TÁCH và xác ĐỊNH cấu TRÚC hợp CHẤT TRITECPENOIT từ

Mặc dù cho đếnnay, việc nghiên cứu hệ thực vật ở nước ta chưa được tiến hành một cách đầy đủ và quy mô, nhưng theo tổng hợp từ các nguồn tài liệu của nhiều tác giả thì ở Việt Nam hiện na

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Hoàng Văn Lựu Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ HUẾ

Lớp : 49A Hoá

Mã sinh viên : 0852010374

VINH, 2012

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm

ơn tới: PGS TS Hoàng Văn Lựu – Khoa Hóa học – Trường Đại học Vinh.

Thầy đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện khoá luận này.

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo khoa Hóa học, khoa Sau đại học – trường Đại học Vinh, các thầy giáo, cô giáo trường THPT Đặng Thai Mai và gia đình, người thân, bạn bè đã tạo mọi điều kiện để giúp

đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi hoàn thành được luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Vinh, ngày tháng năm 2012

Tác giả

Trần Thị Huế

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Nhiệm vụ ngiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 CÂY VỐI 3

1.1.1 Tên gọi 3

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Mô tả thực vật 3

1 1.4 Thành phần hóa học cây vối 4

1.1.5 Về tác dụng dược lí: 17

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 19

2.1 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, TÁCH VÀ PHÂN LẬP CÁC CHẤT 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 19

2.4 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 20

2.4.1 Thiết bị 20

2.4.2 Hoá chất 20

2.5 TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT TỪ VỎ CÂY VỐI .20 2.5.1 Tách các hợp chất từ vỏ cây vối 20

2.5.2 Xác định cấu trúc các hợp chất 23

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Xác định cấu trúc của hợp chất B (TDV10) 24

KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

1H – NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ

cộng hưởng từ hạt nhân proton)

13C – NMR : Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon – 13)DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu lá vối ở Quảng Châu, Trung Quốc 4

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của tinh dầu nụ vối ở 5

Bảng 1.6 Thành phần hóa học của tinh dầu lá vối ở thành phố Vinh, Nghệ An 7

Bảng 1.7 Thành phần hoá học của tinh dầu nụ vối non và nụ vối già 9

Bảng 1.8 Thành phần hoá học của tinh dầu hoa vối ở thành phố Vinh, Nghệ An 10

Bảng 2.1: Số liệu của quá trình chạy cột cao vỏ vối 21

Bảng 3.1 : Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất TDV10 dung môi CDCl3 29

DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Ảnh cây vối 3

Hình 1.2: Phổ 1H-NMR của hợp chât B 25

Hình 1.3: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất B 26

Hình 1.5 : Phổ 13C – NMR của hợp chất B 32

Hình 1.6 : Phổ giãn 13C – NMR của hợp chất B 33

Hình 1.7: Phổ DEPT của hợp chất B 34

Hình 1.8: Phổ giãn DEPT của hợp chất B 35

Hình 1.9: Phổ HMBC của hợp chất B 36

Hình 1.11: Phổ giãn HMBC của hợp chất B 38

Hình 1.12: Phổ giãn HMBC của hợp chất B 39

Hình 1.14: Phổ HSQC của hợp chất B 40

Hình 1.15: Phổ giãn HSQC của hợp chất B 41

Hình 1.16: Phổ giãn HSQC của hợp chất B 42

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, cận xích đạo, lượngmưa nhiều, độ ẩm cao nên có thảm thực vật rất phong phú Mặc dù cho đếnnay, việc nghiên cứu hệ thực vật ở nước ta chưa được tiến hành một cách đầy

