Nghiên cứu tạo hạt nano polymer bọc alpha mangostin và bước đầu đánh giá hoạt tính kháng ung thư in virtro của hạt tạo được

Ứng dụng công nghệ nano vào y học bằng cách dùng các dạng vật liệu ở kích thước nano để tương tác với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở cấp phân tử, ví dụ dẫn th

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-***** -

NGUYỄN TRUNG HỢP

“NGHIÊN CỨU TẠO HẠT NANO POLYMER BỌC ALPHA- MANGOSTIN VÀ BƯỚC ĐẦU

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN

VITRO CỦA HẠT TẠO ĐƯỢC’’

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THỊ MAI PHƯƠNG

HÀ NỘI - 2017

1

LỜI CẢM ƠN

- Trong quá trình thực hiện luận văn khoa học, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, khích lệ và động viên của các Thầy, Cô giáo, các bạn đồng nghiệp, bạn bè và những người thân trong gia đình Qua đây, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình đến những cá nhân và tập thể đã hết lòng giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể tìm hiểu, nâng cao kiến thức trong suốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện bản luận văn này

Tôi xin cảm ơn Đảng ủy, lãnh đạo, chỉ huy và cán bộ phòng Kỹ thuật hình sự - Công an thành phố Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian tôi đi học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân và đồng nghiệp - những người đã luôn luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Trung Hợp

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

2

AMG Alpha – magostin

DLS Dynamic light scattering

EPS Exopolysaccharide

FESEM Field emission scanning electron microscopy

HPLC High performance liquid chromatography

NMR Nuclear magnetic resonance

TLC Thin layer chromatography

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s media

FBS Fetal Bovine Serum

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 8

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Bệnh học ung thư 9

1.1.1 Các giai đoạn phát triển của bệnh ung thư 10

1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư 11

1.1.3 Các liệu pháp điều trị ung thư 11

1.1.4 Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và Việt Nam 13

1.2 Công nghệ nano và ứng dụng 15

1.2.1 Hệ dẫn thuốc cấu trúc nano 16

1.2.2 Đặc điểm của hạt nano 17

1.2.3 Nghiên cứu về vật liệu nano phục vụ y học tại Viêt Nam 18

1.3 Khái quát về β-cyclodextrin 19

1.3.1 Cấu trúc của β-cyclodextrin 19

1.3.2 Tính chất của β-cyclodextrin 20

1.3.3 Ứng dụng của β-cyclodextrin 22

1.4 Alpha-mangostin, chất kháng ung thư tiềm năng từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) 23

1.4.1 Đặc điểm sinh học 23

1.4.2 Các chất xathone trong măng cụt 24

1.4.3 Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt 25

1.4.4 Alpha- mangostin từ vỏ của quả măng cụt (Garcinia mangostana L) 27

1.5 Ý tưởng nghiên cứu của đề tài 28

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi 29

2.2 Nguyên liệu thực vật 30

2.3 Hóa chất, thiết bị 30

2.3.1 Hóa chất 30

2.3.2 Thiết bị 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

4

2.4.1 Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt 31

2.4.2 Tạo hạt nano polyme micelle bọc AMG (nanomangostin) và đánh giá các đặc trưng của hạt 32

2.5 Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549 33

2.6 Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào 34

2.7 Đánh giá ảnh hưởng của NMG đến kích thước nhân tế bào 34

2.8 Xử lý thống kê 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nghiên cứu quy trình tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt 34

3.1.1 Tách chiết phân đoạn có chứa AMG từ vỏ quả măng cụt 34

3.1.2 Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt 37

3.2 Chế tạo hạt nano polymer bọc mangostin (nanomangostin)-NMG 46

3.2.1 Tổng hợp hạt NMG 46

3.2.2 Tối ưu hóa các thông số tạo hạt NMG 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

KẾT LUẬN 56

ĐỀ NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Tài liệu tiếng Việt 57

Tài liệu tiếng Anh 58

Nguồn trích dẫn URL 61

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 62

PHỤ LỤC 64

và n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng 37 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phương pháp sắc

Hình 3.3 Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả

măng cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1) 39 Hình 3.4 A Sắc ký đồ AMG tinh sạch từ vỏ quả măng cụt với hệ dung

Hình 3.4 B Sắc ký đồ AMG tinh sạch từ vỏ quả măng cụt với hệ dung

Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC của chất tinh sạch sau khi qua các cột sắc

ký silicagel đo trên máy Hitachi – DAD L2455

40

Hình 3.14 Hoạt tính gây độc tế bào của NMG tan trong nước lên

dòng tế bào ung thư A549

8

MỞ ĐẦU

Theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 200.000 người mắc bệnh ung thư mới và khoảng 75.000 - 100.000 người tử vong vì căn bệnh này Công bố của tổ chức Y tế thế giới (WHO) 4/2014 cho thấy Việt Nam thuộc thuộc nhóm thứ hai các quốc gia dẫn đầu về tỉ lệ mắc bệnh này Phần lớn các bệnh nhân ung thư ở Việt Nam (khoảng 70%) chỉ đến bệnh viện điều trị khi đã quá muộn, khiến cho cơ hội chữa khỏi bệnh rất thấp Theo thống kê, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư ở Việt Nam là 35% Ung thư đang

-là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở Việt Nam và thực sự -là mối quan tâm của cả quốc gia

Hiện nay, các loại thuốc điều trị ung thư thường không mang lại hiệu quả mong muốn do một số nguyên nhân như tính hướng đích đặc hiệu chưa cao và hiệu quả thâm nhập khối u kém vì khả năng hòa tan của thuốc thấp Đặc biệt, những thuốc tự nhiên đang được sử dụng hiện nay trong điều trị ung thư như paclitaxel, doxorubixin, curcumin, có tính tan rất kém (ví dụ curcumin chỉ đạt 0,001%), vì thế khả năng xâm nhập khối u cũng như điều trị bệnh rất hạn chế Ứng dụng công nghệ nano vào y học bằng cách dùng các dạng vật liệu

