Phân tích cấu trúc một số dẫn xuất furan hemiasterlin lược giản bằng các phương pháp phổ hiện đại

Thông thường để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ người ta thường sử dụng các phương pháp như như sau: phương pháp phổ như phổ hồng ngoại cho ta các thông số về nhóm chức, phổ tử ngo

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––––––

LÊ VIỆT HÙNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ DẪN XUẤT FURAN-HEMIASTERLIN LƯỢC GIẢN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thế Chính người thầy đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu cho

em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, người thầy đã tận tình hướng dẫn để em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Tuyến và các bạn NCS, HVCH phòng Hóa dược Viện Hóa học đã giúp đỡ em rất nhiều về thực nghiệm trong suốt thời gian làm luận văn

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo viên Trường THPT Thái Phiên – Hải Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô đã dạy dỗ em nên người! Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã giúp

đỡ em hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Lê Việt Hùng

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN A MỤC LỤC B DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT D DANH MỤC CÁC BẢNG E DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ G DANH MỤC CÁC HÌNH F DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc 3

1.1.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 3

1.1.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4] 9

1.1.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1-4] 11

1.2 Hemiasterlin 12

1.2.1 Chiết tách hemiasterlin 12

1.2.2 Hoạt tính sinh học của hemiasterlin 13

1.3 Mục tiêu của nghiên cứu 14

Chương 2 THỰC NGHIỆM 15

2.1 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị 15

2.1.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu nghiên cứu 15

2.1.2 Hóa chất và dung môi 15

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng 15

2.1.4 Xác nhận cấu trúc 15

2.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 16

2.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu là furan-hemiasterlin [19] 16

2.2.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu là acid furan-hemiasterlin [19] 17

2.3 Phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng phương pháp phổ IR 18

2.3.1 Phân tích phổ IR các hợp chất este furan-hemiasterlin 18

2.3.2 Phân tích phổ IR các hợp chất axit furan-hemiasterlin 18

2.4 Phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng phương pháp phổ NMR 19

2.4.1 Phân tích phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của este furan-hemiasterlin 19

2.4.2 phân tích phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của axit furan-hemiasterlin 20

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 22

3.2 Kết quả phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng phương pháp phổ IR 23

3.2.1 Kết quả phân tích phổ IR các este furan-hemiasterlin 23

3.2.2 Kết quả phân tích phổ IR các este furan-hemiasterlin 25

3.3 Kết quả phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng phổ NMR 26

3.3.1 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của este furan-hemiasterlin 26

3.3.2 Kết quả phân tích phổ NMR của axit furan-hemiasterlin 30

KẾT LUẬN 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHụ LụC 36

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Boc2O Di-tert-butyl dicacbonat

DIBAL-H Di-iso-butyl nhôm hidrua

DIPEA hoặc DIEA N,N’-Di -iso-propyletyl amin

HPLC High-performance liquid chromatography

LC-MS Liquid chromatography - mass spectrometry

LiHMDS Lithi bis(trimetylsilyl)amit

PyBOP Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphon

–hexaflorophosphat

p-TsOH Axit p-toluen sunfonic

TBDMSCl ter-Butyl đimetyl clo silan

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

sơ đồ 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu furan-hemiasterlin 22

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hệ thống phân tích phổ hạt nhân 3

Hình 1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của etylphenylsunfurơ 6

Hình 1.3 Phổ HMQC của ipsenol 7

Hình 1.4 Phổ HMBC của ipsenol 8

Hình 1.5 Phổ khối lượng của tetrapeptit 10

Hình 1.6 Phổ hồng ngoại của 2-metyl butan-1-ol 12

Hình 3.1 Phổ IR của hợp chất 11 23

Hình 3.2 Phổ IR của hợp chất 12 24

Hình 3.3 Phổ IR của hợp chất 13 25

Hình 3.4 Phổ IR của hợp chất 14 26

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR của hợp chất 11 27

Hình 3.6 Phổ 13C-NMR của hợp chất 11 28

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của hợp chất 12 29

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của hợp chất 13 30

Hình 3.9 Phổ 13C-NMR của hợp chất 13 31

Hình 3.10 Phổ 1H-NMRcủa hợp chất 14 32

Hình 3.11 Phổ 13C-NMR của hợp chất 14 32

DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của chất 11

MỞ ĐẦU Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là nhiệm vụ quan trọng trong hóa phân tích hiện đại Ngày nay để giải quyết các vấn đề thực tiễn, nhiệm vụ của hóa phân tích là phải biết cấu trúc chính xác của đối tượng nghiên cứu, vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, người ta mới xây dựng được phương pháp phân tích cho phù hợp Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ, người