đủ và quy mô, nhưng theo tổng hợp từ các nguồn tài liệu của nhiều tác giả thì

ở Việt Nam hiện nay có trên 7.000 loài thực vật học bậc cao Trong số đó đã

có trên 2000 loài thực vật đã được nhân dân ta sử dụng làm nguồn lương thực,thực phẩm, lấy gỗ, tinh dầu, thuốc chữa bệnh… Các nhà nghiên cứu đã tổng hợpđược rất nhiều hợp chất có tác dụng chữa bệnh, song các hợp chất này có một sốhạn chế nhất định, như là gây những phản ứng phụ không mong muốn Mặtkhác, Việt Nam là nước đang phát triển, các loại thuốc chữa bệnh hầu hết nhập

từ nước ngoài và có giá thành cao, gây nên khó khăn cho người sử dụng Do đó,nhà nước đã có chủ trương tăng cường sản xuất thuốc trong nước, hạn chế nhậpkhẩu, hạ giá thành sản phẩm Một trong các nguồn nguyên liệu sản xuất thuốcđược lấy ra từ thiên nhiên Vì vậy, vấn đề đang được đặc biệt quan tâm là nghiêncứu các hợp chất được tách ra từ sản phẩm thiên nhiên

Trong số các loài cây cần quan tâm nghiên cứu có cây vối (Cleistocslyx

operculatus Roxb) Ở nước ta, cây vối mọc nhiều nơi, tập trung nhiều ở miền

Trung Từ nhiều đời nay, cây vối được nhân dân ta, nhất là ở vùng nông thôntrồng để lấy lá, nụ đun nước uống hằng ngày Theo đông y, lá vối có tác dụngkiện tỳ, giúp ăn ngon, tiêu hóa tốt Ngoài ra lá vối và nụ vối làm thuốc chữamụn nhọn, lở loét, ghẻ Mới đây, viện Đông y cũng thử áp dụng vối làm thuốcchữa các bệnh đường ruột, viêm họng, bệnh ngoài da Từ năm 1991 trở lại đây,một số công trình trong nước và trên thế giới nghiên cứu cây vối cho thấy hàmlượng flavonoit chứa trong cây cao và một số chất có hoạt tính kháng HIV Đặcbiệt, một nghiên cứu gần đây nhất cho thấy nước chiết của nụ vối là thành phầncủa thuốc trợ tim, chống khối u

Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn đề tài "Tách và xác định cấu trúc hợp

chất tritecpenoit từ vỏ cây vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry)

ở Nghệ An" nhằm góp phần xác định thành phần hóa học của cây vối, và tìm

nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược liệu, công nghiệp hương liệu,khai thác và sử dụng có hiệu quả nguồn tài nguyên quý giá địa phương

2 Nhiệm vụ ngiên cứu

- Lấy mẫu vỏ cây vối

- Ngâm với dung môi MeOH và chiết với các dung môi khác

- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

- Làm sạch các chất bằng phương pháp rửa và kết tinh phân đoạn

- Xác định cấu trúc của các hợp chất bằng các phương pháp: phổ cộnghưởng từ hạt nhân một chiều

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là vỏ cây vối, mẫu lấy tại thành phố Vinh, tỉnhNghệ An

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 CÂY VỐI

Hình 1.1 Ảnh cây vối

1.1.1 Tên gọi

Cây vối còn gọi là chè vối, chè gội có tên khoa học là Cleistocalyx

operculatus (Roxb) Merr Et Perry; Syzygium nervosum DC

hình cầu hay hình trứng, đường kính 7-12 mm, nhám, có dịch Toàn lá, cành non và

nụ có mùi thơm dễ chịu Cây mọc hoang và được trồng ở khắp nơi Cần phân biệtcây này với vối rừng, mọc hoang ở vùng núi Nó cũng thuộc họ sim và được đông ydùng vỏ cây làm thuốc gọi là hậu phác [1, 10, 18]

1 1.4 Thành phần hóa học cây vối

Các nhà hóa học Trung Quốc đã xác định được trong lá vối có 0,08%tinh dầu, còn trong nụ hoa vối có 0,18% tinh dầu

