Nghiên cứu địa động lực vùng Tuần Giáo và kế cận xác lập cơ sở khoa học đánh giá và dự báo động đất

Nghiên cứu địa động lực vùng Tuần Giáo và kế cận xác lập cơ sở khoa học đánh giá và dự báo động đất Nghiên cứu địa động lực vùng Tuần Giáo và kế cận xác lập cơ sở khoa học đánh giá và dự báo động đất Nghiên cứu địa động lực vùng Tuần Giáo và kế cận xác lập cơ sở khoa học đánh giá và dự báo động đất luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

-

Đoàn Thị Huyền

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN

HỒI QUY ĐA BIẾN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017

-

Đoàn Thị Huyền

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN

HỒI QUY ĐA BIẾN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Tạ Thị Thảo

TS Bùi Xuân Thành

XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ

CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN

Người hướng dẫn khoa học Chủ tịch hội đồng đánh giá

Luận án Tiến sĩ

PGS.TS Tạ Thị Thảo PGS.TS Trần Chương Huyến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS Tạ Thị Thảo và TS Bùi Xuân Thành Các số liệu, kết quả

nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình

nào khác

Tác giả

ĐOÀN THỊ HUYỀN

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành với sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các Thầy

Cô, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp

Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ

Thị Thảo và TS Bùi Xuân Thành là những người thầy đã tận tâm hướng dẫn,

giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các quý Thầy, Cô trong Bộ môn Hóa Phân

tích, khoa Hóa Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi được học tập,

nghiên cứu tại đây

Tôi xin được cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí và thiết bị máy móc từ đề tài nghị

định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014 - 2016, mã số 39/2014/HD- NĐT Cảm ơn

các bạn trong nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại của

Bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại

học Quốc gia Hà Nội đã phối hợp, hỗ trợ tôi hoàn thành nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm

Nghệ An đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình làm luận án

Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân

trong gia đình, tới những người bạn, tới lãnh đạo và các đồng nghiệp khoa Tự

nhiên, trường Cao đẳng Sư phạm Hà Tây, các học viên, sinh viên trong Bộ môn

Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc

gia Hà Nội đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất

trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án

Tác giả Đoàn Thị Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG IX DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ XI

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1.GIỚI THIỆU VỀ CÁC NHÓM THUỐC KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU 4

1.1.1 Nhóm thuốc kháng sinh Sulfamid 4

1.1.1.1 Cấu tạo của các chất kháng sinh nhóm Sulfamid 4

1.1.1.2 Tính chất vật lí và hóa học của các Sulfamid 5

1.1.1.3 Độc tính của Sulfamid 6

1.1.2 Nhóm thuốc kháng sinh họ β- lactam 6

1.1.2.1 Cấu tạo hóa học của các kháng sinh nhóm β-lactam

(nhóm penicilin và cephalossporin) 6

1.1.2.2 Tính chất vật lí và hóa học của các β- lactam 9

1.1.2.3 Độc tính và tai biến của β- lactam 12

1.2.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH

TRONG THUỐC 12

1.3.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH

TRONG THUỐC 14

1.3.1 Phương pháp điện hóa 14

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản 14

1.3.3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 15

1.3.4 Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến 16

1.3.5 Phương pháp phổ Raman 17

1.4.PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG THUỐC 19

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp đo phổ hồng ngoại 19

1.4.1.1 Sự xuất hiện của phổ hồng ngoại 19

1.4.1.2 Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại 20

1.4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại 23

1.4.2 Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với

thuật toán hồi quy đa biến 24

1.4.2.1 Cơ sở lí thuyết của phương pháp hồi quy đa biến 24

1.4.2.2 Các nguyên cứu định lượng các hoạt chất kháng sinh

bằng phương pháp phổ hồng ngoại đã được công bố 33

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 37

2.1.HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 37

2.1.1 Hóa chất 37

2.1.2 Thiết bị 39

2.2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 39

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 41

2.2.2.1 Phương pháp phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại kết hợp

với thuật toán hồi quy đa biến 41

2.2.2.2 Các phương pháp phân tích đối chứng xác định hàm lượng

các hoạt chất kháng sinh trong thuốc 50

2.2.2.3 Quy trình phân tích 51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1.NGHIÊN CỨU TÌM ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU PHÉP ĐO HỒNG NGOẠI 53

3.1.1 Lựa chọn vùng đo phổ hấp thụ hồng ngoại của các hoạt chất 53

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược 58

3.1.3 Khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu /KBr 61

3.1.4 Khảo sát khối lượng mẫu đem ép viên và độ lặp lại của quá trình ép viên 62

3.1.5 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm của mẫu 64

3.2.NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN MÔ HÌNH HỒI QUY ĐA BIẾN XÁC ĐỊNH MỘT

HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG THUỐC 65

3.2.1 Ma trận mẫu chuẩn và ma trận mẫu kiểm tra xác định hoạt chất cefixim

khi có mặt các tá dược 67

3.2.2 Nghiên cứu xác định cefixim khi có tá dược bằng phương pháp

CLS và ILS 69

3.2.3 Nghiên cứu xác định cefixim khi có lẫn tá dược theo phương pháp PCR 71

3.2.4 Xác định cefixim khi có lẫn tá dược theo phương pháp pháp PLS 78

3.2.5 Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định hoạt chất

kháng sinh sulfaguanidin trong thuốc 84

3.3.NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN MÔ HÌNH HỒI QUY ĐA BIẾN XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG CÙNG NHÓM THUỐC 85

3.3.1 Nghiên cứu xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil

khi có tá dược 86

3.3.1.1 Chế tạo mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra chứa hoạt chất cefaclor, cephalexin, cefadroxil và các tá dược 86

3.3.1.2 Xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn

tá dược theo mô hình PCR 88

3.3.1.3 Đánh giá lựa chọn mô hình chuẩn xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn tá dược theo phương pháp pháp PLS 91

3.3.2 Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong

thuốc theo mô hình PLS và PCR 95

3.3.2.1 Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh nhóm penicilin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR 95

3.3.2.2 Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh ceftriaxon và cefotaxim trong thuốc theo mô hình PLS và PCR 97

3.3.2.3 Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh cefixim và cefadroxil trong thuốc theo mô hình PLS và PCR 101

3.3.2.4 Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh penicilin và cephalexin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR 104

3.3.2.5 Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid trong thuốc theo mô hình PLS và PCR 108

3.4.ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM KHÔNG KHÍ ĐẾN KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG TÍNH TOÁN

THEO MÔ HÌNH 112

3.5.PHÂN TÍCH MẪU THỰC TẾ 114

3.5.1 Định tính mẫu thực tế 114

3.5.2 Định lượng các kháng sinh trong mẫu thuốc 118

3.5.2.1 Định lượng các kháng sinh nhóm sulfamid 118

3.5.2.2 Định lượng các kháng sinh nhóm penicilin 121

3.5.2.3 Định lượng các kháng sinh nhóm Cephalosporin 122

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 129

TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CZE capillary zone

electrophoresis Điện di mao quản vùng

DĐVN 4 pharmacopoeia

vietnamica 2009-2010 Dược điển Việt Nam 4

FT Fourier transform Chuyển hóa Fourier

FT- IR Fourier transform infrared

spectroscopy

Phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc k lỏng hiệu năng cao

HPLC/UV

The standard ultraviolet (UV) detector for high performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghét đầu dò cực tím

ILS inverse least square Bình phương tối thiểu

nghịch đảo

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

KLTB mean weight Khối lượng trung bình viên

LC-UV/DAD

Liquid Chromatography with ultraviolet/Diode Array Detection

Sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò cực tím/diot array

MEKC Micellar electrokinetic

chromatography

Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen

PC Principal component Cấu tử chính

PCA Principal Component

Analysis Phân tích thành phần chính

PCR principal component

regression Hồi qui cấu tử chính

PLS partial least square Bình phương tối thiểu từng

phần

RMSE Root mean square error Độ lệch chuẩn

RMSES Root mean square error of

standard

Độ lệch chuẩn của ma trận chuẩn

RMSET Root mean square error of

test

Độ lệch chuẩn của ma trận kiểm tra

RP-HPLC

Reverse phase High Performance Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép 2 lầnkhối phổ

