Nghiên cứu trứng cá cá con làm cơ sở khoa học cho việc bảo vệ nguồn giống ở vùng biển vịnh Bắc Bộ Việt Nam

Nghiên cứu trứng cá cá con làm cơ sở khoa học cho việc bảo vệ nguồn giống ở vùng biển vịnh Bắc Bộ Việt Nam Nghiên cứu trứng cá cá con làm cơ sở khoa học cho việc bảo vệ nguồn giống ở vùng biển vịnh Bắc Bộ Việt Nam luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

ĐỐI KHÁNG CHỐNG Ralstonia solanacearum

GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

ĐỐI KHÁNG CHỐNG Ralstonia solanacearum

GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Lê Như Kiểu

2 PGS TS Lại Thúy Hiền

Hà Nội - 2015

iii

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Tiến sĩ Lê Như Kiểu và PGS TS Lại Thúy Hiền là những người thày đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tổ chức khoá đào tạo tiến sỹ này, giúp tôi có điều kiện học tập và nghiên cứu để nâng cao trình độ chuyên môn

- Phòng Đào tạo sau Đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành Luận án

- Ban lãnh đạo Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, tập thể cán bộ Bộ môn Vi sinh vật và các phòng liên quan

- Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án này

Hà Nội, ngày 20 tháng 07 năm 2015

Tác giả

Lê Thị Thanh Thủy

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

- Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tập san và tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

- Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả luận án

Lê Thị Thanh Thủy

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 12

2 Mục tiêu của luận án 13

5 Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 1.1 Tình hình trồng ớt, lạc ở Việt Nam và trên thế giới 15

1.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phát triển của vi khuẩn R

solanacearum

22

1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh do vi khuẩn ở Việt

Nam và trên thế giới

23

1.3.1 Bệnh héo xanh do vi khuẩn 23

1.4 Vi sinh vật đối kháng và cơ chế đối kháng 30

vật

32

2

1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng 38

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

45

2.2.1 Khảo sát tình hình bệnh héo xanh cây ớt và lạc ở miền

Bắc và miền Trung Việt Nam

46

2.2.1.1 Đánh giá tình hình bệnh héo xanh cây lạc ở miền Bắc và

miền Trung Việt Nam

46

2.2.1.2 Phân lập vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh trên

cây ớt và lạc

46

2.2.2 Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R solanacearum 49

2.2.2.2 Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn đối

kháng

50

2.2.2.5 Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt và lạc

(trong nhà lưới) của các chủng vi khuẩn đối kháng

55

2.2.3 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh HX 57

2.2.3.1 Nghiên cứu sự tương tác của chủng B subtilis ĐKB1 và P

fluorescens ĐKP1 trên cùng môi trường

57

2.2.3.2 Xác định các điều kiện nhân sinh khối phù hợp của 2 chủng

B subtilis ĐKB1 và P fluorescens ĐKP1

57

3

2.2.4 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và

lạc ngoài đồng ruộng

60

2.2.4.1 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và

lạc ở điều kiện thí nghiệm ngoài đồng ruộng

60

2.2.4.2 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và

lạc ở mô hình ngoài đồng ruộng

61

3.1 Khảo sát tình hình bệnh héo xanh cây ớt và lạc do R

solanacearum ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam

63

3.1.1 Bệnh héo xanh cây ớt ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam 63

3.1.2 Bệnh héo xanh cây lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam 63

3.1.3 Phân lập vi khuẩn R solanacearum gây bệnh HX cây ớt và

lạc

65

lạc) và YH3 (gây bệnh HX trên ớt) bằng phân nhóm biovar

71

3.2 Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R solanacearum 73

3.2.1.1 Phân lập, lựa chọn các chủng vi khuẩn kháng vi khuẩn gây

bệnh héo xanh cây ớt

74

3.2.1.2 Phân lập, lựa chọn các chủng vi khuẩn kháng vi khuẩn gây

bệnh héo xanh cây lạc

79

3.2.1.3 Khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt và lạc trong nhà

lưới của hai chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1

84

3.2.2 Hoạt tính sinh học các chủng VKĐK tuyển chọn 89

4

3.2.4 Đánh giá an toàn sinh học của vi khuẩn đối kháng 94

3.2.4.1 Xác định độc tính của vi khuẩn đối kháng bằng danh mục an

toàn sinh học của vi sinh vật

95

3.2.5 Xác định loại kháng sinh do các chủng vi khuẩn tuyển

3.3 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh HX 106

3.3.1.1 Đánh giá khả năng tồn tại cùng nhau trên môi trường của 2

3.3.2.6 Xác định tỷ lệ giống cấp 2 phù hợp cho nhân sinh khối 114

3.3.2.8 Hoạt tính đối kháng của 2 chủng vi khuẩn sau nhân sinh khối 117

3.3.4 Sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng chống bệnh héo 122

5

xanh cây ớt và lạc

3.3.4.1 Xây dựng Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng

chống bệnh héo xanh cây lạc và ớt

122

3.3.4.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng R solanacearum của chế phẩm