ta phải kết hợp sử dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau, vì mỗi phương pháp chỉ cho một số thông tin xác định, việc tổ hợp các phương pháp phân tích cho ta đầy đủ các dữ liệu cho phép khẳng định chính xác cấu trúc các hợp chất Thông thường để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ người

ta thường sử dụng các phương pháp như như sau: phương pháp phổ như phổ hồng ngoại cho ta các thông số về nhóm chức, phổ tử ngoại khả kiến cho ta biết các kiểu liên kết, phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho ta thông tin về khung cấu trúc, phổ khối lượng cho ta biết thông số về khối lượng phân tử, tỷ lệ các đồng vị, nguyên tố tham gia cấu trúc hoặc cơ chế phân mảnh

Hemiasterlin là một tripeptit có hoạt tính chống ung thư ở ngưỡng nM (0,3 nM) với nhiều dòng tế bào ung thư thực nghiệm, được phân lập từ loài hải miên Hemiasterella minor vào năm 1994 [1] Hoạt tính gây độc tế bào của hemiasterlin do làm ngưng trệ sự phân bào ở giai đoạn metaphase của động học tế bào nhờ ức chế quá trình polyme hóa tubulin và depolyme hóa microtubule do gắn lên vị trí vinca peptit trên tubulin [4]

Mặt khác, do hàm lượng trong thiên nhiên thấp và cấu trúc độc đáo nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tổng hợp nhằm tìm kiếm các hợp chất mới và hoạt tính sinh học lý thú Hemiasterlin là tripeptit có cấu trúc

rất phức tạp, việc xác định cấu trúc của hợp chất này cần phải có kết hợp nhiều phương pháp phân tích cấu trúc khác nhau và phải phân tích nhiều lần

để tìm được các điều kiện ghi mẫu có độ lặp lại và chính xác cao Vì vậy đề tài “Phân tích cấu trúc một số dẫn xuất furan-hemiasterlin bằng các phương pháp phổ hiện đại” như phương pháp phổ hồng ngoại IR, phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR là rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nội dung và nhiệm vụ chính của luận văn được đặt ra là:

- Chuẩn bị mẫu furan-hemiasterlin bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ

- Phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng các phương pháp phổ

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc

1.1.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance), là phương pháp hiện đại và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu Hóa học Trong phương pháp phân tích cấu trúc này, chỉ các nguyên tố có spin hạt nhân I≠0 mới được nhận diện và phân tích Ngày nay, có nhiều hạt nhân có thể nghiên cứu bằng kĩ thuật NMR, tuy nhiên phổ biến nhất là H, C,

N, P và F được ứng dụng hiệu quả trong xác định cấu trúc phân tử Trong đó phổ biến nhất là phương pháp phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì momen từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [1,2]

Hình 1.1 Hệ thống phân tích phổ hạt nhân

a Tính chất của hạt nhân trong từ trường ngoài [1-4]

Hạt nhân nguyên tử mang điện tích dương và tự quay quanh mình nó tạo nên dòng điện vòng có momen điện từ µ, đồng thời cũng tạo ra momen

quay gọi là momen spin Như vậy hạt nhân nguyên tử được đặc trưng bằng momen từ µ

và momen spin P

Khi đặt hạt nhân nguyên tử vào từ trường ngoài có cường độ B0 thì dưới tác dụng của đường sức từ trường ngoài momen từ của hạt nhân bị xoay

