Nghiên cứu thành phần aglycon của loài thực vật tri mẫu

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết và các hợp chất được phân lập ra từ loài Tri mẫu có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, bảo vệ tế bào và làm giảm đường máu... V

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ THỊ CẨM HƯNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON CỦA LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU

(Anemarrhena asphodeloides)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ THỊ CẨM HƯNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON CỦA LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Học viên

Vũ Thị Cẩm Hưng

XÁC NHẬN CỦA

KHOA CHUYÊN MÔN

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

HƯỚNG DẪN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới TS Phạm Văn Khang - người thầy đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập,

nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn học viên Thẩm Hương Thảo và sinh viên Dương Quang Công đã đồng hành, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

thực nghiệm và hoàn thành luận văn Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các học viên cao học K22 và các em sinh viên trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban lãnh đạo khoa Hóa, phòng Sau đại học - trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên, tháng năm 2016

Học viên

Vũ Thị Cẩm Hưng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ v

DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Dự kiến kết quả đề tài 3

6 Dự kiến cấu trúc luận văn 3

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Khái quát về thực vật họ Thùa (Agavaceae) 4

1.2 Tổng quan về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) 4

1.2.1 Tên khoa học 4

1.2.2 Đặc điểm thực vật 4

1.2.3 Phân bố trong tự nhiên 6

1.2.4 Công dụng của loài Tri mẫu 6

1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa ho ̣c loài Tri mẫu 7

1.3.1 Các hơ ̣p chất glycoside 7

1.3.2 Các hợp chất aglycon 21

1.3.3 Các hợp chất phenolic 23

1.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu 25

1.4.1 Hoạt tính sinh học của các saponin 25

1.4.2 Hoạt tính sinh học của các aglycon 28

Chương 2 THỰC NGHIỆM 32

2.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.2 Hóa chất và thiết bị 32

2.3 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 33

2.3.1 Xử lý mẫu thực vật 33

2.3.2 Chiết tách các chất 33

2.3.3 Xác định cấu trúc các chất 33

2.4 Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme alpha-glucosidase 33

2.5 Thực nghiệm 34

2.5.1 Quá trình phân lập các chất từ phần rễ của loài Tri mẫu 34

2.5.2 Dữ kiện phổ của các chất phân lập được 37

2.5.3 Xác định khả năng ức chế α-glucosidase 40

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả phân lập các hợp chất 41

3.2 Xác định cấu trúc chất tách được 41

3.2.1 Chất AA1 41

3.2.2 Chất AA2 47

3.2.3 Chất AA3 51

3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase của các hợp chất phân lập được 55

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HPLC Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

MKN45 và Kato III Tế bào ung thư dạ dày

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 13C

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 1H

SUNE-1 Tế bào ung thư biểu bì

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ

Bảng 2.1 Số liệu phổ NMR của AA1 37

Bảng 2.2: Số liệu phổ NMR của AA2 38

Bảng 2.3: Số liệu phổ NMR của AA3 39

Bảng 3.1: Mốt số tín hiệu cộng hưởng trên 1H-NMR của chất AA1 và Sarsasapogenin 43

Bảng 3.2: Số liệu phổ 13C- NMR của chất AA1 và sarsasapogenin 44

Bảng 3.3: Một số tín hiệu cộng hưởng trên 1H-NMR của chất AA2 và Sarsasapogenone 48

Bảng 3.4: Số liệu phổ 13C- NMR của chất AA2 và sarsasapogenone 49

Bảng 3.5: Một số tín hiệu cộng hưởng trên 1H và 13C NMR của chất AA3 52

Bảng 3.6: Kết quả chế enzyme α-glucoside 55

DANH MỤC CÁC ẢNH, HÌNH

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết xuất và thủy phân mẫu phần rễ 34

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các chất từ cao tổng số 36

Hình 1.1: Các bộ phận cây Tri mẫu 5

Hình 1.2: Rễ cây Tri mẫu 5

Hình 1.3: Vườn cây Tri mẫu 6

Hình 3.1: Phổ khối lượng EIS-MS của AA1 42

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất AA1 42

Hình 3.3: Phổ 13C NMR của chất AA1 44

Hình 3.4: Phổ HMBC của chất AA1 46

Hình 3.5: Một số tín hiệu quan trọng trên phổ HMBC của chất AA1 46

Hình 3.6: Công thức cấu tạo của chất AA1 (Sarsasapogenin) 47

Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của chất AA2 47

Hình 3.8: Phổ 13C NMR của chất AA2 49

Hình 3.9: Công thức cấu tạo của AA2 (sarsasapogenone) 51

Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của chất AA3 51

Hình 3.12: Phổ HMBC của chất AA3 54

Hình 3.13: Một số tín hiệu quan trọng trên phổ HMBC của chất AA3 54

Hình 3.14: Công thức cấu tạo của AA3 (marcogenin) 55

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và các hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Từ xa xưa con người đã khám phá sức mạnh của thiên nhiên và biết sử dụng nhiều loại thực vật nhằm mục đích chữa bệnh, đồng thời tránh được một số tác nhân có hại cho sức khỏe con người

