Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen btk gây bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể không có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính x

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên tác giả luận văn: Ngô Mạnh Tiến Đề tài luận văn: “Áp dụng kỹ thuật si

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGÔ MẠNH TIẾN

ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN

ĐỘT BIẾN GEN BTK GÂY BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH

BẨM SINH THỂ KHÔNG CÓ GAMMAGLOBULIN MÁU

LIÊN KẾT NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH X

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGÔ MẠNH TIẾN

ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN

ĐỘT BIẾN GEN BTK GÂY BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH

BẨM SINH THỂ KHÔNG CÓ GAMMAGLOBULIN MÁU

LIÊN KẾT NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH X

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS KHUẤT HỮU THANH

HÀ NỘI - 2018

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên tác giả luận văn: Ngô Mạnh Tiến

Đề tài luận văn: “Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen

btk gây bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể không có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X”

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số SV: CB160059

Tác giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 10/10/2018 với các nội dung sau:

- Trang 1, phần mở đầu, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành

“Bruton tyrosine kinase”

- Trang 4, mục 1.2.2, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton tyrosine kinase”

- Trang 8, mục 1.2.3.3, thay thế “Tế bào mầm tạo máu” thành “tế bào gốc tạo máu”, thay thế “Tế bào đầu dòng lympho” thành “Tế bào tiền thân lympho”

- Trang 8, muc 1.2.3.3, thay thế “Tế bào proB” thành “Tế bào hướng dòng B”, thay thế “tế bào PreB” thành “Tế bào tiền B”

- Trang 10, mục 1.3.1, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton tyrosine kinase”

- Trang 11, mục 1.3.2, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton tyrosine kinase”

- Trang 14, mục 1.4.2.1, thay thế “suy giảm miễn dịch phối hợp trầm trọng” thành “bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nguy kịch”

- Trang 35, mục 3.3.1, bổ sung “các đột biến được thể hiện ở phụ lục 3”

- Trang 37, mục 3.3.1, thay thế “sự sau khác trong quá trình dịch mã tạo mRNA” thành “làm thay đổi các vị trí báo hiệu cho việc cắt chính xác các đoạn introng”

- Trang 40, muc 3.3.1, bổ sung “Các đột biến vùng ghép nối exon/intron cần phải khẳng định thêm bằng thực nghiệm thông qua phân tích mRNA.”

- Trang 47, mục 3.3.3, bổ sung “Trong số 31 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA, 04 bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng ”

Ngày 08 tháng 11 năm 2018 Giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Ngô Mạnh Tiến, học viên lớp Cao học khóa 16B-CNSH, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy PGS TS Khuất Hữu Thanh

Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác được công

bố tại Việt Nam

Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác và trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2018

Tác giả

Ngô Mạnh Tiến

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được cảm ơn chân thành đến người thầy khoa học, PGS.TS Khuất Hữu Thanh - Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn BS Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền và Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung Ương đã tạo đạo điều kiện cho em hoàn thành nghiên cứu này

Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá trình học tập và rèn luyện

Trong thời gian học tập và nghiên cứu em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình đầy động viên khích lệ của tập thể cán bộ nhân viên khoa Di truyền và Sinh học phân tử, em xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó

Cuối cùng, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con đường học tập và nghiên cứu

Ngô Mạnh Tiến

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BTK Burton’s tyrosine kinase

kDa Kilo Dalton

MLPA Multiplex Ligation-dependent

Probe Amplification

Kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa vào phản ứng nối

RNA Ribonucleic acid

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

sIg Surface Immunoglobulin Kháng thể bề mặt

SNPs Single nucleotide

polymorphisms

Đa hình nucleotid đơn

XLA X-linked agammaglobulinemia Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh

thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 24

Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi phản ứng PCR khuếch đại gen BTK 25

Bảng 2.3 Trình tự mồi phản ứng PCR mồi đơn 27

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR mồi đơn 27

Bảng 3.1 Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen 35

Bảng 3.3 Danh sách đột biến mới trên gen BTK 36

Bảng 3.4 Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA 42

Bảng 3.5 Kiểu gen của 31 bệnh nhân XLA 44

Bảng 3.6 Tỷ lệ các đột biến của gen BTK 46

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Nồng độ kháng thể ở trẻ 5

Hình 1.2: Sự phát triển và biệt hóa của lympho B trong bệnh XLA 9

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc gen BTK 10

Hình 1.4 Cấu trúc 3 chiều protein BTK 11

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xác định đột biến gen BTK gây bệnh XLA 22

Hình 2.2 Sơ đồ nhân đoạn gen BTK 24

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen BTK người bình thường 33

Hình 3.2 Kết quả phân tích MLPA trên người bình thường 34

Hình 3.3 Ảnh đột biến c.1735G>C (p.D579H) trên gen BTK 36

Hình 3.4 Ảnh đột biến c.1908+2_11delinsC trên gen BTK 37

Hình 3.5 Ảnh đột biến c.521-1G>A (p.IVS6-1G>A) trên gen BTK 38

Hình 3.6 Ảnh đột biến c.1578_1581del (p.C527Wfs*2) trên gen BTK 38

Hình 3.7 Ảnh điện di bệnh nhân XLA-26 và XLA-27 gen BTK 41

Hình 3.8 Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân XLA-26 và XLA-27 42

Hình 3.9 Phân bố các dạng đột biến gen BTK 45

Hình 3.10 Tỷ lệ phát hiện đột biến các vùng gen BTK 47

Hình 3.11 Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen BTK gây bệnh XLA ở các bệnh nhân nghiên cứu 48

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh 3

1.2 Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (XLA) 4

Định nghĩa bệnh XLA 4

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh XLA 4

1.2.2 Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh XLA 5

1.2.3 Dịch tễ học 9

1.2.4 1.3 Cơ sở di truyền bệnh XLA 10

Vị trí và cấu trúc gen BTK 10

1.3.1 Cấu trúc và chức năng protein BTK 10

1.3.2 Đặc điểm di truyền và đột biến gen BTK 11

1.3.3 1.4 Chẩn đoán bệnh XLA 12

Tiêu chuẩn lâm sàng 13

1.4.1 Xét nghiệm cận lâm sàng 13

1.4.2 Xét nghiệm sinh học phân tử phân tích gen BTK 15

1.4.3 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh XLA 16

Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.5.1 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 18

1.5.2 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân và tiêu chuẩn loại trừ 19

2.1.1 Thu thập mẫu 20

2.1.2 2.2 Hoá chất và thiết bị 20

Hóa chất 20

2.2.1 Trang thiết bị 21

2.2.2 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

Kỹ thuật tách DNA tổng số 22

2.3.1 Phương pháp điện di DNA 23

2.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger bằng máy ABI 3130 24

2.3.3 Kỹ thuật Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) 29

2.3.4 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Lựa chọn kỹ thuật phát hiện đột biến gen BTK 33

Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger 33

3.1.1 Kỹ thuật MLPA 34

3.1.2 Lựa chọn quy trình phát hiện đột biến gen BTK 34

3.1.3 3.2 Kết quả xác định đột biến gen BTK trên 31 bệnh nhân XLA 35

Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen 35

3.3.1 Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA 41

3.3.2 Đặc điểm đột biến gen BTK của 31 bệnh nhân XLA 43

3.3.3 KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 58

MỞ ĐẦU

Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (X-linked agammaglobulinemia – bệnh XLA): là bệnh di truyền trên

nhiễm sắc thể giới tính X do đột biến trên gen BTK khiến cho cơ thể không sản xuất

được protein Bruton tyrosine kinase dẫn đến các tế bào lympho B không thể biệt hóa hoặc trưởng thành Do vậy, giảm khả năng sản xuất kháng thể, khiến cơ thể thường xuyên bị các tác nhân gây bệnh tấn công

Bệnh nhân mắc XLA khi mới sinh thường khỏe mạnh như những trẻ bình thường khác bởi trước 6 tháng đầu, trẻ được bảo vệ bởi kháng thể từ mẹ truyền sang Sau đó các nhiễm khuẩn lần lượt xuất hiện và tăng dần tần suất cũng như mức

độ nặng

Việt Nam là nước nhiệt đới, trẻ nhỏ thường dễ mắc các bệnh liên quan đến đường hô hấp, tiêu hóa, tái phát nhiều lần… làm cho bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh (SGMDBS) dễ bị trùng lặp trong bối cảnh đa dạng nhiễm trùng ở trẻ em, dễ bị

bỏ sót ở tuyến cơ sở Sau khi các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA được khám và sàng lọc dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và các xét nghiệm ban đầu, sẽ được chẩn

đoán xác định bằng phân tích gen BTK bằng phương pháp sinh học phân tử để phát

hiện các đột biến gây bệnh Trước đây, các xét nghiệm bằng phương pháp sinh học phân tử được tiến hành tại các trung tâm của nước ngoài, gây nhiều khó khăn về vận chuyển mẫu, chi phí cao, thời gian chờ đợi kéo dài, đặc biệt rất khó áp dụng cho các trường hợp có nhu cầu chẩn đoán trước sinh cho các lần sinh con tiếp theo của các gia đình có tiền sử sinh con mắc bệnh

Việc xác định chính xác đột biến gây bệnh XLA đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh và thể bệnh để định hướng điều trị hiệu quả Đây là tiền đề cho công tác phòng bệnh bằng tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh giúp làm giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh XLA

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Áp dụng

kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen BTK gây bệnh Suy giảm miễn

dịch bẩm sinh thể không có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X”

Mục tiêu của đề tài:

- Sử dụng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen phát hiện các đột biến trên gen

BTK gây bệnh thiếu gammaglobulin trong máu liên kết nhiễm sắc thể X

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh (SGMDBS - Primary Immunodeficiency): là một nhóm các bệnh lý bất thường liên quan tới tình trạng suy giảm hoặc thiếu hụt một hoặc nhiều yếu tố trong hệ thống miễn dịch Hầu hết mắc các bệnh này sẽ kéo dài suốt cuộc đời, nên việc chẩn đoán chính xác bệnh trước khi áp dụng các biện pháp điều trị là rất quan trọng

SGMDBS được phân loại dựa theo loại tế bào, vị trí tổn thương của hệ miễn dịch Những trẻ mắc bệnh suy giảm miễn dịch thường nhạy cảm với nhiều tác nhân nhiễm trùng khác nhau Biểu hiện lâm sàng đặc trưng của nhóm bệnh này là người mắc bệnh nhiễm trùng nặng, tái diễn suốt đời với nhiều biến chứng nguy hiểm như

tử vong, tổn thương các cơ quan, rối loạn phát triển thể chất và ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống

Tỉ lệ mắc các bệnh SGMDBS trong quần thể là 1/1200 (theo nghiên cứu của

tổ chức SGMDBS thế giới Jeffrey Modell Center for Primary Immunodeficiencies) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh chia 5 nhóm lớn: SGMD thể dịch, SGMD tế bào, SGMD kết hợp nguy kịch, SGMD dòng bổ thể, SGMD dòng thực bào

Nghiên cứu tổng kết trên toàn bộ 6 châu lục năm 2011 cho thấy, trong số

44762 bệnh nhân mắc SGMDBS, có tới 3163 bệnh nhân mắc bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nguy kịch (7,1%) và 2132 bệnh nhân mắc bệnh SGMD thể X-linked agammaglobulinemia (4,8%) [35]

Bệnh nhân SGMD bẩm sinh không được chẩn đoán sẽ bị nhiễm khuẩn nặng, tái diễn thường xuyên, đòi hỏi nhập viện và điều trị tích cực bằng các thuốc kháng sinh mạnh, kéo dài và ảnh hưởng nhiều kinh tế và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân, gia đình người bệnh và toàn xã hội Báo cáo của Hội suy giảm miễn dịch bẩm sinh Jeffrey cho biết cứ 1 bệnh nhân SGMDBS mà bị bỏ sót chẩn đoán thì chi phí hết $102.736/năm cho y tế vì cấp cứu, nhập viện nhiều lần Viện nghiên cứu sức khỏe Hoa Kỳ ước tính ít nhất có 500.000 trường hợp SGMDBS chưa được chẩn

đoán và như vậy thiệt hại về kinh tế do vấn đề bỏ sót chẩn đoán nhóm bệnh này gây

Đặc điểm lâm sàng của bệnh XLA

1.2.2.

Thông thường, trẻ sau sinh sẽ được hưởng kháng thể IgG từ mẹ sang thai qua rau thai cho nên khi sinh trẻ có lượng kháng thể IgG tương tự kháng thể IgG của mẹ, kháng thể IgG của mẹ cho sẽ giảm còn 50% trong vòng 2 - 3 tháng sau sinh Trẻ cũng tự tổng hợp kháng thể IgG, tốc độ tổng hợp kháng thể IgG của trẻ sẽ cao hơn tốc độ giảm kháng thể IgG của mẹ vào khoảng 4 - 6 tháng tuổi Kháng thể IgG trẻ sẽ tăng nhanh trong 3 năm đầu tiên đạt đến ngưỡng 60% so với người lớn, sau đó sẽ tăng chậm lại và đạt ngưỡng của người lớn vào lúc vị thành niên Do đặc

điểm bệnh XLA có đột biến gen BTK, tế bào B của trẻ bệnh XLA không có khả

năng tăng sinh, biệt hóa để tạo lượng gamma globulin bảo vệ cho trẻ, cho nên ở giai đoạn sau sinh lượng kháng thể IgG từ mẹ cho con ở các trẻ này vẫn còn làm hàng rào tự nhiên đủ để bảo vệ trẻ, chỉ sau 4 - 6 tháng tuổi khi IgG mẹ giảm thì trẻ mới

dễ bị mắc bệnh [39]

