinh trưởng thực vật được buôn bán và sử dụng với nhiều tên thương mại khác nhau như: siêu ra rễ, siêu trái, thuốc kích mầm, thần dược siêu tăng trưởng Bên cạnh đó, một số loại phân bón qua lá cho các loại cây trồng cũng chứa một hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật nhất định Bản chất của các thuốc kích thích sinh trưởng thực vật chứa các chất như: auxin, gibberellin hoặc cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng phát triển, gia tăng sinh khối cho cây trồng

Việc sử dụng quá liều lượng quy định hoặc không đảm bảo thời gian cách ly khi sử dụng các thuốc kích thích sinh trưởng thực vật cho các loại cây trồng, đặc biệt là rau xanh, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng như: ngộ độc thức ăn, tiêu chảy, ung thư, hoặc tử vong

1.6 Các phương pháp phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật

Trong những năm gần đây, có rất nhiều công trình công bố về phương pháp phân tích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong các mẫu sinh học Tuy nhiên, rất ít bài báo lý giải việc lựa chọn phương pháp này thay vì các phương pháp kia Tùy theo phương pháp phân tích được sử dụng mà lựa chọn các kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phù hợp

1.6.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong phương pháp phân tích trong những năm gần đây, nhưng việc chuẩn bị mẫu vẫn được xem là bước chính trong phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật và chiếm tới 80% tổng thời gian phân tích [76] Tùy

thuộc vào đối tượng mẫu và phương pháp được sử dụng, quy trình chuẩn bị mẫu hoàn chỉnh có thể bao gồm các quá trình như: thu thập mẫu, đồng nhất mẫu, chiết chất phân tích từ nền mẫu và tinh chế dịch chiết để loại bỏ các chất cản trở đồng chiết xuất [77]

1.6.1.1 Thu thập mẫu

Thu thập mẫu là bước đầu tiên trong quá trình chuẩn bị mẫu trước khi phân tích, đòi hỏi phải thao tác nhanh chóng và đông cứng mẫu trong nitơ lỏng để tránh thay đổi nồng độ của chất phân tích trong mẫu [78] Tiếp đến, thực hiện nghiền các mẫu đông lạnh trong môi trường nitơ lỏng để ngăn ngừa sự rã đông của mẫu và sự phân hủy hóa học của các chất phân tích [79] Có thể đông khô mẫu trước khi nghiền, giúp loại bỏ các hạn chế về thời gian liên quan đến khả năng rã đông và giảm thiểu sự phân hủy hóa học của chất phân tích [80]

1.6.1.2 Chiết tách

Các mẫu thực vật có dạng rắn, do đó bước đầu tiên của quy trình phân tích chính là thực hiện phương pháp chiết tách rắn lỏng để chuyển hóa chất phân tích từ dạng rắn sang dạng lỏng, sử dụng cho việc tinh chế và làm giàu nồng độ ở các bước tiếp theo Hiệu suất chiết phụ thuộc vào việc lựa chọn dung môi chiết, và hỗn hợp các dung môi thường cho hiệu suất chiết cao hơn so với dung môi đơn lẻ [80] Một

số dung môi khác nhau đã được sử dụng trong chiết xuất các chất kích thích sinh

acetonitrile : nước [84], methanol : đệm KH2PO4 [85], iso-propanol : đệm imidazole [86]

1.6.1.3 Làm sạch và tinh chế mẫu

Việc làm sạch và tinh chế mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ các chất cản trở và tăng độ nhạy của phương pháp phân tích Tuy nhiên, tùy thuộc vào đối tượng mẫu và phương pháp phân tích để lựa chọn phương pháp làm sạch và tinh chế phù hợp Một số phương pháp làm sạch và tinh chế mẫu sử dụng trong phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật như: chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi chiết lỏng-lỏng phân tán, vi chiết pha rắn [80]