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo thống kê sơ bộ, ở Việt

Nam hiện có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo, trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc

Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu Việt Nam cho thấy nguồn dược liệu

ở nước ta rất phong phú với 3948 loài thực vật và nấm lớn có công dụng làm thuốc, trong đó 90 % là cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng Nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới trên 20.000 tấn mỗi năm Với nguồn thực vật phong phú như vậy thì hóa học hợp chất thiên nhiên

đã và đang phát triển rất mạnh ở nước ta

Thực vật họ Thùa (Agavaceae) thường mọc hoang và được trồng phổ biến ở Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc Ở Việt Nam thường được trồng ở

vùng núi phía Bắc (Thái Nguyên, Bắc Kạn, Tuyên Quang, )

Họ thực vật này đã được sử dụng từ lâu để chữa một số bệnh như: trị viêm nhiễm, thấp khớp, Nhiều bài thuốc dân gian có sử dụng các loài thực vật họ Thùa để chữa bệnh Trong đó, thực vật Tri mẫu được sử dụng phổ biến nhất Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết và các hợp chất được phân lập ra từ loài Tri mẫu có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, bảo vệ tế bào và làm giảm đường máu

Tuy nhiên, đến nay trong nước có ít các công trình nghiên cứu về loài Tri mẫu Việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này cũng chưa được quan tâm đúng mức, chưa có báo cáo cụ thể nào về thành phần saponin và aglycon

Dó đó chúng tôi đề xuất đề tài: "Nghiên cứu thành phần aglycon của loài

thực vật Tri Mẫu (Anemarrhena asphodeloides)” để giải quyết vấn đề đó

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và xác định cấu trúc aglycon từ loài Tri mẫu (Anemarrhena

asphodeloides Bunge)

Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được

3 Nội dung nghiên cứu

Tổng quan các nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã công bố về loài Tri mẫu

Tiến hành chiết xuất các hợp chất từ loài thực vật này

Tiến hành thủy phân để thu được các aglycon Phân lập và xác định cấu trúc của nó bằng các phương pháp phổ

Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

4 Phương pháp nghiên cứu

- Thu thập mẫu nguyên liệu thực vật

Mẫu thực vật là phần rễ loài Tri mẫu được thu mua ở Viện y học bản địa Việt Nam

- Xây dựng phương pháp chiết xuất các chất có trong thực vật

+ Xác định phương pháp phân tích chính xác, thuận tiện nhất cho quá trình thực hiện

+ Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu và chiết xuất các hợp chất từ loài thực vật trên

+ Xử lý mẫu thực vật và chiết mẫu bằng dung môi khảo sát để lựa chọn dung môi an toàn, phù hợp

- Xây dựng và dự kiến phương pháp để thu được các aglycon từ nguyên liệu đã chọn

+ Trên cơ sở quy trình chiết đã xây dựng được, tiến hành thủy phân mẫu chiết cao tổng số, xử lý dung dịch sau thủy phân và chiết các aglycon bằng các dung môi hữu cơ

+ Sử dụng phương pháp sắc ký cột bằng các dung môi thích hợp để phân lập các aglycon từ dịch chiết thủy phân

+ Xác định cấu trúc hóa học của các aglycon bằng phương pháp phổ

- Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Dự đoán hoạt tính sinh học điển hình của các chất đã phân lập được dựa vào cấu trúc của chúng và tiến hành thử hoạt tính sinh học

5 Dự kiến kết quả đề tài

- Kết quả chiết xuất và phân lập aglycon từ loài Tri mẫu

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất

6 Dự kiến cấu trúc luận văn

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về thực vật họ Thùa (Agavaceae)

Họ Thùa bao gồm khoảng 550-640 loài với khoảng 18-23 chi, phân bố rộng khắp trong khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới

Các loài trong họ Thùa có thể là cây mọng nước hoặc không mọng nước

Lá của chúng có các gân lá song song, lá thường dài và nhọn mũi, thường có gai cứng ở đỉnh, đôi khi có các gai phụ mọc dọc theo mép lá.[3]

Các loài thực vật họ Thùa thường được sử dụng để sản xuất các dạng đồ uống chứa cồn ở khu vực Trung Mỹ như bia pulque và rượu mezcal trong khi các loài khác có giá trị để lấy sợi Chúng rất phổ biến trong khu vực khô cằn, nhiều loài có hoa sặc sỡ.[3]

Loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) mà chúng tôi đang nghiên cứu là loài duy nhất thuộc chi Anemarrhena của họ Thùa (Agavaceae)

1.2 Tổng quan về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)

1.2.1 Tên khoa học

- Tên Khoa học: Anemarrhena asphodeloides Bunge

- Tên tiếng Việt: Tri mẫu

- Tên khác: Rhizoma Anemarrhena, zhimu

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Tri mẫu là cây thảo, sống lâu năm Thân rễ dày, dẹt, mọc ngang bao bọc bởi những phần còn sót lại của gốc lá, màu đỏ hay vàng đỏ, mặt trong màu vàng Lá mọc tụ tập ở gốc thành cụm dày, hình dài, dài 20 - 70 cm, rộng 3 - 6mm, gốc có bẹ to mọc ốp vào nhau, đầu thuôn nhọn, hai mặt nhẵn [1]

Cụm hoa mọc từ giữa túm lá hình bông, hơi cong, cán thẳng và dài 0,5 - 1m; hoa nhỏ, thơm nở vào buổi chiều, bao hoa màu trắng hay tía nhạt, chia 6 thùy dính nhau ở gốc; nhị 3, chỉ nhị rất ngắn; bầu 3 ô, vòi nhụy hình chỉ [1]

Quả nang, hình trứng, nhọn đầu, có cạnh; hạt 1 - 2, hình tam giác, màu đen [1] Mùa hoa: tháng 7 - 8 [1]

Hình 1.3 Vườn cây Tri mẫu 1.2.3 Phân bố trong tự nhiên

Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) là loại thảo dược lâu năm

được trồng hoặc mọc hoang trên sườn núi ở Mãn Châu, Mông Cổ, và miền Bắc của Trung Quốc [8] Ở Việt Nam, loài thực vật này chủ yếu phân bố ở các tỉnh phía bắc như Thái Nguyên, Bắc Kạn, Tuyên Quang,

1.2.4 Công dụng của loài Tri mẫu

Tri mẫu được dùng trị sốt, đái tháo đường, ho đờm thở dốc, ngực nóng khó chịu, ho lao,…

Một số bài thuốc có Tri mẫu:[1]

- Điều trị các triệu chứng sốt cao, co giật, hôn mê trong viêm não Nhật Bản B: Tri mẫu 16g, thạch cao 40g; kim ngân, huyền sâm, sinh địa, mỗi vị 16g; hoàng liên, liên kiều, mỗi vị 12g; cam thảo 4g Sắc uống

- Chữa viêm phổi trẻ em thể phong nhiệt, sốt cao: Tri mẫu 6g, thạch cao 20g, kim ngân hoa 16g, tang bạch bì 8g; hoàng liên, liên kiều, hoàng cầm, mỗi

vị 6g; cam thảo 4g Sắc uống ngày một thang

- Chữa sốt cao, li bì, mê sảng trong bệnh sởi trẻ em: Tri mẫu 8g; huyền sâm, gạo tẻ, mỗi vị 12g; sừng trâu 8g, cam thảo 4g Sắc uống ngày một thang

- Chữa huyết áp cao, nhức đầu, hoa mắt, khó ngủ: Dùng bài Tri bá bát vị hoàn gia giảm nêu trên, thêm thảo quyết minh sao 20g, chi tử 12g

- Chữa nóng âm, háo khát, mồ hôi trộm, ho khan, đái tháo đường: Dùng bài Tri bá bát vị hoàn gia giảm nêu trên, thêm huyền sâm, thiên môn, thiên hoa phấn, mỗi vị 16g

1.3 Ti ̀nh hình nghiên cứu thành phần hóa ho ̣c loài Tri mẫu

1.3.1 Ca ́ c hợp chất glycoside

Năm 1963, Kawasaki và cộng sự [42] đã phân lập được Timosaponin

A-III (1) từ loài Tri mẫu Khi thủy phân saponin này với axit HCl 2N trong

etanol 50% thu được sarsasapogenin, D-galactose và D-glucose Cấu trúc hóa

học của (1) là:

O

O OH OH

O OH OH

O

OH

O H

OH

O

C

H3C

Năm 1992, từ dịch chiết etanol của loài Tri mẫu, Dong và các cộng sự [9]

đã tìm ramột saponin mới là Anemarsaponin B (2) cùng với hai saponin đã biết

là Anemarsaponin A1 (3) và Anemarsaponin A2 (4)

O

O OH O H

O OH

H OH

O

O H

O H

OH

O

C

H3C

O H

OH C

H3

O H

(2)

O OH OH

O OH OH

O

O H

O

OH

O O

(3)

O

O OH OH

O OH OH

O

O H

O H

OH

O O

O H

(4)

Năm 1993, Nakashima và cộng sự [28] đã phân lập được một glycoside

mới là pseudoprototimosaponin AIII (5) từ loài Tri mẫu và được so sánh với chất đã biết là prototimosaponin AIII (6).