ở kích thước nano để tương tác với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở cấp phân tử, ví dụ dẫn thuốc đến các tế bào bệnh và chẩn đoán bệnh ở mức phân tử đã được chứng minh là tăng tính sinh khả dụng, hướng đích, giảm liều dùng nhờ khả năng bảo vệ dược chất và giảm thải trừ thuốc trong cơ thể

Măng cụt (Garcinia mangostana L) là thực vật được trồng phổ biến ở các

nước Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam Vỏ quả chứa hàm lượng lớn các chất xanthone (có thể đạt đến 0,2%), là những chất thuộc nhóm phenol, có nhiều đặc tính sinh học quí Alpha-mangostin (AMG) là một dẫn xuất xanthone tự nhiên phổ biến nhất ở vỏ quả măng cụt Chất này đã được chứng

9

minh là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và ức chế sự phát

triển của các dòng tế bào ung thư rất cao Phân tích in vitro cũng khẳng định

chất này ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ruột HT-29 với IC50 khoảng 6–12 μM đồng thời làm giảm sự biểu hiện của BcL-2 DNA β-catenin AMG cảm ứng apoptosis ở các tế bào ung thư đã được nhiều nghiên cứu khẳng định AMG đưa vào cơ thể theo đường uống cũng làm giảm sự phát triển của khối

u ở chuột Các nghiên cứu gần đây của Nguyen và cộng sự [20] cho thấy AMG

có khả năng ức chế có hiệu quả sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây sâu

răng ở người là Streptococcus mutans Ngoài ra, AMG còn có tác dụng ức chế

hoạt tính enzyme HIV-1 protease với nồng độ IC50 là khoảng 5,1 M Vì thế, việc nghiên cứu và ứng dụng chất này đã và đang thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trong suốt hơn một thập kỷ qua Tuy nhiên, cũng giống như curcumin và paclitaxel, khả năng hòa tan chất này trong nước rất thấp (chỉ đạt 0,0002%), do đó đã hạn chế lớn hoạt tính sinh học của nó Cho đến nay, ngoài việc nghiên cứu tổng hợp những dẫn suất mới của nó để tăng cường tính tan và hiệu quả tác dụng thì cũng đã bắt đầu xuất hiện một số nghiên cứu trên thế giới về việc nâng cao tính tan của AMG sử dụng phương pháp tạo hạt nano (nanomangostin) để xử lý các bệnh liên quan đến ung thư Các kết quả thu được là rất khả quan nhưng vẫn cần phải có những nghiên cứu tiếp tục đi sâu hơn nữa nhằm tạo được hệ hạt tối ưu, có tính sinh, khả dụng cao, có khả năng ứng dụng thực tiễn

Đề tài luận văn này nhằm tạo hạt nano polymer bọc mangostin (nanomangostin) để làm tăng tính tan và sinh khả dụng của chất AMG, tạo cơ

sở để ứng dụng chúng trong xử lý các bệnh ung thư

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh học ung thư

10

Ung thư là căn bệnh của tế bào, đơn vị của cơ thể sống Đây là một thuật ngữ để chỉ một nhóm các bệnh liên quan đến việc các tế bào tăng trưởng một cách bất thường, thoát khỏi mọi cơ chế kiểm soát của cơ thể, gây tổn hại đến các tế bào bình thường và cuối cùng khiến cơ thể bị tử vong [14]

Bình thường, các tế bào của cơ thể phát triển, phân chia và chết một cách trật tự theo quy định của cơ thể (gọi là chết theo chương trình - Apoptosis) Khi bị ung thư, tế bào phân chia bất thường, không kiểm soát tạo thành các khối u,

di căn khắp cơ thể gọi là ung thư [12]

Ung thư là vấn đề sức khỏe của con người trên toàn thế giới và là một trong nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn cầu Hiện nay đã phân thành

5 loại ung thư theo nguồn gốc tế bào: i)Ung thư biểu mô Carcinoma: là loại

ung thư phổ biến nhất, chiếm tới 80% tổng số loại ung thư Chúng được sinh ra từ các tế bào biểu mô, là loại tế bào bao phủ các bề mặt của da và cơ quan nội

tạng; ii)Ung thư Sarcoma:là loại ung thư xuất hiện từ những thay đổi trong tế bào của cơ bắp, xương, mỡ, hoặc mô liên kết; iii)Ung thư Leukaemia: là dạng ung thư các tế bào bạch cầu ác tính; iv)Ung thư Lymphoma và Myelmas: là dạng

ung thư của tế bào thuộc hệ thống miễn dịch như hệ bạch huyết, tủy xương;

v)Ung thư hệ thống thần kinh: là dạng ung thư bắt nguồn từ các mô của não và

tủy sống [12]

1.1.1 Các giai đoạn phát triển của bệnh ung thư

-Giai đoạn khởi phát

Bắt đầu từ khi tế bào gốc tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến Quá trình này diễn ra rất nhanh, hoàn thành trong một vài giây và không thay đổi được Trong cuộc đời, con người có rất nhiều tế bào cơ thể trải qua giai đoạn này, nhưng không phải tế bào nào cũng phát sinh bệnh Đa số các tế bào khởi phát hoặc là không tiến triển hoặc là chết đi, hoặc bị hệ miễn dịch của cơ thể vô hiệu hóa

-Giai đoạn tăng trưởng, thúc đẩy, chuyển biển

11

Ở giai đoạn này các tế bào ung thư còn ở mức độ nhỏ, cư trú ở một mô nào đó trong cơ thể

-Giai đoạn lan tràn

Giai đoạn này có thể kéo dài vài tháng hoặc vài năm Các khối u tăng sinh, gia tăng có thể từ 100 đến 1 triệu tế bào Tuy nhiên khối u trong giai đoạn này cón quá nhỏ để phát hiện bằng phương pháp phân tích được

-Giai đoạn tiến triển – xâm lấn – di căn

Giai đoạn này là sự tăng lên kích thước của khối u Đây là giai đoạn khối

u phát triển nhanh Trong giai đoạn này các tế bào ung thư không chỉ phát triển

ở cơ quan đầu tiên xuất hiện, mà còn xâm lấn, di căn sang khác mô, tổ chức khác của cơ thể

