Nghiên cứu phương pháp xác định một số steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng

Từ những luận giải nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng” được thực hiện với mong muốn đóng góp phần n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

Tổng quan về cây cỏ ngọt………3

1.1 1.1.1 Giới thiệu……… 3

1.1.1.1 Thực vật học ………3

1.1.1.2 Tác dụng.……… ……….4

1.1.1.3 Liều dùng an toàn ở người……….6

1.1.2 Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt……….7

Tổng quan về Steviol glycoside……… 8

1.2 1.2.1 Giới thiệu……… 8

1.2.2 Tính chất vật lý, hóa học………10

1.2.3 Ứng dụng thực tế của Steviol glycosides……… 11

Các phương pháp xác định Steviol glycosides……… ………… 12

1.3 1.3.1 Sắc ký lớp mỏng……….13

1.3.2 Phương pháp quang phổ……….14

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản……… 15

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ………17

1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao UV-Vis/PDA……….19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

Mục tiêu nghiên cứu……….27

2.1 Nội dung nghiên cứu………27

2.2 Đối tượng nghiên cứu……… 27

2.3 Nguyên vật liệu – thiết bị, dụng cụ……… 28 2.4

2.4.1 Nguyên vật liệu……… 28

2.4.2 Thiết bị, dụng cụ………28

Phương pháp nghiên cứu ……… ……….29

2.5 2.5.1 Phương pháp phân tích……… 29

2.5.2 Phương pháp xử lý mẫu……….31

2.5.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp……… 32

2.5.4 Phương pháp xử lý số liệu……….33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

Lựa chọn các điều kiện phân tích sắc ký……… 34

3.1 3.1.1 Khảo sát nồng độ đệm……… 34

3.1.2 Khảo sát pH pha động……… 36

3.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột………38

3.1.4 Điều kiện tối ưu phân tích một số Steviol glycosides bằng HPLC……… 39

Khảo sát điều kiện xử lý mẫu……… 40

3.2 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu………40

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu……… 41

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết mẫu……….42

3.2.4 Khảo sát điều kiện làm sạch qua SPE……… 42

Thẩm định phương pháp……….……….44

3.3 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn……….44

3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp……… 46

3.3.3 Độ lặp lại……… 47

3.3.4 Đánh giá độ thu hồi……… 51

Phân tích mẫu thực tế……… 56

3.4 KẾT LUẬN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 68

hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các quý Thầy, Cô trong Bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi được học tập, nghiên cứu tại đây

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện, TS Vũ Thị Trang và các anh chị đồng nghiệp tại khoa Dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình làm luận văn

Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, tới những người bạn, tới lãnh đạo và các đồng nghiệp khoa Dinh dưỡng và Phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã luôn động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

chấp nhận được

HPTLC High-performance thin-layer

HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký khí khổi phổ

LC-MS Liquid chromatography mass pectrometry Sắc ký lỏng khối phổ

MDL Method detection limit Giới hạn phát hiện phương pháp MQL Method quantification limit Giới hạn định lượng phương pháp

RP-

HPLC

Reverse phase high performance liquid

UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại – Khả kiến

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lá cây cỏ ngọt 3

Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides 8

Hình 1.3: Thành phần chính của Steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a Stevioside; b Rebaudioside A 9

Hình 2.1: Hệ thống thiết bị HPLC-PDA 29

Hình 2.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 31

Hình 3.1: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 5mM 35

Hình 3.2: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 10mM 35

Hình 3.3: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 20mM 35

Hình 3.4: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 50mM 36

Hình 3.5: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở pH = 7 37

Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến độ phân giải của Stevioside và Rebaudioside A 37

Hình 3.7: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 20oC 38

Hình 3.8: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 40oC 38

Hình 3.9: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 60oC 39

Hình 3.10: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycoside ở nhiệt độ cột 79oC 39

Hình 3.11: Hàm lượng của các Steviol glycosides khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau 40

Hình 3.12: Hiệu suất thu hồi (H%) của các Steviol glycosides khi làm sạch trên cột C18 và HLB 43

Hình 3.13: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 44

Hình 3.14: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ RebA 45

Hình 3.15: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ Stevioside 45

Hình 3.16: Kết quả phân tích tổng hàm lượng Steviol glycosides của mẫu cỏ ngọt và

đường ăn kiêng 57 Hình 3.17: Kết quả phân tích tổng hàm lượng Steviol glycosides của mẫu nước giải

khát 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đường

sucrose 9Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm 11Bảng 1.3: Tóm tắt kết quả một số phương pháp xác định Steviol glycosides 23Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian lưu của nhóm chất

Steviol glycosides 37 Bảng 3.2: Hàm lượng của các chất Steviol glycosides (mg/g) thu được với dung

môi chiết khác nhau 41 Bảng 3.3: Hàm lượng của các chất Steviol glycosides ở các nhiệt độ khác nhau 41Bảng 3.4: Hàm lượng Steviol glycosides (mg/g) thu được với thời gian chiết khác

nhau 42 Bảng 3.5: Quy trình làm sạch qua SPE 43Bảng 3.6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các chất Steviol

glycosides 44Bảng 3.7: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Steviol

glycosides 46Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng của

phương pháp (MQL) của các Steviol glycosides 47Bảng 3.9: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu lá cỏ ngọt 48 Bảng 3.10: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu đường ăn

kiêng 49 Bảng 3.11: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu nước ngọt 50 Bảng 3.12: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu lá cỏ ngọt 52 Bảng 3.13: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu đường ăn

kiêng 53 Bảng 3.14: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu nước giải khát 54 Bảng 3.15: Bảng kết quả độ thu hồi so với yêu cầu của AOAC 55

Bảng 3.16: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên nguyên liệu đường cỏ ngọt,

cây cỏ ngọt, đường ăn kiêng 56 Bảng 3.17: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên mẫu trà giảm cân và nước

giải khát 57

cỏ ngọt có nhiều ưu thế và đang được ưa chuộng nhất

Nhóm Steviol glycosides là nhóm hợp chất tạo ngọt tự nhiên thu được từ loài

cỏ ngọt, có mức độ ngọt gấp 75 – 300 lần so với đường kính [13] Đây là loại chất tạo ngọt không sinh năng lượng, có tác dụng trong điều trị bệnh tiểu đường, hạ đường huyết, béo phì, sâu răng, tăng huyết áp, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm Nhiều sản phẩm như kẹo, bánh ngọt, đường cho người ăn kiêng

và các loại nước ngọt đã được sản xuất sử dụng chất tạo ngọt Steviol glycosides Mặc dù đây là các hợp chất thu được từ thiên nhiên, không sinh năng lượng khi tiêu thụ vào cơ thể, nhưng Ủy ban chuyên gia quốc tế về phụ gia thực phẩm (JECFA) vẫn đưa ra mức hấp thụ hàng ngày chấp nhận được đối với các hợp chất này (mức ADI) là 4 mg/kg trọng lượng cơ thể

Hiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều phương pháp phân tích hàm lượng các chất nhóm Steviol glycosides trong thực phẩm, chỉ có một vài nghiên cứu về phân tích và chiết tách các thành phần này trong nguyên liệu thô Do đó, việc xây dựng được một phương pháp phân tích đồng thời các hợp chất này là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tế trong việc cung cấp thông tin cần thiết cho các nhà quản lý và người tiêu dùng để lựa chọn và điều chỉnh hợp lý khẩu phần dinh dưỡng hàng ngày Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng rất phổ biến hiện nay và

phương pháp này cho thấy khả năng tách cao đối với các hợp chất đường cỏ ngọt với nhiều ưu điểm như độ nhạy và độ chính xác cao, hóa chất phổ biến, quy trình

phân tích đơn giản Từ những luận giải nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng” được thực hiện với mong muốn đóng góp phần nhỏ vào việc xây dựng một

quy trình phân tích hiệu quả trong lĩnh vực đánh giá chất lượng sản phẩm thực phẩm với chỉ tiêu là nhóm Steviol glycosides

Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là một loài thực

vật thuộc chi Stevia, thuộc họ hoa hướng dương

(Asteraceae) [40] Cỏ ngọt là cây lâu năm có thân rễ

khoẻ, ít phân nhánh, mọc nông từ 0-30 cm tuỳ

thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm

của đất Cỏ ngọt có dạng thân bụi, chiều cao 50-60

Cây cỏ ngọt có nguồn gốc từ các vùng của Brazil và Paraguay (Nam Mỹ) hiện được trồng ở nhiều nơi trên thế giới để làm chất tạo ngọt và làm thuốc, là nguồn gốc của các sản phẩm làm ngọt được gọi chung là stevia và được bán dưới nhiều tên thương mại khác nhau [11] Các hợp chất hóa học tạo ra vị ngọt của nó là các glycosides steviol khác nhau (chủ yếu là Stevioside và Rebaudioside ), có độ

ngọt gấp 75 lần 300 lần so với đường mía [10] Ngày nay, nhiều nước trên thế giới

đã phát triển việc dùng loại cây này trong đời sống

1.1.1.2 Tác dụng

Đường cỏ ngọt có độ ngọt gấp nhiều lần so với đường mía và có thể được sử dụng thay thế cho đường mía Các hợp chất này khi tiêu hóa không bị phá vỡ cấu trúc hóa học, không chuyển hóa trong cơ thể con người, không tạo ra năng lượng an toàn cho những người cần kiểm soát lượng đường trong máu Điều này có ý nghĩa

vô cùng lớn, đặc biệt là trong bối cảnh của hiện nay, con người đang tìm kiếm những thực phẩm tự nhiên và an toàn đối với sức khỏe do tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường và béo phì tăng cao và mối lo ngại đối với an toàn thực phẩm ngày càng tăng khi các chất làm ngọt hóa học đang được sử dụng rộng rãi [10]

Steviol glycosides được coi là an toàn [13]; tuy nhiên, các nghiên cứu trên động vật cho thấy có một số tác động bất lợi do steviol aglycone [10] Khi sử dụng đường cỏ ngọt ở ngưỡng hàm lượng cao trong thời gian dài có thể ảnh hưởng bất lợi tới sức khỏe Tại nhiều nước trên thế giới, Stevioside được dùng làm chất tạo vị ngọt thay thế các loại đường mía hoặc đường hóa học [2] Cỏ ngọt phơi khô, sấy khô có thể làm trà Bột lá khô có thể trộn với bột làm bánh để thay thế đường

Trong đầu thập niên 1970, người Nhật bắt đầu trồng cây và đưa vào sản xuất công nghiệp để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo như cyclamate hay saccharin Nhật Bản cũng là Quốc gia đầu tiên ở châu Á sử dụng Stevioside như một chất làm ngọt trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Chúng chiếm 40% thị trường chất làm ngọt trong năm 2005 tại đất nước này và là nước tiêu dùng lớn nhất thế giới [13] Cỏ ngọt hiện nay được trồng và tiêu thụ ở nhiều nước châu Á như: Trung Quốc (từ năm 1984), Hàn Quốc, Thái Lan và Malaysia [24] Nó cũng được tìm thấy ở Nam Mỹ và Israel [13] Người dân Trung Quốc xem cỏ ngọt như một dược liệu thiên nhiên rất tốt để giúp làm giảm cân, giúp ăn ngon và tiêu hóa tốt Hiện nay chất tạo ngọt Stevioside đang được sử dụng trong kẹo gum, bánh ngọt và trong các loại nước ngọt như Coca Cola,… Hơn nữa, ở các Quốc gia Châu Á và

Nam Mỹ đường cỏ ngọt được công nhận và được cho phép sử dụng như một chất phụ gia Ngược lại các Quốc gia phương Tây (Anh, Pháp, Hoa Kỳ, Úc Châu, Canada, v.v…) lại chưa công nhận đường cỏ ngọt là chất phụ gia để tạo vị ngọt như các chất aspartame, natri cyclamate mà chỉ được xem là một loại thực phẩm bổ sung

Tại Việt Nam, từ năm 1988, cỏ ngọt đã được nhập và trồng ở nhiều vùng như

Hà Giang, Cao Bằng, Hà Tây, Lâm Đồng Từ năm 1990 Công ty Dược liệu TWI hướng dẫn kỹ thuật trồng trên diện tích sản xuất công nghiệp để cung ứng cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu

Cỏ ngọt không tạo năng lượng nên rất thích hợp để giảm cân Cỏ ngọt không làm bẩn răng, không gây sâu răng, bảo vệ vệ sinh răng miệng và cũng giúp vào việc làm lành các vết thương ngoài da, bổ tim, lợi tiểu, làm giảm huyết áp ở những người huyết áp cao, và đặc biệt nhất là đối với những người bị bệnh tiểu đường, cỏ ngọt giúp tuyến tụy trong việc tiết chất insulin Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cỏ ngọt có thể mang lại lợi ích điều trị chống tăng đường huyết, chống viêm, chống khối u, chống tiêu chảy, lợi tiểuvà tác dụng điều hòa miễn dịch

Một số tác dụng của cây cỏ ngọt đã được đánh giá [14]:

- Hỗ trợ điều trị đau dạ dày: Trong cây cỏ ngọt có khá nhiều hoạt chất giúp giảm các cơn đau và chứng bệnh đường tiêu hóa, đặc biệt là rối loạn dạ dày Do vậy, cây cỏ ngọt chính là một loại thuốc bổ giúp chống lại các bệnh rối loạn dạ dày, giảm đau và tiêu hóa tốt

- Chăm sóc răng miệng: Nhờ chứa nhiều hoạt chất kháng khuẩn mạnh, sử dụng nước cây cỏ ngọt súc miệng thường xuyên giúp ngăn ngừa chảy máu chân răng

ở những người mắc bệnh viêm lợi và giúp chăm sóc tốt hơn cho răng miệng

- Chăm sóc da: cỏ ngọt được xem là một nguyên liệu tự nhiên chăm sóc da khá tốt, có tác dụng giảm tiết bã nhờn, làm giảm các vết nhăn, giúp làn da trở lên sáng trắng hơn, chống viêm da và ngăn ngừa mụn trứng cá

- Chăm sóc tóc: Giúp tóc đẹp, mượt và giảm các vấn đề về gàu và da đầu

- Giải nhiệt, lợi tiểu: Có tác dụng giúp thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu hiệu quả Cây

cỏ ngọt có thể sử dụng kết hợp với các loại nhân trần, cam thảo, trà atiso uống mỗi ngày như nước bình thường, không chỉ giúp thanh nhiệt, giải độc, loại nước này còn có công dụng lợi tiểu hiệu quả