CH3

O Glc

(5)

O Glc O

H

(6)

Đến năm 1994, Setsuo và cộng sự [38] đã phân lập được từ rễ của loài

Tri mẫu bốn saponin steroid mới có tên anemarrhena saponin I-IV (7-10) cùng với các saponin đã biết là timosaponin A-III (1), marcogenin diglycoside (11), timosaponin B-II (12) và mangiferin (13) Các saponin thuộc loại glycoside

steroid Cấu trúc của chúng đã được xác định bằng các phương pháp phổ

O OH OH

O

O H

O H

O OH OH

O OH OH

O H

O OH OH

O

O H

O H

OH

CH3O

O H

OH

CH3O

O

O OH OH

O OH OH

O

O H

OH O

O H

OH OH

OH

(13)

Năm 1997, Ma B và các cộng sự [22] đã phân lập được hai saponin

spirostanol mới có tên là anemarsaponin F (14) và G (15) Trên cơ sở phân tích quang phổ, cấu trúc của (14) và (15) được xác định tương ứng là neogitogenin

O O OH

O

O H

O H

OH

O OH O

O H

O

CH3

O O H

O O OH

O

O H

O H

OH

O OH O

O H

O

CH3

O O H

O Gal

Glc

O

O Glc OH

OH H

CH3

(16)

O Gal

Glc

O

O Glc OCH3

OH H

CH3

(17)

Năm 1998, nhóm nghiên cứu này tìm ra ba hợp chất saponin mới là

timosaponin B-IV (18), timosaponin B-V(19), timosaponin B-VI(20) Cả ba

chất này đều ở dạng bột, màu trắng [24]

O

O

C

H3C

H3

O Glc

gal glc glc

O

RO C

H3C

O gal glc glc

glc

CH3

CH3

4 3 2

(19) R=H (20) R=CH3

Cũng trong năm 1998, nhóm nghiên cứu này tiếp tục phân lập thêm một

saponin mới được đặt tên là timosaponin D (21) Hợp chất này cũng ở dạng bột,

màu trắng , nhiệt độ sôi 186 - 190 oC và có thêm nhóm OH ở vị trí số 2 [25]

O O

H

O gal glc

(21)

Năm 1999, nhóm nghiên cứu này tiếp tục phân lập được bốn saponin mới từ phần rễ của loài Tri mẫu bằng sắc ký cột và phương pháp sắc ký HPLC là: timosaponin H1 (22), timosaponin H2 (23), timosaponin I1 (24), timosaponin I2

(25) Bằng các phương pháp phổ, cấu trúc của chúng được xác định như sau [23].

O

O

CH3

O Glc

CH3

CH3

R

glc Xyl

Glc

gal 4 3

2

(22) R=OH, (23) R=OCH3

O

CH3

O Glc

CH3

CH3

R

glc Xyl

Glc

gal 4 3

2

(24) R=OH, (25) R=OCH3

Cũng trong năm 1999, Hong và các cộng sự [11] đã phân lập được hợp

chất saponin steroit từ phần rễ của loài này là xilingsaponin B (26)

Hợp chất (26) là một chất rắn dạng màu trắng, rất dễ tan trong nước,

nhiệt độ sôi 178 - 180 oC Công thức được xác định như sau

O

CH2OH OH O

O O

CH2OH O

O O

O

CH2OH OH O OH

O

O

CH3C

H3

C

(26)

Năm 2006, Kang và các cộng sự [17] đã phân lập được sáu saponin

steroid từ thân rễ của Tri mẫu là timosaponin N (27), timosaponin E1 (16), timosaponin O (28), timosaponin E2 (17), purpureagitosid (29) và

marcogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (30) Trong đó hợp chất (28) và (29) là hợp chất mới và hợp chất (30) được phân lập

lần đầu tiên từ loài Tri mẫu

Sáu hợp chất thu được đều ở dạng bột màu trắng, phản ứng Molisch và phản ứng Liebermann-Burchard cho kết quả dương tính Phản ứng thuốc thử

Ehrlich hiển thị màu đỏ chỉ ra các hợp chất này là saponin furostanol Qua phân tích phổ FAB -MS, 1H NMR và 13C NMR, cấu trúc hóa học của các chất được xác định như dưới đây [17].