1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư

Có rất nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều liên quan đến sự đột biến của các tế bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào này Các tác nhân gây đột biến như hóa chất độc hại, tia phóng xạ, các virus ung thư làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể Đầu tiên tế bào bị mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào Vật liệu di truyền (DNA) của một tế bào bị thay đổi hoặc hư hỏng, làm tăng sinh

vô tổ chức các tế bào “lỗi”- tế bào ung thư Các tế bào ung thư này không chết

đi theo chương trình được lập trình sẵn (apoptosis) như các tế bào bình thường

mà tiếp tục tăng sinh và nhân lên mất kiểm soát tạo thành một khối lớn gọi là khối u Các khối u có khả năng di căn sang các phần khác gọi là u ác tính hay

là ung thư

1.1.3 Các liệu pháp điều trị ung thư

Điều trị ung thư có nhiều phương pháp, tùy thuộc vào từng loại ung thư

mà sử dụng phương pháp cho phù hợp hay kết hợp nhiều phương pháp điều trị cùng một lúc Theo Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI), hiệp hội ung

12

thư Hoa Kỳ (ACS) điều trị ung thư có thể chia thành một số nhóm lớn phương pháp sau [32]:

-Phương pháp phẫu thuật: Phẫu thuật có thể được sử dụng để chuẩn

đoán, điều trị, hoặc thậm chí ngăn ngừa ung thư trong một số trường hợp Hầu hết những người bị ung thư sẽ có một số loại phẫu thuật Đây là phương pháp phổ biến và đem đến cơ hội lớn nhất để chữa bệnh, đặc biệt là nếu ung thư chưa

ở giai đoạn di căn đến các bộ phận khác của cơ thể

-Phương pháp xạ trị: Xạ trị sử dụng các hạt năng lượng cao hoặc sóng để

tiêu diệt tế bào ung thư Nó là một trong những phương pháp điều trị phổ biến nhất đối với một số bệnh ung thư ở dạng không thể phẫu thuật hoặc hóa trị Phương pháp này có thể sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các hình thức điều trị khác

-Phương pháp hóa trị: là sử dụng các loại thuốc để điều trị bệnh ung thư

Hóa trị hoạt động bằng cách ngăn hoặc làm chậm, làm ngưng sự tăng trưởng của tế bào ung thư Hóa trị tiềm ẩn nhiều tác dụng phụ, không chỉ giết chết tế bào ung thư mà còn có thể giết hoặc làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới hoạt động của các tế bào khỏe mạnh

-Phương pháp miễn dịch: Liệu pháp miễn dịch điều trị là sử dụng hệ

thống miễn dịch của cơ thể để chống lại bệnh ung thư Có một số loại liệu pháp miễn dịch, bao gồm các kháng thể đơn dòng (rituximab) và trastuzumab (Herceptin), miễn dịch không đặc hiệu (interferon, interleukins, các cytokine)

và vắc xin ung thư

-Phương pháp hướng đích: là một loại mới hơn của điều trị ung thư, sử

dụng thuốc để tấn công trực tiếp vào các tế bào ung thư, thường là không gây tổn hại đến các tế bào bình thường Liệu pháp này là nền tảng của y học chính xác Liệu pháp này nhằm vào những yếu tố dẫn tới sự thay đổi quan trọng trong các tế bào ung thư bao gồm những yếu tố giúp chúng phát triển, phân chia và lây lan Thuốc của nhóm này chủ yếu là các thuốc phân tử nhỏ và kháng thể

13

đơn dòng Thuốc phân tử nhỏ là đủ nhỏ để dễ xâm nhập vào bên trong tế bào,

vì vậy chúng được sử dụng cho các đích bên trong tế bào Ngược lại, các kháng thể đơn dòng là loại thuốc mà không xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng Thay vào đó, chúng gắn với các mục tiêu cụ thể trên bề mặt ngoài của tế bào ung thư

Hiện nay, trên thế giới có một số hệ nano polymer mang thuốc điều trị ung thư đã và đang được thử nghiệm lâm sàng pha III được sử dụng trong tiêm truyền tĩnh mạch như: Genexol-PM® là một dạng nano polymer methoxypoly (ethylene glycol)-block-poly(D,L-lactic) (mPEG-PDLLA) (dùng trong điều trị ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt) đã và đang được thử nghiệm ở lâm sàng pha II đối với ung thư tuyến tụy Kết quả bước đầu cho thấy, Genexol PM làm tăng hàm lượng paclitaxel trong máu, cho phép xử dụng liều cao hơn dạng paclitaxel tự do [34]; ELIGARD® là một hệ nano polymer dẫn truyền leuprolide acetate dùng để tiêm dưới da trên những bệnh nhân ung thư tuyến tụy và ung thư vú Các kết quả lâm sàng pha III cũng đang được theo dõi [30] Paclitaxel poliglumexvới tên thương mại là Opaxio® đang sử dụng trong điều trị ung thư buồng trứng, ung thư phổi tế bào không nhỏ và ung thư não là một loại thuốc dạng nano được tạo nên từ sự kết hợp các phân tử paclitaxel với các phân tử polymer polyglutamate tan được trong nước cũng đang được thử nghiệm lâm sàng ở pha III [33]

1.1.4 Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và Việt Nam

Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới, với khoảng 14 triệu trường hợp mới vào năm 2012.Số ca bệnh mới sẽ tăng khoảng 70% trong vòng 2 thập kỷ tới.Ung thư đã gây tử vong cho 8,8 triệu người vào năm 2015

ở các nước giàu Trong đó các loại ung thư đại trực tràng, tiền liệt tuyến thường gặp ở các nước giàu Nhưng ở các nước đang phát triển chủ yếu gặp các loại ung thư cổ tử cung, vòm họng, gan, thực quản…Một số loại ung thư thường gặp

xếp theo thứ tự phổ biến như sau: i) Ung thư phổi: (chiếm khoảng 12,4% các loại ung thư); ii) Ung thư dạ dày: ước tính có khoảng 934.000 bệnh nhân loại ung thư này mới mắc hàng năm; iii) Ung thư vú: là loại ung thư thường gặp nhất

ở nữ (chiếm khoảng 23% tổng số các loại ung thư); iv) Ung thư đại trực tràng: chiếm khoảng 9,4% tổng số các loại ung thư; v) Ung thư gan: chiếm khoảng