Hình 1.1 Nồng độ kháng thể ở trẻ

(Nguồn: immunobiology 5th edition (2001)

Các biểu hiện lâm sàng trở nên rõ ràng trong những tháng tiếp theo, khi kháng thể IgG từ mẹ được chuyển hóa và tác dụng bảo vệ của chúng không còn hiện diện nữa Điểm nổi bật của bệnh là tái phát do vi khuẩn đường hô hấp và / hoặc nhiễm trùng đường tiêu hóa, mặc dù một số bệnh nhân có thể không có triệu chứng trong những năm đầu đời Trong trường hợp hiếm hoi, bệnh nhân được chẩn đoán SGMD thể XLA ở tuổi vị thành niên hoặc thậm chí ở tuổi trưởng thành do thiếu các triệu chứng cho đến tuổi đó Phạm vi nhiễm trùng điển hình ở bệnh nhân SGMD thể XLA bao gồm viêm tai giữa tái phát, viêm xoang, viêm phế quản, viêm phổi và nhiễm trùng đường tiêu hóa Mặc dù tỷ lệ mắc các loại nhiễm trùng khác nhau giữa các nhóm thuần tập khác nhau cho đến nay được báo cáo, có vẻ như loại nhiễm trùng chính liên quan đến đường hô hấp trên và dưới Sau đó các nhiễm khuẩn lần lượt xuất hiện và tăng dần tần suất cũng như mức độ nặng

Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh XLA

1.2.3.

1.2.3.1 Nồng độ kháng thể trong máu ngoại vi

Trong huyết thanh, thành phần globulin miễn dịch chiếm khoảng 20% tổng lượng protein 5 lớp Globulin miễn dịch chính là Globulin miễn dịch G (IgG), Globulin miễn dịch A (IgA), Globulin miễn dịch M (IgM), Globulin miễn dịch D

(IgD), Globulin miễn dịch E (IgE) Trong đó, ba Globulin đầu có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch

Lớp IgG là lớp kháng thể chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch thứ phát IgG chiếm khoảng 70-75% tổng số globulin miễn dịch của cơ thể người Có 4 dưới lớp của IgG: IgG1, IgG2, IgG3 và IgG4 Mỗi dưới lớp của IgG có vai trò khác nhau trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể IgG là kháng thể duy nhất có thể qua được rau thai, vì thế thai nhi được hưởng IgG của mẹ truyền cho

Lớp IgA chiếm khoảng 15-20% tổng số Globulin miễn dịch có trong huyết thanh IgA bao gồm IgA trong huyết thanh và IgA tiết ra ngoài niêm mạc Có 2 dưới lớp của IgA: IgA1 và IgA2 Đó là phương tiện bảo vệ tại chỗ của cơ thể, ngăn cản sự xâm nhập của các kháng nguyên Chúng có trong nước bọt, nước mắt, và rất nhiều trong sữa mẹ Vì vậy trẻ nhận được rất nhiều IgA nếu được bú mẹ

Lớp IgM chiếm khoảng 10% tổng số Globulin miễn dịch có trong huyết thanh IgM có khả năng liên kết bổ thể mạnh nhất Đó là kháng nguyên xuất hiện đầu tiên khi có kháng nguyên xâm nhập, IgG sẽ xuất hiện muộn hơn và thay thế cho IgM Các kháng thể trên có nhiều chức năng sinh học khác nhau trong đáp ứng miễn dịch: chức năng nhận biết kháng nguyên, tác động trực tiếp lên kháng nguyên và hạn chế khả năng gây bệnh của kháng nguyên đó Riêng kháng thể IgG, IgM còn có vai trò hoạt hóa bổ thể, tạo thành phức hợp tấn công màng, chọc thủng và dung giải các kháng nguyên là tế bào, vi khuẩn Ngoài ra, các kháng thể còn có khả năng tương tác với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác như bạch cầu ái kiềm, tế bào mast, các đại thực bào và bạch cầu trung tính và các tế bào diệt tự nhiên (Nature killer) để cùng tham gia tiêu diệt kháng nguyên

Đối với bệnh nhân SGMD thể XLA, do có sự sụt giảm rõ rệt số lượng tế bào lympho B trưởng thành trong máu ngoại vi nên khả năng sản xuất kháng thể cũng bị giảm nặng Bệnh nhân XLA thường có nồng độ IgG thấp dưới 2 độ lệch chuẩn so với trẻ cùng lứa tuổi Nghiên cứu của Coley năm 2002 trên 82 bệnh nhân XLA tại

52 trung tâm của Hoa Kỳ cho thấy: đa số bệnh nhân có nồng độ IgG rất thấp hoặc không đo được khi được chẩn đoán bệnh Chỉ có 10% bệnh nhân có nồng độ trên

200 mg/dL [28] Các nghiên cứu của Eduardo Lopez trên 54 bệnh nhân XLA ở Tây Ban Nha và của Toyama trên 93 bệnh nhân ở Nhật Bản cũng cho kết quả tương tự [13]

Nồng độ IgM và IgA thường dưới 20 mg/dL Dấu hiệu giảm IgM là một dấu hiệu quan trọng do giảm IgG và IgA có thể gặp ở trẻ chậm sản xuất globulin miễn dịch sinh lý Trong khi giảm IgM thường gặp trong bệnh cảnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh

1.2.3.2 Dấu ấn màng tế bào

Trong cơ thể, có rất nhiều tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch: tế bào lympho,

tế bào đơn nhân, tế bào bạch cầu hạt trung tính, bạch cầu ái kiềm, bạch cầu ái toan, dưỡng bào…Tuy nhiên, vai trò chính được cho là của các tế bào lympho Mỗi tế bào đều có đặc trưng riêng về mặt miễn dịch do sự có mặt của các thụ thể trên bề mặt màng tế bào

Các tế bào tiền thân dạng lympho từ tổ chức tạo máu đi tới tuyến ức, phân chia, biệt hóa thành các lympho bào chịu trách nhiệm đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào: lympho T Tế bào lympho T bao gồm lympho T hỗ trợ (T helper), lympho T độc (T cytotoxic), Lympho T gây quá mẫn muộn (TDTH) Lympho T ức chế (Ts), Lympho T điều hòa ngược (TFR) Trong đó, hai dưới nhóm lympho quan trọng là: lympho T hỗ trợ (dấu ấn màng tế bào: CD4+), vai trò quan trọng trong hoạt hóa và thúc đẩy hoạt động của các lympho T khác thông qua việc tiết ra Interleukin-2 và lympho T độc (dấu ấn màng tế bào: CD8+), có nhiệm vụ tấn công trực tiếp các tế bào có kháng nguyên lạ trên bề mặt và tham gia đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Các tế bào lympho B được sinh ra ở tủy xương, trưởng thành ở các nang lympho trong hạch ngoại vi hoặc tủy trắng của lách Các dấu ấn màng tế bào thường

có ở lympho B là: CD10+, CD19+, CD20+, CD38+ Khi các lympho B được mẫn cảm sẽ biệt hóa thành tương bào sản xuất kháng thể Vì vậy, lympho B đảm nhiệm vai trò chính trong đáp ứng miễn dịch thể dịch