O OH

O H

O

OH

O H

O H OH OH

O H

OH

OH

OH

O H

R2O

O OH

OH

CH3

O OH

O OH O H

O H

O O OH O H

O H

OH

(29)

O O

OH O H

O OH OH

O

OH

O H

(30)

Năm 2007, hai saponin mới được Peng và các cộng sự [35] đã tìm ra từ phần rễ khô của loài Tri mẫu Mẫu khô (5,0 kg) được đun hồi lưu với EtOH 70% Phần cặn thu được tiếp tục được chiết trong ete dầu, EAvà BuOH Phần hòa tan BuOH được phân tích bằng phương pháp sắc ký cột, thu được hai hợp

chất là timosaponin IV (31) và timosaponin B IV (32)

O OH O

O OH

O OH OH

O O

CH3

O OH

O OH O O

(32)

Đến năm 2008, Zhang và các cộng sự [52] đã nghiên cứu thành phần dịch chiết của phần rễ loài Tri Mẫu và tìm ra một hợp chất mới được đặt tên là

timosaponin B V (33)

O

O H

O H

O

OH OH

O OH

O H

O

OH OH

CH3

(33)

Năm 2013, Liu và các cộng sự [20] đã phân lập từ loài Tri Mẫu hai

saponin steroid mới có tên anemarnoside A (34) và anemarnoside B (35), cùng với ba hợp chất đã biết là timosaponin J (36), timosaponin B II (12), và timosaponin B (37)

H O

H

O H H

CH3O OH

OH OH OH

Glc

glc

(34) (35)

H O

C

H3 HO

gal glc

(12)

H O

H

H H

Năm 2014, Yuan và cộng sự [50] đã phân lập được các saponin steroid là

timosaponin X (38), timosaponin Y (39), một pregnane glycoside là timopregnane B (40), 25S-timosaponin BII (41), protodesgalactotigonin (42)

và timosaponin BII-a (43) từ rễ của loài Tri mẫu.

O

R1O

H

OR2OH

H

O H H

O O H OH

H

H O H

O H

OH H

O O H OH

H

H O H

O H

OH H

H OH OH

O H OH

H

H O H

OH H

OH

O H OH

H

O H H

OH H

OH

O H O

H

O H

O

O

O H OH

H

OH O

OH

H

H O H

OH

OH

O H OH

H

H O H

OH, cũng có hợp chất mở dị vòng 6 cạnh ở vị trí C số 22

1.3.2 Các hợp chất aglycon

Năm 1999, Liu và các cộng sự đã đưa ra một nghiên cứu về việc xác

định thành phần sarsasapogenin (44) từ loài Tri mẫu bằng phương pháp hệ

thống sắc ký khí (GC) [21] Ngoài ra, cũng có một số tài liệu đề cập đến việc phân lập aglycon này từ loài Tri mẫu và thử nghiệm hoạt tính sinh học như hoạt tính bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ, ức chế tế bào ung thư và hạ đường huyết… [45], [46], [47], [51]

O

CH3C

dẫn xuất trong đó dẫn xuất (48), (49), (53), (54) và (55) có khả năng ức chế

Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe tốt hơn so với sarsasapogenin.

22

Năm 2012, Peng và cộng sự [34] đã tổng hợp 8 hợp chất dạng este ở vị trí cacbon số 3 từ sarsasapogenin bằng các phản ứng este hóa Đồng thời nhóm nghiên cứu này cũng thử khả năng chống lão hóa thông qua sự ức chế của nó

với enzym β-gal Nhận thấy chất (56), (57), (61), (63) có khả năng chống lão

hóa tốt

O O

1.3.3 Các hợp chất phenolic

Trong loài Tri mẫu, ngoài thành phần chính là các saponin và sapogenin thì còn có các hợp chất phenolic, cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu về hợp chất này

Năm 2005, Tsukamoto và các cộng sự [43] đã phân tách từ loài Tri mẫu

ở Nhật Bản bốn hợp chất phenolic: 2,6,4-trihydroxy-4-methoxybenzophenone

(64), 7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman (65), broussonin B (66) và nyasol (cis-hinokiresinol) (67)

OH

OH O

OCH3

O H

O OH

Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Qin [36] đã phân lập được magiferin

(68) và neomagiferin (69) từ lá loài Tri mẫu Magiferin và neomagiferin ở

dạng bột màu vàng

R2

O H

R1O

(68): R1=H, R2=Glu

(69): R1=Glu, R2=Glu

Năm 2009, Youn và các cộng sự [49] đã phân lập được 6 hợp chất

phenolic từ rễ Tri mẫu là 7,4'-dihydroxy homoisoflavonoid (70);

(2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavaone (71) cùng với 4,4'-dihydroxychalcon (72), methylphlorethin (73); 1,3-bis-di-phydroxyphenyl-4-penten-1-one (74) và 2,4'-

2'-O-dihydroxy-4-metoxybenzophenon (75) Trong đó hợp chất (70)-(73) được phân

lập lần đầu tiên từ loài thực vật này

O O

Nhận xét: Các hợp chất phenolic chủ yếu có bộ khung cacbon: C6-C3-C6,

C6-C4-C6, C6-C5-C6 Các dẫn xuất nyasol và isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn

1.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu

1.4.1 Hoạt tính sinh học của các saponin

Như đã trình bày ở trên, trong loài thực vật Tri mẫu, thành phần hóa học chủ yếu là các saponin, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài này cũng định hướng theo tác dụng sinh học của loại hợp chất đó Trong đó, đáng chú ý

hơn cả là tác dụng bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệm, tác dụng ức chế tế bào ung thư và tác dụng hạ đường huyết

1.4.1.1 Tác dụng bảo vệ tế bào và cải thiện trí nhớ

Năm 2005, Liu và các cộng sự [33] nghiên cứu ảnh hưởng của timosaponin đến khả năng cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn

thương là Aβ Aβ có thể gây suy giảm trí nhớ ở chuột một cách trầm trọng, nó

làm hạ thấp hoạt động SOD và khả năng chống oxy hóa cũng như tăng mức độ MDA So sánh giữa những con chuột bình thường với những con chuột được tác động bởi timosaponin thì thấy những con chuột sau khi được xử lí với hợp

chất (12), (16), (36) thì hoạt động SOD và khả năng oxy hóa được nâng cao

đồng thời mức độ MDA giảm Từ đó cho thấy các timosaponin có thể nâng cao đáng kể năng lực trí nhớ ở chuột thí nghiệm

Trong nghiên cứu gần đây nhất năm 2016, Che và các cộng sự [18] cũng

đã chỉ ra khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp chất saponin Các giá trị IC50 (μM) được ghi nhận như sau: hợp chất TA III (1): IC50

= 2.3±0.2, TA1: IC50 = 6.1±2.8, TA IV: IC50 = 4.2±1.2, timosaponin B1: IC50 >

100, hợp chất (12) > 100 Kết quả trên cho thấy khả năng ức chế Aβ42 trên tế

bào N2A-APPswe của các saponin tương đối tốt, nhất là hợp chất (1)

Một nghiên cứu khác của Dong và các cộng sự (2009) đã chỉ ra hợp chất

(1) có khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase (một tác nhân gây bệnh

Alzheimer) để cải thiện trí nhớ Cơ chế của quá trình bảo vệ tế bào não của chất này có thể được giải thích bằng sự chống viêm của nó Nó cũng thể hiện khả

năng ức chế sự truyền dẫn tín hiệu NF-kB trong tế bào BV-2 và trong tế bào

não SK-N-SH trên mô hình chuột thực nghiệm, đây là một trong những thành

tố có ảnh hưởng lớn đến sự mất trí nhớ [7]

Ngoài ra, dịch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu được Jung và các cộng

sự đưa ra kết quả nghiên cứu về khả năng bảo vệ tế bào não vào năm 2007 [32]

Sự thiếu máu cục bộ xảy ra khi bị tắc ở động mạch não phải Dịch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu ức chế đáng kể sự xâm nhập bạch cầu của các

mô não thiếu máu cục bộ, điều này được xác định dựa trên hoạt động của enzym MPO MPO đã giảm đáng kể khi dùng dịch chiết từ loài Tri mẫu trong vùng thể vân và vỏ não Những phát hiện này đóng một vai trò rất quan trọng trong việc điều trị chấn thương não do thiếu máu cục bộ gây ra, và dự đoán loài Tri mẫu có thể là một loại thảo dược chính được sử dụng để bảo vệ tế bào não sau khi bị tổn thương do thiếu máu cục bộ [32]

1.4.1.2 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Năm 2001, Takeda và các cộng sự [41] đã đưa ra một nghiên cứu quan trọng và đáng chú ý về khả năng ức chế sự tăng trưởng và kích thích sự chết của tế bào tự hủy từ loại thảo dược Tri mẫu ở các dòng tế bào ung thư dạ dày Sau khi kết thúc quá trình nghiên cứu, họ kết luận rằng loài Tri Mẫu có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 và Kato-III và có thể gây

ra quá trình tự chết của tế bào này

Đến năm 2008, Che và các cộng sự [40] đã chỉ ra hợp chất (1) có tiềm năng

là một tác nhân chống ung thư HeLa Bên cạnh đó chất này cũng thể hiện khả năng ức chế nhiều tế bào ung thư như: ung thư biểu bì (SUNE-1), ung thư gan (HepG2), ung thư vú (MCF-7) với các giá trị IC50 dao động từ 8.5 - 10.1 (μmol/l)