USP 34 The United State

Pharmacopoeia 34, 2012 Dƣợc điển Mỹ 34

UV-VIS Ultraviolet-visible

spectroscopy Phổ tử ngoại khả kiến

Ghi chú: Trong luận án, tên hóa chất và hoạt chất theo quy định trong

Dược điển Việt Nam 4 [2]

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến 4

Bảng 1.2: Công thức cấu tạo một số penicilin 7

Bảng 1.3: Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin 8

Bảng 1.4: Danh sách các dược phẩm được nghiên cứu bằng phương pháp

quang phổ Raman 18

Bảng 1.5: Bảng so sánh một số đặc điểm của 2 loại thiết bị đo phổ hồng ngoại thường IR và FT-IR 22

Bảng 1.6: Tóm tắt một số công trình nghiên cứu định lượng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc bằng phương pháp phổ hồng ngoại 35

Bảng 2.1: Mẫu thuốc phân tích 40

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu thuốc viên cefalexin/KBr 61

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu thuốc viên Bisepton /KBr 61

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của khối lượng mẫu đem ép viên đến độ hấp thụ quang 62

Bảng 3.4: Khảo sát độ lặp lại quá trình ép mẫu theo độ hấp thụ và

theo diện tích pic 63

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của độ ẩm mẫu đến độ hấp thụ quang tại các số sóng

đặc trưng 64

Bảng 3.6: Hàm lượng (%) cefixim và tổng tá dược trong mẫu chuẩn 67

Bảng 3.7: Hàm lượng (%) cefixim và tổng tá dược các mẫu kiểm tra 68

Bảng 3.8: Hàm lượng (%) hoạt chất cefixim và sai số tương ứng 70

Bảng 3.9: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim có lẫn tá dược

trong mẫu chuẩn tự tạo theo phương pháp PCR 76

Bảng 3.10: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim có lẫn tá dược

trong mẫu kiểm tra tự tạo theo phương pháp PCR 77

Bảng 3.11: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim có lẫn tá dược

trong mẫu kiểm tra tự tạo theo phương pháp PLS 81

Bảng 3.12: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định sulfaguanidin có lẫn

tá dược trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phương pháp PLS và PCR 84

Bảng 3.13: Hàm lượng (%) cefadroxil, cephalexin, cefaclor và tổng tá dược

trong mẫu chuẩn 86

Bảng 3.14: Hàm lượng (%) cefadroxil, cephalexin, cefaclor và tổng tá dược

trong mẫu kiểm tra 87

Bảng 3.15: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefadroxil, cephalexin,

cefaclor có lẫn tá dược trong mẫu chuẩn tự tạo theo phương pháp PCR 89

Bảng 3.16: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefadroxil, cephalexil, cefaclor có lẫn tá dược trong mẫu kiểm tra tự tạo theo phương pháp PCR 90

Bảng 3.17: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefadroxil, cephalexin, cefaclor có lẫn tá dược trong mẫu chuẩn tự tạo theo phương pháp PLS 92

Bảng 3.18: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định penicilin, ampicilin, amoxicilin có lẫn tá dược trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR, PLS 95

Bảng 3.19: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định ceftriaxon và cefotaxim

có lẫn tá dược trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR, PLS 98

Bảng 3.20: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim và cefadroxil

có lẫn tá dược trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR, PLS 101

Bảng 3.21: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định penicilin, cephalexin

có lẫn tá dược trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR, PLS 105

Bảng 3.22: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định hoạt chất kháng sinh

nhóm sulfamid có lẫn tá dược trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo

phương pháp PCR, PLS 109

Bảng 3.23: Hàm lượng các hoạt chất (mg) và giá trị độ ẩm (%) tương ứng

trong các mẫu chuẩn 112

Bảng 3.24: Hàm lượng hoạt chất (mg) và giá trị độ ẩm (%) tương ứng 113

Bảng 3.25: Sai số tương đối (%) khi phân tích các hoạt chất trong mẫu kiểm tra (khi thay đổi độ ẩm mẫu và môi trường đo) 114

Bảng 3.26: Khối lượng hoạt chất và tổng tá dược trộn thêm vào các mẫu thực tế 119

Bảng 3.27: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế 120

Bảng 3.28: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế 120

Bảng 3.29: Khối lượng hoạt chất trong nhóm penicilin và tá dược trộn thêm 121

Bảng 3.30: Hàm lượng (mg/viên) của PN, AM, AX trong các mẫu thực tế 122

Bảng 3.31: Khối lượng hoạt chất nhóm cephalosporin và tá dược trộn thêm 123

Bảng 3.32: Hàm lượng (mg/viên) của nhóm Cephalosporin trong các mẫu

thực tế 124

Bảng 3.33: Hàm lượng (mg/lọ) thuốc tiêm của nhóm Cephalosporin trong các

mẫu thực tế 124

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của nhóm Sulfamid 4

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Azetidin-2-on (beta-lactam) 6

Hình 1.3: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm penicilin 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm cephalosporin 8

Hình 1.5: Phản ứng mở vòng β-lactam bởi β-lactamase 10

Hình 1.6: Phản ứng thủy phân của β-lactam khi pH>8 10

Hình 1.7: Sơ đồ định lượng β-lactam bằng phương pháp đo iod 10

Hình 1.8: Phản ứng thủy phân β-lactam khi pH<5 11

Hình 1.9: Phản ứng giữa penicilin với hydroxylamin, Cu2+ 11

Hình 1.10: Các bước phân tích quang phổ hồng ngoại 20

Hình 1.11: Giao thoa kế Michell 21

Hình 2.1: Lược đồ phân tích các hoạt chất trong thuốc bằng phương pháp IR

kết hợp với hồi quy đa biến 52

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của a) sulfaguanidin, b) sulfamethoxazol và

c) trimethoprim trong khoảng 4000-400cm-1 54

Hình 3.2: Phổ hấp thụ hồng ngoại các hoạt chất trong nhóm sulfamid và trimethoprim trong khoảng 7500 - 2800 cm-1 55

Hình 3.3: Hình biểu diễn các giá trị của tập dữ liệu ban đầu trên trục tọa độ gốc 55

Hình 3.4: Hình biểu diễn các giá trị của tập dữ liệu ban đầu trên trục tọa độ mới 56

Hình 3.5: Phổ hấp thụ hồng ngoại của các hoạt chất kháng sinh a) nhóm penicilin; b) và c) nhóm cephalosporin trong khoảng 7500 - 2800 cm-1 57

Hình 3.6: Phổ hấp thụ hồng ngoại của a) các tá dược trong nhóm sulfamid,

b) các tá dược trong nhóm penicilin, c) các tá dược trong nhóm cephalosporin

khảo sát trong khoảng phổ 3600 -2800 cm-1 59

Hình 3.7: Cách tìm ma trận trị số a) và ma trận trọng số b) 72

Hình 3.8: Cách tìm PC trong PCA 74

Hình 3.9: Phương sai t ch lũy của mô hình biểu diễn theo số cấu tử

riêng từng phần khi xác định hoạt chất cefixim và các tá dược 75

Hình 3.10: Tương quan hàm lượng cefixim tìm được từ mô hình PCR 78

Hình 3.11: Biểu diễn cách tìm ma trận trực giao trong PLS 80

Hình 3.12: Tương quan hàm lượng (%) cefixim tìm được với hàm lượng trong các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra sử dụng phổ đạo hàm bậc 1 và phương pháp PLS 83

Hình 3.13: Tương quan hàm lượng (mg) của sulfaguanidin (trong mẫu chuẩn và

mẫu kiểm tra) tìm được từ mô hình PLS với giá trị ban đầu 85

Hình 3.14: Phương sai t ch lũy của mô hình biểu diễn theo số cấu tử riêng 88

Hình 3.15: Tương quan hàm lượng (%) của cefadroxil, cephalexin, cefaclor

a) trong mẫu chuẩn và b) trong mẫu kiểm tra tìm được từ mô hình PCR với

giá trị ban đầu 91

Hình 3.16: Tương quan hàm lượng (%) của cefadroxil, cephalexin, cefaclor

a) trong mẫu chuẩn và b) trong mẫu kiểm tra tìm được từ mô hình PLS với

giá trị ban đầu 94

Hình 3.17: Tương quan hàm lượng (g) của penicilin, ampicilin, amoxicilin

a) trong mẫu chuẩn và b) trong mẫu kiểm tra tìm được từ mô hình PCR với

giá trị ban đầu 97

Hình 3.18: Tương quan hàm lượng (%) của ceftriaxone, cefotaxim tìm được

từ mô hình PLS (a) trong mẫu chuẩn và b) mẫu kiểm tra) và PCR (a) trong mẫu chuẩn và b) mẫu kiểm tra) với giá trị ban đầu 100