đi một hướng nhất định trong không gian gọi là lượng tử hóa và được đặc trưng bằng số lượng tử từ m (m có các giá trị -I, I +I và +I) đối với các nguyên tử có hạt nhân như 1

H, 13C và 31 P thì I chỉ có 2 giá trị là +1/2 và -1/2 Nếu gọi Z là trục của hướng từ trường ngoài B0 thì hình chiếu của µ trên trục

2

h π

γB0 (1) (γ gọi là hằng số hồi chuyển nó phụ thuộc vào từng loại hạt nhân)

Tỷ lệ giữa các hạt nhân năng lượng thấp N1 và hạt nhân năng lương cao

N2 theo sự phân bố Boltman

từ trường hiệu dụng và ký hiệu là Bc Vì mỗi hạt nhân có một lớp vỏ điện từ xác định nên sự che chắn này là cố định vì thế gọi nó là hằng số chắn và ký

hiệu là σ Khi đó Be = B0 (1-σ) Như thế mật độ điện tử càng cao hằng số chắn càng lớn, từ trường hiệu dụng càng bé, hạt nhân càng được bảo vệ, không bị tác dụng lớn của từ trường ngoài

Các hạt nhân có vỏ điện tử giống nhau thì có hằng số chắn bằng nhau, các hạt nhân như thế gọi là hạt nhân tương đương Các hạt nhân không có vỏ điện từ giống nhau, không có hằng số chắn bằng nhau gọi là hạt nhân không tương đương Có hai nguyên nhân xuất hiện hằng số chắn:

- Hiệu ứng nghịch từ: Các điện tử bao quanh hạt nhân sinh ra từ trường ngược chiều với từ trường ngoài làm giảm bớt (chắn bớt) sự tác dụng của nó lên hạt nhân Lớp vỏ điện tử càng dày, mật độ càng cao càng chắn nhiều, hằng số chắn càng lớn Như thế các nhóm có hiệu ứng +I có hằng số chắn lớn: CH3, C2H5… các nhóm có hiệu ứng –I có hằng số bé: Cl, Br, NO2… Các hợp chất có hằng số chắn lớn nằm ở phía trường mạnh

- Hiệu ứng thuận từ: Đối với các hợp chất có liên kết π như olefin, ankin, benzen và cacbonyl Ở đây các điện tử chuyển động sinh ra dòng điện vòng và tạo ra từ riêng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường ngoài Các nghiên cứu cho thấy các hợp chất này có từ trường riêng cùng chiều với từ trường ngoài nghĩa là có hiệu ứng thuận từ, nghĩa là hằng số chắn bé, trường hiệu dụng lớn, nên các hợp chất có hằng số chắn bé nằm ở phía trường yếu

c, Độ dịch chuyển hóa học [1-4]

Giá trị quan trọng nhất trong phân tích NMR là độ chuyển dịch hóa học

δ Giá trị này có được là do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H

và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân

1H thì:

) ( 10 6

ppm

o

x TMS

ν

ν ν

δ = −

Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:

) ( 10 6

ppm

o

x chuan

ν

ν ν

Hình1.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của etylphenylsunfurơ

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học δ ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [3]

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau, đặc biệt là cho biết các thông tin về cấu trúc không gian của phân tử như: cấu hình cis-trans, Z-E, syn-anti, R-S, a-e…[2]

d, Phương pháp phổ HMQC và HMBC [4]

Hình 1.3 Phổ HMQC của ipsenol Phép thực nghiệm tương quan lượng tử bội dị hạt nhân HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) là sự tương quan của các spin

dị hạt nhân được ghép cặp ngang qua liên kết đơn và do đó nhận biết các hạt nhân tiếp nối nhau, thường là 1H-13C Phép thực nghiệm này được áp dụng để phát hiện các hạt nhân có độ nhạy cao, chẳng hạn 1H, 19F, 31P (trong “kĩ thuật

nghịch đảo”) Về mặt lịch sử, phép thực nghiệm HMQC có trước phép thực nghiệm HETCOR Mặc dù có nhiều điểm khác nhau về mặt thực nghiệm, song sự khác nhau chủ yếu là ở chỗ trong khi phép thực nghiệm HETCOR là phát hiện carbon, thì phép thực nghiệm HMQC là phát hiện proton Vì có sự khác nhau lớn giữa proton và carbon về độ phổ biến tương đối của chúng và