Các tế bào diệt tự nhiên - NK là một tiểu quần thể tế bào có khả năng diệt một

số tế bào đích: tế bào u, tế bào vật chủ bị nhiễm virus Chức năng quan trọng của tế bào NK là kiểm soát miễn dịch, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virus Dấu ấn màng tế bào: CD16+, CD56+

Xét nghiệm tìm các dấu ấn miễn dịch trên màng tế bào vào những năm 1970

đã mở ra một thời kì mới trong nghiên cứu và ứng dụng của chuyên ngành miễn dịch học Dựa vào các dấu ấn trên tế bào lympho T (CD3+, CD4+, CD8+), lympho

B (CD19+, CD20+) và các tế bào diệt tự nhiên (CD56+), các tổ chức SGMD toàn cầu đã phân loại bệnh nhân SGMD thành ba nhóm lớn: SGMD tế bào, SGMD thể dịch hay SGMD kết hợp

Với bệnh nhân XLA, tổn thương do quá trình hình thành và biệt hóa của tế bào lympho B nên khi xác định dấu ấn màng tế bào, chỉ có lympho B (CD19+) giảm ≤ 2%; các tế bào lympho T, NK đều trong giới hạn bình thường [23]

1.2.3.3 Tế bào Lympho B

Bình thường, các tế bào lympho B trải qua quá trình biệt hoá và trở thành tương bào, sản xuất kháng thể Trong tuỷ xương, tế bào gốc tạo máu (hematopoietic stem cell) phát triển thành tế bào tiền thân lympho (lymphoid precursorursor cell), sau đó tiếp tục biệt hoá thành tế bào hướng dòng B (pro-B cell), tiếp tục biệt hoá thành tế bào tiền B (pre-B cell) rồi thành tế bào B non (immature B cell) Tế bào B non tiếp tục chín thêm ở trong tủy xương hoặc sau khi đã rời tủy xương vào các mô lympho ngoại vi tiếp tục biệt hoá thành tế bào B trưởng thành (mature B cell) Sau

đó, các tế bào lympho B trưởng thành trú ngụ tại vùng vỏ ngoài của hạch ngoại vi, tủy trắng của lách, tạo ra các nang lympho

Hình 1.2: Sự phát triển và biệt hóa của lympho B trong bệnh XLA

(Nguồn: Nature Reviews Immunoglogy, 2005)

Trong quá trình biệt hoá từ tế bào tiền B tới tế bào B non có sự ảnh hưởng trực tiếp của phức hợp Pre-BCR (Pre B-cell receptor signalling – preBCR) Phức hợp pre-BCR bao gồm hai chuỗi Igμ giống hệt nhau và 2 protein chuỗi nhẹ VpreB và λ14.1, cùng với các phân tử neo đậu CD79α và CD79β Có nhiều đột biến gây ra bất thường phức hợp Pre-BCR

Trong bệnh XLA, đột biến gen Bruton Tyrosin Kinase (BTK) gây ra bất

thường trong quá trình tổng hợp protein Bruton tyrosine kinase (BTK), một protein

quan trọng giúp hình thành phức hợp Pre-BCR Do vậy, khi bị đột biến gen BTK,

các tế bào lympho B sẽ bị dừng biệt hoá ở giai đoạn tế bào Pre B trong tủy xương, dẫn đến sự vắng mặt của các tế bào lympho B trong máu ngoại vi và các mô lympho ngoại biên Kết quả là sự sản xuất tất cả các loại kháng thể: IgM, IgA, IgG, các kháng thể đặc hiệu với các căn nguyên gây bệnh đều bị suy giảm nghiêm trọng

Đột biến gen BTK là đột biến gen đầu tiên (năm 1993) gây bất thường Pre-BCR

được tìm thấy, chiếm 85% trong số tất cả các trường hợp không có gammaglobulin máu tiên phát

Tại các nước châu Á, rất ít nghiên cứu đưa ra tỷ lệ mắc bệnh XLA do chưa

có nguồn dữ liệu khu vực cũng như dữ liệu của từng quốc gia

Tuy nhiên, do đặc điểm của bệnh SGMD thể XLA gây suy giảm miễn dịch thể dịch nặng nên rất nhiều bệnh nhân bị nhiễm khuẩn nặng và tử vong trước khi được chẩn đoán xác định bệnh Vì vậy, đa số các báo cáo chỉ đưa ra số bệnh nhân mắc bệnh không thực sự đầy đủ

1.3 Cơ sở di truyền bệnh XLA

Vị trí và cấu trúc gen BTK

1.3.1.

Năm 1993, lần đầu tiên hai nhóm nghiên cứu độc lập cùng tìm ra gen gây bệnh XLA và giải thích được cơ chế bệnh sinh của bệnh, sau này được đổi tên để

tưởng nhớ bác sỹ Bruton, người đã tìm ra căn bệnh [42], [12] Đột biến ở gen BTK

gây nên giảm mất chức năng của protein Bruton tyrosine kinase khiến cho tế bào lympho B không thể biệt hóa hoặc trưởng thành và không sản xuất ra kháng thể

Gen BTK nằm ở cánh dài của nhiễm sắc thể X ở vị trí Xq21.3 - q22 Gen

BTK dài 37,5 kilobase, chứa 19 exon Kích thước của exon thay đổi từ 55 đến 560

bp, và các intron từ 164 bp đến 9 kb [12]

Cấu trúc và chức năng protein BTK

1.3.2.