Hình 3.19: Tương quan hàm lượng (%) của cefixim, cefadroxil (a) trong mẫu

chuẩn và b) mẫu kiểm tra) tìm được từ mô hình PLS với giá trị ban đầu 103

Hình 3.20: Tương quan hàm lượng (mg) của penicilin, cephalexin (a) trong mẫu chuẩn và b) mẫu kiểm tra) tìm được từ ma trận đạo hàm bậc 1 và mô hình PLS

với giá trị ban đầu 108

Hình 3.21: Tương quan hàm lượng (mg) của các hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid (trong mẫu chuẩn a) và mẫu kiểm tra b)) tìm được từ mô hình PCR 111

Hình 3.22: Phổ hấp thụ hồng ngoại của Sulfaguanidin 115

Hình 3.23: Phổ hấp thụ hồng ngoại của Sulfamethoxazol 116

Hình 3.24: Phổ hấp thụ hồng ngoại của Trimethoprim 116

Hình 3.25: Phổ hấp thụ hồng ngoại của sulfaguanidin 117

Hình 3.26: Phổ hấp thụ hồng ngoại của mẫu thuốc S1 chứa sulfaguanidin 118

Hình 3.27: Tương quan giữa hàm lượng hoạt chất được xác định bằng hồi quy 125

MỞ ĐẦU

Dược phẩm và chất lượng dược phẩm hiện đang là vấn đề rất được quan tâm

ở Việt Nam [4] Các thuốc trên thị trường đều có các quy chuẩn kiểm nghiệm theo chuẩn dược điển được thực hiện tại các trung tâm kiểm nghiệm có uy tín sử dụng các trang thiết bị có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi phải mất nhiều thời gian Quy trình phân tích bao gồm: Phân lập hoạt chất cần phân tích trong thuốc, làm giàu hoặc pha loãng, phân tích và xử lý kết quả phân tích [2, 3] Tuy nhiên, trong quá trình lưu thông thuốc trên thị trường, có nhiều thuốc giả, thuốc nhái, thuốc kém chất lượng cần được phân tích nhanh theo ba khâu: Phân lập thuốc, phân tích và xử lý kết quả Gần đây, các tác giả xây dựng phương pháp phân t ch nhanh theo ba tiêu chí: Chuẩn bị mẫu nhanh, không cần phân lập hoạt chất, xử lý kết quả tự động và đạt độ chính xác cao kết hợp với quy trình xử lý kết quả tự động là định hướng nghiên cứu lý thú cả về phát triển phương pháp và khả năng ứng dụng [53]

Đặc tính của phương pháp phổ hồng ngoại là phổ dao động của các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học, do đó gặp khó khăn khi đưa ra được các thông tin đặc trưng nếu chỉ đo tại một bước sóng [7, 70] Mặt khác, phổ hồng ngoại chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của các thông số như điều kiện vật lý của mẫu, môi trường đo mẫu, độ dày của viên mẫu, tỷ lệ ép viên Vì thế phương pháp phổ hồng ngoại được biết đến là một phương pháp chủ yếu dùng trong phân tích cấu trúc, các kỹ thuật phân t ch thông thường như đường chuẩn và thêm chuẩn được ứng dụng rất hạn chế, phần lớn các trường hợp đều không khả thi [32] Toán hóa (chemometrics) được định nghĩa là việc ứng dụng các phương pháp toán học, thống kê, đồ hoạ,… để quy hoạch thực nghiệm, tối ưu hoá các thông tin hoá học trích ra từ tập số liệu phân t ch và đưa ra tối đa những thông tin hữu ích từ tập

số liệu ban đầu [10] Ra đời từ những năm đầu của thập kỉ 70, cho tới nay toán hóa

đã xác lập được một vị trí quan trọng cho mình trong ngành hoá học, đặc biệt là trong hoá học phân tích hiện đại Một mảng lớn trong toán hóa phát triển nhanh gắn liền với toán học và tin học là hồi quy đa biến - kỹ thuật đa biến được dùng rộng rãi trong phòng thí nghiệm hoá học giúp giải quyết các bài toán xác định đồng thời

nhiều cấu tử cùng có mặt trong hỗn hợp mà không cần tách loại trước Bản chất của thuật toán hồi quy đa biến là chuyển một tập hợp liên tục trên trục số thực thành tập hợp các điểm rời rạc và tìm mối quan hệ toán học của chúng Nếu các điểm toán học được mã hóa các tín hiệu điện, ánh sáng…thì các t n hiệu được phân tách và nhận dạng rõ ràng, nhiễu được giảm đi tối đa, t n hiệu trở nên sắc nét và đặc trưng

Vì vậy, phân tích quang phổ hồng ngoại kết hợp với hồi quy đa biến đã mở ra nhiều ứng dụng mới trong nhiều lĩnh vực [20, 53, 69, 71, 80, 87, 97, 99]

Trong nhiều năm gần đây, kỹ thuật phân tích quang phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp hồi quy đa biến đã trở thành một kỹ thuật phân tích có tính ứng dụng cao cho ngành công nghiệp dược phẩm [19, 59, 94, 95, 100] bởi vì đây là một phương pháp phân t ch nhanh, không cần phá hủy mẫu hoặc xử lí mẫu đơn giản, không sử dụng các hóa chất và dung môi độc hại [36, 58, 61, 65, 68, 87] Do vậy,

mục tiêu của đề tài luận án : “Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất trong thuốc

kháng sinh bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến” nhằm phát triển phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với hồi quy đa biến

tuyến t nh xác định các hoạt chất trong thuốc phục vụ phân t ch sàng lọc và định lượng nhanh hàm lượng hoạt chất trong các sản phẩm kháng sinh thuộc nhóm

sulfamid và β-lactam đang được sử dụng phổ biến trên thị trường Việt Nam hiện nay

Để xây dựng quy trình xác định các hoạt chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp hồi quy đa biến, nội dung nghiên cứu chủ yếu của luận án gồm:

1 Khảo sát tìm các điều kiện tối ưu của phép đo phổ hồng ngoại vùng gần và trung với các hoạt chất và mẫu thuốc tự tạo, mẫu thuốc thành phẩm

2 Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến phù hợp để xác định một hoạt chất khi có mặt các tá dược trong mẫu thuốc viên/thuốc bột và nghiên cứu xác định đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm chất bằng một mô hình hồi quy

đa biến tuyến tính

3 Đánh giá các thông số chính của một quy trình phân tích nhanh trên

cơ sở xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính từ các mẫu tự tạo có chứa hoạt chất và tá dược thường dùng

4 Ứng dụng quy trình phân tích xây dựng được để phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lưu hành trên thị trường hiện nay và so sánh kết quả với phương pháp tiêu chuẩn quy định trong Dược điển

 Điểm mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án:

- Lần đầu tiên đã xây dựng được quy trình phân tích nhanh các hoạt chất nhóm

sulfamid và một số chất thuộc nhóm β-lactam (ampicilin, cefixim, cefaclor,

ceftriaxon, cefotaxim) bằng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại vùng gần và trung trên cơ sở sử dụng các mô hình hồi quy đa biến PLS và PCR Quy trình này cho phép phân tích xử lí mẫu đơn giản, không sử dụng dung môi độc hại, nhanh và cho kết quả phù hợp trong việc sàng lọc nguyên liệu và phân tích nhanh các sản phẩm thuốc

- Lần đầu tiên có thể xác định đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm thuốc

sulfamid và β-lactam bằng phương pháp IR kết hợp với hồi quy đa biến trên cùng

một mô hình Quy trình này cho phép xác định được bất kỳ một chất nào trong thuốc bằng một mô hình hồi quy đa biến Điều này mở ra khả năng xây dựng phần mềm trên thiết bị cầm tay theo cách bổ sung dần tập số liệu