độ nhạy, nên hiện nay HMQC rất hay được sử dụng Ưu điểm của phép thực nghiệm nghịch đảo so với các phép thực nghiệm phát hiện trực tiếp là ở chỗ, với phép thực nghiệm nghịch đảo, hạt nhân với γ lớn nhất (thường là 1H) được phát hiện với độ nhạy cao nhất

Hình 1.4 Phổ HMBC của ipsenol Phép thực nghiệm gắn kết dị hạt nhân qua nhiều liên kết HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) là sự tương quan của các spin được ghép cặp ngang qua nhiều liên kết và được áp dụng để phát hiện các hạt nhân có hạt nhân có độ nhạy cao như 1H, 19F, 31P (một “kĩ thuật nghịch đảo”) Phổ HMQC dùng để phát hiện các ghép cặp nhỏ, có giá trị nhất trong tương

quan 1H – 13C qua hai hoặc ba liên kết Đây là một phương pháp cho phép ghép nối các mảnh cấu trúc với nhau

1.1.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4]

Phương pháp khối phổ (MS) là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí Đây là phương pháp phân tích hiện đại được sử dụng phổ biến trong các phép phân tích cấu trúc và phân tích hàm lượng các hợp chất hóa học

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e Sau

đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc

bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:

(2)

(1) 3e

2

ABC

2e ABC e

có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân

tử ở mức năng lượng 70 eV

B A

B AB ABC

BC A

ABC

AB

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa

Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e,

tỉ số m/e được gọi là số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì

đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.3)

Hình 1.5 Phổ khối lượng của tetrapeptit Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.1.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1-4]

Phương pháp phân tích cấu trúc bằng phổ hồng ngoại (IR) cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất, đặc biệt là nhóm chức các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc trung của phương pháp phổ hồng ngoại là khi ta chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn Có hai loại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết

Mỗi dao động riêng có một mức năng lượng nhất định nên khi chiếu tia hồng ngoại có năng lượng E= (hC): λ trong đó λ có bước sóng dài từ 100cm-1

,

thì các dao động hấp thu năng lượng ở bước sóng nhất định và dao động mạnh hơn nhanh hơn Sự hấp thu năng lượng này được ghi lại thành biểu đồ gọi là phổ hồng ngoại Như vậy mỗi pic trên phổ hồng ngoại ứng với một dao động và vì trong phân tử có nhiều loại dao động nên phổ hồng ngoại có nhiều pic rất phức tạp Vì thế khi phân tích phổ hồng ngoại người ta chỉ chú ý những pic chính đặc trưng cho một số loại liên kết

Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân

tử Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau

Hình 1.6 Phổ hồng ngoại của 2-metyl butan-1-ol Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 – 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay 1.2 Hemiasterlin

Hemiasterlin là nhóm các tripeptit thiên nhiên mạch thẳng được phân lập từ loài hải miên Hemiasterella minor Phân tử hemiasterlin được cấu tạo

từ ba đơn vị amino axit bất thường Do có độc tính mạnh với nhiều dòng tế bào ung thư nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hiện nay, một số hemiasterlin đang được thử nghiệm điều trị ung thư ở giai đoạn hai [19] 1.2.1 Chiết tách hemiasterlin

Năm 1994, lần đầu tiên nhóm nghiên cứu của Kashman đã phát hiện và phân lập được hemiasterlin (1) từ loài hải miên Hemiasterella minor ở vịnh Dodwana với hàm lượng rất thấp 0,01% so với khối lượng mẫu khô [1] Cấu trúc phức tạp của hemiasterlin đã được Kashman chứng minh bằng nhiều phương pháp phổ như phổ khối lượng phân giải cao bắn phá nhanh ghép nối

khối phổ (HRFABMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D và phổ IR đã khẳng định cấu trúc mạch thẳng của hemiasterlin gồm ba amino axit bất thường sắp xếp lần lượt theo thứ tự A, B, C nhưng không giải thích được cấu hình không gian của các nhóm thế trên ba amino axit [19-22]