5,7% tổng số các loại ung thư và có liên quan mật thiết với tiền sử viêm gan virus B và C

Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc và tử vong hàng năm do căn bệnh này rất đáng báo động Theo thống kê, có đến hơn một nửa số bệnh nhân ung thư đi khám đã ở giai đoạn muộn (khoảng 80%) hoặc quá muộn

Tại Việt Nam, các loại bệnh ung thư hiện nay có tỷ lệ mắc và tử vong tùy thuộc vào giới tính Theo đó, ở nam giới 10 căn bệnh ung thư thường hay mắc phải nhất đó là: ung thư phổi, dạ dày, da, đại trực tràng, thực quản, máu, tuyến tiền liệt, khoang miệng Còn ở phụ nữ, 10 loại ung thư có tỷ lệ mắc cao nhất đó là: ung thư vú, ung thư đại trực tràng, phế quản - phổi, cổ tử cung, dạ dày, giáp trạng, gan, buồng trứng, hạch và máu [31]

Tóm lại, từ những dẫn liệu trên có thể thấy rằng tỷ lệ mắc ung thư trên thế giới cũng như ở nước ta ngày một gia tăng Việc nghiên cứu đưa ra các kỹ thuật

và áp dụng các phương pháp điều trị mới, cũng như việc phát hiện sớm, chẩn

15

đoán đúng và tăng cường công tác phòng chống căn bệnh này là rất cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn cao

1.2 Công nghệ nano và ứng dụng

Công nghệ Nano là công nghệ sử dụng kỹ thuật phân tử để xử lý những yếu tố mang tính chất siêu vi mô Nói cách khác, công nghệ nano được coi là công nghệ siêu nhỏ Thậm chí, chúng được sử dụng chỉ với tỷ lệ bằng 1/80.000

so với bề dày của một sợi tóc Công nghệ nano được coi như một bước ngoặt của khoa học kỹ thuật thế giới

Ứng dụng công nghệ nano vào y học bằng cách dùng các dạng vật liệu ở kích thước nano để tương tác với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở cấp phân tử, ví dụ dẫn thuốc đến các tế bào bệnh và chẩn đoán bệnh

ở mức phân tử đã được chứng minh là tăng tính hướng đích, giảm liều dùng nhờ khả năng bảo vệ dược chất và giảm thải trừ thuốc trong cơ thể (Hình 1.1) [8, 16]

Hình 1.1 Các ưu điểm của hệ dẫn thuốc nano [16]

Nhằm kéo dài hiệu lực của thuốc và hạn chế các tác dụng phụ do thuốc gây ra, người ta có nhiều giải pháp khác nhau, trong đó có giải pháp quan trọng

là đưa thuốc vào các chất mang Việc đưa thuốc vào chất mang sẽ cho các ưu

điểm sau: i) Có khả năng vận chuyển chọn lọc đến các tế bào mang bệnh; ii)

16

Tăng thời gian bán thải của thuốc do vậy giảm số lần sử dụng thuốc; iii) Đôi

khi làm xuất hiện những tác dụng sinh học mới so với thuốc ban đầu (Hình 1.2)

Hình 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới hệ dẫn thuốc: vật lý (kích thước, hình thái, phân hủy của polyme), dược động học (tương tác thuốc-chất mang) và

sinh học (hấp phụ protein, tương thích, hướng đích)

1.2.1 Hệ dẫn thuốc cấu trúc nano

Các kết quả của các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy: quá trình vận chuyển thuốc có thể được nâng cao hiệu quả nhờ những chất mang thuốc (drug delivery system) có kích thước nano như polymer cấu trúc nano, micelle, dendrimer, liposome, cấu trúc virut, và ống nano carbon (Hình 1.3) Để đảm bảo an toàn, những chất mang phải có dung lượng thuốc mang lớn, thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn đủ dài và thuốc tập trung được trong

những khu vực có triệu chứng bệnh lý

17

Hình 1.3: Hình ảnh minh họa cấu trúc các loại nano dẫn thuốc

Có rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để phát triển các chất mang dạng keo cho các dược chất, bao gồm polymer cấu trúc nano, micelle, liposome

và nhũ tương lipid nhằm mở rộng các lợi ích của thuốc cho các ứng dụng lâm sàng Mặc dù vậy, nhũ tương lipid và liposome không thể giữ thuốc trong cơ thể trong thời gian dài Ngược lại, hạt micelle và polymer thể hiện là chất mang

có triển vọng hơn trong việc ổn định thuốc [17,28]

1.2.2 Đặc điểm của hạt nano

Để dẫn thuốc đến đích (ví dụ như khối u) hiệu quả thì các hạt nano phải

có khả năng tồn tại trong mạch máu với thời gian tương đối dài mà không bị đào thải Các hạt nano có bề mặt không được biến đổi thường bị bắt giữ bởi hệ lưới nội mô (reticuloendothelial) ở thận và lá lách Mức độ bị bắt giữ phụ thuộc vào kích cỡ và bề mặt của hạt nano Nghĩa là sự phân bố của các hạt nano sau khi tiêm vào cơ thể phụ thuộc vào kích thước và cấu trúc bề mặt của hạt Một trong những ưu điểm của hạt nano là có thể chủ động điều chỉnh kích

cỡ Chúng cần phải đủ lớn để tránh dò rỉ ra ngoài mao mạch nhưng phải đủ nhỏ

để thoát khỏi hoạt động của đại thực bào trong hệ Res ở gan, thận Kích cỡ của vòng huyết quản (sinusoid) trong lá lách và khe (fenestra), trong tế bào Kuffer

ở gan biến đổi từ 150 đến 200 nm và khoảng cách giữa các tế bào của lớp nội

18

mô trong khối u khoảng 100 đến 400 nm Do đó, kích thước hạt nano phải nằm trong khoảng kích cỡ này để có thể tiếp cận khối u