- Quy trình phân tích các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim; cephalexin, cefaclor và cefadroxil; penicilin, ampicilin và amoxicilin; cefotaxim và ceftriaxon; cefixim và cefadroxil bằng các mô hình xác định đồng thời cho phép ứng dụng để phân t ch sàng lọc nguyên liệu và các sản phẩm thuốc thành phẩm Kết quả luận án mở ra các hướng nghiên cứu mới trên các đối tượng phức tạp hơn như thực phẩm chức năng, các mẫu sinh học và thực phẩm

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về các nhóm thuốc kháng sinh nghiên cứu

1.1.1 Nhóm thuốc kháng sinh sulfamid

1.1.1.1 Cấu tạo của các chất kháng sinh nhóm sulfamid

Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p-aminobenzensulfonamid, có

công thức cấu tạo chung như hình 1.1

HN

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của nhóm sulfamid

Trong đó thường gặp R2 là H Khi R2 là H thì sulfamid mới có hoạt tính kháng khuẩn Khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thuốc R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng Tuy nhiên, nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường là các dị vòng 2 - 3 dị tố Khi R1 và R2 đều là gốc hidro thì thu được sulfamid có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid) [8, 11, 21, 81]

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số sulfamid phổ biến

Sulfaguanidin C7H10N4O2S

NH2NH

Sulfadiazin

C10H10N4O2S

N N

Sulfamethoxazol C10H11N3O3S

N O

CH3

Sulfadoxin C12H14N4O4S

N N

H3OC OCH3

1.1.1.2 Tính chất vật lí và hóa học của các sulfamid

Nhóm amin thơm trong các sulfamid có thể tham gia phản ứng diazo hoá nên thường được dùng để định t nh và định lượng sulfamid

1.1.1.3 Độc tính của Sulfamid

Tác dụng phụ khi sử dụng sulfamid là khoảng 5% khác nhau đối với mỗi cá thể và đối với mỗi loại sulfamid Một số tác dụng có thể gặp khi sử dụng sulfamid như làm rối loạn hệ thống tạo máu do hiện tượng mẫn cảm, hiện tượng tan huyết liên quan tới sự hoạt hóa glucose-6 phosphat dehydrogennase Sulfamid cũng có thể kết tinh ở thận gây tổn thương thận, viêm thận, sỏi thận đái ra máu; Phản ứng tăng nhạy cảm như nổi ban đỏ, xuất huyết [8, 21]

1.1.2 Nhóm thuốc kháng sinh họ β- lactam

1.1.2.1 Cấu tạo hóa học của các kháng sinh nhóm β-lactam (nhóm penicilin và cephalossporin)

Các kháng sinh nhóm β-lactam có cấu trúc azetidin-2-on (vòng β-lactam) là

một amid vòng 4 cạnh (hình 1.2), gồm các nhóm penicilin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem Trong 4 nhóm trên, 2 nhóm sử dụng phổ biến là penicilin và cephalosporin [72]

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Azetidin-2-on (beta-lactam)

Nhóm các penicilin:

Các penicilin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng

β-lactam (hình 1.3) Công thức cấu tạo của các kháng sinh cụ thể ở bảng 1.2 [72]

O

CO R

COOM

2 3 4 1

5 6

7

Hình 1.3: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm penicilin

Bảng 1.2: Công thức cấu tạo một số penicilin

chất

C

N C C S

CH3

C

C C

H H HN

O

vòng lactam

H

CH3

O HO

NH2

Ampicilin

H C

Nhóm các cephalosporin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-lactam 4 cạnh gắn

với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R, khác nhau bởi các gốc R

N H

O

CO R1

N S

R3 R2

COOM

1 2 3 4 5

6 7 8

Hình 1.4: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm cephalosporin

Dựa vào khổ kháng khuẩn, người ta chia các cephalosporin thành 4 thế hệ Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau [8, 72]

Bảng 1.3: Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin

N S

R2COOH

H H

H 2 C

CH 3

Cefuroxim

O C

N OCH 3

-CH 2 OCONH 2 Cefmetazon N C-CH2-S-CH2

N N S

H 2 C

CH 3

1.1.2.2 Tính chất vật lí và hóa học của các β- lactam

Tính chất lí học:

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng ngà, dạng axit ít tan trong

nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong methanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải, tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm -COOH và -NH2 Do phân tử có C bất đối tạo góc quay cực αD, nên

các β-lactam có khả năng hấp thụ UV và được ứng dụng trong TLC, HPLC (định tính, thử tinh khiết, tạp liên quan, định lượng) Phổ hấp thụ hồng ngoại của β-lactam

tạo ra do nhiều nhóm chức cực đại hấp thụ (chủ yếu do nhân phenyl) Tùy vào cấu

trúc khác nhau của β-lactam mà dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển

sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ) [8, 72]

Tính chất hóa học:

Tính acid: Các β-lactam có hằng số phân li acid (pKa) từ 2,5 - 2,75 Muối

Na, K dễ tan trong nước Muối của các bazo amin phân tử lớn khó tan trong nước

Các β-lactamase được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+) và một số vi khuẩn Gram (-) cótác dụng mở vòng β-lactam, tạo acid penicilloic [8, 72] (hình 1.5)

Hình 1.5: Phản ứng mở vòng β-lactam bởi β-lactamase

Các β-lactam bị thủy phân trong môi trường pH>8 (hình 1.6)

Hình 1.6: Phản ứng thủy phân của β-lactam khi pH>8

Phản ứng thủy phân được ứng dụng để định lượng bằng phương pháp đo iod (hình 1.7) và phương pháp đo thủy ngân

Hình 1.7: Sơ đồ định lượng β-lactam bằng phương pháp đo iod

HN

3

CH3COOH

HNC

OR

1 2 3

4 5 6 7

O

NH

Amid/acid penicilloic

NO

4 5 6 7

N O

3

CH3COOH

H N C

O R

1 23

4 5 6 7

H N C

O R

1 23

4 5 6 7

O OH Acid penicilloic

HN

3

CH3COOH

H N C

O R

1 23

4 5 6

Acid penilloic

H C COOH

CHO

H N C

O

CH C

3

CH3COOH Acid penaldic

Penicillamin

H C COOH CHO H

Ngoài ra, cỏc β-lactam cũng bị thủy phõn trong mụi trường pH<5 (hỡnh 1.8)

Hỡnh 1.8: Phản ứng thủy phõn β-lactam khi pH<5

Dung dịch cỏc β-lactam khụng bền ở pH>8 hoặc <5 Do đú cần bảo quản

chỳng ở pH 5,5 - 6,8 bằng cỏc hệ đệm citrat, phosphat Cỏc ion citrat và phosphat cũn cú vai trũ tạo muối khú tan với cỏc cation kim loại Zn, Ca, Cd, Cu làm giảm vai trũ xỳc tỏc thủy phõn của cỏc cation này

Phản ứng với tỏc nhõn ỏi nhõn

Cỏc penicilin phản ứng với ancol, amin tạo este hoặc amid của acid penicilloic, với hydroxylamin tạo acid hydroxamic [11] (hỡnh 1.9), với Fe3+ cho màu

đỏ Cỏc ion kim loại khỏc (Zn2+, Cd2+, Pb2+, Hg2+) xỳc tỏc phản ứng thủy phõn [8]

Hỡnh 1.9: Phản ứng giữa penicilin với hydroxylamin, Cu 2+

N

CH 3 COOH

N C

R

1 2 3

4 5 6 7

N R

1 2 3

4 5 6 7

1 2 3

4 5 6 7

1

N HOOC

R

Acid penillic

N O

S CH 3

CH 3 COOH

NH 2 OH

HN

S CH 3

CH 3 C

H N C

O R

3 4 5 6 7

NH O

OH

O OH

H N C

O R

1 2 3 4 5 6 7

NH O

O

O O

Acid hydroxamic

Cu

Hydroxamat đồng (xanh)

1.1.2.3 Độc tính và tai biến của β- lactam

Các kháng sinh nhóm penicilin rất t độc, gây tai biến chủ yếu do dị ứng, gây ngứa và nổi mề đay, dị ứng nặng gây sốc phản vệ, có thể xảy ra với người dùng thuốc lần đầu, nhưng thường xảy ra nhất với những người dùng thuốc nhiều lần, ít xảy ra ở trẻ em [1, 8]