Tiếp theo, nhóm nghiên cứu của Raymond J Andersen đã phân lập được hai dẫn xuất khác của hemiasterlin là hemiasterlin A (5), hemiasterlin B (6) từ loài hải tiêu Auletta và Cymbastella [2] Do cấu trúc phức tạp của hemiasterlin và hàm lượng hemiasterlin trong các mẫu hải tiêu rất thấp nên đến năm 1996 cấu trúc không gian của hemiasterlin mới được khẳng định nhờ phổ nhiễu xạ tia X [3], sau này được các nhà khoa học chứng minh bằng nhiều phương pháp hiện đại [20]

Như vậy, việc phân lập được hemiasterlin từ các loài hải miên với cấu trúc độc đáo đã cuốn hút được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu phân lập nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có cấu trúc lý thú từ sinh vật biển [19] 1.2.2 Hoạt tính sinh học của hemiasterlin

Kết quả sàng lọc hoạt tính ban đầu của Kashman đã khẳng định khả năng gây độc tế bào ung thư P388 leukaemia của hemiasterlin (1) ở nồng độ

IC50 = 19 nM [6] Năm 1995, Andersen đã thử nghiệm lại độc tính tế bào của hemiasterlin trên dòng P388 leukaemia với nồng độ ức chế IC50 = 8,7 nM [7]

So sánh hai kết quả nghiên cứu, nhóm Andersen đã giải thích do mẫu hemiasterlin của họ có độ sạch cao hơn, điều này phù hợp với sự khẳng định của nhóm Kashman năm 1994 là mẫu hemiasterlin cho nghiên cứu hoạt tính có độ

sạch chưa cao [6,7] Cũng trong công trình này, Andersen đã khẳng định độc tính của hemiasterlin với nhiều dòng tế bào khác như: ung thư vú MCF7 (ED50 = 0,089 µg/ml), ung thư glioblastoma/astrocytoma U373 (ED50 = 0,012 µg/ml), ung thư ovarian carcinoma HEY (ED50 = 0,0014 µg/ml), các dẫn chất hemiasterlin A, B có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn hemiasterlin (1) [7]

Năm 1997, nhóm nghiên cứu của Andersen đã phát hiện cơ chế chống ung thư của hemiasterlin Hoạt tính độc tế bào của hemiasterlin là do làm ngưng trệ sự phân bào ở giai đoạn metaphase của động học tế bào nhờ ức chế quá trình polyme hóa tubulin bởi sự gắn kết của hemiasterlin lên vị trí Vinca peptit của tubulin Tác động này tương tự như một số tác nhân chống ung thư khác gắn kết lên tubulin đã được ứng dụng trong hóa trị liệu ung thư paclitaxel hoặc vinblastin, ở khoảng liều ED50 từ 0,5nM đến 28nM [8-19]

Như vậy, nhóm chất hemiasterlin được phân lập từ loài hải miên không chỉ có cấu trúc hóa học độc đáo mà chúng còn có hoạt tính gây độc tế bào mạnh với nhiều dòng tế bào ung thư Kết quả này đã mở ra hướng nghiên cứu tìm các hợp chất chống ung thư mới có nguồn gốc sinh vật biển [7-19]

1.3 Mục tiêu của nghiên cứu

Như phân tích ở trên Hemiasterlin là tripeptit có cấu trúc rất phức tạp, việc xác định cấu trúc của hợp chất này cần phải có kết hợp nhiều phương pháp phân tích cấu trúc khác nhau và phải phân tích nhiều lần để tìm được các điều kiện ghi mẫu có độ lặp lại và chính xác cao Vì vậy đề tài “Phân tích cấu trúc một số dẫn xuất furan-hemiasterlin bằng các phương pháp phổ hiện đại”, rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn Nội dung và nhiệm vụ chính của luận văn được đặt ra là: Chuẩn bị các mẫu furran-hemiasterlin bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ và phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng các phương pháp phổ hiện đại