HX

125

3.4 Hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và lạc 127

6

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

Chromatography

Sắc ký lỏng cao áp

Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia

Vi khuẩn khu trú trong vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng.1.1: Các race quan trọng nhất, cây ký chủ, phân bố địa lý của

R solanacearum

18

Bảng 2.1: Phân nhóm vi khuẩn R solanacearum thành các biovar 48

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn R

solanacearum phân lập từ cây ớt

66

Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn R

solanacearum phân lập từ cây lạc

68

Bảng 3.3: Khả năng ức chế vi khuẩn R solanacearum gây bệnh

héo xanh cây ớt của các chủng vi khuẩn phân lập

75

Bảng 3.5: Khả năng cạnh tranh của chủng ĐKB1 với chủng vi

khuẩn R solanacearum YH3 gây bệnh héo xanh cây ớt

78

Bảng 3.6: Khả năng ức chế vi khuẩn R solanacearum gây bệnh

héo xanh cây lạc của các chủng vi khuẩn phân lập

79

Bảng 3.7: Một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn ĐKP1 82

Bảng 3.8: Khả năng cạnh tranh của vi khuẩn đối kháng ĐKP1 và

chủng vi khuẩn R solanacearum LH3

83

Bảng 3.9: Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt (giống ớt cay

LN57) trong nhà lưới của hai chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1

85

Bảng 3.10: Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây lạc (giống lạc

L14) trong nhà lưới của hai chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1

87

Bảng 3.11: Đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn kháng vi

khuẩn gây bệnh héo xanh lạc và ớt

Bảng 3.15: Đánh giá khả năng gây độc tính cấp của các chủng vi

khuẩn nghiên cứu trên chuột bạch, thí nghiệm sau 24 giờ

96

Bảng 3.16: Đánh giá khả năng gây độc bán trường diễn của các

chủng vi khuẩn nghiên cứu trên chuột bạch, thí nghiệm

97

Bảng 3.18: Kết quả thay đổi trọng lượng của chuột thí nghiệm 98

Bảng 3.19: Khả năng tồn tại của chủng B subtilis ĐKB1 và P

fluorescens ĐKP1 trong điều kiện hỗn hợp và đơn lẻ

107

Bảng 3.20: Hoạt tính đối kháng R solanacearum của chủng B

subtilis ĐKB1 và P fluorescens ĐKP1 trong điều kiện hỗn hợp và đơn lẻ

108

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng đến sinh

trưởng của 2 chủng vi khuẩn

109

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn

110

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủngvi

khuẩn sau 48h nuôi

111

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của lượng không khí đến sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn sau 48h nuôi

112

Bảng 3.25: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sinh trưởng của các

chủngvi khuẩn sau 48h nuôi

114

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 2 bổ sung đến chất lượng

sinh khối vi khuẩn

115

Bảng 3.27: Thời gian nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn 116

Bảng 3.28: Hoạt lực đối kháng R solanacearum của 2 chủng vi

khuẩn trước và sau nhân sinh khối

Bảng 3.32: Hoạt lực đối kháng R solanacearum của B subtilis

ĐKB1 và P fluorescens ĐKP1 trong chất mang dạng

bột sau 30 ngày nhiễm

120

Bảng 3.33: Khả năng tồn tại của 2 chủng vi khuẩn B subtilis ĐKB1

và P fluorescens ĐKP1 trong chất mang

121

Bảng 3.34: Khả năng tồn tại của B subtilis ĐKB1 và P fluorescens

ĐKP1 trong chế phẩm HX sau thời gian bảo quản

125

Bảng 3.35: Hoạt lực đối kháng R solanacearum của chế phẩm vi 126

Bảng 3.37: Hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX tới sinh trưởng và

phát triển của cây ớt (giống ớt ngọt Mỹ)(tại xã Tráng Việt, Mê Linh, Vĩnh Phúc, vụ Hè Thu 2013)

127

Bảng 3.38: Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn của chế

phẩm vi sinh HX trên cây lạc (xã Hòa Nam, Ứng Hòa,

Hà Nội, vụ Hè Thu 2013)