- Trị tiểu đường, béo phì, cao huyết áp: Nghiên cứu trên 40 bệnh nhân cao huyết

áp độ tuổi 50 cho thấy uống chè cỏ ngọt trong một tháng, kết quả huyết áp ổn định hơn, lợi tiểu, người khỏe và hoạt bát hơn Cỏ ngọt và Stevioside có vị ngọt

sẽ làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của người bệnh, vì thế sẽ làm giảm đường huyết Liều dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25 g steviosid (hoặc 2,5 g lá cỏ ngọt), ngày 4 lần, uống trong nhiều ngày Ngoài ra cỏ ngọt và Stevioside còn chữa béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu đường và tinh bột của cơ thể, nên cũng có tác dụng chữa béo phì Liều dùng 0,5 – l g steviosidchiara dùng 3-4 lần trong ngày, uống nhiều ngày Lá cỏ ngọt hoặc Stevioside còn thường dùng làm chất điều vị cho các loại trà thuốc

Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có cỏ ngọt như trà actisô - stevia Trà sâm quy - stevia có sâm, tam thất, đương quy, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và cỏ ngọt Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và cỏ ngọt

1.1.1.3 Liều dùng an toàn ở người

Tính an toàn của steviol glycosides đã được xác nhận trong nhiều nghiên cứu độc tính bao gồm độc tính cấp tính và bán cấp tính, độc tính sinh sản, độc tính di truyền và gây ung thư Do đó, steviol glycosides được coi là an toàn đối với cơ thể người Một số nghiên cứu Nồng độ Stevioside trong một số nước giải khát ở Nhật Bản được ghi nhận là 0,005 - 0,007% Nếu một ngày uống 1 lít nước thì lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 - 0,07 g tương ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt Đây

là liều lượng an toàn, đã được Chính phủ Nhật cho phép Ủy ban chuyên gia quốc tế

về phụ gia thực phẩm (JECFA) đưa ra mức tiêu thụ chấp nhận hàng ngày đối với các hợp chất này, mức ADI là 4 mg/kg trọng lượng cơ thể

1.1.2 Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt

Chất cơ bản tạo nên độ ngọt tự nhiên của loại cây cỏ ngọt là các hợp chất Steviol glycosides, hợp chất này ngọt gấp 300 lần đường mía (saccarose) [13], không lên men, ít năng lượng và có vị rất thơm ngon, những người phải kiêng đường như bệnh nhân tiểu đường có thể sử dụng hợp chất này để thay thế đường trong các bữa ăn hàng ngày Cỏ ngọt thường được thu hái, phơi khô và có thể sử dụng cho mọi lứa tuổi

Thành phần trong lá (tính theo % chất khô) chứa 6,2% protein, 5,6% chất béo, 52,8% carbohydrate, 15% Stevioside và khoảng 42% chất hòa tan trong nước

là các diterpenoid glycosides và gồm có Stevioside (5 – 10%), rebauvioside A (2 – 4%), rebauvioside C (1 – 2%), và dulcoside A (0,5 – 1%), một số hợp chất khác là rebauvioside B, D và E Chất ngọt Stevioside có vị ngọt gấp 300 lần hơn đường mía (saccharose) Stevioside rất ổn định ở nhiệt độ cao 198oC (388 độ F), không bị sạm màu và caramel hóa [11]

Bên cạnh Stevioside, Rebaudioside có hàm lượng ít hơn nhưng ngọt hơn Stevioside 1,2 – 1,5 lần Ngoài ra, trong thành phần cỏ ngọt chứa một hàm lượng thấp các chất: stigmasterol, sitosterol, campesterol, flavonoid, và cosmosiin, caryophyllen, spathuienol Một số khoáng đa lượng và vi lượng được tìm thấy trong cỏ ngọt là Ca, Mg,…Về mặt sinh vật học, sự hiện diện của gibberellin A20 trong cỏ ngọt đã chứng minh steviol có thể chuyển hóa thành gibberillin Phần chiết stevia có tính chất ức chế rotavirus, chống vi khuẩn Helicobacter pylori, được ứng dụng trong điều trị khối u [21] Những flavonoid trong cây (4,75%) có tính chất

chống vi khuẩn Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli Các thí

nghiệm trên chuột cho thấy chất này ức chế sự phát triển ung thư da

Tổng quan về Steviol glycoside

1.2.

1.2.1 Giới thiệu

Steviol glycosides là một nhóm glycoside có nguồn gốc từ cây cỏ ngọt , có thể được sử dụng làm chất làm ngọt Bao gồm tám diterpene glycoside: Stevioside, steviolbioside, Rebaudiosides A, B, C, D và E, và dulcoside A Steviol glycoside trong cỏ ngọt đã được báo cáo là ngọt hơn từ 30 đến 320 lần so với sucrose Chúng

có cấu trúc tương tự nhau steviol aglycon ở C-4 và C-13 liên kết với mono-, di- hoặc trisaccharide: glucose hoặc rhamnose hoặc cả hai [11] Khung cấu trúc của nhóm Steviol glycosides và thành phần chính được thể hiện trong hình 1.2 và 1.3 Cấu trúc bảy chất phân tích trong nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đường sucrose được thể hiện trong bảng 1.1

Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides

a b

Hình 1.3: Thành phần chính của steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a Stevioside;

b Rebaudioside A Bảng 1.1: Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đường

sucrose

Hợp chất Chuỗi R 1 Chuỗi R 2

Độ ngọt so với sucrose

Hợp chất Chuỗi R 1 Chuỗi R 2

Độ ngọt so với sucrose

số thay đổi của Stevioside và Rebaudioside trong đồ uống có ga do bị acid hóa với phosphor và acid citric trong quá trình bảo quản ở 37oC Gia nhiệt ở 60oC trong 6 ngày làm mất 0% - 6% độ ngọt Tiếp xúc ánh sáng mặt trời trong vòng 1 tuần không ảnh hưởng đến Stevioside, nhưng dẫn đến mất 20% Rebaudioside A Nhờ độ ổn định cao, Stevioside là một chất làm ngọt phù hợp cho thực phẩm kể cả nấu chín và cho đồ uống Stevioside còn ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật trong khoang miệng [26]

Trong số các thành phần của cỏ ngọt, Rebaudioside A được đặc biệt quan tâm nhờ hương vị được yêu thích Trong thực tế, Stevioside lại là chất chiếm phần lớn trong nhóm (60-70% tổng hàm lượng glycoside) nhưng có dư vị đắng cùng hương vị cam thảo còn Rebaudioside A chiếm khoảng 30-40% tổng hàm lượng glycoside và không có dư vị đắng (hậu vị cam thảo kéo dài lâu) [26] Nếu Rebaudioside A có hàm lượng bằng Stevioside có thể loại bỏ dư vị đắng của sản phẩm Tác dụng làm ngọt của các chất này hoàn toàn là hương vị, không được tiêu hóa do không xảy ra phản ứng đường phân khi ăn vì cơ thể người không thể chuyển hóa stevia Do đó, các chất này có ít giá trị dinh dưỡng, là chất có thể thay thế đường tự nhiên cho bệnh nhân tiểu đường và những người trong chế độ ăn kiêng kiểm soát carbohydrate [41]

Steviolbioside là chất tạo ngọt có hoạt tính sinh học, rất hiếm trong cây cỏ ngọt Ngoài công dụng là phụ gia thực phẩm tạo ngọt, Steviolbioside còn được sử dụng như chất trung gian sử dụng trong nhiều loại thuốc Steviolbioside có hoạt tính chống bệnh lao Ngoài ra, steviolbioside đã được sử dụng trong các thử nghiệm nghiên cứu điều trị nhiễm HIV-1