Các kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn được xem là các phương pháp tinh chế mẫu cổ điển, đơn giản và tự động hóa, được sử dụng phổ biến trong phân tích các chất PGR Bên cạnh đó, sắc ký trao đổi ion (IEC) cũng được kết hợp với chiết pha rắn và/hoặc chiết lỏng-lỏng trong quá trình làm sạch và tính chế mẫu nhằm giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu và gia tăng khả năng phát hiện chất phân tích trên thiết bị LC-ESI-MS [87] Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi lượng mẫu phân tích tương đối lớn, thời gian hoạt động dài, và tạo ra nhiều chất thải dung môi Để khắc phục những hạn chế này, các kỹ thuật vi chiết được phát triển nhằm giảm thiểu việc sử dụng lượng mẫu ban đầu và dung môi chiết Nhưng, trên thị trường số lượng các lớp phủ sợi trong kỹ thuật vi chiết tương đối hạn chế và yêu cầu đối với chất phân tích dễ bay hơi hoặc bán bay hơi trong phân tích vi chiết pha rắn-sắc ký khí [88] Kỹ thuật vi chiết lỏng-lỏng phân tán đã từng được sử dụng trong chiết xuất các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật trong tảo xanh

Chlorella vulgaris với thời gian chiết xuất duới 1 phút [82] Tuy nhiên, phương

pháp này không thể áp dụng được đối với một số loài thực vật trên cạn do độ nhiễu của nền mẫu quá lớn [80] Điều này làm thu hẹp phạm vi ứng dụng của kỹ thuật vi chiết trong phân tích các hợp chất PGR trong các mẫu thực vật

Một số tác giả đã sử dụng cột miễn dịch để tinh chế các chất chiết xuất từ thực vật dựa trên sự tương tác kháng nguyên-kháng nguyên có khả năng chọn lọc,

do đó khắc phục đáng kể các vấn đề phổ biến của SPE như đồng chiết xuất và sự gây nhiễu của chất nền [89] Các cột miễn dịch được đóng gói bằng chất hấp thụ có chứa kháng thể cố định chống lại chất phân tích cụ thể, hay còn gọi là chất hấp thụ miễn dịch, cho phép cô đặc mẫu [90] Kỹ thuật QuEChERS cũng được ứng dụng trong quá trình xử lý mẫu phục vụ cho việc phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật với độ thu hồi cao [91] Tuy nhiên, tùy theo phương pháp phân tích, đối tượng mẫu và điều kiện của cơ sở nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp tinh chế mẫu cho phù hợp để đạt được những kết quả mong muốn

1.6.2 Phương pháp phân tích

Phương pháp phân tích phát hiện và định lượng các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc các nhóm auxin, gibberellin và cytokinin đã được báo cáo trong một số công trình nghiên cứu trước đây

1.6.2.1 Phương pháp phân tích các hợp chất auxin

GC/MS là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tích IAA Hợp chất này thường được methyl hóa hoặc trimethylsilyl hóa để tăng tính bay hơi của

nó Việc tạo dẫn xuất như vậy làm cải thiện đáng kể tín hiệu sắc ký và độ nhạy của phép phân tích Độ nhạy của các máy khối phổ đơn thông thường thường không đủ cao để phân tích hợp chất IAA với hàm lượng nhỏ miligram trong các mô thực vật Cần phải tinh chế dịch chiết một cách tốt hơn, tối ưu hóa việc thu hồi chất phân tích

và điều chỉnh điều kiện phân tích máy khối phổ để đảm bảo độ nhạy chấp nhận được [92] Tuy nhiên, có thể giảm thiểu việc tinh chế mẫu bằng cách sử dụng khối phổ song song hoặc khối phổ có độ phân giải cao, là các kỹ thuật cung cấp độ chọn lọc cao đối với các chất phân tích

Một phương pháp khác được phát triển cho phép định lượng hợp chất IAA ở nồng độ milligram trong các mẫu thực vật với việc tinh chế tương đối ít bằng cách

sử dụng thiết bị từ tính hội tụ kép với hình học đảo ngược cho phép giám sát các phản ứng được lựa chọn (GC-MS-SRM) [93] Kỹ thuật quét này liên quan đến việc phát hiện các ion con có nguồn gốc từ các ion mẹ di căn đặc trưng, cho độ nhạy và