129

Bảng 3.39: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh HX đến các yếu tố cấu

thành năng suất lạc (xã Hòa Nam, Ứng Hòa, Hà Nội, Vụ

Hè Thu 2013)

130

Bảng 3.40: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh HX đến sinh trưởng,

phát triển và năng suất lạc (xã Hòa Nam, Ứng Hòa, Hà Nội, Vụ Hè Thu 2013)

131

Bảng 3.41: Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt (giống ớt cay

Hàn Quốc) của chế phẩm vi sinh HX (xã Tiền Phong, Mê Linh, Hà Nội, vụ Đông Xuân 2014)

131

Bảng 3.42: Hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX đến sinh trưởng và

phát triển của cây ớt (giống ớt cay Hàn Quốc)(tại Tiền Phong, Mê Linh, Vĩnh Phúc, vụ Đông Xuân, 2014)

132

Bảng 3.43: Hiệu quả kinh tế của chế phẩm vi sinh HX trong mô hình

ớt (xã Tiền Phong, Mê Linh, Hà Nội, vụ Đông Xuân 2014)

133

Bảng 3.44: Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây lạc - giống L14

của chế phẩm vi sinh HX (Tĩnh Gia, Thanh Hóa, vụ Đông Xuân, 2014)

134

Bảng 3.45: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh HX đến sinh trưởng,

phát triển và năng suất lạc- giống L14 tại Tĩnh Gia, Thanh Hóa, vụ Đông Xuân, 2014

134

Bảng 3.46: Hiệu quả kinh tế của mô hình lạc khi bón chế phẩm vi

sinh HX tại Thanh Hóa, vụ Đông Xuân 2014

135

10

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn R solanacearum Pss4, nuôi cấy

Hình 1.2: Cây lạc bị chết do bệnh héo xanh vi khuẩn (mẫu bệnh héo xanh

lạc thu thập tại Tĩnh Gia, Thanh Hóa)

26

Hình 1.3: A: Cây ớt bị chết do bệnh héo xanh vi khuẩn; B Dịch vi khuẩn

R solanacearum màu trắng sữa thôi ra từ thân cây bị bệnh HXVK (Nguồn: Viện TNNH)

26

Hình 3.1: Bệnh héo xanh cây lạc (Nghi Lộc, Nghệ An, tháng 3-2014) 64

Hình 3.3: Hình ảnh thử phản ứng siêu nhạy trên lá thuốc lá 70

Hình 3.4: Sự chuyển hoá 6 môi trường biovar của chủng vi khuẩn LH3

Hình 3.6: Tế bào của chủng vi khuẩn LH3 gây bệnh HX điển hình, chụp

dưới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại x 25.00 lần

Hình 3.11: Minh hoạ thí nghiệm đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh HX cây

ớt trong nhà lưới của các chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1

85

Hình 3.12: Minh hoạ thí nghiệm đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh HX cây

lạc trong nhà lưới của các chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1

Hình 3.16: Hoạt lực đối kháng vi khuẩn R solanacearum gây héo xanh

lạc và ớt của chủng B subtilis ĐKB1 và P fluorescens ĐKP1

99

Hình 3.17: Ảnh chụp TLC mẫu phenazine dịch lên men (1) và phenazine 101

11

chuẩn (2) Hình 3.18: Hình ảnh peak của phenazine thu được từ dịch lên men (mẫu

T1) trên sắc ký đồ HPLC

101

Hình 3.19: Hình ảnh peak của phenazine chuẩn (Mẫu T2) trên HPLC 102

Hình 3.20: Phổ tử ngoại của mẫu phenazine từ dịch lên men chủng P

fluorescens ĐKP1 (Mẫu T1)

102

Hình 3.21: Phổ tử ngoại của mẫu phenazine chuẩn (Mẫu T2) 103

Hình 3.22: (A) Vùng ức chế của dịch nuôi cấy ĐKP1; (B) Vùng ức chế

của phenazine từ bản gen TLC đối với vi khuẩn R

solanacearm gây bệnh héo xanh lạc

105

Hình 3.26: Nuôi cấy vạch 2 chủng vi khuẩn B.subtilis ĐKB1 và P

fluorescens ĐKP1 trên cùng môi trường dinh dưỡng

106

Hình 3.27: Hoạt tính đối kháng R solanacearum 2 chủng vi khuẩn

B.subtilis ĐKB1 và P fluorescens ĐKP1 trong chất mang sau

30 ngày nhiễm, trong điều kiện hỗn hợp chủng vi khuẩn (A) và đơn chủng vi khuẩn (B)