1.2 Các phương pháp phân tích định tính các hoạt chất kháng sinh trong thuốc

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (theo dược điển Việt Nam 4 [2])

Phương pháp sắc ký lớp mỏng định tính các hoạt chất nhóm sulfamid (dạng viên nén) dùng bản mỏng silica gel GF254 Dung môi khai triển là dicloromethan- methanol- acid formic khan (70:20:10) đối với sulfaguanidin, cloroform - methanol

- dimethylformamid (20 : 2 : 1), hoặc cloroform - methanol (19 :1) đối với sulfamethoxazol, heptan - cloroform - dung dịch methanol 5 % (v/v) trong ethanol - acid acetic bằng tỷ lệ (4 : 4 : 4 : 1) đối với sulfadoxin (viên nén chứa sulfadoxinvà pyrimethamin) Dung dịch thử và dung dịch đối chiếu của sulfaguanidin được pha trong aceton, sulfamethoxazol và sulfadoxin được pha trong methanol Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng mỗi dung dịch trên Triển khai sắc ký, sau đó lấy bản mỏng ra để khô ngoài không kh Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254

nm Hai vết ch nh trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp với hai vết ch nh trên sắc ký đồ của các dung dịch đối chiếu về vị tr và màu sắc [2]

Để định t nh các hoạt chất cephalosporin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

ta dùng bản mỏng là Silica gel F254 đã được silan hóa Dung môi khai triển gồm

có dung dịch acid citric 0,1 M - dung dịch dinatri hydrophosphat 0,1 M - dungdịch ninhydrin trong aceton có nồng độ 1 g trong 15 ml (60 : 40 : 1,5) đối với cefadroxil, methyl acetat - dung dịch amoni acetat 15,4 % đã được điều chỉnh trước tới pH 6,2 bằng acid acetic (10 : 90) đối với cefixim, aceton - dung dịch amoni acetat 15,4% đã được điều chỉnh trước tới pH 6,2 bằng acid acetic (15 : 85) đối với cefotaxim Dung dịch thử và dung dịch đối chiếu của cefadroxil hòa tan trong nước, còn với cefixim

sử dụng dung môi pha mẫu(dung dịch A) là hỗn hợp methanol - dung dịch đệm phosphat 0,067 M pH 7,0 (1 : 1), cefotaxim sử dụng môi pha mẫu (dung dịch A): Hỗn hợp methanol - dung dịch đệm phosphat 0,067 M pH 7,0 (1 : 1) Sau đó, chấm riêng biệt lên bản mỏng mỗi dung dịch trên Triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để

khô và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm Vết ch nh thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp về vị tr , k ch thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) Phép thử chỉ có giá trị khi sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) cho 2 vết tách rõ ràng [2].

Phương pháp định tính cefaclor: Thời gian lưu của pic ch nh trong sắc ký đồ

ở phần định lượng của dung dịch thử phải tương đương với thời gian lưu của pic

ch nh thu được từ sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Lấy khoảng 2 mg chế phẩm cho vào một ống nghiệm có chiều dài 15 cm và đường k nh 1,5 cm Làm ẩm bằng một giọt nước, thêm 2 ml dung dịch formaldehyd trong acid sulfuric (TT) Quay tròn ống nghiệm để trộn đều, dung dịch phải không màu Đặt ống nghiệm vào trong, cách thủy sôi 1 phút, dung dịch chuyển thành màu nâu vàng [2]

Với nhóm penicilin, định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng (pha tĩnh) là silicagel H đã được silan hoá Đối với penicilin, pha động là hỗn hợp của dung dịch amoni acetat 15,4% và aceton (TT) (70 : 30), được điều chỉnh tới

pH 5,0 bằng acid acetic khan (TT), pha động là hỗn hợp của dung dịch amoni acetat 15,4% và aceton (TT) (90 : 10) được điều chỉnh tới pH 5,0 bằng acid acetic khan (TT) với amoxicilin và ampicilin Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch đối chiếu cho ampicilin với dung môi là dung dịch natri hydrocarbonat 4,2% Sau khi triển khai sắc ký, để khô bản mỏng ngoài không kh , đặt bản mỏng vào bình có hơi iod cho đến khi xuất hiện các vết Quan sát các vết dưới ánh sáng ban ngày Trên sắc ký

đồ, vết ch nh thu được của dung dịch (1) phải tương ứng về vị tr , màu sắc và k ch thước với vết thu được của dung dịch (2) Phép thử chỉ có giá trị khi trên sắc ký đồ dung dịch (3) tách ra 2 vết rõ ràng, riêng biệt [2]

Phản ứng với H 2 SO 4 - formaldehyd: Tùy thuộc vào từng loại mà phản ứng định

tính cho các màu sắc khác nhau Cefixim phản ứng với H2SO4- formaldehyd cho màu vàng, chuyển thành cam khi đun cách thủy; Cefadroxil cho màu vàng, chuyển sang màu da cam khi cách thủy; Amoxicilin hầu như không màu, chuyển thành vàng sẫm khi đun cách thủy; Ampicilin hầu như không màu, chuyển thành vàng sẫm khi đun cách thủy; Benzylpenicilin kali hầu như không màu, chuyển thành màu nâu đỏ

khi đun cách thủy; Cefaclor hầu như không màu, chuyển thành vàng nâu khi đun cách thủy; Cefotaxim màu vàng sáng, chuyển thành nâu khi đun cách thủy;

Cephalexin màu vàng nhạt, chuyển thành vàng sẫm khi đun cách thủy [2]

Phương pháp phổ hồng ngoại cho phép nhận dạng sự xuất hiện và có mặt của các nhóm chức đặc trưng [9] Cụ thể, phổ IR xác định được sự có mặt nhóm amin bậc một -NH2 trong vùng từ 3400-3250 cm-1, amin bậc hai >NH trong vùng từ 3350-

3310 cm-1, chức >SO2 ở giữa 1370- 1310 cm-1 (đối với dao động hóa trị bất đối xứng)

và 1180- 1120cm-1 (đối với dao động hóa trị đối xứng), nhân thơm trong vùng

1625-1430 cm-1 Để định tính các mẫu thuốc, tiến hành đo phổ IR của các mẫu thử sau đó

so sánh với phổ IR của mẫu chuẩn trong các thư viện phổ tham chiếu [2, 3]

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc

1.3.1 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam

nhưng không phổ biến nhiều Phương pháp có t nh chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, độ ch nh xác cao nhưng khó ứng dụng trong phân t ch đồng thời

Các nghiên cứu định lượng hoạt chất kháng sinh như cefadroxil [14], cefaclor [98], cefotaxim [123] được tiến hành trên điện cực màng thủy ngân, xác định cephalexin [35, 121], penicilin [107] trên điện cực màng kim cương, xác định amoxicilin [41] bằng điện cực than thủy tinh biến tính bằng glutaraldehyd Ngoài ra,

có thể xác định đồng thời glutathion và cephalexin bằng điện cực màng kim cương - boron [35], xác định đồng thời các cephalosporin bằng phương pháp phân t ch phân cực [89] Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu có pH, đệm, điện thế xác định Kết quả phân tích cho thấy độ lệch chuẩn tương đối vào khoảng 1,5% - 4,2%, khoảng tuyến tính ở nồng độ từ 10-7-10-9 mol/l

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β- lactam

trong nhiều đối tượng khác nhau đặt biệt là các mẫu sinh học Phương pháp có độ thu hồi cao, giới hạn phát hiện thấp, độ lệch chuẩn thấp nhưng việc chuẩn bị mẫu khá phức tạp [24, 91, 96]

Các nghiên cứu cho thấy có thể áp dụng phương pháp CE để phân tích riêng

lẻ (amoxicilin [44]) và đồng thời các hoạt chất kháng sinh (nafcilin, dicloxacilin, cloxacilin, oxacilin, ampicilin, penicilin G và amoxicilin; cephazolin, cefuroxim natri, ceftriaxon natri, cefoperazon natri và ceftaidim [23, 91, 96]) trên các đối tượng như nước [22], nước tiểu người [26], trong chất thải, nước sông [24] Các kỹ thuật chủ yếu là điện di mao quản vùng (CZE) và điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) Kết quả cho thấy hệ số tương quan lớn 0,94- 0,99%, độ lệch chuẩn tương đối nhỏ <10%, giới hạn phát hiện thấp (µg/L)