độ chọn lọc cực cao Phương pháp này đã được cải tiến hơn nữa kể từ khi nghiên cứu được công bố và hiện tại cho phép phân tích định lượng hàm lượng chất trong mẫu ở mức 0,05-0,1 mg Tính hữu ích của phương pháp này đã được chứng minh trong việc phân tích sự phân bố IAA theo các mô đặc trưng ở các cây mầm

Arabidopsis [94] và để xác định hàm lượng IAA và sự luân chuyển IAA trong từng

milimét của rễ cây mầm Arabidopsis [95, 96] Tuy nhiên, trên thực tế, công nghệ

hiện đã đạt đến một giai đoạn mà ở đó sự nhiễm bẩn và chuẩn bị mẫu là ngang nhau hoặc đôi khi còn hạn chế hơn độ nhạy của máy phân tích khối phổ!

Phép phân tích khối phổ song song có thể được thực hiện với các loại khối phổ khác nhau như: thiết bị bẫy ion MS-MS hoặc ba tứ cực Ví dụ, phương pháp phân tích IAA và các hoocmon khác đã được mô tả bằng cách sử dụng thiết bị bẫy ion MS-MS [97], với khối lượng mẫu yêu cầu cho việc định lượng các chất phân tích dao động trong khoảng 20-200 mg Các phương pháp sử dụng thiết bị sắc ký lỏng ghép nối song song với khối phổ theo chế độ phun điện tử để phân tích IAA và

các chất chuyển hóa của IAA cũng đã được phát triển [98, 99] Các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao, do đó có tiềm năng trong việc định lượng

1.6.2.2 Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin

Gibberellin chủ yếu được phân tích dưới dạng dẫn xuất metyl este

cao, nên điều quan trọng là phải tối ưu hóa hệ thống GC để tách các đồng phân GA,

ví dụ: GA1 và GA29, và các GA có các phân mảnh khối phổ chung Điều này đặc biệt quan trọng khi các GA khác nhau không được tách biệt trước khi phân tích GC/MS, vì các GA đồng rửa giải có thể gây ra sự không chính xác Mặc dù có một vài ví dụ về GA được định lượng trong một lượng mẫu nhỏ mà không cần tinh chế sâu bằng cách sử dụng phương pháp phát hiện SRM có độ chọn lọc cao [100, 101], điều quan trọng cần lưu ý là trong nhiều nguyên liệu thực vật, ví dụ: Lá cây

Arabidopsis có chứa một số hợp chất liên quan đến cấu trúc có thể gây cản trở đến

việc phân tích GA của GC/MS Do đó, việc tinh chế sâu hơn và phân tích bằng HPLC đóng vai trò cần thiết trước khi phân tích các chất nghiên cứu trên thiết bị GC/MS Với HPLC, có thể tách một số lượng lớn GA, nhưng bằng cách kết hợp các phần nhỏ để giảm số lượng các phần GA cần phân tích SPE và HPLC là các phương pháp được lựa chọn để tinh chế mẫu còn GC/MS được sử dụng để phân tích cuối cùng

LC/MS chủ yếu được sử dụng để phân tích các liên hợp GA [102] Mặc dù

có những trường hợp GA đã được phân tích bằng LC/ESI-MS-MS trên một thiết bị

ba tứ cực [103], trong khi việc phân tích vết GA trong các mô cụ thể là không thể hoặc chưa thực hiện được bằng LC/MS Thay vào đó, GC/SRM-MS đã được sử dụng trong một công trình nghiên cứu công bố phân tích hàm lượng GA trong một lượng nhỏ mô thực vật Theo nghiên cứu này, nồng độ của GA1, GA4 và GA5 được theo dõi trong các chóp Lolium trong quá trình cảm ứng ra hoa dài ngày [100] Phương pháp phân tích này yêu cầu giới hạn phát hiện thấp hơn 0,5 pg và độ thu hồi cao trong quá trình chiết xuất Do đó, việc phân tích được thực hiện mà không cần tinh chế dịch chiết bằng HPLC, và để xác nhận danh tính của các GA được phân tích, một số chiết xuất đã được bổ sung thêm các GA không nhãn Phương pháp