1.4.1.3 Tác dụng hạ đường huyết

Một chế phẩm cổ truyền được bào chế từ thân rễ Tri mẫu được thử nghiệm trên chuột nhắt KK-Ay (chuột mắc một típ đái tháo đường không phụ thuộc insulin) Chế phẩm này (1700 mg/kg), làm giảm đường máu ở chuột nhắt KK-Ay từ 557 ± 17 xuống 383 ± 36 (mg/1000 ml) trong vòng 7h sau khi cho uống một liều thuốc (P < 0,001) Thuốc cũng làm giảm đường máu và làm tăng

sự dung nạp glucose trong vòng 5 tuần sau khi cho uống những lều lặp lại trên chuột nhắt KK - Ay [1]

Năm 2004, Hoa và các cộng sự đã chứng minh dịch chiết ethanol của Tri mẫu có tác dụng kích thích sự tiết insulin của đảo tụy ở chuột bình thường và chuột

đái tháo đường ở nồng độ 2,4 và 8 (mg/ml) [10]

1.4.1.4 Một số hoạt tính sinh học khác

Các hợp chất saponin được phân lập từ các dịch chiết ethanol và dịch chiết nước từ phần rễ Tri mẫu có khả năng chống enteroviruts 71(EV71) gây bệnh tay chân miệng, điều này được đưa ra trong nghiên cứu của Liu và cộng

sự năm 2014 Trong số các saponin, hợp chất timosaponin B-II (12) có chỉ số

IC50 (4,3 ± 2,1 mM, SI = 92,9), chất đối chứng là ribavirin (IC50 = 361,7 ± 104,6

mM, SI = 2,4) So sánh 2 hợp chất này thì thấy hợp chất (12) có SI cao hơn gấp

40 lần so với chất đối chứng [19]

Trong báo cáo của Meng và các cộng sự [16] được công bố năm 2000

cho thấy timosaponin E1 (16) và E2 (17) được phân lập từ loài Tri Mẫu có tác

dụng chống oxi hóa, gây ảnh hưởng đến gốc superoxide trong bạch cầu của

con người Hợp chất (16) và (17) ức chế đáng kể

N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) - tác nhân gây ra gốc superoxide Ngoài ra, protein tyrosine kinase tham gia vào gốc superoxide cũng giảm đáng kể trong bạch cầu

của con người khi dùng hợp chất (16), (17)

Anemarsaponin B (ASB) (2) thể hiện khả năng chống viêm tiềm tàng

Kết quả nghiên cứu cho thấy tác dụng chống viêm của ASB trong LPS ở đại

thực bào RAW 264,7 có sự liên kết với sự ức chế hoạt động của enzym NF- kB thông qua con đường kích hoạt p38 MAP.[15]

Ngoài ra, các saponin của loài Tri mẫu điều trị hiệu quả sự loãng xương

ở chuột thông qua sự hình thành xương nhưng không ức chế sự tái hấp thu xương [31] và còn có tác dụng chống oxi hóa.[48]

1.4.2 Hoạt tính sinh học của các aglycon

Trong loài Tri mẫu có nhiều khung aglycon, nhưng aglycon sarsasapogenin

(44) là khung cơ bản nhất của loài thực vật này Đến nay chỉ có một số công trình

phân lập aglycon này để nghiên cứu hoạt tính sinh học Hoạt tính sinh học điển

hình nhất của khung aglycon này là khả năng bảo vệ tế bào não để nâng cao khả năng trí nhớ và ức chế tế bào ung thư

1.4.2.1 Tác dụng bảo vệ tế bào

Năm 2005, Hu và các cộng sự [13] đã thử khả năng nâng cao trí nhớ của khung aglycon này trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương là

amyloid β-peptide, kết quả cho thấy nhóm thực nghiệm với chất này có thể cải

thiện khả năng nhớ và học tập, với nhóm đối chứng là tacrin

Năm 2010, cũng nhóm nghiên cứu này đã chứng minh sự ảnh hưởng của aglycon này đến vai trò của phần kết nối vòng AMP (CREB) đối với độ dầy đặc của thụ thể M1 trên tế bào CHOm1 trong quá trình trình già đi, nó có khả năng nâng cao độ dầy đặc của thụ thể M1 tốt cho các CREB và phosphor-CREB để chống lại quá trình lão hóa [12]

Năm 2011, Wang và các cộng sự [45] đã chứng minh sự ảnh hưởng của sarsasapogenin đến sự phát triển theo hình cây của tế bào thần kinh vỏ não, kết quả cho thấy chất này có khả năng làm tăng sự phát triển của các tế bào thần kinh hình cây trên vỏ não với các nồng độ khác nhau thông qua con đường kích thích PI3K/Akt/mTOR Điều này rất tốt cho việc bảo vệ tế bào

và kích thích sự ghi nhớ

Đến năm 2012, Yue [51] và cộng sự đã nghiên cứu thực nghiệm và chứng minh rằng sarsasapogenin có thể bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não bởi sự tác động gây tổn thương của axit glutamic, kết quả cũng cho thấy chất này có khả năng bảo vệ tế bào này thông qua con đường kích hoạt sự truyền dẫn thông tin của