Gen BTK mã hóa protein Bruton’s Tyrosine Kinase dài 659 acid amin, nặng

77 Kilodaltons, với năm khu vực chức năng: plekstrin homology (PH) domain (acid amin 1 tới 138), Tec homology (TH) domain (acid amin 139 tới 215), Src homology

3 (SH3) domain (acid amin 216 tới 280), Src homology 2 (SH2) domain (acid amin

281 tới 377) and kinase (SH1) domain (acid amin 375 tới 659) [24], [16]

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc gen BTK

(Nguồn: Akintunde Akinleye ,2013)

Hình 1.4 Cấu trúc 3 chiều protein BTK

(Nguồn: Wang và cộng sự, 2015)

Gen BTK mã hóa cho protein Bruton Tyrosine Kinase (BTK), Protein BTK

là đại diện của nhóm gia đình Tec của các protein không tham gia vai trò receptor: tyrosine kinases Nó tham gia trong tất cả các giai đoạn phát triển của tế bào lympho

B từ tế bào tiền B CD34+CD19+ tới tế bào B trưởng thành, tới tế bào plasma thì không còn tác dụng Protein BTK cũng thể hiện ở tế bào erythroid precusors, myeloid cells, tế bào mast, tế bào mono, megakaryocytes và tiểu cầu [5]

Protein BTK là một trong những Protein Tyrosine Kinase (PTKs) trong bào tương Các enzyme Protein tyrosine kinases (PTKs) xúc tác chuyển hóa phosphate của ATP Phosphoryl hóa dư lượng tyrosine điều chỉnh hoạt tính enzym và tạo ra các vị trí gắn kết các protein báo hiệu hạ lưu Hai nhóm PTK có mặt trong các tế bào: các PTK receptor xuyên màng và các PTK không phải receptor (nonreceptor) Bởi vì PTK là thành phần quan trọng của con đường tín hiệu tế bào, hoạt động xúc tác của chúng được điều chỉnh rất nghiêm ngặt Trong vài năm qua, các nghiên cứu cấu trúc có độ phân giải cao của PTK đã cung cấp một cơ sở phân tử để hiểu các cơ chế mà theo đó các thụ thể PTK và receptor nonreceptor được điều chỉnh [27]

Đặc điểm di truyền và đột biến gen BTK

novo), do đó người mẹ không phát hiện có đột biến gây bệnh trên nhiễm sắc thể X [34]

Phát hiện đột biến trên gen BTK đóng vai trò quan trọng trong tư vấn di

truyền Đặc biệt trong các gia đình có tiền sử sinh con mắc bệnh XLA, việc phát hiện sớm người mang gen bệnh là điều kiện cần và đủ cho chẩn đoán trước sinh giúp phòng bệnh và giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh

Công bố gần đây nhất của ngân hàng gen - Gene Bank: 900 đột biến (789 đã

được báo cáo) của gen BTK Phân bố dạng đột biến của các đột biến này như sau:

sai nghĩa/vô nghĩa (350 đột biến); splicing (125 đột biến); regulatory (2 đột biến); mất đoạn nhỏ (156 đột biến); thêm đoạn nhỏ (53 đột biến); small indel (22 đột biến); mất đoạn lớn (64 đột biến); thêm đoạn lớn/ lặp đoạn lớn (15 đột biến) và phức tạp (2 đột biến) Khoảng 35% đột biến điểm, dẫn đến sự thay thế axit amin Các đột biến thay thế axit amin này được phát hiện chủ yêu ở vùng kinase, đặc biệt

là ở phần đầu C của vùng kinase Một số đột biến thay thế axit amin cũng có thể được phát hiện ở các vùng PH và SH2, trong khi vùng TH, SH3 ít phát hiện thấy đột biến [26]

Những đột biến được tìm thấy trên cả exon và intron suốt chiều dài gen và là những đột biến đã được chứng minh là làm giảm số lượng hoàn toàn hoặc mất chức năng của protein Bruton Tyrosine Kinase [23] Tuy nhiên, mỗi năm, con số các đột biến được tìm thấy và công bố được tăng lên do số lượng bệnh nhân được chẩn đoán ngày càng lớn và nghiên cứu được mở rộng ở các quần thể khác nhau trên toàn thế giới

1.4 Chẩn đoán bệnh XLA

Các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA được chẩn đoán dựa vào các tiêu chuẩn lâm sàng, xét nghiệm cơ bản và chẩn đoán xác định dựa vào phân tích gen

BTK

Tiêu chuẩn lâm sàng

1.4.1.

Năm 1999, hội đồng SGMD châu Âu ESID (European Society for deficiencies) và hội đồng SGMD Mỹ PAGID (Pan-American Group for Immunodeficiency) đã thống nhất và đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán cho các nhóm bệnh SGMD bẩm sinh Các tiêu chuẩn chẩn đoán này dựa vào lâm sàng, xét nghiệm cơ bản và xét nghiệm phân tích đột biến gen Cho tới nay, đây vẫn là bản tiêu chuẩn được áp dụng rộng rãi nhất trên toàn thế giới [10], [14]

Immuno-Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh SGMD thể XLA

 Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định (definitif): bệnh nhân nam có số lượng

tế bào lympho B CD19+ ≤2% và ít nhất một tiêu chuẩn sau:

+ Tìm thấy đột biến trên gen BTK

+ Không có Btk mRNA trong mẫu phân tích mARN của bạch cầu hạt trung tính và bạch cầu mono theo phương pháp Northern blot analysis

+ Không có protein BTK trong tế bào bạch cầu mono hoặc tiểu cầu

+ Anh, em trai cùng mẹ của bệnh nhân, cậu và bác trai bên mẹ, hoặc cháu trai bên mẹ có số lượng tế bào lymphoB CD19+ ≤ 2%

 Tiêu chuẩn chẩn đoán có thể (probable): bệnh nhân nam có số lượng

tế bào lymphoB CD19+ ≤ 2% và ít nhất một tiêu chuẩn sau:

+ Xuất hiện các đợt nhiễm vi khuẩn tái diễn trong năm năm đầu đời

+ Nồng độ IgG, IgM, và IgA ≤ - 2 SD với nồng độ ở trẻ bình thường cùng lứa tuổi

+ Không có kháng thể kháng hồng cầu Anti-A và Anti-B trong máu và/hoặc đáp ứng kém với vaccine

bào lympho B nên số lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, ái kiềm, hồng cầu

và tiểu cầu không bị ảnh hưởng Tuy nhiên, công thức máu vẫn có vai trò quan trọng, giúp xác định mức độ nhiễm trùng và có thể loại trừ một số bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh khác như: bệnh giảm bạch cầu hạt trung tính, bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nguy kịch

Một số trường hợp bệnh nhân XLA đã có tiền sử giảm bạch cầu hạt trung tính, đặc biệt trong đợt nhiễm khuẩn và được chẩn đoán nhầm với bệnh giảm bạch cầu hạt bẩm sinh Vi khuẩn pseudomonas và tụ cầu là hai loại vi khuẩn thường gây giảm bạch cầu hạt trung tính nặng ở bệnh nhân XLA [11], [21]

1.4.2.2 Phân tích dấu ấn màng tế bào

Bình thường, số lượng tế bào lympho B dao động theo tuổi của bệnh nhân nhưng trung bình chiếm 5-15% số lượng tế bào lympho trong máu ngoại vi [41] Đối với bệnh nhân XLA, các tế bào lympho B không thể biệt hoá thành các tế bào lympho B trưởng thành nên số lượng tế bào lympho B ra máu ngoại vi rất ít hoặc thậm chí bằng không