1.3.3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau, có độ ch nh xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác định các hoạt chất kháng sinh trong các sản phẩm dược phẩm Tuy nhiên có nhược điểm thiết

bị đắt tiền, tốn dung môi, thời gian làm sạch và ổn định sau mỗi lần chạy lâu

Theo dược điển Việt Nam và dược điển Mỹ [2, 111] các hoạt chất kháng sinh trong nhóm sulfamid được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng với pha động là hỗn hợp của 700ml nước, 200ml Acetonitril và 1ml triethylamin Điều kiện sắc ký gồm cột thép không gỉ (30 cm × 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 m) với detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm, tốc độ dòng là 2,0 ml/phút, thể t ch tiêm mẫu 20 l (dược điển Việt Nam) [2] và cột C18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector

UV 254 nm, tốc độ dòng là 1,8 ml/ phút, thể t ch tiêm 20 µl (dược điển Mỹ) [111] Nhóm tác giả Cemal Akay, Sibel A Ozkan [33] đã tiến hành nghiên cứu thành công quy trình định lượng sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứa sulfamethoxazol

và trimethoprim) theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với pha động là hỗn hợp của methanol và nước (60: 40) điều chỉnh đến pH=3,0 bằng acid phosphoric 10

% Điều kiện sắc ký gồm cột C18, detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 213

nm, tốc độ dòng 1,8 ml/min, thể t ch tiêm 10 l Khoảng tuyến t nh của phương pháp là từ 2,0-10,0 µg/ml đối với trimethoprim và từ 10,0- 50,0 0 µg/ml đối với sulfamethoxazol Giới hạn phát hiện tương ứng với trimethoprim và sulfamethoxazol lần lượt là 0,45 và 1,21 µg/ml [33]

Đối với các hoạt chất kháng sinh β-lactam có thể định lượng được riêng lẻ

(ampicilin [29, 109], cefaclor [37], cefadroxil [67]) và định lượng đồng thời (amoxicillin và clavulanic [13], cephalexin và carbocistein [12], cefixim và cloxacilin [16], cefotaxim natri và paracetamol [28], amoxicilin, ampicilin, oxacilin, cloxacilin và cephapirin [34], cefixim, cefaclor, cefadroxil, cephalexin, cephradin [82] và các hoạt chất kháng sinh khác trong nhóm [27, 62, 79, 109, 114]…) bằng phương pháp HPLC trên các đối tượng khác nhau như huyết tương [119], sữa bò khô đã chế biến [117], các mẫu nước, mẫu dược phẩm, nước tiểu chuột, các mô cơ bắp [63] Sử dụng các phương pháp RP-HPLC [12, 13], HPLC [104], LC/MS [27, 28], UPLC-MS/MS [37], LC-MS/MS[66], HPLC/UV [93], LC-UV/DAD [48], với pha động chủ yếu là đệm acetat, acid formic dung dịch (0,05%) và methanol ở tỷ lệ 45: 55, dihydrogen phosphat (pH 3,5) -acetonitril (87,5: 12,5, v / v), 0,1% acid formic và acetonitril Các cột thường dùng là C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm), C8, Polar-RP 80A kết quả cho thấy rằng phương pháp HPLC có độ phát hiện thấp từ 0,05 -0,5µg/ml và độ ch nh xác <15%

1.3.4 Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến

Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến là phương pháp phân t ch dựa trên t nh chất quang học của chất cần phân t ch Các phương pháp này đơn giản dễ tiến hành

thông dụng được ứng dụng nhiều khi xác định các β-lactam và sulfamid ở dạng hoạt

chất tinh khiết và trong dược phẩm

Phương pháp được ứng dụng để định lượng một số các hoạt chất kháng sinh riêng lẻ Xác định cephalexin [17] được thực hiện bằng phương pháp UV- Vis và phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử khi hoạt chất tạo phức với Fe(III) trong điều kiện pH= 1-8 điều kiện tốt nhất là pH=2 Để định lượng amoxicilin [117]

người ta cho tạo phức với acid p-amino benzoic hoặc diazo hóa trong môi trường

kiềm, phương pháp có LOD từ 0,1877 µg/ml đến 0,1916 µg/ml

Một số công trình nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có thể sử dụng phương pháp phổ tử ngoại khả kiến để xác định đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong nhóm sulfamid [86, 90, 122] và nhóm β-lactam [54, 55, 56, 101] Định lượng các sulfamid bằng cách đo UV trong khoảng sóng 200-350 nm từ một bộ mẫu có chứa

dung dịch ethanol (pH = 9,9) [86] xử l kết quả thực nghiệm theo 3 mô hình hồi quy CLS, PCR và PLS xác định được các hoạt chất trong khoảng nồng độ1,0-24,0 mg/l với LOD trong khoảng 0,2-1,0 mg/l Có thể định lượng các sulfamid dựa trên sự hình thành của một sản phẩm có màu đỏ bằng phương pháp diazo hóa [90] xác định được các hoạt chất trong khoảng tuyến t nh 0,04-8,0 µg/ml, hay bằng phương pháp chuẩn độ gián tiếp theo phương pháp iod [40] Định lượng các cephalosporin trong thuốc bột pha tiêm được thực hiện bằng cách oxi hóa tạo hợp chất có màu với chất thử metol-chromi (VI) [18], muối variamine xanh [31], 4-amino antipyrin [55], prussian xanh [88] trong khoảng nồng đồ tuyến t nh từ 0,2 µg/l đến 8,5 µg/l phương pháp có độ chọn lọc và độ ch nh xác cao

Như vậy, qua các công trình nghiên cứu ta có thể thấy rằng sử dụng phương pháp phổ tử ngoại khả kiến trong phân t ch các hoạt chất kháng sinh sulfamid và β- lactam có ưu điểm là cho độ ch nh xác và độ chọn lọc cao, nhanh Nhược điểm là chỉ có thể áp dụng với các chất có t nh chất quang học, khoảng nồng độ tuyến t nh nhỏ và phải sử dụng các chất tạo màu, phải đảm bảo các điều kiện phân t ch như

pH, dung môi phù hợp cho các th nghiệm

1.3.5 Phương pháp phổ Raman

Hiện tại, về phương diện định lượng, phổ Raman chưa thể hiện được nhiều thế mạnh so với phổ cận hồng ngoại nên việc ứng dụng phổ Raman để định lượng hầu như rất t chủ yếu được ứng dụng về định t nh và xác định cấu trúc chất phân

t ch Có thể thấy phổ Raman còn tồn tại một số vấn đề khiến chưa thể là phương pháp định lượng được ứng dụng rộng rãi

Thứ nhất, phổ Raman có chùm tia nhỏ, chỉ phân t ch được trong một diện

t ch nhỏ, không mang t nh đại diện cao cho mẫu phân t ch Trong nhiều trường hợp, không thể đồng nhất tuyệt đối mẫu đo được nên nhiều khi do vị tr phân t ch khác nhau mà đáp ứng phổ giữa các lần đo khác nhau, đặc biệt là khi đo phổ của các mẫu rắn Điều này dẫn đến sai số khi phân t ch dữ liệu để xây dựng mô hình định lượng bằng các phần mềm toán hóa

Thứ hai, muốn định lượng được phổ Raman thì sự đồng đều của các mẫu đo cần phải yêu cầu rất cao, nên phổ Raman thường chỉ có thể áp dụng cho các mẫu

phân t ch dạng dung dịch mà thôi Tuy nhiên, khi phân t ch dung dịch, hàm lƣợng chất phân t ch nhỏ nên yêu cầu thiết bị phải có độ phân giải và độ ch nh xác cao, kèm theo các điều kiện phân t ch phải ổn định [50, 102]

Một số nghiên cứu ứng dụng quang phổ Raman trong phân t ch dƣợc phẩm đƣợc thống kê trong bảng 1 4