1.2.3 Ứng dụng thực tế của Steviol glycosides

Trong thực phẩm, chiết xuất Steviol glycosides chủ yếu được sử dụng làm chất làm ngọt trong sản xuất đồ uống trái cây và sữa, món tráng miệng, sữa chua, bánh kẹo lạnh, sản phẩm hương vị và dưa chua Stevioside và Rebaudioside A có tính ổn định dưới nhiệt độ cao được sử dụng trong chế biến thực phẩm và không bị hóa nâu hoặc caramen khi đun nóng Đối với các sản phẩm có tính acid, các Steviol glycosides này cũng có tính ổn định cao [18,19]

Các hợp chất này được sử dụng như một chất làm ngọt của thực phẩm, có mã hóa quốc tế INS 960 [32], có mức quy định giới hạn sử dụng trong thực phẩm theo thông tư 24/2019/TT-BYT về hướng dẫn quản lý phụ gia trong thực phẩm Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm được thể hiện trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm

Loại thực phẩm Mức sử dụng tối đa (mg/kg)

Đồ uống từ sữa, có hương liệu và/hoặc lên men 200

Các sản phẩm tương tự sữa bột hoặc cream bột 330

Kem lạnh thực phẩm, bao gồm nước hoa quả

Loại thực phẩm Mức sử dụng tối đa (mg/kg)

Đồ uống có cồn hương liệu (bia, vang và đồ

uống có cồn làm lạnh)

200

Một số nghiên cứu độc tính trên động vật đã cho thấy các dữ liệu đầu tiên về tác động bất lợi đến sức khỏe Do đó, các tổ chức quan tâm đến sức khỏe cộng đồng cũng đã đưa ra mức tiêu thụ chấp nhận hàng ngày cho hợp chất Steviol glycosides, mức ADI là 4 mg/kg thể trọng/ngày (cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu – EFSA)

Do đó, cần có phương pháp xác định hàm lượng các chất Steviol glycosides trong nguyên liệu cỏ ngọt cũng như các sản phẩm thực phẩm nhằm đánh giá chất lượng

an toàn thực phẩm, góp phần kiểm soát được mức tiêu thụ của người tiêu dùng

Các phương pháp xác định Steviol glycosides

1.3.

Trên thế giới và tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu được công

bố về các phương pháp xác định các hợp chất tạo ngọt tự nhiên này bao gồm phương pháp quang phổ, phương pháp điện di mao quản và các phương pháp sắc

ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV (PDA) và sắc ký lỏng khối phổ Một số phương pháp phân tích được liệt kê dưới đây là tài liệu tham khảo cho nghiên cứu

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một dạng của sắc ký hấp phụ dạng rắn – lỏng, là

kĩ thuật quan trọng dùng trong phân tích nhanh với lượng mẫu nhỏ Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên một tấm kính, nhựa hoặc nhôm, được phủ một lớp mỏng của vật liệu hấp phụ thường là silica gel, oxit nhôm, hoặc cellulose Sắc ký lớp mỏng đã được phát triển như là một kỹ thuật định tính nhanh chóng và đơn giản Tuy nhiên, với công nghệ hiện đại, TLC có thể cũng là một công cụ của định lượng

Đã có một số công trình nghiên cứu sứ dụng phương pháp TLC scanner để xác định hàm lượng nhóm Steviol glycosides đã được công bố

Vikas Jaitak và các cộng sự [39] đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) để phân tích Steviol glycosides trong cỏ ngọt Bột lá cỏ ngọt khô được chiết với hỗn hợp dung dịch MeOH/H2O (80:20, v/v) trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng và lặp lại ba lần Dung dịch được bay hơi đến khô và chiết phân đoạn với hexane, chloroform, ethyl acetate và butanol Sử dụng Na2SO4 để loại nước và cô ở áp suất thấp tại 50 ± 5oC thu được các chiết xuất hexan (30,0 g), chloroform (10,0 g), ethyl acetate (10,5 g) và butanol (150,2 g) tương ứng Khai triển chuẩn và mẫu được thực hiện trên tấm silicagel 60 F254 (20 cm × 10 cm) có độ dày 0,20 mm và thuốc thử gồm acid acetic: acid sulfuric: ethanol (01:01:10, v/v/v) Phương pháp có độ nhạy và tính đặc hiệu cao Đường chuẩn là tuyến tính trong khoảng 160–960 ng/điểm đối với steviolbioside, 1–6 g/điểm đối với Stevioside và 0,5–3 g/điểm đối với Rebaudioside A với hệ số tương quan tốt (0,998–0,999)

Phương pháp HPTLC được phát triển và xác nhận giá trị sử dụng để phân tích 7 Steviol glycosides trong 6 loại thực phẩm Morlock và cộng sự [28] đã sử dụng dung môi chiết mẫu là methanol Pha động sử dụng trong nghiên cứu là ethyl acetate - acetic acid - methanol (3:1:1, v/v/v) Phương pháp có độ chính xác thông

qua độ thu hồi đạt 92 - 120%, độ lặp lại 3,1 - 5,4% và độ tái lặp 4,0 - 8,4% được xác định đối với Stevioside trong nền sữa Phương pháp HPTLC cho Rebaudioside A được so sánh với kết quả của phương pháp HPLC cho thấy kết quả của hai phương pháp có sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp tách phát triển và cũng đã được nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định một số Steviol glycosides trong một số đối tượng khác nhau Tuy nhiên phương pháp lại tốn kém

và ít được sử dụng ở phòng thí nghiệm của Việt Nam

1.3.2 Phương pháp quang phổ

Mizukami và cộng sự [20] sử dụng enzyme hesperidinase để thủy phân Stevioside tạo ra steviol và glucose Sau đó steviol được đo gián tiếp thông qua việc xác định hàm lượng glucose Hydrogen peroxide được tạo ra bởi phản ứng oxy hóa glucose, sẽ phản ứng với 2, 2’-azino-di- (acid 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) (ABTS) tạo thành sản phẩm oxidized ABTS, được đo phổ hấp thụ phân tử ở bước sóng 600 nm

Trình tự của phản ứng như sau:

Stevioside + 3H2O Steviol + 3Glucose

Glucose + O2 + H2O Gluconic acid + H2O2

H2O2 + ABTS Oxidized ABTS

Quá trình thủy phân enzyme của Stevioside xảy ra trong 2 giờ khi được ủ ở 50oC với 1 mg hesperidinase trong 1,0 mL dung dịch đệm citrat phosphat, pH 4,0 Quá trình thủy phân mất 5 giờ nếu xảy ra ở 40oC và 2 giờ nếu ở 50 oC Do đó, quá trình thủy phân được thực hiện ở 50oC trong 2 giờ Ngược lại, quá trình thủy phân enzyme của Rebaudioside A mất 48 giờ để hoàn thành và 10% Rebaudioside A không thủy phân trong vòng 2 giờ Độ thu hồi trung bình của 40, 50 và 80 µg Stevioside được thêm vào 0,1 mL dịch chiết metanol lá cỏ ngọt chứa 116 µg