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu lá vối ở

Quảng Châu, Trung Quốc

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của tinh dầu nụ vối ở

Quảng Châu, Trung Quốc

Tác giả Zhang Fengxion và các cộng sự [28] đã tách được 9 hợp chất

từ nụ vối sau khi đã loại bỏ tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơinước, 7 hợp chất từ chúng đã được xác định gồm:

(1) 2, 4 dihydroxy 6 metoxy (2) 5, 7 dihydroxy 6, 8

3, 5 dimetyl chalcon dimethyl – flavanon

CH = CH - COOH

OH

OH HO

COOH

OH

OH HO

7 hydroxy-5-metoxy-6,8-dimethyl-flavanon Axit ursolic

Tác giả Nguyễn Văn Đậu và cộng sự [6] đã tách và xác định cấu trúcđược 4 hợp chất từ lá vối (mẫu lấy ở tỉnh Nam Định)

(10)Axit oleanolic (11) 3,5,7,4’ - tetrahydroxy flavon

Theo tác giả Hoàng Văn Lựu [3, 5, 12], lần đầu tiên nghiên cứu thànhphần hóa học cây vối ở Nghệ An đã thu được kết quả như sau:

- Trong lá vối có chứa tinh dầu Khi nghiên cứu thành phần hóa họccủa tinh dầu lá vối lấy ở 3 địa điểm khác nhau là huyện Quế Phong, huyệnTân Kỳ và thành phố Vinh (tỉnh Nghệ An) thấy hàm lượng tinh dầu lá vối tạicác địa điểm có sự khác nhau như ở huyện Quế Phong là 0,40%, ở thành phốVinh là 0.10% còn ở các địa phương khác là 0,20%, phát hiện 9 cấu tử chínhtrong đó có bốn thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất là: myrcen, (E) -  -ocimen, (Z) -  - ocimen và  - caryophyllen

Bảng 1.6 Thành phần hóa học của tinh dầu lá vối ở thành phố Vinh, Nghệ An

Bảng 1.7 Thành phần hoá học của tinh dầu nụ vối non và nụ vối già

Bảng1.8 Thành phần hoá học của tinh dầu hoa vối ở thành phố Vinh, Nghệ An

5,7-dihydroxy-6,8-dimetyl-flavanon; 7-hydroxy-5-metoxy-6,8-dimetylflava non

(53) Axit oleanolic (54)  - Sitosterol

- Từ vỏ cây vối đó tách được các chất:  - sitosterol và axit oleanolic

4 hợp chất flavonoid C-metyl hóa mới đã được tách từ cao metanol của nụ vối

(Cleistocalyx operculatus, có hoạt tính chống cúm H1N1 và H9N2) [34].

O O

CH3

OH

(20) (21)

3' 4'

5' 6'

1' 2 3 4 4a

8 7

6 5 8a



3 CHO

5' 6' 1' 2'

1

2

4 5 6

Từ cao metanol của nụ vối đã tách được 7 hợp chất [37].

Gossypetin - 8,3'-dimetylete -3-O--galactoside

O OH

O OH

Tamarixetin

O OH

OH

OCH3

(43)

và 1 hợp chất mới: 5,7,8,4'-Tetrahydroxy - 3',5' - dimetoxy - flavon - 3 - O - 

- galacto - pyranoside có hoạt tính độc tế bào

HO O

O OH

OCH3

OCH3OH

Song nước vối còn là loại có công hiệu giải khát trong những ngày hènóng nực, làm mát và lợi tiểu nên còn có công năng đào thải các độc chấttrong cơ thể qua đường niệu Các nghiên cứu còn cho thấy nếu chỉ uống nướclọc hoặc nước trắng thì sau 30 - 40 phút là cơ thể đào thải hết, nhưng nếuuống nước lá vối hoặc nụ vối thì cũng trong thời gian ấy cơ thể chỉ thải loại1/5 lượng nước đã uống, phần còn lại sẽ được đào thải từ từ sau đó