Bảng 1.4: Danh sách các dược phẩm được nghiên cứu bằng phương pháp

FT Phân tích

dữ liệu phổ Lewis EN,

Kalasinsky VF,

Levin IW

[75]

nystatin, amphotericin A, amphotericin B

1.4 Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến phân tích các hoạt chất kháng sinh trong thuốc

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp đo phổ hồng ngoại

1.4.1.1 Sự xuất hiện của phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là phổ của các phân tử và nhóm phân tử xuất hiện dưới tác dụng của chùm sáng k ch th ch có năng lượng phù hợp (tương tác không đàn hồi) nằm trong vùng hồng ngoại (IR) làm cho các phân tử , các nhóm phân tử, nguyên tử quay và dao động Các quá trình đó sinh ra phổ hấp thụ hồng ngoại của chất dưới tác dụng của chùm sáng kích thích Như vậy, thành phần tạo ra phổ IR bao gồm sự quay của phân tử chất và các dao động của các nguyên tử và nhóm nguyên tử trong phân tử [9, 53, 70]

Năng lượng tạo ra 2 quá trình này là do chùm sáng kích thích cung cấp và nó xác định bởi công thức sau:

Etot= Eq+ Ed

Trong 2 thành phần này, Eq là năng lượng quay và Ed là năng lượng dao động Khi bị kích thích, bên cạnh sự dao động, các phân tử còn quay trong không gian và quay trong mặt phẳng Nghĩa là phân tử vừa quay, vừa dao động bởi nguồn sáng thích hợp IR

Mặt khác, vì năng lượng quay và dao động của phân tử là nhỏ,nên tần số của phổ hồng ngoại thường nằm trong vùng từ 12000 đến 10 cm-1 Trong toàn vùng phổ hồng ngoại này, người ta chia làm 3 miền nhỏ hồng ngoại gần: 12000- 4000 cm-1(800-3000nm), hồng ngoại trung bình: 4000 - 200 cm-1 (3000- 28000 nm), hồng ngoại xa: 200- 10 cm-1 ( 28000- 40000 nm)

Phổ hồng ngoại là phổ quay và dao động của các phân tử, nhóm phân tử, hay nhóm nguyên tử khi chúng bị kích thích bằng chùm tia sáng có năng lượng thích hợp trong vùng IR Vì trong phân tử của các chất, các nguyên tử có thể có các liên kết đơn (σ), liên kết đôi (п), liên kết ba khác nhau nên phổ IR của chúng cũng khác nhau Các liên kết bội đôi (-C=C-) và bội ba bao giờ cũng dễ hấp thụ năng lượng thấp, để tạo ra các dao động IR và dao động theo những kiểu khác nhau, tùy thuộc

vào các loại liên kết có trong phân tử chất, tức là cấu tạo phân tử của các chất bao gồm các dao động hóa trị (co kéo trên trục liên kết), các dao động biến dạng (lắc, đu đưa, xoắn và uốn trong không gian) [74] Như vậy, mỗi loại liên kết sẽ hấp thụ năng lượng khác nhau và ứng với những vùng phổ nhất định Tần số dao động vm của các nguyên tử trong phân tử phụ thuộc vào hằng số lực kiên kết k và khối lượng m của chúng theo công thức:

nó Do đó, muốn đo phổ IR của một chất ta tiến hành qua các bước như hình 1.10 :

Hình 1.10: Các bước phân tích quang phổ hồng ngoại

Chuẩn bị mẫu đo (rắn, lỏng, khí)

Nguồn kích thích phổ (chọn chùm sáng phù

hợp)

Bộ phận phát hiện (detector) (thu phổ IR của chất, phân ly

và ghi phổ)

Đánh giá phổ (định t nh, định lượng)

Trên nguyên tắc đó, có nhiều thiết bị và máy đo phổ IR khác nhau, tùy theo từng hãng chế tạo, từ đơn giản, cơ bản đến hoàn chỉnh đã được cung cấp ra thị trường thế giới [32]

+ Kỹ thuật hồng ngoại, chuyển hóa Fourier, FT- IR

Phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier (FT- IR) về nguyên tắc vẫn như kỹ thuật hồng ngoại phân tán (phân giải) thông thường Nhưng ở đây, bộ phận phân giải phổ

IR không phải hệ lăng k nh hay tấm cách tử mà là một hệ gương giao thoa kế kiểu Michell và máy t nh điều khiển hệ giao thoa này hoạt động làm nhiệm vụ chuyển hóa Fourier tín hiệu phổ IR Do đó, khả năng phân giải, tốc độ phân tích, của loại máy FT- IR cao hơn [47, 60]

Hình 1.11: Giao thoa kế Michell

Cấu tạo của giao thoa kế Michell gồm 2 gương phẳng M1 và M2 đặt vuông góc với nhau, nhưng M1 gắn cố định, còn gương M2 có thể tịnh tiến trên một đường thẳng nằm ngang trục OM về cả 2 phía (trái-phải)

Chùm tia bức xạ từ nguồn sau khi đi qua bộ tách S được chia thành 2 chùm vuông góc với nhau, trong đó một chùm đi lên gương cố định M1, còn chùm kia đi đến gương di động M2 Cả 2 chùm, khi gặp gương M1 và M2 chúng đều phản xạ toàn phần trở lại bộ tách S (bộ phận chia S) Đến đây, mỗi chùm lại được chia đôi một lần nữa, một nửa về nguồn, một nửa kia sẽ đi qua mẫu phân t ch đến detector Như vậy, chùm tia bức xạ đi đến mẫu đo gồm 2 bức xạ nhập lại từ 2 gương phản xạ tới có thời gian trễ ti khác nhau, nên cường độ bức xạ qua mẫu sẽ thay đổi theo thời

gian và phụ thuộc vào đoạn đường đi thay đổi của 2 chùm tia đi đến gương di dộng

M2 và trên cơ sở đó tạo ra sự phân giải phổ IR [32, 47]

Lợi thế của thiết bị đo phổ hồng ngoại chuyển hóa fourier là có thể mở rộng

khe đo Do đó, lượng ánh sáng đi vào detector sẽ lớn hơn nhiều so với thiết bị đo

phổ hồng ngoại phân giải thông thường kiểu cũ, nên t n hiệu cường độ phổ IR đo

được sẽ là rất lớn Vì thế phép đo phổ hồng ngoại chuyển hóa fourier có độ nhạy

tăng đáng kể so với kỹ thuật đo thông thường [47, 60]

Bảng 1.5: Bảng so sánh một số đặc điểm của 2 loại thiết bị

đo phổ hồng ngoại thường IR và FT-IR

Đặc điểm Thiết bị IR thông thường

kiểu cũ

Thiết bị IR chuyển hóa Fourier

Hệ quang Hệ quang cấu tạo phức tạp,

có nhiều phân chuyển động, dùng lăng k nh hay cách tử

để phân giải phổ

Hệ quang tương đối đơn giản, dùng hệ gương giao thoa Michell để phân giải phổ

Tỉ lệ (tín hiệu/nhiễu) (Tín hiệu/nhiễu) nhỏ (Tín hiệu/nhiễu nền) lớn

Kết quả đo Tại mỗi thời điểm chỉ có 1

bước sóng được đo

Đo được đồng thời nhiều bước sóng tại một thời điểm

Khe đo Khe đo phải mở nhỏ, không

mở rộng được

Khe đo có thể mở lớn được, nên tăng cường độ và

độ nhạy

Độ nhạy Độ nhạy không cao Độ nhạy cao

b) Cấu tạo thiết bị đo phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier

Như nguyên lý đã trình bày ở trên, một hệ máy đo phổ hồng ngoại FT-IR phải gồm các bộ phận cơ bản:

1) Nguồn sáng (như máy IR thông thường);

2) Hệ giao thoa kế Michell, bộ phân giải phổ IR;

3) Buồng mẫu và cuvet đựng mẫu;

4) Detector và modul điện tử;

5) Máy tính và bộ chương trình;

6) Bộ điều nhiệt buồng mẫu;

7) Bộ altals phổ IR;