Stevioside lần lượt là 95,0; 98,8 và 96,7% Độ lặp lại với RSD% là 1,7% và độ tái lặp thực hiện trong 6 ngày với RSD% là 5,8% cho thấy phương pháp có độ chính xác tốt Kết quả đo các mẫu lá cỏ ngọt bằng phương pháp đo quang và phương pháp TLC cho kết quả có sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Udompaisarn và cộng sự [34] đã xây dựng một phương pháp enzym để xác định hàm lượng Stevioside Β-glucosidase tái tổ hợp BT_3567 (rBT_3567) từ Bacteroides thetaiotaomicron HB-13 có sự thủy phân chọn lọc Stevioside tại liên kết β-1,2-glycosidic để tạo ra rubusoside và glucose Sự kết hợp của enzyme này với glucose oxidase và peroxidase cho phép định lượng hàm lượng Stevioside trong các mẫu Stevia bằng cách sử dụng phương pháp dựa trên phép đo màu Các phản ứng để xác định Stevioside có thể được hoàn thành trong vòng 1 giờ ở 37°C Việc xác định Stevioside bằng cách sử dụng enzyme so với kết quả thu được từ định lượng HPLC (r2

= 0,9629, n = 16) Phần trăm biến thiên hệ số (CV) của các thử nghiệm trong ngày (n = 12) và giữa các ngày (n = 12) thấp hơn 5% và độ chính xác

là 95−105% Phân tích này chứng minh rằng phương pháp enzym được phát triển trong nghiên cứu này là cụ thể, dễ thực hiện, chính xác và mang lại kết quả tốt

Phương pháp quang phổ là một phương pháp phổ biến tại các phòng thí nghiệm trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Tuy nhiên phương pháp lại

có độ nhạy và chọn lọc kém dẫn đến độ chính xác không cao, để phân tích nhóm Steviol glycosides các bước xử lý mẫu phức tạp

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản

Các tác giả J Liu và cộng sự [22] đã dùng kỹ thuật điện di mao quản và HPLC detector UV để tách các Steviol glycosides trong đường cỏ ngọt bao gồm Stevioside, Rebaudioside A, Rebaudioside C và dulcoside Nhóm tác giả tập trung nghiên cứu các điều kiện phân tích bằng kỹ thuật điện di mao quản, kết quả nhận thấy kỹ thuật này đơn giản, có thể tách được 4 hợp chất nghiên cứu Mẫu đường cỏ ngọt chiết trong nước deion và làm sạch qua cột SPE Sử dụng kỹ thuật HPLC để

kiểm chứng lại kết quả nghiên cứu và nhận thấy có sự tương đồng kết quả giữa hai

kỹ thuật sử dụng

Để tách Steviol glycoside trong đồ uống, Vaclav và các cộng sự [37] sử dụng phương pháp điện di mao quản với detector C4

D Phương pháp sử dụng dung dịch

H3BO3 ở nồng độ cao để tạo thành các phức ổn định giữa Steviol glycoside và

H3BO3 Việc phân tách điện di được thực hiện bằng hệ thống HP3D CE-C4D (Agilent Technologies, Waldbronn, Đức) Nhóm Steviol glycoside được tách trên cột mao quản silica với đường kính trong 10 µm, đường kính ngoài 363 µm, tổng chiều dài 31,5 cm (chiều dài hiệu dụng là 18,0 cm) Dung dịch đệm gồm acid boric

170 mM/LiOH, pH 9,0 Việc phân tách được thực hiện với điện áp cao +20 kV; các mẫu được bơm vào mao quản với áp suất 50 mbar trong 100 giây Dung dịch phủ INST với lượng 0,5% v/v, ngăn chặn hiệu quả dòng chuyển động điện, được trộn vào chất điện phân nền để giúp cho quá trình phân tách lẫn nhau của Rebaudioside

A và Stevioside Phương pháp CE với sự ngăn chặn EOF được đặc trưng bởi sự phân tách hoàn toàn của Rebaudioside A và Stevioside Quy trình xử lý mẫu đơn giản: 1 mg mẫu rắn hoàn tan trong 1 mL nước deion Sau đó, mẫu được ly tâm

14100 vòng/phút và lọc qua màng 0,45 µm Dịch lọc được pha loãng với ACN trước khi phân tích CE Độ nhạy cao của C4

D kết hợp với phương pháp xử lý mẫu đảm bảo độ nhạy cao của phương pháp CE với LOD là 0,3 mg/L (0,1 μM) Khoảng tuyến tính của Reaudioside A từ 10-100 mg/L Để hiệu suất của tách CE cao nhất yêu cầu phải sử dụng các mao quản hẹp với đường kính trong khoảng 10 µm Phương pháp có độ nhạy cao với Steviol glycosides, không hấp thụ ở vùng UV, độ nhạy của phương pháp được kiểm soát bởi độ dẫn của dung dịch trong mao quản Thiết bị đơn giản này có thể được sử dụng để đạt được giới hạn phát hiện ở nồng độ thấp

Một phương pháp điện di mao quản đơn giản và độ nhạy cao được phát triển bởi Dacome và cộng sự [16] để định lượng glycosides trong cây đường cỏ ngọt Để tách một số đường cỏ ngọt nhóm tác giả đã sử dụng mao quản silica dài 70 cm và đường kính trong 50 µm cùng đệm tách natri tetraborate 30 mM, pH 10,3 chứa 3

mM -cyclodextrin và 22,5% acetonitril và 15% metanol là chất điều chỉnh độ phân cực của dung môi Khoảng tuyến tính của Rebaudioside-A và Stevioside trong khoảng 2,09 - 5,63 và 1,95-5,15 mg/mL Hệ số tương quan cho cả hai chất lần lượt

là 0,9986 và 0,9974 Nhận thấy rằng dung dịch đệm borat kiềm có thể làm tăng sự ion hóa của nhóm silanol và giúp cho việc cải thiện độ phân giải và rút ngắn thời gian phân tích

Tác giả Mauri và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp điện di mao quản để phân tích một số Steviol glycoside Các phép phân tích được thực hiện trên cột mao quản silica với dung dịch đệm natri tetraborat 20 mM, pH 8,3 và natri dodecyl sulfat

30 mM Các mẫu cỏ ngọt được chiết trong methanol 50% ở nhiệt độ phòng Dung dịch chuẩn Stevioside được pha trong methanol 20%

Phương pháp này với ưu điểm tiết kiệm, lượng hóa chất sử dụng rất ít, có thể phân tích được nhiều nhóm chất khác nhau Tuy nhiên, độ nhạy kém đồng thời tính

ổn định không cao, thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm Do đó, việc tiến hành thực nghiệm yêu cầu kỹ thuật phân tích chuẩn xác trong các điều kiện khắt khe