Đặc điểm bề mặt của hạt nano cũng là yếu tố quan trọng xác định tuổi thọ

và sự phân bố của chúng trong hệ tuần hoàn liên quan đến sự bắt giữ của các đại thực bào Hạt nano lý tưởng phải có bề mặt ưa nước để phân tán tốt trong môi trường cơ thể Điều này có thể đáp ứng bằng cách bọc trên bề mặt của hạt nano một lớp polymer ưa nước như PEG (polyethylene glycol), Vitamin E-TPGS, O-carboxylmethyl chitosan, alginat, glucan hoặc BSA (Bovine serum albumin) để bảo vệ chúng khỏi sự opsonine hóa [17]

1.2.3 Nghiên cứu về vật liệu nano phục vụ y học tại Việt Nam

Tại Việt Nam, một số cơ sở nghiên cứu trong nước đã và đang nghiên cứu, ứng dụng thử nghiệm các cấu trúc nano phục vụ điều trị trong y học Có thể kể đến là Viện Khoa học vật liệu, Viện Hóa học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học vật liệu ứng dụng… thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia

Hà Nội; Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh y dược học thuộc Học viện Quân Y [13] Điều này mở ra triển vọng nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ nano cho các nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có khác tại Việt Nam Đặc biệt, gần đây Phạm Hữu Lý và cộng sự (Viện Hoá học) đã sản xuất thành công ở quy mô pilot nanocurcumin từ củ nghệ vàng (sử dụng sóng siêu

âm cao tần biến curcumin thành những phân tử kích thước nano và dùng các polyme thân nước như Poly L- glutamic acid (PLGA) tương thích sinh học để bảo vệ các hạt curcumin, giữ chúng ở kích thước khoảng 100 nm, phân tán tốt trong môi trường nước, hấp thu tới 95% Sản phẩm viên nang mềm CumarGold đã được thử hoạt tính sinh học trên các dòng tế bào ung thư tại Trung tâm ung thư thực nghiệm, Đại học Quốc Gia Hà Nội trước khi được công ty Cổ phần Dược Mỹ phẩm CVI tiếp thị và phân phối đưa ra thị trường

19

Nghiên cứu ứng dụng hạt Nano-Y dược (Redox Nano Particles – RNP) trong điều trị bệnh viêm đại tràng, bệnh ung thư, bệnh tim mạch… cũng đã được nhóm nghiên cứu của Vòng Bính Long, Trường Đại học Khoa học và Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh thục hiện trong thời gian qua

1.3 Khái quát về β-cyclodextrin

1.3.1 Cấu trúc của β-cyclodextrin

β-cyclodextrin là một trong những cyclodextrin thuộc họ oligosaccharide vòng với lỗ hổng trung tâm ưa chất béo và bề mặt ngoài ưu nước Phân tử β-cyclodextrin chứa số lượng hydro cho và nhận tương đối lớn β-cyclodextrin được mô tả đầu tiên bởi Villier vào năm 1891 Các tên khác thường sử dụng là cyclomylose, cyclomalto oligosaccharide, cyclomaltose hoặc Schardinger dextrin

Phân tử β-cyclodextrin chứa bảy đơn vị α-D-glucopyranose được liên kết bằng liên kết α-1,4-glucoside Cấu trúc của phân tử β- cyclodextrin được trình bày ở hình 1.4

Hình 1.4: Hình ảnh minh họa cấu trúc phân tử β-cyclodextrin

Do sự hình thành cấu tạo ghế của các đơn vị glucopyranose, phân tử cyclodextrin có hình dạng giống như hình nón cụt Các nhóm chức hydroxyl định hướng ở mặt ngoài hình nón, trong đó những nhóm hydroxyl bậc một ở rìa hẹp của hình nón và những nhóm hydroxyl bậc hai ở rìa rộng hơn Lỗ hổng trung tâm được bọc bởi khung carbon và nguyên tử oxygen thuộc ether của

β-20

đường Vị trí lỗ hổng hẹp của β-yclodextrin có các nhóm hydroxyl bậc một và được gọi là mặt thứ nhất Ngược lại, vị trí lỗ hổng rộng của β-cyclodextrin có các nhóm hydroxyl bậc hai và được gọi là mặt thứ hai Sự khác nhau giữa các nhóm hydroxyl bậc một và bậc hai cho phép hình thành chức năng chọn lọc trên rìa bậc một và bậc hai Đường kính mặt ngoài của phân tử β-cyclodextrin

là 1,54 nm, đường kính lỗ hổng 0,60- 0,65nm

1.3.2 Tính chất của β-cyclodextrin

1.3.2.1 Tính chất lý-hóa của β-cyclodextrin

β-cyclodextrin ổn định về mặt hóa học trong các dung dịch kiềm, dễ bị thủy phân trong điều kiện acid mạnh Tuy nhiên, β-cyclodextrin có nhiều khả năng chịu được sự thủy phân được xúc tác với acid hơn so với dextrin tuyến tính Sự thủy phân trong acid của β-cyclodextrin được nghiên cứu bởi

Schonberger et al (1988) Liên kết glycoside trong β-cyclodextrin ổn định

giống như liên kết glycoside trong oligosaccharide tuyến tính

β-cyclodextrin có độ hòa tan trong nước thấp hơn nhiều so với dextrin tuyến tính hay nhánh và thấp hơn so với saccharide không vòng Điều này là

do sự liên kết tương đối mạnh của các phân tử β-cyclodextrin ở trạng thái tinh thể (năng lượng mạng tinh thể tương đối cao) Hơn nữa, β-cyclodextrin hình thành liên kết hydro nội phân tử giữa các nhóm hydroxyl bậc hai, chính điều này làm giảm số lượng các nhóm hydroxyl có khả năng hình thành các liên kết hydro với các phân tử nước xung quanh Các lực tương tác này làm ổn định vòng lớn của β-cyclodextrin và là nguyên nhân ngăn ngừa sự hydrate hóa các phân tử nước Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng thì độ tan tăng nhanh Sự thay thế bất kỳ liên kết hydro hình thành nhóm hydroxyl, thậm chí bằng nhóm chứa methoxy ưa chất béo, đưa đến kết quả là cải thiện độ tan trong nước của chúng

1.3.2.2 Độc tính của β-cyclodextrin

Các nghiên cứu độc tính đã chứng minh rằng β-cyclodextrin được phân phối bằng đường uống thực tế là không độc hại Gần đây β-cyclodextrin được