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Các mẫu nghiên cứu là furan-hemiasterlin được chuẩn bị bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ đã được công bố trên tài liệu [19-22] được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ – Hóa dược, Trường đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên và Phòng thí nghiệm Hoá dược - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Nhằm mục đích chuẩn bị các mẫu furan-hemiasterlin cho nghiên cứu phân tích cấu trúc

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ) Silica gel cho sắc ký cột là loại 100 -

200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel là bản nhôm tráng sẵn Art

5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck) Các tác nhân và nguyên liệu cho phản ứng được mua lại tinh khiết của hãng Aldrich (Mỹ)

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc

và sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra phản ứng Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất

2.1.4 Xác nhận cấu trúc

Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, luận văn tiến hành các phương pháp sau:

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy Gallenkamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi thích hợp và TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Các mẫu nghiên cứu là furan-hemiasterlin được chuẩn bị bằng cách lặp lại các các phương pháp tổng hợp hữu cơ đã được công bố trên tài liệu [19-22] Các nguyên liệu đầu chất là hợp 8, 9 và 10 được hỗ trợ từ công trình nghiên cứu [19]

2.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu là furan-hemiasterlin [19]

Dung dịch của hợp chất 10 (47 mg, 0,24 mmol), EDC (50 mg, 0,26 mmol), HOBt (35 mg, 0,26 mmol) và i-PrNHEt (124 mg, 0,48 mmol) trong DMF (3 mL) được cho thêm hợp chất 8 (99 mg, 0,24 mmol) và khuấy ở nhiệt

độ phòng trong khoảng 24h Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được cho thêm nước

và chiết ba lần bằng EtOAc mỗi lần 30 ml, dịch hữu cơ thu được rửa bằng nước muối và làm khan bằng Na2SO4 sau đó loại dung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải (n-hexan/EtOAc: 85/15) thu được sản phẩm 11 (51 mg, 44%) Hợp chất 11 là chất rắn có điểm chảy 95-97 oC

Tương tự, dung dịch của hợp chất 9 (47 mg, 0,24 mmol), EDC (50 mg, 0,26 mmol), HOBt (35 mg, 0,26 mmol) và i-PrNHEt (124 mg, 0,48 mmol) trong DMF (3 mL) được cho thêm hợp chất 8 (99 mg, 0,24 mmol) và khuấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 24h Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được cho thêm nước và chiết ba lần bằng EtOAc mỗi lần 30 ml, dịch hữu cơ thu được rửa bằng nước muối và làm khan bằng Na2SO4 sau đó loại dung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải (n-hexan/EtOAc: 85/15) thu được sản phẩm 12 (56

mg, 49%) Hợp chất 12 là chất rắn có điểm chảy 130-131oC

2.2.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu là acid furan-hemiasterlin [19]

Dung dịch của chất 11 (50 mg, 0,11 mmol) trong 2 ml MeOH/ H2O (2:1) được làm lạnh về 0oC và được cho LiOH rắn (47 mg, 1,95 mmol) Sau

đó hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 24h Kết thúc phản ứng, dung môi được quay đuổi ở áp suất thấp sau đó axit hóa bằng HCl (pH=2) về dung dịch có pH=5,5-6 Tiếp theo, dịch được chiết 3 lần bằng EtOAc, lớp hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4 sau đó đuổi dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất 13 (44 mg, 90%) Hợp chất 13 là chất rắn có điểm chảy 128-130 oC

Tương tự, dung dịch của chất 12 (50 mg, 0,11 mmol) trong 2 ml MeOH/ H2O (2:1) được làm lạnh về 0oC và được cho LiOH rắn (47 mg, 1,95 mmol) Sau đó hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 12h Kết thúc phản ứng, dung môi được quay đuổi ở áp suất thấp sau đó axit hóa bằng HCl (pH=2) về dung dịch có pH=5,5-6 Tiếp theo, dịch được chiết 3

lần bằng EtOAc, lớp hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4 sau đó đuổi dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất 14 (43 mg, 89%) Hợp chất 14 là chất rắn có điểm chảy 149-151 oC