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Paweł Kubica và cộng sự [30] đã xây dựng và phát triển một phương pháp có thể xác định đồng thời 8 chất đường hóa học là acesulfame-K, saccharine, cyclamate, aspartame, sucralose, alitame, neohesperidin dihydrochalcone, neotame

và 5 chất đường cỏ ngọt (nhóm Steviol glycosides) phổ biến (Rebaudioside A, Rebaudioside C, steviol, steviolbioside và Stevioside) trong đồ uống có cồn và không cồn bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao và kết hợp detector khối phổ (HPLC-ESI-MS/MS) Đây là công trình đầu tiên sử dụng phương pháp HPLC-ESI-MS/MS để xác định đồng thời tất cả các chất có độ ngọt cao của EU (không bao gồm thaumatin) trong một lần phân tích Quá trình xử lý mẫu đơn giản gồm các bước pha loãng và ly tâm Độ thu hồi được tiến hành ở ba nồng độ thử nghiệm, kết quả thu được ở các mức thay đổi từ 97,0 đến 105,7%, với độ lệch chuẩn tương đối

thấp hơn 4,1% Phương pháp đã được áp dụng thành công cho việc xác định chất

làm ngọt trong 24 mẫu đồ uống có cồn và không chứa cồn khác nhau

Tác giả Claudio Gardanaa và cộng sự [15] đã nghiên cứu và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (UHPLC-MS) để đánh giá steviol-glycosides hoặc steviol trong lá cỏ ngọt và chất làm ngọt thương mại Mẫu được chiết xuất bằng methanol, làm sạch bằng SPE và các chất được tách ra bởi hệ thống UHPLC sử dụng cột HSS C18 (150mm × 2,1mm x 1,8 µm) Pha động sử dụng được thêm diclomethan để bổ sung thêm clo làm tăng độ nhạy của phương pháp Giới hạn phát hiện (LOD) cho Stevioside, Rebaudioside A, steviolbioside và steviol lần lượt là 15, 50, 10 và 1 ng/mL Độ thu hồi trong khoảng (89 – 103%), độ chính xác (<4,3%), độ lặp lại (<5,7%) và khoảng tuyến tính (40 - 180 mg/g) Stevioside (5,8 ± 1,3%), Rebaudioside A (1,8 ± 1,2%) và Rebaudioside C (1,3 ± 1,4%) là phổ biến nhất trong nhóm steviol-glycosides được tìm thấy trong các mẫu của lá cỏ ngọt (n = 10) từ miền nam nước Ý Rebaudioside A là thành phần chính của steviol-glycosides tìm thấy trong các mẫu nguyên liệu thương mại (0,84 ± 0,03%) Lượng steviol-glycosides thu được bởi phương pháp UHPLC-MS phù hợp với phương pháp LC-NH2-UV truyền thống Steviol được tìm thấy trong tất cả các mẫu được chiết xuất từ lá (2,7-13,2 mg/kg) nhưng không phát hiện thấy trong mẫu thương mại (<1 µg/kg) Phương pháp UHPLC-MS có thể được áp dụng để kiểm soát chất lượng của lá cỏ ngọt và các sản phẩm thương mại của chúng

Molina-Calle và cộng sự [27] đã phát triển một phương pháp LC-MS/MS để định lượng 8 Steviol glycosides trong chiết xuất từ lá cỏ ngọt Quá trình ion hóa và các thông số phân mảnh đã được tối ưu hóa Steviol glycoside được chiết xuất từ lá hoặc lá + cành cây cỏ ngọt bằng cách ngâm trong 2 giờ sử dụng 25 mL hỗn hợp etanol-nước (35:65, v/v) làm chất chiết Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là từ 0,1- 0,5 ng/mL và 0,5 – 1 ng/mL Hàm lượng Steviol glycosides được chiết xuất từ lá trồng trong nhà kính và trồng trên cánh đồng có sự khác nhau Cây trồng ở cánh đồng có nồng độ của Steviol glycosides cao hơn so với những loại

đến nồng độ của các hợp chất này

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ là kỹ thuật được phát triển mạnh mẽ ngày nay với độ đặc hiệu và chọn lọc cao và được sử dụng rộng rãi đối với phân tích Khối phổ cho phép xác định trực tiếp các hợp chất mà không cần quá trình dẫn xuất hóa, hơn nữa còn cho phép định lượng chính xác các hợp chất mà không yêu cầu việc tách sắc ký rõ ràng Như vậy, phương pháp này rất phù hợp cho việc phân tích đồng thời nhóm hợp chất có tính chất và cấu tạo tương đồng trong nền mẫu thực phẩm phức tạp Tuy nhiên, nhóm chất Steviol glycosides trong mẫu cỏ ngọt có hàm lượng cao, nên khi phân tích trên hệ khối phổ cần phải pha loãng nhiều dẫn đến sai số

1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao UV-Vis/PDA

Để tách được chín chất trong nhóm Steviol glycosides (Rebaudioside A, steviolbioside, Stevioside, rubusoside, Rebaudioside B, Rebaudioside C, Rebaudioside D, Rebaudioside F và dulcoside A, tác giả Venkata Sai Prakash Chaturvedula và cộng sự [38] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector PDA Các tác giả sử dụng cột C18 A Phenomenex (250 mm x 4,6

mm, 5 μm) để tách các chất thay vì sử dụng cột NH2 do cột C18 có độ bền và khả năng tái tạo cao hơn Tuy nhiên, trên cột C18 một số Steviol glycosides rửa giải với cùng thời gian lưu (tR) Để khắc phục điều này, nhiệt độ buồng cột được điều chỉnh trong khoảng 40-60oC

Tác giả R Amery và các cộng sự [32] đã phát triển một phương pháp mới để xác định Steviol glycosides trong sản phẩm từ sữa và sữa đậu nành Các chất béo từ sữa, nước uống đậu nành và đồ uống sữa lên men được loại bỏ bằng cách ly tâm 25

mL mẫu trong 12 phút ở tốc độ 15000 vòng Protein sau đó được kết tủa với acetonitrile Dịch chiết được làm giàu qua cột chiết pha rắn SPE C18 và phân tích bằng hệ thống HPLC với detector UV ở bước sóng 200 nm Kết quả chỉ ra phương pháp có độ thu hồi tốt và có sự phù hợp giữa đường chuẩn ngoại với phương pháp thêm chuẩn và nội chuẩn được thêm vào trước khi chiết tách

Annie Shirwaikar và các cộng sự [12] đã xây dựng phương pháp xác định nhanh và định lượng Stevioside trong các sản phẩm thương mại bằng HPTLC và HPLC Việc nhận biết Stevioside được thực hiện bằng HPTLC Quá trình tách được thực hiện trên tấm sắc ký bản mỏng silica gel 60F254 với dung môi ethyl acetate: methanol: nước (75:15:10, v/v/v) sử dụng hỗn hợp thuốc thử anhydride acetic: sulfuric acid: ethanol (1:1:10, v/v/v), quét phổ tại 510nm Việc xác định chính xác các pic sắc ký tương ứng của Stevioside được khẳng định chắc chắn hơn bằng kỹ thuật HPLC Đường chuẩn xây dựng có khoảng tuyến tính từ 0,1 đến 1 mg/mL Giới hạn phát hiện của Stevioside là 0,05 mg/mL Hàm lượng Stevioside trong mẫu bột stevia và lá được tìm thấy tương ứng là 8,859 và 3,703% Phương pháp cho phép xác định và định lượng nhanh Stevioside trong các mẫu khác nhau và có thể được sử dụng để phân tích thường quy các hợp chất Stevioside trong mẫu thương mại

Tác giả Yan-Hong Wang và công sự [41] đã phát triển Phương pháp UHPLC-UV và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector tán xạ bay hơi UPLC-UV-ELSD đã được phát triển để định lượng Rebaudioside A, Stevioside, Rebaudioside D, dulcoside A và steviolbioside từ Stevia rebaudiana và các sản phẩm liên quan Với chương trình phân tích 12 phút, năm Steviol glycoside