Số lượng tế bào lympho B có thể xác định bằng xét nghiệm phát hiện dấu ấn màng tế bào bằng hệ thống phân tích dòng chảy tế bào - Flow Cytometry Nguyên

lý của kỹ thuật là sử dụng chùm tia laser phát hiện ra các kháng thể gắn huỳnh quang được gắn lên các dấu ấn màng tế bào máu Nhờ đó nhận biết các tế bào mang các dấu ấn bề mặt (hay còn gọi là kháng nguyên bề mặt), giúp xác định chính xác loại và số lượng từng loại tế bào Dựa vào nguyên lý này, các nhà miễn dịch học đã ứng dụng để xác định số lượng các dòng tế bào: lympho T (CD3+, CD4+, CD 8+), lympho B (CD19+, CD20+) và các tế bào diệt tự nhiên (CD56+) và rất nhiều dưới nhóm của tế bào khác như các tế bào dưới nhóm khác Việc xác định được các dấu

ấn miễn dịch trên màng tế bào vào những năm 1970 đã mở ra một thời kì mới giúp chứng minh được về bản chất và phân loại các thể của bệnh SGMD bẩm sinh

Theo tiêu chuẩn chẩn đoán của hiệp hội suy giảm miễn dịch Mỹ và Châu Âu năm 1999, bệnh nhân XLA có số lượng tế bào lympho B dưới 2 % [10] Hầu hết các bệnh nhân XLA, đặc biệt là những bệnh nhân dưới 10 tuổi, đều có rất ít tế bào

B trong máu (<1% tổng số lympho bào) Trong khi đó, số lượng lympho T và NK của bệnh nhân XLA bình thường

1.4.2.3 Định lượng kháng thể

Do có sự sụt giảm rõ rệt số lượng tế bào lympho B trưởng thành trong máu ngoại vi nên khả năng sản xuất kháng thể cũng bị giảm rõ rệt Theo tiêu chuẩn chẩn đoán của hiệp hội suy giảm miễn dịch Mỹ và Châu Âu năm 1999, nồng độ kháng thể IgA, IgG và IgM của bệnh nhân XLA thấp hơn 2 độ lệch chuẩn so với trẻ cùng

Xét nghiệm sinh học phân tử phân tích gen BTK

1.4.3.

1.4.3.1 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger

Giải trình tự DNA là phương pháp cho phép phân tích một cách chính xác trình tự nucleotid của từng gen hoặc của một vùng gen được quan tâm, được mô tả lần đầu tiên bởi Sanger và cộng sự vào năm 1992 [37] Nguyên lý của phương pháp dựa trên sự nhân lên của các sợi DNA từ sợi DNA khuôn bằng phương pháp PCR, trong đó sự tổng hợp của mỗi sợi DNA mới được dừng lại tại mọi điểm dọc theo chuỗi Chuỗi được liên tục kéo dài do sự kết hợp ngẫu nhiên của các dNTP, kèm theo sự có mặt của DNA polymersase và mồi là các chuỗi oligonucleotid dài khoảng 20 bp được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với vùng DNA đích cần quan tâm Thông thường các dNTP được đánh dấu 4 màu huỳnh quang khác nhau Đối với phương pháp này, hệ thống điện di thường sử dụng là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử dNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, từ đó máy sẽ nhận diện được các

nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích Giải trình tự gen cho phép xác định hầu hết các đột biến điểm, đột biến mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn của gen Đối

với bệnh XLA, 95% các trường hợp mắc bệnh cần phải giải trình tự gen BTK để

phát hiện đột biến điểm Các vùng được giải trình tự bao gồm: các vùng mã hóa trên

gen BTK, vùng ranh giới exon-intron, vùng cận promoter

1.4.3.2 Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification - MLPA)

Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) là phương pháp sử dụng nhiều phản ứng PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gene khác nhau với chỉ một cặp mồi duy nhất Mỗi một đầu dò (probe) bao gồm 1 cặp mồi (primer), cặp mồi này sẽ bắt cặp từ hai đầu của vùng gene quan tâm, sau đó hai cặp mồi này sẽ được nối lại với nhau thành một trình tự đích hoàn chỉnh Ưu điểm của các đầu dò phân đôi này là chỉ có các trình tự đầu dò sau khi ghép nối lại mới được khuếch đại chứ không phải mẫu DNA ban đầu Mỗi một đầu dò được thiết kế

có thêm một trình tự DNA đặc biệt có độ dài định trước gọi là trình tự thêm (stuffer sequence) Khi điện đi trên máy, trình tự thêm này đảm bảo các trình tự đã được khuếch đại có độ dài chính xác trên bản điện di Độ dài các trình tự thêm ở các đầu

dò là khác nhau, điều này sẽ tránh được các giới hạn phân giải trong phương pháp multiplex PCR Các đầu dò này cũng được gắn huỳnh quang nên cường độ của các tín hiệu có liên quan đến chất lượng của phản ứng khuếch đại

1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh XLA

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1986, nhóm nghiên cứu Y khoa Harvard đã xác định được vị trí gen liên quan tới bệnh XLA có vị trí trên cánh dài của nhiễm sắc thể giới tính X, từ đó

mở hướng chẩn đoán trước sinh cho các bà mẹ thể ẩn [25]

Năm 1993, Nghiên cứu của David Vetrie và cộng sự sử dụng phương pháp

lai ghép tại chỗ đã vẽ bản đồ gen BTK tại vị trí Xq21.3-q22, phát hiện tyrosine

kinase trong tế bào chất có liên quan đến tiến trình tăng trưởng và biệt hóa của tế bào B, sự thiếu hụt BTK đã được quan sát ở các bệnh nhân mắc bệnh XLA [12]

Năm 1993, nghiên cứu của Tsukada và cộng sự đã mô tả protein BTK như là một tyrosine kinase bào tương và gọi là BTK, biểu hiện trong tất cả các tế bào của dòng B và trong các tế bào tủy xương Ông cũng phát hiện ra rằng RNA thông tin

của gen BTK, biểu hiện của protein và hoạt động của kinase đều bị giảm hoặc không

có trong tế bào tế bào B trưởng thành và tế bào tiền B [42]

Năm 1994, nghiên cứu của Yuko Ohta và cộng sự đã công bố trình tự DNA

của 18 exon trên gen BTK mã hóa protein BTK và các vùng xung quanh của chúng Nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan giữa các đột biến gen BTK [33]

Năm 1996 đến 2006, Nghiên cứu của Vihinen và cộng sự đã xây dựng một

cơ sở dữ liệu về các đột biến gen BTK bao gồm các đột biến xảy ra trên cả 5 vùng của gen BTK thường gặp nhất là đột biến sai nghĩa Các đột biến xuất hiện rải rác

trong toàn bộ gen và thường ảnh hưởng đến các vị trí CpG tạo thành Arginine Các đột biến đều ảnh hưởng đến quá trình dịch mã Các đột biến được phát hiện trên hầu

hết các exon của gen BTK, phần lớn các đột biến là dạng đột biến lệch khung dịch

mã và đột biến vô nghĩa ở đầu 5’, đột biến sai nghĩa ở đầu 3’ của gen [43], [45], [47]

Năm 2005, Nghiên cứu của Eduardo và Wang phân tích số lượng lớn bệnh nhân XLA cho thấy mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình, đồng thời chỉ ra một số đột biến có xu hướng dẫn đến độ tuổi chẩn đoán cao hơn, nồng độ Globulin miễn dịch giảm ít hơn và số lượng tế bào lympho B giảm nhẹ hơn so với các đột biến khác thấy [13], [49]

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

1.5.2.