2.3 Phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng phương pháp phổ IR

2.3.1 Phân tích phổ IR các hợp chất este furan-hemiasterlin

Cân 2 mg lần lượt của chất 11 và 12, được trộn lần lượt với100 mg KBr trong cối mã não, trộn đều và được nghiền mịn thành hỗn hợp đồng nhất bằng chày của cối mã não Hỗn hợp này được đưa vào thiết bị ép viên thủy lực 50 tấn của hãng HP, sau đó mẫu được đo lần lượt trên trên máy FT-ICR Mass spectrometer Model 910-MSTQFTMS-7 Tesla tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội

Chất 11 IR (KBr): 3291; 2962; 2875; 1702; 1651; 1529; 1370; 1277; 1246; 1102 cm-1

Chất 12 IR (KBr): 3315; 2964; 2875; 1700, 1657; 1525; 1371; 1277; 1245; 1165; 1245 cm-1

2.3.2 Phân tích phổ IR các hợp chất axit furan-hemiasterlin

Cân 2 mg lần lượt của chất 13 và 14, được trộn lần lượt với100 mg KBr trong cối mã não, trộn đều và được nghiền mịn thành hỗn hợp đồng nhất bằng chày của cối mã não Hỗn hợp này được đưa vào thiết bị ép viên thủy lực 50 tấn của hãng HP, sau đó mẫu được đo lần lượt trên trên máy FT-ICR Mass spectrometer Model 910-MSTQFTMS-7 Tesla tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội

Chất 13 IR (KBr): 3417; 3315; 3068; 2963; 2875; 1648; 1519; 1371; 1245; 1154 cm-1

Chất 14 IR (KBr): 3411; 3287; 2964; 2874; 1695; 1654; 1631; 1520; 1371; 1236; 1165 cm-1

2.4 Phân tích cấu trúc của các furan-hemiasterlin bằng phương pháp phổ NMR

2.4.1 Phân tích phổ 1

H-NMR và 13

C-NMR của este furan-hemiasterlin Cân 25 mg các chất 11 và 12 được cho lần lượt vào các ống NMR (loại tubes NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3

và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Các mẫu được đo lần lượt trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn tại Trung tâm phân tích cấu trúc Viện hóa học – Viện hàn lâm

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 7,51 (1H, s, H-5’); 6,78 (1H, bs, H-3’); 6,58 (1H, bs, H-4’); 6,56 (1H, s, H-15); 6,47 (1H, s, H-3); 4,54 (1H,

dd, J = 9,0; 16,5 Hz, H-9); 4,39 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-4); 4,13-4,20 (2H, m,

CH2 Et); 2,10 (3H, s, CH3 Ac); 1,93 (3H, s, CH3-C-2); 1,77-1,82 (1H, m, 5); 1,27 (3H, t, J = 7,0 Hz, CH3 Et); 0,97 (9H, s, H-12, H-11); 0,86 (6H, dd, J

H-= 7,5 Hz; 13,5, H-6, H-7)

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ ppm: 169,9 (C-8); 168,1 (C=O Ac); 164,5 (COOEt); 162,5 (C-13); 149,9 (C-2’); 143,9 (C-5’); 139,6 (C-2); 129,8 (C-3); 127,1 (C-14); 114,3 (C-15); 113,7 (C-3’); 112,0 (C-4’); 61,1 (C-9); 60,7 (C-4); 52,7 (CH2 Et); 36,4 (C-10); 34,9 (C-5); 32,7 (CH3 Ac); 26,6 (C-

11, C-12); 18,6 (C-6, C-7); 14.1 (CH3 Et); 13.1 (CH3-C-2)

H N

OEt O

N H NHAc

12

O

O O

1 2 4 3

5

6 7

8 9 10 11 12

13 14 15

3' 5'