β-cyclodextrin có khả năng bao các phân tử khách vào trong lỗ hổng của

nó Bởi vì các nhóm hydroxyl trên phân tử β-cyclodextrin ở cả hai mặt sắp xếp

ở mặt ngoài của lỗ hổng và mặt trong của lỗ hổng là môi trường rất nhỏ kỵ nước, β-cyclodextrin có thể bắt lấy các phân tử khách kỵ nước thích hợp vào lỗ hổng kỵ nước trong môi trường nước

Trong các phức này, phân tử khách được giữ trong lỗ hổng của cyclodextrin Sự hình thành phức là sự phù hợp không gian giữa lỗ hổng của chủ thể và phân tử khách thể Lỗ hổng ưa chất béo của β-cyclodextrin cung cấp một môi trường rất nhỏ mà một phần ưa chất béo có thể đi vào để tạo thành phức chất thành phần lồng nhau Không có liên kết cộng hóa trị bị phá vỡ hoặc được hình thành trong quá trình tạo phức Động lực chính đối với quá trình tạo phức là sự thay thế của các phân tử nước giàu enthalpy chứa trong lỗ hổng với

β-sự có mặt phân tử khách kỵ nước trong dung dịch để đạt β-sự kết hợp liên hợp không cực- không cực và làm giảm sự căng vòng β-cyclodextrin đưa đến kết quả trạng thái năng lượng ổn định thấp hơn, liên kết hydrogen, tương tác Vander Waals, tương tác tĩnh điện,…Liên kết của các phân tử khách với β-cyclodextrin chủ không phải là vĩnh viễn và được đặc trưng bằng trạng thái cân bằng động, độ mạnh liên kết phụ thuộc vào phức chủ thể- khách thể phù hợp với nhau và trên các tương tác cục bộ đặc biệt giữa các nguyên tử trên bề mặt Phức có thể được hình thành cả trong dung dịch hoặc trong trạng thái tinh thể

1.3.3 Ứng dụng của β-cyclodextrin

β-cyclodextrin được sử dụng trong nhiều nghiên cứu vì kích thước lỗ hổng của nó (0,60-0,65 nm) lớn hơn và ít độc hơn so với các cyclodextrin tự nhiên khác β-cyclodextrin làm tăng sự dẫn truyền thuốc cục bộ khi có mặt của nước

Vì vậy, β-cyclodextrin có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, chuyển hóa sinh học, đóng gói và ngành công nghiệp dệt Trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc, nhờ vào khả năng hình thành phức với nhiều phân tử thuốc khác nhau mà β-cyclodextrin và các dẫn xuất của nó được ứng dụng rộng rãi trong dẫn truyền thuốc Sự tương thích không gian của β-cyclodextrin làm cho nó có khả năng bao lấy các phân tử lạ khác nhau tương thích với kích thước lỗ hổng của nó

β-cyclodextrin cũng có thể tăng cường sinh khả dụng của thuốc bằng cách ổn định các phân tử thuốc ở bề mặt màng sinh học Ví dụ, cyclodextrin làm tăng sinh khả dụng của insulin sau khi phân phối thuốc nhỏ mũi một phần là do hiệu quả ổn định này Nói chung, độ ổn định của thuốc liên kết với phức β-cyclodextrin chỉ đóng một vai trò rất nhỏ khi nói đến dẫn truyền thuốc qua

23

màng sinh học Đây là hiệu quả ổn định mà thường liên quan để cải thiện tính dẫn truyền thuốc Tuy nhiên, vì β-cyclodextrin có thể nâng cao và cản trở sự dẫn truyền thuốc qua màng sinh học, điều này vô cùng quan trọng để tối ưu hóa

sự hình thành công thức β-cyclodextrin chứa thuốc liên quan đến việc dẫn truyền thuốc từ các công thức

β-cyclodextrin làm tăng độ hòa tan của các thuốc ít tan và có khả năng

làm tăng sự hấp thu của thuốc tạo phức trong hệ thống in vivo Bên cạnh đó,

việc cải thiện sinh khả dụng của thuốc là đo độ hòa tan thuốc tăng lên, cải thiện

tỷ lệ và phạm vi phân hủy, khả năng ổn định của thuốc ở vị trí hấp thu vùng dạ dầy- ruột hoặc giảm bớt sự kích thích do thuốc gây ra và giấu mùi

1.4 Alpha-mangostin, chất kháng ung thư tiềm năng từ vỏ quả măng cụt

(Garcinia mangostana L.)

1.4.1 Đặc điểm sinh học

Măng cụt có tên khoa học là

Garcinia mangostana L

thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae)

Măng cụt là loại cây gỗ to,

có thể cao tới 20 m, lá dày,

màu lục sẫm, hình thuôn dài 15-20cm,

rộng 7-10 cm Quả măng cụt hình cầu, to

bằng quả cam trung bình, vỏ ngoài màu đỏ sẫm, dày, phía dưới có lá dài, phía đỉnh có đầu nhụy Trong quả có từ 6 đến 18 hạt, quanh hạt có áo hạt ăn được (Hình 1.4 ) Măng cụt được trồng rộng rãi ở Nam Bộ Ở nhiều nước như Malaysia,Indonesia, Philipine và Campuchia, nước sắc vỏ quả măng cụt thường được dùng để chữa bệnh đi ngoài hay bệnh lỵ [1]

Hình 1.5: Quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)

24

1.4.2 Các chất xathone trong măng cụt

Măng cụt có chứa nhiều chất hóa học khác nhau và thành phần của chúng thay đổi tùy theo từng bộ phận của cây Ví dụ, hàm lượng tannin ở vỏ cây là khoảng 9-13% nhưng ở vỏ quả chỉ khoảng 5,5% Các chất hóa học chính được tìm thấy trong đối tượng này là tannin, chất nhựa (resin), pectin và các dẫn xuất xanthone