Tại Việt nam, bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh còn ít được nghiên cứu và chưa có một dữ liệu thống kê nào về số lượng và tỷ lệ mắc bệnh Nếu lấy tỷ lệ mắc bệnh là 1/1200 trong quần thể người Châu Á, Châu âu, Mỹ, với số dân của Việt nam là trên 90 triệu, có thể ước tính được khoảng 75.000 người Việt nam mắc bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh Mặt khác, ở nước ta có nhiều dân tộc thiểu số còn tập tục kết hôn cận huyết khá phổ biến thì tỷ lệ mắc bệnh SGMDBS trong dân số có thể cao hơn

Năm 2011, tác giả Lâm Thị Mỹ tiến hành nghiên cứu đầu tiên về “Đặc điểm bệnh nhân thiếu gammaglobulin máu liên quan nhiễm sắc thể giới tính tại bệnh viện Nhi Đồng 1 Tp Hồ Chí Minh” Nghiên cứu được thực hiện trên 4 bệnh nhân đã xác định được mối tương quan giữa đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, đưa ra các dấu hiệu cảnh báo ban đầu [3]

Năm 2013, tác giả Hoàng Anh Vũ đã tiến hành nghiên cứu “Đột biến gen BTK

trên bệnh nhân thiếu gammablobulin máu liên kết nhiễm sắc thể X” Nghiên cứu được tiến thành trên 22 bệnh nhân nam trong đó phát hiện được 13 đột biến trên gen

BTK gây bệnh XLA và 9 bệnh nhân không tìm thấy đột biến Tuy nhiên, nghiên cứu

đề cập đến phân tích đột biến ở mức mRNA mà không khảo sát vùng promoter và vùng intron [4]

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của bệnh viện Nhi Trung Ương và bệnh viện Đại học Y Hải Phòng công bố về 4 ca bệnh XLA đầu tiên được chẩn đoán xác định gen trên tạp chí BioMed Central [1]

Các nghiên cứu phát hiện đột biến gen BTK được thực hiện tại nhiều đơn vị

khác nhau và kỹ thuật phân tích gen mới dừng lại ở phân tích RNA mà chưa xác

định được hết các đột biến trên gen BTK Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử để

sàng lọc toàn bộ đột biến cho bệnh nhân XLA có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc điều trị và chẩn đoán trước sinh sau này

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- 31 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA thuộc 28 gia đình, tuổi từ 2 tuổi đến

15 tuổi được khám, chẩn đoán, điều trị và theo dõi tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ 01/2017 đến 05/2018

- 30 người bình thường làm mẫu đối chứng xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen để đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân và tiêu chuẩn loại trừ

2.1.1.

Năm 1999, hội đồng SGMD châu Âu ESID (European Society for Immunodeficiencies) và Hoa Kỳ PAGID (Pan-American Group for Immunodeficiency) đã thống nhất và đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán cho các nhóm bệnh SGMD bẩm sinh [10], [14] Các tiêu chuẩn chẩn đoán này dựa vào lâm sàng, xét nghiệm cơ bản và xét nghiệm phân tích đột biến gen Cho tới nay, đây vẫn là bản tiêu chuẩn được áp dụng rộng rãi nhất trên toàn thế giới

 Tiêu chuẩn lựa chọn:

Bệnh nhân nam có số lượng tế bào lymphoB CD19+ ≤ 2% và ít nhất một tiêu chuẩn sau:

+ Xuất hiện các đợt nhiễm vi khuẩn tái diễn trong năm năm đầu đời

+ Nồng độ IgG, IgM, và IgA thấp dưới 2 độ lệch chuẩn so với nồng độ ở trẻ bình thường cùng lứa tuổi IgG thường dưới 200mg/dL, IgM, IgA, IgE rất thấp hoặc không định lượng được Trẻ dưới 6 tháng: Do có mặt của IgG từ

mẹ nên IgA, IgM rất có ý nghĩa cho chẩn đoán sớm

+ Không có kháng thể kháng hồng cầu Anti-A và Anti-B trong máu và/hoặc đáp ứng kém với vaccine

 Tiêu chuẩn loại trừ

- Loại trừ những thể SGMDBS khác cũng gây giảm IgG máu nhưng số lượng

tế bào lympho B bình thường hoặc hơi cao so với lứa tuổi

- Loại trừ các bệnh di truyền khác đã được chẩn đoán xác định bằng xét nghiệm di truyền phân tử

- Bệnh nhân không chấp thuận tham gia nghiên cứu

Thu thập mẫu

2.1.2.

- Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Di

truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Trung ương từ 1/2017 đến 05/2018

- Mẫu bệnh phẩm: Lấy 2ml máu ngoại vi chống đông EDTA của 30 người

bình thường và 31 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA, được thu thập và bảo quản

ở điều kiện nhiệt độ 0ºC đến 4ºC

2.2 Hoá chất và thiết bị

Hóa chất

2.2.1.

 Hóa chất tách DNA từ máu ngoại vi và từ dịch ối sau nuôi cấy

- QiaAmp DNA blood mini kit (250 phản ứng/ kit (QIAGEN, Đức)

- 100% Ethanol (Merck, Đức)

 Hóa chất cho PCR

- MgCl2, dNTPs, Taq polymerase (Invitrogen, Hoa Kỳ)

- 19 cặp mồi, bao gồm mồi xuôi và mồi ngược (Error! Reference source

ot found.)