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 7,67 (1H, s, H-2’); 7,45 (1H, bs, H-5’); 7,03 (1H, bs, H-4’); 6,83 (1H, s, H-15); 6,54 (1H, s, H-3); 4,53-4,58 (1H, m, H-9); 4,38 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-4); 4,14-4,20 (2H, m, CH2 Et); 2,19 (3H, s, CH3 Ac); 1,88 (3H, s, CH3-C-2); 1,72-1,77 (1H, m, H-5); 1,27 (3H, t,

và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Các mẫu được đo lần lượt trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn tại Trung tâm phân tích cấu trúc Viện hóa học – Viện hàn lâm

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ ppm: 7,68 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5’); 7,14 (1H, s, H-15); 6,78 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-3’); 6,61 (1H, dd, J = 1,5, 10,0

Hz, H-3); 6,58 (1H, dd, J = 1,5, 3,5 Hz, H-4’); 4,50 (1H, dd, J = 1,5, 10,0 Hz, H-4); 4,39 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-9); 2,22 (3H, s, CH3 Ac); 1,92 (3H, s, CH3-C=CH); 1,81-1,84 (1H, m, H-5); 1,00 (9H, s, H-11, H-12); 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6); 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-7)

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ ppm: 173,4 (COOH); 171,8 (C-8); 166,5 (CO Ac); 151,0 (C-2’); 146,1 (C-5’); 140,6 (C-2); 131,4 (C-14); 126,7 (C-3); 119,5 (C-15); 116,2 (C-4’); 113,1 (C-3’); 62,2 (C-9); 54,5 (C-4); 36,2 (C-10); 33,6 (C-5); 27,1 (C-11, C-12); 22,7 (CH3 Ac); 19,3 (C-6; 19,1 (C-7); 13,4 (CH3-C-2)

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ ppm: 7,88 (1H, s, H-15); 7,56 (1H, d, J

= 1,5 Hz, H-2’); 7,27 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-5’); 6,70 (1H, dd, J = 1,5, 3,5 Hz, H-4’); 6,60 (1H, dd, J = 1,0, 10,0 Hz, H-3); 4,51 (1H, dd, J = 1,5, 10,0 Hz, H-4); 4,40 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-9); 2,21 (3H, s, CH3 Ac); 1,92 (3H, s, CH3-C-2); 1,80-1,85 (1H, m, H-5); 1,00 (9H, s, H-11, H-12); 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6); 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-7)

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ ppm: 173,1 (COOH); 171,8 (C-8); 171,4 (CO Ac); 166,6 (C-13); 146,5 (C-2’); 145,1 (C-5’); 140,5 (C-2); 131,5 (C-14); 128,3 (C-3); 124,1 (C-15); 121,3 (C-3’); 110,5 (C-4’); 62,1 (C-9); 54,6 (C-4); 36,2 (C-10); 33,6 (C-5); 27,1 (C-11, C-12); 22,7 (CH3 Ac); 19,3 (CH3 C-6); 19,2 (C-7); 13,4 (CH3-C-2)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Hemiasterlin là một tripeptid có hoạt tính chống ung thư ở ngưỡng nanomo, cơ chế tác dụng của hợp chất này tương tự như vinblastin và taxol, hiện nay đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng ở giai đoạn III cho sản xuất thuốc chống ung thư Do có hoạt tính sinh học lý thú nên hemiasterlin được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hemiasterlin là một tripetid phức tạp, trong cấu trúc có nhiều trung tâm bất đối, các trung tâm này đóng vai trò quan trọng đến hoạt tính của các hemiasterlin Do đó, việc phân tích cấu trúc của hemiasterlin đòi hỏi cần có phải kết hợp nhiều phương pháp phân tích hóa lý hiện đại Nguyên liệu cho nghiên cứu cấu trúc là các hợp chất furan-hemiasterlin được chuẩn bị nhờ phương pháp tổng hợp hữu Các mẫu nghiên cứu là furan-hemiasterlin được chuẩn bị bằng cách lặp lại các các phương pháp tổng hợp hữu cơ đã được công bố trên tài liệu [19-22] Các nguyên liệu đầu chất là hợp 8, 9 và 10 được hỗ trợ từ công trình nghiên cứu [19]

H N

O O

O 8

R NHAc

O OH

EDC, HOBT, i-PrNEt,

H N

O O N

H O

O R NHAc

O

O R NHAc

9, 10