Măng cụt là thực vật giàu các chất xanthone nhất được phát hiện cho đến nay Trong số hơn 200 dẫn xuất xanthone được phát hiện ở thực vật thì có đến hơn 60 dẫn xuất được tìm thấy ở măng cụt và tập trung nhiều ở phần vỏ quả Với những tính chất sinh học đặc biệt quý, các chất xanthone, đặc biệt là xanthone từ măng cụt đang được các nhà khoa học hết sức quan tâm Bảng 1 giới thiệu một số xanthone chính có trong vỏ quả măng cụt

Bảng 1.1 Công thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả măng cụt [10]

25

1.4.3 Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt

Các chất xanthone trong cây măng cụt có nhiều đặc tính dược lý và các hoạt tính sinh học quý Chính vì thế, việc tìm thấy các xanthone trong măng cụt được coi là một trong những phát hiện lớn của y học

1.4.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Các xanthone trong măng cụt có tác dụng diệt khuẩn mạnh Hàng loạt các nghiên cứu đã chỉ ra rằng xanthone của măng cụt trong đó có mangostin có khả

năng kháng nấm và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus

kháng methicilin ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) khoảng 0,3 – 1,2 µg/ml, thấp hơn nhiều so với giá trị MIC của chất kháng sinh vancomycin với vi khuẩn này (3,13 – 6,25 µg/ml) [2,10,11,15] Không những thế, AMG của vỏ quả măng cụt còn có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme HIV-1 protease với nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzyme (IC50) là 5,1 µM

1.4.3.2 Hoạt tính kháng nấm

Mangostin của măng cụt có khả năng kháng được một số loài vi khuẩn

gây bệnh ngoài da như Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum

và Epidermophyton floccosum ở nồng độ 1µg/ml, nhưng không có tác dụng trên nấm Candida albicans[10,11] Ngoài ra, một số xanthone tách từ vỏ măng

cụt còn có hoạt tính chống các loại nấm gây bệnh cho lúa mì và các cây nông

nghiệp như Fusarium oxysporum, Alternaria tenuis và Dreschlera oryzae

1.4.3.3 Tác dụng chống oxi hóa

Mangostin trong măng cụt được chứng minh là có khả năng chống oxi hóa, thậm chí còn mạnh hơn gấp nhiều lần so với các vitamin nhóm C và nhóm

E Các nghiên cứu in vitro đã cho thấy mangostin trong măng cụt có tác dụng

làm ức chế sự oxi hóa các lipoprotein có tỷ trọng thấp (low density lipoprotein – LDL) Chúng đóng vai trò như là các chất săn lùng gốc tự do để bảo vệ các

26

LDL khỏi bị tổn thương oxi hóa, vì thế ngăn ngừa được hội chứng xơ vữa động mạch và có tác dụng làm chậm sự lão hóa [10,11]

1.4.3.4 Tác dụng chống viêm (anti-inflamation)

Peres và cộng sự [24] đã chứng minh được γ-mangostin trong măng cụt là chất ức chế mạnh của COX (cyclooxgenase)-2 Enzyme COX-2 là tác nhân gây viêm trong cơ thể người Các enzyme này thường có mặt ở các bệnh nhân bị đau khớp hay bị viêm khớp Các tác giả đã phát hiện thấy chất này làm giảm rõ rệt sự hình thành enzyme COX-2 Hội chứng viêm kinh niên là một trong những căn nguyên hàng đầu dẫn đến bệnh tiểu đường tuýp 2, các chất xanthone có thể giúp ngăn ngừa bệnh này thông qua việc làm giảm và điều hòa lượng đường trong máu, tăng sinh lực cho cơ thể người bệnh

1.4.3.5 Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất xanthone trong măng cụt được đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư khác nhau Sato và cộng sự [26] khi nghiên cứu tác dụng gây apoptosis của 8 dẫn xuất xanthone khác nhau trên tế bào ung thư ưa crôm (pheochromocytoma) ở chuột đã phát hiện thấy các dẫn xuất này đều có tác dụng gây ra hiện tượng apoptosis nhưng AMG có tác dụng mạnh nhất Nhóm nghiên cứu cũng phát hiện thấy garcinone-E có hoạt tính diệt mạnh các tế bào ung thư người thuộc các dòng ung thư dạ dày, phổi và gan Đặc biệt, Matsumoto và cộng sự [18] khi nghiên cứu tác dụng của 6 xanthone khác nhau từ vỏ quả măng cụt lên sự phát triển của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL-60

ở người đã thu được một kết quả hết sức thú vị là tất cả các dẫn xuất xanthone nghiên cứu đều có tác dụng ức chế, trong đó AMG có hoạt tính ức chế hoàn toàn ở nồng độ 10 µM thông qua con đường apoptosis

Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy rằng các dẫn xuất xanthone từ măng cụt có tác dụng ức chế có hiệu quả sự phát triển của nhiều dòng tế bào

27

ung thư người khác nhau và có thể nói các chất này có rất nhiều tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư

1.4.4 Alpha- mangostin từ vỏ của quả măng cụt (Garcinia mangostana L)

AMG là xanthone đầu tiên được phân lập từ quả măng cụt Công thức phân tử là C24H26O6 (M=410,46), công thức cấu tạo được trình bày ở hình 1.5

Hình 1.6 Công thức cấu tạo alpha – mangostin

-Danh pháp quốc tế:

1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis-(3-methyl-2-butenyl)-xanthen-9-one

-Tính chất: Tinh thể màu vàng (từ benzen), nhiệt độ nóng chảy: 181,6-

182,6°C Thực tế không tan trong nước, tan trong alcol, ether, aceton, chloroform, ethyl acetat

Trong số các xanthone, hoạt chất được nghiên cứu sâu, rộng nhất là những mangostin, trong đó có AMG Tác dụng dược lý chính của AMG và dẫn chất của nó gồm có:

- Tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương: AMG tạo ra những phản

ứng ức chế thần kinh trung ương gây các triệu chứng như giảm đau, giảm hoạt động của hệ thần kinh vận động, tăng cường hoạt tính gây ngủ và gây mê

- AMG có hoạt tính chống viêm: Tác dụng này được phát hiện khi dùng

tiêm vào phúc mạc hay khi cho uống với chuột bị gây viêm phù chân bằng carrageenan, hay bằng cách cấy cục bông dưới da AMG cũng có có hoạt tính chống loét dạ dày khi thử trên chuột