1.4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại

Có nhiều yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại bao gồm ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử (hằng số lực hóa trị, sự thay thế đồng vị, hiệu ứng electron, yếu tố không gian, liên kết hidro nội phân tử), ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử, ảnh hưởng của quy trình chuẩn bị mẫu và ảnh hưởng của môi trường Tuy nhiên, với trạng thái tồn tại khác nhau của mẫu thì các yếu tố ảnh hưởng tác động đến các mẫu đo là khác nhau [7, 9, 47]

Với mẫu rắn, việc chuẩn bị mẫu là rất quan trọng Do mẫu rắn có hiện tượng tán xạ ánh sáng làm giảm cường độ hấp thụ của mẫu và làm mất đi những thông tin hóa học [78] Vì vậy, việc làm giảm tán xạ của mẫu đến mức tối thiểu là cần thiết Khi chuẩn bị mẫu ta phải đảm bảo các yêu cầu của mẫu đo có k ch thước hạt nhỏ, phân tán đồng đều, bề mặt nhẵn, trong, mỏng Mặt khác, đối với phổ truyền qua thông thường được áp dụng bằng định luật Lambert-Beer, nhưng với phương pháp phân tích phổ hồng ngoại cho mẫu rắn có sự sai lệch đáng kể do nồng độ của chất hấp thụ quá cao nằm ngoài khoảng tuyến tính của định luật [85] Ngay cả khi ở nồng độ thấp trong khoảng tuyến tính của định luật thì hiện tượng tán xạ ánh sáng cũng gây nên sự sai khác nên đồ thị thu được biểu diễn mối tương quan giữa nồng

độ và độ hấp thu quang cũng hiếm khi đi qua gốc tọa độ Một nguyên nhân nữa

khiến định luật Lambert-Beer không thể áp dụng trong việc định lượng các mẫu rắn bằng phương pháp phổ hồng ngoại là do phổ hấp thụ của các chất nằm trong các vùng hẹp chứa các đỉnh đặc trưng nên thường hẹp hơn dải phổ hồng ngoại được lựa chọn khi đo định lượng do đó có sự sai lệch phi tuyến ánh sáng Khi hiệu chỉnh bằng hồi quy đa biến việc hiệu chỉnh tốt nhất cho các biến ở nồng độ cao hay thấp tiến gần đến giá trị trung bình ta phải phân bố tập số liệu đồng đều Do đó, khi lập

ma trận nồng độ cần phân bố đồng đều nồng độ từ cao đến thấp Ngoài ra, còn yếu

tố ảnh hưởng của độ ẩm môi trường do xuất hiện pic của nước ở vùng sóng 3450cm-1 nên khi chuẩn bị mẫu đo cần giữ mẫu đo và chất nền khô [47]

Đối với mẫu khí và lỏng thì ảnh hưởng do hiện tượng tán xạ ánh sáng rất

ít, mà tín hiệu đo lại bị ảnh hưởng của các liên kết hidro nội phân tử, hiệu ứng electron, yếu tố không gian, ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử, ảnh hưởng của độ ẩm do nước tạo liện kết hidro hay tương tác với chất phân tích làm giảm cường độ ở các đỉnh đặc trưng làm mất thông tin hóa học liên quan đến chất phân tích [9]

1.4.2 Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

1.4.2.1 Cơ sở lí thuyết của phương pháp hồi quy đa biến

Phương pháp hồi quy đa biến về cơ bản khác với kỹ thuật đơn biến là dãy các mẫu chuẩn là hỗn hợp chứa các cấu tử cần phân tích (các biến độc lập X) và tín hiệu

đo gồm tất cả các chất có trong hỗn hợp đóng góp nên (biến phụ thuộc y) Do vậy,

để giải quyết bài toán bằng phương pháp bình phương tối thiểu thì phải có tín hiệu phân tích tại nhiều điểm (ví dụ độ hấp thụ quang hoặc cường độ vạch phổ tại nhiều bước sóng, cường độ dòng hòa tan tại nhiều giá trị thế, tốc độ phản ứng tại các thời gian khác nhau…) Dựa trên mô hình này có thể tìm được nồng độ của các cấu tử trong cùng mẫu định phân khi có tín hiệu phân tích của mẫu đó [10, 64]

Nếu các cấu tử có mặt trong hỗn hợp cho tín hiệu do có tính chất cộng tính

thì có thể sử dụng phương pháp hồi quy đa biến tuyến t nh thông thường (Multiple

linear regression- MLR) như phương pháp bình phương tối thiểu thông thường

(CLS) và nghịch đảo (ILS) dựa trên tập số liệu thô (raw data) hoặc bình phương tối

thiểu từng phần (PLS), phương pháp hồi quy thành phần chính (PCR)… trên tập số liệu đã rút gọn k ch thước Nhưng nếu trong hỗn hợp các cấu tử có sự tương tác lẫn nhau làm mất tính chất cộng tính tín hiệu đo thì phải sử dụng mô hình hồi quy đa biến phi tuyến tính (phổ biến là phương pháp phân t ch thành phần chính kết hợp với mạng nơron nhân tạo PCA- ANN) [10]

Các thuật toán về hồi quy tuyến tính và dự đoán nồng độ các chất trong cùng hỗn hợp cần được giải bằng phần mềm MATLAB, Uscrambler [5, 6, 71]…Một số thuật toán đơn giản như chỉ cần xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thì có thể

sử dụng MINITAB hoặc SPSS hay STATGRAPHICS

Hồi quy đa biến tuyến tính

Giả sử trong hỗn hợp cần phân t ch có k cấu tử (X1, X2…Xk), t n hiệu phân

t ch của hỗn hợp là y thì phương trình hồi quy đa biến mô tả quan hệ giữa y và các biến Xi (i=1,2,…k) có dạng:

y= a+ b1X1 + b2X2 +…+ bkXk (1.1)

Về mặt lý thuyết để tìm nồng độ của k cấu tử cần có t nhất k phương trình hồi quy Vì vậy thực tế sẽ cần tiến hành m th nghiệm (m ≥ k) với m mẫu chuẩn hỗn hợp thì sẽ lập được m phương trình hồi quy đa biến Dạng tổng quát của hệ phương trình này như sau:

y= a+Xb (1.2)

Trong đó b là vecto chứa các hệ số của phương trình hồi quy

y là vecto cột chứa m giá trị y1…ym còn X là ma trận có m hàng (ứng với m quan sát) và k cột (ứng với k biến)

Nếu t n hiệu đo ứng với mỗi th nghiệm có nhiều hơn một giá trị (v dụ đo độ hấp thụ quang một dung dịch chuẩn hỗn hợp tại p bước sóng thay vì một bước sóng) thì số liệu của Y sẽ là ma trận có m hàng và p cột (ymxp) như sau:

p p

y y

y

y y

y

y y

2 22

21

1 12

11

Các phương trình hồi quy tuyến t nh thu được sẽ cho biết:

- Những biến (cấu tử) nào có ảnh hưởng lớn (nếu giá trị tuyệt đối của hệ số hồi quy lớn) đến kết quả th nghiệm (t n hiệu đo)

- Biết được chiều hướng các ảnh hưởng (hệ số hồi quy mang dấu dương sẽ có ảnh hưởng cùng chiều đến kết quả th nghiệm và ngược lại)

- Tìm được nồng độ các cấu tử trong dung dịch cần định phân khi có t n hiệu phân tích y

Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phương pháp hồi quy đa biến tuyến t nh thành 2 nhóm ch nh: các phương pháp hồi quy đa biến tuyến

t nh sử dụng phổ toàn phần như phương pháp CLS, PLS, và phương pháp sử dụng dữ liệu phổ riêng phần như ILS [64, 69, 71]

square-CLS)

Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường là phương pháp định lượng trực tiếp được xây dựng dựa trên mô hình tuyến t nh nhiều điểm mà tại mỗi điểm, đáp ứng phổ và nồng độ chất phân t ch thay đổi tuyến t nh theo định luật Lambert - Beer Phương trình của mô hình như sau:

Trong đó: Y0: là ma trận chứa dữ liệu phổ của n mẫu;

X0: Ma trận nồng độ của m thành phần hóa học trong n mẫu;

K: Chứa các đáp ứng phổ của m thành phần hóa học trên;

E: Sai số của mô hình;

N: Số mẫu để xây dựng mô hình hồi quy đa biến

k: Số bước sóng;

m: Số cấu tử (thành phần hóa học) trong mỗi mẫu