luận này rất hữu ích để xác nhận các phương pháp và có thể rất hữu ích để phân biệt

các hợp chất quan tâm với các chất gây nhiễu

1.6.2.3 Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin

Việc phân tích các cytokinin có liên quan đến một số vấn đề cụ thể liên quan đến bản chất hóa học của các hợp chất Ví dụ, để xác định chính xác hàm lượng nucleotide cytokinin có trong mẫu, quá trình chiết cần phải được thực hiện cẩn thận

vì phosphatase có thể được kích hoạt trong quá trình chiết xuất Một phương pháp phổ biến là chiết mẫu trong đệm Bielesky (60% MeOH, 25% CHCl3, 10% HCOOH

và 5% H2O) ở -20°C [104] Các chất chiết xuất có thể được tinh chế thêm bằng cách

sử dụng các cột chiết pha rắn SPE trao đổi ion cation mạnh, ví dụ SPESCX, và sắc

ký anion SPEDEA, SPE-SAX Sau đó có thể tách nucleotide khỏi base và riboside Một báo cáo liên quan đến cột SPE với cả vật liệu C18 và SCX (MCX) đã được sử dụng để tách các cytokinin khác nhau [105] Tinh chế cột ái lực miễn dịch cũng đã được sử dụng rộng rãi trong phân tích cytokinin [106] Mặc dù sắc ký ái lực miễn dịch chậm, nhưng ưu điểm là các chất chiết xuất sạch, do đó đơn giản hóa việc phát hiện cuối cùng bằng phương pháp khối phổ

Có một số phương pháp tạo dẫn xuất cytokinin để phân tích trên thiết bị GC/MS [107], nhưng gần đây LC/MS là phương pháp được ưa thích để phân tích cytokinin Một số công trình nghiên cứu đã mô tả phân tích cytokinin bằng frit-FAB LC/MS, là một kỹ thuật có thể cho độ nhạy cao, tuy nhiên, nó khá phức tạp [108] Hiện nay, LC-ESI-MS là công cụ phân tích được lựa chọn trong nghiên cứu các cytokinin [109] Mặc dù, cấu trúc của các hợp chất cytokinin phù hợp với việc phân tích bằng chế độ ESI, nhưng hiệu quả của việc phân tích có thể được cải thiện hơn nữa bằng cách tạo dẫn xuất, điều này không chỉ làm tăng sự ion hóa ESI tuyệt đối

mà còn cải thiện các đặc tính sắc ký của cytokinin Với việc tạo dẫn xuất, có thể tách tất cả các hợp chất cytokinin chính, bao gồm các nucleotide, và đạt được giới hạn phát hiện thấp

* Nhận xét phần nghiên cứu tổng quan:

Từ các thông tin và dữ liệu được trình bày phần tổng quan, nghiên cứu sinh nhận thấy:

- Các chất kích thích sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của cây, rút ngắn thời gian sản xuất, tăng chất lượng và sản lượng cây trồng, nâng cao hiệu quả sản xuất, tăng thu nhập cho người nông dân, góp phần trong phát triển kinh tế xã hội của đất nước

- Nghiên cứu về sự tồn dư của các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh và trái cây trên thế giới còn hạn chế, và chưa có công trình nào công bố ở Việt Nam

- Việc nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên các đối tượng rau xanh và trái cây đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và thực từ nhiều năm nay, nhưng ở Việt Nam đây vẫn là một trong những vấn đề mới, chưa được công bố

- Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ được xem là phương pháp tốt nhất trong phân tích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, bởi phương pháp này khắc phục các nhược điểm của các phương pháp còn lại, có khả năng định tính, phân tách tốt, với độ chính xác cao

- Trong nghiên cứu này, nghiên cứu sinh lựa chọn kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò khối phổ bẫy ion để xây dựng và phát triển phương pháp phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh Phương pháp này được xác nhận và đánh giá trước khi áp dụng để đánh giá dư lượng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập ở một số quận huyện của Hà Nội, và đánh giá mức độ tích lũy của chất kích thích sinh trưởng thực vật trong một số loại rau xanh Kết quả của nghiên cứu này chính là cơ sở cho việc nghiên cứu xác định dư lượng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các sản phẩm rau xanh cũng như các loại trái cây và các sản phẩm nông nghiệp khác

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

• Thiết bị sắc ký lỏng Ultimate 3000 HPLC system, cột sắc ký: C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) (gọi tắt là cột Hypersil), cột Purospher ® RP-18 endcapped (5 µm, 250 x 4,6 mm) (gọi tắt là cột Purospher) và thiết bị phân tích khối phổ LCQ Fleet MS (Thermo Fisher Scientific, Germany)

• Thiết bị sản xuất nước siêu sạch (Milli-Q Integral 3 Water Purification System (Merck Millipore, France)

• Các thiết bị và dụng cụ phụ trợ khác: máy đồng nhất mẫu; máy ly tâm; máy votex; lò vi sóng; máy siêu âm; bộ cô mẫu bằng khí nitơ; cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g; cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g; kim tiêm mẫu Hamilton có dung tích 500 µL; tủ đông, tủ lạnh bảo quản mẫu; micropipete các loại điều chỉnh được thể tích: 10-1000 µL; pipet Pasteur; ống ly tâm có nắp kín Teflon 15 mL, 50 mL; lọ đựng mẫu có thể tích 1,8 mL, có màu nâu dùng cho tiêm mẫu vào hệ thống LC; bình định mức, cốc, ống đong, kéo, thìa, kẹp, nhíp…

2.1.2 Hóa chất thí nghiệm

2.1.2.1 Hóa chất

Các chất chuẩn có độ tinh khiết ≥ 98% gồm: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR được mua từ công ty OlChemim Ltd., Cộng hòa Czech Methanol, MeOH và Acetonitrile, ACN dùng cho HPLC có độ tinh khiết 99,80%, được mua của Merck, Đức Foocmic acid, FA và hydrochloric acid, HCl 65% của Merck, Đức Dung môi dichloromethane, 1-propanol và 2-propanol mua của Sigma-Aldrich (Singapore) Thuốc kích thích sinh trưởng thực vật Gibber4TB sản xuất bởi Công ty TNHH Á Châu hóa sinh Nitơ lỏng mua của

Công ty TNHH xuất nhập khẩu TM và DV Đại Dương

2.1.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

chất chuẩn chất kích thích sinh trưởng thực vật, sau đó hòa tan trong bình định mức

10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 0,1% FA thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn Dung dịch MeOH chứa 0,1% FA được chuẩn bị bằng cách pha 1 mL axít foocmic trong 1 L MeOH Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ

C, có thể lưu giữ và sử dụng trong thời gian 1 năm

trong bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 0,1% FA thêm đầy đến

giữ và sử dụng trong 6 tháng

bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 0,1% FA thêm đầy đến vạch

và sử dụng trong 6 tháng

thực vật cho vào cùng một bình định mức có dung tích 20 mL, sau định bổ sung dung môi MeOH có chứa 0,1% FA đầy đến vạch tiêu chuẩn Dung dịch được bảo

- Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp của các chất kích thích sinh trưởng thực vật

dung môi MeOH có chứa 0,1% FA Các dung dịch này chỉ pha khi cần sử dụng

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc ba nhóm: auxin (IAA, IBA, ICA và IPA ), gibberellin (GA3, GA4 và GA7) và cytokinin (BA, iP, iPR, K, DHZR, tZ, tZR)