Năm 1968, Nguyễn Đức Minh, phòng Đông y thực nghiệm - Việnnghiên cứu đông y đã tiến hành nghiên cứu và đi tới kết luận là ở tất cả cácgiai đoạn phát triển, lá và nụ đều có tác dụng kháng sinh, vào mùa đông

kháng sinh tập trung nhiều nhất ở lá Hoạt chất kháng sinh tan trong nước, cácdung môi hữu cơ, bền vững với nhiệt độ và ở các môi trường có pH từ 2 đến 8,

tác dụng mạnh nhất với Streptococcus, sau đến vi trùng bạch cầu và

Staphylococcus và Pneumcoccus [1, 10, 14,18]

Ở Ấn Độ, rễ sắc đặc dạng xirô được dùng để dắp vào vết thương sưng

đỏ, quả dùng để ăn trị phong thấp [20]

Ở Trung Quốc, các bộ phận của cây dùng để chữa trị cảm mạo, đau đầuphát sốt, lỵ trực khuẩn, viêm gan, bệnh mẩn ngứa, viêm tuyến sữa, ngứa ngáyngoài da, bệnh nấm ở chân, vết thương do dao súng [20]

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU

Vỏ vối được thu hái ở phường Lê Mao, thành phố Vinh, tỉnh Nghệ An,được 5kg mẫu tươi Mẫu sau khi lấy về rửa sạch, chặt nhỏ sau đó ngâm quaetanol 960 rồi phơi trong bóng râm cho đến khô Sau đó ngâm trong metanol ởnhiệt độ phòng khoảng 30 ngày rồi lọc tách và cho bay hơi tự nhiên cho đến khôthu được cao metanol Cao metanol được phân bố vào nước cất rồi chiết lầnlượt với n-hexan, cloroform, etyl axetat và butanol, cũng cất thu hồi dung môi thuđược các cao tương ứng Cao clorofom được trộn đều với silicagen theo tỷ lệ 1:1 rồiđược nhồi vào cột sắc kí với pha tĩnh là silicagel (Mesh) cỡ hạt 0,004-0,0063 (254-Merck) Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là clorofom-metanol với tỷ lệtăng dần độ phân cực, lấy lần lượt các thể tích xác định chảy ra cột, cất thu hồi dungmôi một phần rồi cho bay hơi tự nhiên thu được các phân đoạn tương ứng

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, TÁCH VÀ PHÂN LẬP CÁC CHẤT

Để phân lập các hợp chất, chúng tôi tiến hành lần lượt các phương pháp:

• Sắc ký cột thường sử dụng silicagen cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (254 - Merck)

• Sắc ký lớp mỏng (TLC)

• Các phương pháp kết tinh phân đoạn

2.3 PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp giữa cácphương pháp phổ:

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, dung môi CDCl3

• Phổ 13C - NMR, DEPT được đo trên máy BRUKER 125 MHz, dungmôi CDCl3

• (Các phổ trên đều được đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam)

2.4 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.4.1 Thiết bị

• Cột sắc ký thường (chiều dài 1,4 m; đường kính 4,5 cm)

• Cột sắc ký thường (chiều dài 0,5 m; đường kính 2 cm)

- Chiết và tách các hợp chất từ vỏ cây vối

Vỏ cây vối sau khi thu hái cân được 5,0 kg, sau đó được ngâm trongmetanol trong thời gian 30 ngày Lọc và chưng cất thu hồi dung môi ở áp suấtgiảm thu được cao metanol