- Nước khử ion (Invitrogen, Hoa Kỳ)

 Hóa chất điện di

- Agarose (Invitrogen, Hoa Kỳ)

- Dung dịch TBE 10X (Invitrogen, Hoa Kỳ) (pha loãng 10 lần khi sử dụng (1X)): Tris 0,89 M, acid Boric 0,89 M, EDTA 0,02M

- 10X Blue juice TM (Loading dye) (Invitrogen, Hoa Kỳ)

- Ethidium bromide (EtBr) (Invitrogen, Hoa Kỳ)

- 100 bp DNA Ladder (1 µg/µl) (Invitrogen, Hoa Kỳ)

 Hóa chất tinh sạch: Kit tinh sạch

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Qiagen-purification Kit, Đức)

 Hóa chất giải trình tự gen: Sử dụng hóa chất giải trình tự gen cho máy Giải trình tự ABI 3130 (Applied Biosystems, Hoa Kỳ)

- BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Hoa Kỳ)

- BigDye v3.1 Termination reaction kit (Applied Biosystems, Hoa Kỳ)

- POP-7 polymer (Applied Biosystems, Hoa Kỳ)

- Running buffer 10X (Applied Biosystems, Hoa Kỳ)

- Trình tự 18 cặp mồi, bao gồm mồi xuôi và mồi ngược

- Cân phân tích (Mettler Toledo 10-g, Thụy Sĩ)

- Hệ thống điện di nằm ngang (PowerPac 300, BioRad, Hoa Kỳ)

- Máy lắc

- Pipettes: 20 µL, 200 µL và 1 mL (Eppendorf-Đức)

- Ống PCR 0.2 mL và 0.5 mL (Corning, Hoa Kỳ)

- Ống ly tâm 1.5 mL (Corning, Hoa Kỳ)

- Đầu côn có màng lọc 100 µl, 1000 µl, 10 µl (Labcon, Đức)

- Khay lạnh

- Máy đo nồng độ DNA-Nanodrop 1000 (Thermo, Hoa Kỳ)

- Hệ thống máy khuếch đại gen (PCR Eppendoff, Biorad)

- Hệ thống soi gel (GelDoc, Biorad, Hoa Kỳ);

- Máy giải trình tự gene 3130 Genetic Analyser (ABI, Hoa Kỳ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Qui trình tiến hành phân tích gen BTK tại Khoa Di truyền và Sinh học phân

tử, bệnh viện Nhi Trung Ương theo các bước sau:

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xác định đột biến gen BTK gây bệnh XLA

Kỹ thuật tách DNA tổng số

2.3.1.

2.3.1.1 Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi

Quy trình tách DNA tổng số từ máu ngoại vi được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit tách DNA (Qiagen-DNA blood mini kit) theo quy trình sau:

- Cho 20 µl Protease QIAGEN vào mỗi ống ly tâm 1.5ml, sau đó cho tiếp

200 µl mẫu máu vào trong ống

- Thêm 200 µl dung dịch đệm AL rồi trộn đều hỗn hợp trên bằng máy lắc trong 15 giây

- Ủ hỗn hợp trong máy ổn nhiệt ở nhiệt độ 56ºC trong 10 phút, sau đó lấy ống ra khỏi máy ổn nhiệt

- Ly tâm nhẹ hỗn hợp để tránh dung dịch đọng trên thành ống và nắp ống

- Thêm 200 µl cồn Ethanol (96-100%), trộn đều và ly tâm nhẹ

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp trên vào cột lọc QIAamp, tránh để hỗn hợp dính vào thành ống và nắp ống

- Ly tâm cột lọc ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi và chuyển cột lọc sang ống 2 ml sạch

- Thêm 500 µl dung dịch đệm AW1, ly tâm ống với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút Sau đó bỏ dịch nổi, chuyển cột lọc sang ống 2 ml sạch khác

- Thêm 500 µl dung dịch đệm AW2, ly tâm ống với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút Loại bỏ dịch nổi, chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1.5 ml vô trùng

- Thêm 200 µl dung dịch AE vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 8000 vòng/ phút trong 1 phút thu DNA tổng số

2.3.1.2 Xác định nồng độ DNA tổng số

- Việc xác định nồng độ DNA sẽ cho phép tính toán thành phần phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt Nồng độ DNA được xác định bằng máy Nano Drop của hãng Thermo ở bước sóng 260 nm và 280 nm

- Tiến hành đo 3 lần với mỗi mẫu để tránh sai số

Phương pháp điện di DNA

2.3.2.

Nguyên tắc:

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện một chiều, các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang dương

Quy trình:

- Dung dịch TBE 1X hoà tan 1% Agarose được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C – 600C

- Nhỏ 1μl Ethidium Bromide, lắc đều

- Đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn lược thích hợp Sau khoảng

30 phút khi gel đã đông cứng thì tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di Đổ đệm TBE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm

- Tra mẫu: mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu (Loading dye) theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel

- Tiến hành điện di với dòng điện một chiều, hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60- 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue

để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 60 phút)

- Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng Ảnh điện di được chụp trên máy Biorad với tia UV có bước sóng 320 nm

Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger bằng máy ABI 3130

2.3.3.

2.3.3.1 Phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ gen BTK

Gen BTK gồm 19 exon được chia thành 9 đoạn nhỏ như Hình 2.2 và khuếch

đại bằng các cặp mồi đặc hiệu Bảng 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ nhân đoạn gen BTK

- Phản ứng PCR khuếch đại 19 exon của gen BTK bao gồm các thành phần

trong Bảng 2.1:

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích /mẫu (µl)

- Trình tự mồi trong Bảng 2.2:

Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi phản ứng PCR khuếch đại gen BTK

X7 E14F

5’-TCCTATTTCTGCCCCAGTTGG-3’

1058bp E15R 5’-ATCTCTTCAACTGCACTTCGA-3’

X8 E16F

5’-GCTTAGTGCCCTTAACCTATG-3’

1620bp E18R 5’-CAGTCTTTTGTGGCTGATGG-3’

X9 E19F

5’-ACTTTTGCTCCTTACGCATCGC-3’

627bp E19R 5’-CTTCTGGGATGCTTGAGTGAT-3’

- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại:

Quá trình PCR được thực hiện trên máy PCR Eppendoff (Eppendoff, Đức) Sau mỗi chu kỳ phản ứng, từ 1x đoạn DNA cần nhân sẽ có 2x đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi

2.3.3.2 Tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại

Kiểm tra sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose bằng phương pháp điệm di Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch của QIAGEN (QIAquick PCR Purification Kit, Đức) trước khi tiến hành giải trình tự gen Các bước tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR:

+ Bỏ dịch nổi Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút

+ Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5 ml vô trùng

+ Nhỏ 50 µl dung dịch đệm buffer EB (10mM Tris-Cl, pH 8.5) hoặc nước (pH 7.0- 8.5) Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Sau đó ly tâm ở 13.000 vòng trong 1 phút Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ qua mang lọc xuống ống eppendorf 1.5 ml vô trùng

2.3.3.3 Phản ứng PCR mồi đơn

Trình tự đoạn gene quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng hoá chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hoá chất cần thiết của phản ứng nhân gene để xác định trình tự như ddNTPs, DNA polymerase…

Do đó chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (là sản phẩm PCR tinh sạch) và mồi phù hợp Trình tự mồi cho phản ứng giải PCR giải trình tự gen (Bảng 2.3)

Bảng 2.3 Trình tự mồi phản ứng PCR mồi đơn

X6

X8