đã được phân tách tốt Hai detertor ELSD và UV cho các kết quả tương đương Các phương pháp đã được đánh giá về độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Đối với các Steviol glycoside, kết quả LOD và LOQ lần lượt là 10 và 30 μg/mL RSD% cho các phân tích trong ngày

và khác ngày là dưới 2,5% và hiệu suất thu hồi là 90–94% Đối với dẫn xuất PMP của glucose, LOD và LOQ tương ứng là 0,01 và 0,05 μg/mL Độ lặp lại (RSD%) dưới 2,6%; độ thu hồi là 98,6–101,7% Các phương pháp này hiệu quả cho việc xác

định, đánh giá đảm bảo chất lượng và chất tạp nhiễm trong S.rebaudiana và chất tạo

ngọt Steviol glycosides (sản phẩm từ cây cỏ ngọt)

Tác giả Ursula và cộng sự [35] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng để xác định một số Steviol glycoside chính, chất tạo ngọt diterpene có nguồn gốc từ lá cỏ

ngọt Phương pháp này được thực hiện qua một bước chiết rắn lỏng và chiết pha rắn (SPE) Các cột SPE khác nhau và hai loại cột HPLC đã được thử nghiệm trong việc tách các Steviol glycoside, Stevioside và Rebaudioside A Sự phân tách tốt trên cột phân tích HILIC của Luna với thành phần pha động bao gồm ACN:H2O (85:15, v/v) Khoảng tuyến tính trong khoảng từ 10 đến 800 µg/mL và hiệu suất thu hồi cho Stevioside và Rebaudioside A lần lượt là 99 ± 4,4 và 100 ± 5,0% Phương pháp này

đã được ứng dụng để phân tích Stevioside và Rebaudioside A từ cây cỏ ngọt được trồng ở hai khu vực khác nhau ở Đức Hàm lượng Stevioside và Rebaudioside A giữa hai mùa vụ cho thấy sự khác biệt đáng kể khi dùng F-test và t-test Tuy nhiên, tổng nồng độ (>12%) và tỷ lệ thành phần giữa Stevioside và Rebaudioside A (6:4)

là tương tự cho những mẫu cỏ ngọt khác nhau được tìm thấy ở các Quốc gia Dựa trên sự so sánh sản lượng từ các đợt thu hoạch, nhóm tác giả đã thảo luận về việc có thể trồng rộng rãi cỏ ngọt và đem lại kinh tế ở vùng ôn đới phía bán cầu Bắc Âu

Phương pháp HPLC dùng chế độ đẳng dòng để phân tích nhanh glycosides steviol từ lá cỏ ngọt Tác giả Dominik và cộng sự [17] đã phát triển phương pháp với độ chọn lọc cao cho 9 loại Steviol glycosides và ít tiêu tốn dung môi rửa giải Phương pháp phân tích này được thực hiện trên cột Purospher STAR RP-18 nối cột Hibar RT (250 mm x 4,6 mm x 3 µm) ở 50 oC với thành phần rửa giải là H2O:ACN (65:35, v/v) Với tốc độ dòng là 1 mL/phút, chín glycoside steviol đã biết được phát hiện chọn lọc sau 15 phút Đánh giá phương pháp cho thấy đối với Rebaudioside A LOD là 0,0004 mg/mL và LOQ là 0,0038 mg/mL Đường chuẩn với hệ số

R2=0,9997 ± 0,0002 và 2,01% RSD (n = 12) Độ chính xác của phương pháp thông qua hiệu suất thu hồi đạt 100,99 ± 2,01% Độ chụm trong ngày trong khoảng 0,12 đến 1,96% RSD và giữa các ngày thay đổi từ 0,02 đến 1,89% RSD Những thay đổi nhỏ đến từ các điều kiện phân tích như thành phần dung dịch rửa giải (65 ± 2%), nhiệt độ (50 ± 10 oC) hoặc tốc độ dòng chảy (1 ± 0,2 mL/phút) không ảnh hưởng đến hiệu suất của phương pháp phân tích Phương pháp HPLC đáng tin cậy và thích hợp để áp dụng cho định lượng các nhóm Steviol glycosides trong lá cỏ ngọt trong phòng thí nghiệm và kiểm tra chất lượng

Khi xác định thành phần dinh dưỡng của lá cỏ ngọt tại Việt Nam, các tác giả Trương Hương Lan và cộng sự [5] đã xác định được Stevioside và Rebaudioside A

là hai thành phần chính trong số các Steviol glycosides của lá cỏ ngọt Stevia

rebaudiana Trong nghiên cứu này, hàm lượng Stevioside và Rebaudioside A trong

lá khô của 4 giống cỏ ngọt trồng tại Việt Nam đã được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector PDA 2996 ở bước sóng 210 nm và so sánh với 1 giống cỏ ngọt Hàn Quốc Hàm lượng Stevioside trong lá của các giống cỏ ngọt này dao động từ 2,13% đến 7,72% và Rebaudioside A thay đổi từ 2,05% đến 9,32%

Trong đó, lá cỏ ngọt S rebaudiana S77 của Việt Nam có hàm lượng Steviol

glycoside lớn nhất (11,53%), có tiềm năng là nguyên liệu để sản xuất các loại đường phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm Ngoài ra, một số thành phần dinh

dưỡng chính của lá cỏ ngọt S rebaudiana S77 cũng đã được xác định, trong đó hàm

lượng protein, lipit, cacbonhydrat và đường khử, tương ứng là 10,87%; 3,95%; 62,55% và 5,12%

Trong yêu cầu kỹ thuật của phụ gia mã INS 960, ủy ban về các chất phụ gia (JECFA) [31] cũng đưa ra hướng dẫn quy trình xác định các thành phần Steviol glycoside trong quy định Phương pháp sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao nhận biết bằng detector UV Sử dụng chuẩn đối chứng là các dung dịch Stevioside

và Rebaudioside A được chuẩn bị trong nước – acetonitrile (7:3) Mẫu nguyên liệu được hòa tan trong nước – acetonitrile (7:3) Điều kiện phân tích sử dụng: Cột Capcell pak C18 MG II hoặc Luna C18 hoặc các cột tương đương (250 mm x 4,6

mm x 5 um); tốc độ dòng 1 mL/phút; nhiệt độ buồng cột 40oC; pha động gồm tỷ lệ 32:68 của acetonitrile và dung dịch đệm phosphate 10 mM, pH 2,6; detector cài đặt

ở bước sóng 210 nm; thời gian mỗi lần phân tích là 30 phút Tóm tắt kết quả của một số nghiên cứu phương pháp xác định Steviol glycosides được thể hiện trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Tóm tắt kết quả một số nghiên cứu phương pháp xác định Steviol

Tác giả

1 HPTLC Stevioside,

steviolbioside, Rebaudioside A

Bột cỏ ngọt

MeOH:H2O (80:20)

- Vikas và

cộng sự [39]

2 HPTLC Bảy chất trong

nhóm Steviol glycosides

6 loại thực phẩm

Chiết mẫu trong Methanol

Chiết mẫu trong nước làm sạch qua cột C18

- J Liu và

cộng sự [22]

4 CE-C4D Rebaudioside

A, Stevioside

Mẫu cỏ ngọt

Chiết trong nước

Đệm acid boric 170 mM/LiOH, pH 9,0

LOD 0,3 mg/L

Vaclav và cộng sự [37]

Đệm tách 30mM tetraborate pH 10,3 chứa cyclodextrin, Acetonitril và Methanol

- Mauri và

Cộng sự [25]

Stevioside Sử dụng thuốc thử ABTS đo

độ hấp thụ ở bước sóng 600 nm

Đồ uống

có cồn và không cồn

Mẫu được pha loãng trong nước và ly tâm

LOQ:

3,23-13,56 ng/mL

Pawel và cộng sự [30]

UPLC-MS

Stevioside, Rebaudioside

A, Steviolbioside, steviol

ngọt, chất làm ngọt

Mẫu chiết bằng Methanol, làm sạch bằng cột HLB, cột tách C18, pha động thêm dichlomathane

LOD của Stevioside, Rebaudiosi

Steviolbiosi

de, steviol lần lượt là 15,50, 10, 1 ng/mL

cành cỏ ngọt

Chiết trong hỗn hợp etanol:nước (35:65, v/v)

LOD: 0,5 ng/mL;

0,1-LOQ: 1,0 ng/mL

- Cột tách C18 (250 x

4,6 mm x 5 µm), nhiệt độ buồng cột

- Venkata

và cộng

sự [38]

Steviolbioside, Rubusoside,

40-60 oC

12

HPLC-UV

Steviol glycoside

Sữa và sữa đậu nành

Mẫu đƣợc kết tủa bằng ACN và làm sạch qua cột SPE C18 Sử dụng Steviol-19--

galactose-13-glucose làm nội chuẩn

LOD 0,05 mg/mL

Annie và cộng sự [12]

14

HPLC-UV và

ELSD

Rebaudioside A,D, Dulcoside

A, Steviolbioside

Cây cỏ ngọt

Sử dụng PMP để dẫn xuất

LOD: 10 g/mL;

LOQ: 30 g/mL

Yan Hong Wang và cộng sự [41]

15

HPLC-RID

Stevioside, Rebaudioside A

Lá cỏ ngọt Cột HILIC, pha

động ACN:H2O (85:15,v/v)

- Ursula và

cộng sự [35]

16

HPLC-PDA

Stevioside, Rebaudioside A

Lá cỏ ngọt Cột C18, pha động

ACN:H2O (35:65, v/v)

LOD:

0,0004 mg/mL;

LOQ:

0,0038 mg/mL

Dominik

và cộng

sự [17]

17

HPLC-PDA

Stevioside và Rebaudioside A

Lá cỏ ngọt

ở Việt Nam

Lan Hương và cộng sự [5]

18

HPLC-UV

Chín Steviol glycosides

Nguyên liệu đường cỏ ngọt

Cột C18, Đệm phosphate pH 2,6:

ACN (68:32, v/v)

- JECFA

INS 960 [31]

Trong các phương pháp tìm hiểu trên, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao- detector UV-VIS được sử dụng rất phổ biến hiện nay Khả năng tách cao đối với các hợp chất đường cỏ ngọt Tuy nhiên, phương pháp có hạn chế đối với việc phân tích trong thực phẩm do độ đặc hiệu thấp tại bước sóng phát hiện cận vùng

UV Để giải quyết được nhược điểm này, mẫu cần được xử lý làm sạch trước khi phân tích hoặc cần dẫn xuất hóa để tăng độ đặc hiệu của phương pháp

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm :

* Nghiên cứu, khảo sát một số điều kiện để xác định đồng thời 7 Steviol glycoside: Stevioside, Rebaudioside A, Rebaudioside B, Rebaudioside C, Rubusoside, Steviolbioside và Dulcoside A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Khảo sát nồng độ pha động

- Khảo sát pH pha động

- Khảo sát nhiệt độ cột

* Nghiên cứu, khảo sát quy trình chiết mẫu

- Khảo sát dung môi chiết mẫu

- Khảo sát nhiệt độ và thời gian chiết mẫu

* Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp bao gồm:

- Khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn

- Xác định giới hạn phát hiện (MDL), giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp

- Đánh giá độ lặp lại (độ chụm) của phương pháp phân tích

- Đánh giá độ thu hồi (độ đúng) của phương pháp phân tích

Dulcoside A) và đối tượng nghiên cứu là các mẫu nguyên liệu như thân và lá cây cỏ ngọt khô, đường cỏ ngọt cho người ăn kiêng, nước giải khát bổ sung đường cỏ ngọt Các mẫu phân tích được lấy trên địa bàn thành phố Hà Nội

Nguyên vật liệu – thiết bị, dụng cụ

2.4.

2.4.1 Nguyên vật liệu

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích dùng cho HPLC, cụ thể:

- Chất chuẩn Stevioside (TRC - Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Steviolbioside (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebaudioside A (Sigma - adrich), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebaudioside B (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebaudioside C (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebusoside (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Dulcoside A (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Nước cất 2 lần

- Acetonitril (Merck) (tinh khiết HPLC)

- Methanol (Merck) (tinh khiết HPLC)

- Natri dihydrophotphat (Merck)

- Các chất chuẩn gốc được chuẩn bị đơn lẻ trong dung môi Methanol

2.4.2 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu bao gồm:

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối PDA (Shimazhu)

- Cột sắc ký C18 (250mm x ID 4,6 mm x 5 μm) và tiền cột tương đương

- Máy ly tâm HermLe Z383K

- Cân phân tích độ chính xác 0,1mg (XT220A, Thụy Sĩ)

- Bếp cách thủy (GFL, Đức)

- Máy lắc Vortex Genie 2 (Mỹ)

- Máy rung siêu âm (Elma, Đức)

- Bộ chiết pha rắn

- Cột chiết pha rắn HLB (3mL, 60mg), C18 (3mL, 500mg)

- Dụng cụ thủy tinh thông thường phòng thí nghiệm

Phương pháp nghiên cứu

2.5.

2.5.1 Phương pháp phân tích

HPLC là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau HPLC có ưu thế trong việc phân tích cả định tính và định lượng Phân tích định tính thì sử dụng dữ liệu quan sát phổ, còn định lượng thì dựa vào dữ liệu đo lường được như chiều cao pic, diện tích pic Điều này cho HPLC một lợi thế hơn các kỹ thuật truyền thống khác HPLC có sử dụng một

hệ thống máy tính với một bộ lấy mẫu tự động từ bình chứa pha động, máy bơm, cột và detertor [3,6] Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia gồm hệ thống bơm cao áp Shimadzu LC-20AD kết nối detertor SPD-M20A được thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1: Hệ thống thiết bị HPLC-PDA

Nguyên lý xác định chất phân tích bằng detector PDA: Khi chiếu một chùm tia bức xạ điện tử với một tần số xác định đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua năng lượng của bức xạ không thay đổi nhưng cường độ bức xạ thay đổi Sự thay đổi cường độ bức xạ do sự hấp thụ bức xạ của hợp chất có trong hỗn hợp mà chùm tia bức xạ chiếu qua Dựa vào sự thay đổi cường độ bức xạ, xác định được chất phân tích Chất phân tích sau khi được tách khỏi cột sắc ký, được dẫn vào flowcell của đầu đo và được chiếu bởi một chùm tia tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

Có thể sử dụng detector UV để thay thế Tuy nhiên, detector PDA có nhiều

ưu điểm hơn là có khả năng quét được một dải bước sóng và xem được hình dạng phổ của chất phân tích Hơn nữa, trong nền mẫu thực phẩm có chứa rất nhiều các chất có khả năng hấp thụ tại bước sóng 210nm, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khẳng định chất đó là các Steviol glycosides có thể dễ bị nhầm lẫn Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và hình dạng phổ hấp thụ có thể khẳng định chính xác chất cần phân tích Do đó, trong nghiên cứu này đã sử dụng detector PDA tại bước sóng