- Hoạt tính kháng khuẩn: AMG ức chế Bacillus subtilis ở nồng độ

3,13µg/ml, tác dụng này tăng lên khi kết hợp với vancomycin AMG được phát

28

hiện ức chế vi khuẩn lao Mycosporum tuberculosis với giá trị MIC là 6.25

µg/ml [9,10]

-Hoạt tính chống nấm: AMG kháng được Trichophyton

mentagrophytes, Mycosporum gypseum và Epidermmphyton floccsum ở nồng

độ 1 µg/ml [9,10]

- Hoạt tính chống ung thư: AMG có tác dụng phòng ngừa tiền ung thư

ở ruột già, ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư bạch cầu HL60 của người

ở nồng độ 10µM bằng cách cảm ứng apoptosis (chết theo chương trình)[9,10]

- Tác dụng chống dị ứng: AMG có khả năng chống dị ứng thông qua

việc ức chế sự co của động mạch chủ trên ngực thỏ đã bị histamin và serotonin tác động [9,10]

- Tác dụng ức chế HIV: AMG ức chế HIV-1 protease với nồng độ ức

chế 50% hoạt tính (IC50) là 5,1 g/ml [9,10]

1.5 Ý tưởng nghiên cứu của đề tài

Hóa trị liệu là một trong ba phương pháp phổ biến nhất hiện nay để điều trị ung thư có hiệu quả nhất Đây là liệu pháp sử dụng thuốc hay dược phẩm để tiêu diệt, ngăn chặn hay làm chậm sự phát triển của các tế bào ung thư Tuy nhiên, các loại thuốc điều trị ung thư thường không mang lại hiệu quả mong muốn do một số nguyên nhân như tính hướng đích chưa cao và hiệu quả thâm nhập khối u kém vì khả năng hòa tan của thuốc thấp Do đó, khả năng điều trị bệnh rất hạn chế Để giải quyết vấn đề này, một trong những bước đột phá là sử dụng công nghệ nano để tạo dạng vật liệu có kích thước nano có khả năng tan trong nước, khuyếch tán tốt nên tương tác hiệu quả với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở mức phân tử

Các nghiên cứu đã công bố khẳng định AMG là chất kháng ung thư tiềm năng thông qua việc ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư và cảm ứng apoptosis ở các tế bào này [11,26] Tuy nhiên, cũng giống như curcumin và

29

paclitaxel, khả năng hòa tan chất này trong nước rất thấp (chỉ đạt 0,0002%),

vì thế đã hạn chế lớn hoạt tính sinh học và ứng dụng của nó Cho đến nay, ngoài việc nghiên cứu tổng hợp những dẫn suất mới của nó để tăng cường tính tan và hiệu quả tác dụng thì cũng đã bắt đầu xuất hiện một số nghiên cứu trên thế giới về việc nâng cao tính tan của AMG sử dụng phương pháp tạo hạt nano

để xử lý các bệnh liên quan đến ung thư Vì thế, nghiên cứu của chúng tôi sẽ nhằm mục đích sử dụng công nghệ nano để tạo hạt nanoAMG (nanomangostin) có khả năng phân tán tốt trong nước nhưng vẫn duy trì được hoạt tính sinh học của nó

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi

Dòng tế bào ung thư phổi A549 được mua từ bộ sưu tấp giống của Hoa

Kỳ (American Type Culture Collection- ATCC Manassas, Hoa Kỳ) Tế bào ung thư phổi A549 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung L-

30

glutamine 2 mM, HEPES 10 mM, natri pyruvate 1.0 mM và huyết thanh phôi

bò 10% (FBS; Gibco, Hoa Kỳ) trong tủ ấm ở 37oC chứa CO2 5%

2.2 Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu mua từ tỉnh Bình Dương và được Viện sinh

thái và Tài nguyên vi sinh vật giúp định tên khoa học là Garcinia mangostana

L Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở 60oC, nghiền thành bột mịn và sau

đó được ngâm chiết trong ethanol 96% theo tỉ lệ 1 nguyên liệu: 3 thể tích dung môi Dịch chiết rút sau đó được cô chân không và sử dụng như nguyên liệu khởi đầu cho các bước tinh sạch tiếp theo

2.3 Hóa chất, thiết bị

2.3.1 Hóa chất

-Bản silica gel tráng sẵn (Silicagel 60 F254) được mua từ hãng Mecrk (Đức)

-Hạt Silica gel cho chạy cột sắc ký (Grade 7734, 63-200 μm,

70-230 mesh) được mua từ hãng Mecrk (Đức)

-Alpha, Beta và Hydroxy - β cyclodextrin được mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ) Eudragit RS 100 và RL 100 mua từ hãng Evonik (Singapore)

-Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc từ Trung Quốc

-Môi trường nuôi cấy tế bào (Invitrogen, Hoa Kỳ)

-Tất cả các hoá chất đều đạt độ tinh khiết cho phân tích

31

- Máy đo quang phổ

- Máy đo pH

- Máy soi bản gel sắc ký lớp mỏng

- Box cấy laminare

- Máy quay cất khô chân không

- Máy khuấy từ

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Kính hiển vi đồng tụ quét laser

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt

2.4.1.1 Tách các hợp chất polyphenol bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Việc phân tích được thực hiện trên các bản sắc ký đã được chuẩn bị sẵn

có độ dày 1mm (Silicagel 60 F254, Merck) Các hệ dung môi phân tích được sử

dụng gồm có: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5: 3: 2: 1; ii) n- Hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1 và 2:1; iii) n-Hexane: ethyl acetate

theo tỉ lệ 3:1 Sau khi chạy sắc ký xong, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng Màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặc xông hơi

NH3

2.4.1.2 Sắc ký cột silica gel

Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh Đối với sắc ký cột:

- Pha tĩnh: là chất rắn, thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý,

được nạp nén vào trong một cột có kích thước xác định được tính toán dựa trên lượng mẫu sẽ nạp lên cột

- Pha động: là chất lỏng, được gọi là dung môi rửa giải

Trong thí nghiệm này, phân đoạn chứa chất quan tâm được phân tách trên các cột sắc ký nhồi hạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sử dụng hệ