PI3K/Akt/mTOR và làm tăng hoạt tính của protein caspase-3 và μ-calpain

Trong nghiên cứu gần đây nhất năm 2016, Che và các cộng sự [18] cũng

đã chỉ ra khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp chất aglycon Các giá trị IC50 (μM) được ghi nhận như sau: hợp chất sarsasapogenin

(44): IC50 = 53.0±9.0; các hợp chất được bán tổng hợp từ (44) là (48), (49), (53), (54), (55) có giá trị IC50 lần lượt là: 6.5±2.1, 27.0±8.0, 7.2±2.2, 9.3±3.5, 7.3±4.0 Còn các hợp chất aglycon khác như: tigogenin, smilagenin… có giá trị

IC50 > 100 Kết quả trên cho thấy khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào APPswe của các aglycon tương đối tốt, nhất là các dẫn xuất được bán tổng hợp

N2A-từ chất sarsasapogenin

1.4.2.2 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Năm 2005, Trouillas và cộng sự đã chứng minh khả năng ức chế tế bào ung thư xương người 1547 của aglycon sarsasapogenin thông qua việc gây ra sự chết của tế bào này dựa vào chu trình khép kín của tế bào trong pha G2/M [44]

Năm 2008, Ni và cộng sự [30] chứng minh vai trò cần cho sự sống trong việc gây chết tế bào ung thư HepG2 và HeLa Kết quả cho thấy rằng, sarsasapogenin thúc đẩy phản ứng oxy hóa (ROS) ti thể xảy ra sớm giúp kích hoạt quá trình tự chết của tế bào và cytochrome C được giải phóng nhiều hơn, từ đó bước đầu kết luận sarsasapogenin có khả năng gây ra quá trình tự chết tế bào HepG2 Bao và cộng sự [5] cũng đã chỉ ra sự phụ thuộc của nồng độ và thời gian vào khả năng sống được của tế bào HepG2

Năm 2013, Shen và cộng sự [39] đã cho rằng sarsasapogenin có thể ức

chế khối u trong các thực nghiệm in vitro, và cũng có thể ức chế tế bào ung thư

HeLa gây ra bởi các quá trình oxi hóa stress

1.4.2.3 Một số hoạt tính sinh học khác

Mục đích nghiên cứu của Wu và các cộng sự [37] đưa ra vào năm 2006

là để tìm ra những ảnh hưởng của sarsasapogenin được phân lập từ loài Tri mẫu đến hoạt động chống trầm cảm ở chuột trong bài kiểm tra có tên là mô hình bơi cưỡng bức (the forced swimming) Bộ dụng cụ là một bình hình trụ được làm bằng polycarbonate (cao 25cm, đường kính 10 cm), nước (24oC) được cho vào bình đến mức 15cm Chuột thí nghiệm được cho uống sarsasapogenin 60 phút trước khi làm thí nghiệm Chuột được đặt vào bình và thử nghiệm trong 6 phút Cho chuột bơi tự do trong 2 phút đầu và từ phút thứ

3, thời gian bất động của chuột được ghi nhận

Kết quả cho thấy khi dùng sarsasapogenin với liều 12.5, 25 và 50 mg/ kg thì giảm thời gian bất động tương ứng với kết quả là 26,6% (P< 0,05), 32,7%

(p< 0,05) và 48,7% (p<0,01) Nghiên cứu này chỉ ra khả năng chống trầm cảm tiềm năng của sarsasapogenin từ loài Tri Mẫu dựa vào các dẫn chứng về tâm lí, dược lý, hóa học và các tài liệu về thần kinh

Ngoài ra, sarsasapogenin còn có tác dụng hạ sốt Phân đoạn saponin từ thân rễ tri mẫu và sản phẩm thủy phân sarsasapogenin cũng như dẫn chất hemisucinyl đều có tác dụng ức chế mạnh trên Na+/K+-ATPase và làm giảm lượng oxy thu nhận trong gan được xử lý với thyroxin Tác dụng ức chế của dẫn chất hemisucinyl còn mạnh hơn cả tác dụng của ouabain Sarsasapogenin cũng ức chế Na+/K+-ATPase của hồng cầu người Tác dụng ức chế chậm và có thể tăng lên do ion natri từ bên ngoài và đối kháng bởi ion rubidi từ bên ngoài Tác dụng ức chế trên ATPase có thể có liên quan với tác dụng hạ sốt của sarsasapogenin [1]

Kết luận: Như vậy, các chất được phân lập từ loài tri mẫu có rất nhiều

hoạt tính quan trọng và thiết thực, trong đó timosaponin A-III và aglycon sarsasapogenin được nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là tác dụng bảo vệ tế bào não, chống tế bào ung thư và hạ đường huyết