Cao metanol được phân tán vào trong nước cất sau đó lần lượt chiết vớicác dung môi hexan, clorofom, etyl axetat, butanol Chưng cất thu hồi dungmôi ở áp suất giảm thu được các cao hexan, cao clorofom, cao etyl axetat,phần dịch chiết butanol và phần cặn Cao clorofom trộn đều với silicagel theo

tỉ lệ 1 : 1 rồi cho vào cột sắc ký đã được nhồi bằng pha tĩnh là silicagel cỡ hạt0,040 - 0,063 mm (254 - Merck) Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải làclorofom - metanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực, lấy lần lượt các thể tích xácđịnh chảy ra khỏi cột, cất thu hồi dung môi một phần rồi cho bay hơi tự nhiênthu được các phân đoạn tương ứng ở bảng sau:

Bảng 2.1: Số liệu của quá trình chạy cột cao vỏ vối

Hợp chất TDV 5 được kiểm tra ở SKLM với hệ dung môi rửa giải làCHCl3/MeOH tỉ lệ 90:10 hiện hình bằng iot cho một vết tròn màu vàng nâuvới hệ số Rf=0.6

Hợp chất B: Tại phân đoạn 50 có một lượng chất màu vàng đậm kếttinh Dùng hexan và axeton rửa nhiều lần sau đó kết tinh trong dung môiMeOH thu được một hợp chất sạch màu trắng kí hiệu là chất TDV 10 Hợpchất TDV 10 được kiểm tra ở SKLM với hệ dung môi rửa giải CHCl3/MeOH

tỉ lệ 95:5, hiện hình bằng iot cho một vết màu vàng nâu với hệ số Rf=0.45

Cao

n-hexan

Cao Clorofom Cao etylaxetat Cao

Hîp chÊt B

Ngâm trong methanol 30 ngày

Cất thu hồi dung môi

Cất thu hồi dung môi

n-hexan clorofom etylaxetat butanol

Nhồi cộtRửa giải bằng dung môi clorofom –metanol

Sơ đồ tách các hợp chất từ vỏ cây vối

2.5.2 Xác định cấu trúc các hợp chất

Để xác định cấu trúc các hợp chất, chúng tôi sử dụng kết hợp các phươngpháp phổ:

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, dung môi CDCl3; DMSO

• Phổ 13C - NMR, DEPT được đo trên máy BRUKER 125 MHz, dungmôi CDCl3; DMSO

(Các phổ trên đều được đo tại Viện Hoá học – Viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định cấu trúc của hợp chất B (TDV10)

Từ các số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất B, so sánh với

dữ liệu phổ của các máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh vớitài liệu [36] đã xác định được cấu tạo của hợp chất B là : Axit 3- -O-

axetylbetulinic.Công thức cấu tạo

17 16 18

15 14

22

21 19

20 C

H330

CH229

12 11

9

7 6

10 5

1 2

4 3

COOH 28

CH327

CH326

CH325

C

H324 O

1' C

H32' O

CH323

Hình 1.2: Phổ 1 H-NMR của hợp chât B

Hình 1.3: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất B

Hình 1.4: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất B

 Phổ 1 H-NMR của hợp chất B :

Phổ 1H-NMR của hợp chất B có những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng sau :Tín hiệu cộng hưởng của các proton vinylic H29a , H29b có các giá trị độ chuyểndịch hóa học :

Các nguyên tử cacbon của 6 nhóm metyl (CH3) có các giá trị độ dịch chuyểnhóa học tương ứng sau :

HMBC

13C – NMR

 (ppm)Tài liệu [36]dung môipyridin

Các số liệu phổ 1H – NMR và 13C – NMR của hợp chất A và B gần giốngnhau Chỉ khác nhau ở tín hiệu cộng hưởng của nhóm CH3COO- ở hợp chất A không

có cụ thể tín hiệu cộng hưởng của 3 proton H2’  = 2,04ppm(s)

Tín hiệu cộng hưởng của C2’  =21,3ppm

Tín hiệu cộng hưởng của C1’  =171,1ppm

Tín hiệu cộng hưởng của proton H3  hợp chất B có giá trị  cao hơn sovới hợp chất A (4,47 ppm so với 3,19 ppm)