108

Hình 3.28: Minh họa quá trình sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng chống

bệnh héo xanh cây lạc và ớt

122

Hình 3.29: Sơ đồ Qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng chống

bệnh héo cây lạc và ớt

123

Hình 3.30: Hoạt lực đối kháng R solanacearum của chế phẩm vi sinh HX

sau 6 tháng bảo quản

126

Hình 3.31: Thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm vi sinh HX trên ớt

ngoài đồng ruộng (xã Tráng Việt, Mê Linh, Vĩnh Phúc, vụ Hè Thu 2013)

128

Hình 3.32: Thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm vi sinh HX trên lạc

ngoài đồng ruộng (xã Hòa Nam, Ứng Hòa, Hà Nội, Vụ Hè Thu 2013)

129

Hình 3.33: Mô hình đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây

ớt tại xã Tiền Phong, Mê Linh, vụ Đông Xuân, 2014

132

Hình 3.34: Mô hình đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây

lạc tại Tĩnh Gia, Thanh Hóa, vụ Đông Xuân, 2014

136

12

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Bệnh hại cây trồng đã gây thiệt hại đáng kể trong sản xuất và bảo quản nông sản Trong đó, phải kể đến bệnh héo xanh (Bacterial wilt disease) do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum (HXVK) gây ra Vi khuẩn R solanacearum tồn tại lâu

trong đất, tàn dư thực vật và được thông báo gây hại nhiều loại cây thuộc họ cà và đậu ở nhiều nơi trên thế giới từ những năm 80 của thế kỷ XIX Nguyên nhân gây bệnh được nhà bác học người Mỹ E.F.Smith xác định năm 1896, ở đâu có trồng các loại cây họ cà và đậu (cà chua, khoai tây, ớt, lạc, đậu tương,…) là thấy sự có mặt

của bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây ra Ngoài ra nó còn ký sinh

trên 200 loài thực vật khác như chuối, thuốc lá, bí, dưa chuột, Đây là bệnh phổ biến, nguy hiểm và phân bố rộng khắp trên thế giới, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [78, 93, 115] Bệnh héo xanh do vi khuẩn được coi là một trong năm loại bệnh cây trồng thuộc đối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ sâu bệnh tổng hợp của FAO (1992) và chịu sự kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất

Trước tình hình đó, đã có nhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây trồng, cũng như áp dụng biện pháp kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các chế phẩm vi sinh, phân hữu cơ vi sinh chứa các chủng vi sinh vật đối kháng có khả năng

ức chế và làm giảm tính độc của R solanacearum Tuy nhiên, các biện pháp vẫn

còn hạn chế là: khả năng giảm tỉ lệ bệnh còn thấp, thời gian bảo quản chế phẩm ngắn, hiệu quả chưa cao nên chưa đáp ứng nhu cầu của thực tiễn, v v

Hơn nữa, với bản chất biến đổi tính độc liên tục (do các chủng R

solanacearum độc luôn bị ảnh hưởng bởi hóa chất bảo vệ thực vật, tác động của môi

trường, v…v…) cũng như sự đa dạng của vi khuẩn R solanacearum trên toàn thế

giới, nên các biện pháp phòng trừ bệnh này ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn hơn Bệnh héo xanh do vi khuẩn ở Việt Nam cũng xuất hiện ở mọi lúc, mọi nơi, xâm nhiễm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng, có nơi có lúc bệnh hại nặng tới mức gây chết 90% cây trồng [10]

13

Trong khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học để hạn chế vi khuẩn R

solanacearum không những hiệu quả rất thấp mà còn gây ảnh hưởng xấu tới môi

trường sinh thái, chất lượng sản phẩm và sức khỏe cộng đồng Do đó, việc thường

xuyên phân lập các chủng R solanacearum mới, có tính độc cao từ ngoài đồng

ruộng là rất cần thiết, vì những chủng này sẽ là đối tượng cho việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật (VSV) vừa có khả năng đối kháng cao với chúng vừa cạnh tranh tốt với các VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng để sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh HXVK, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, giảm thiệt hại kinh tế cho người nông dân và xã hội là việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng chống Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng” Trong số các cây trồng quan trọng trong nông nghiệp của Việt

Nam thì cây lạc và ớt có giá trị dinh dưỡng rất cao, mang lại lợi ích kinh tế rất lớn cho xuất khẩu và phục vụ tiêu dùng trong nước Tuy nhiên, hai loại cây này thường

bị bệnh HXVK ở mức độ cao, có những vùng chuyên canh lạc và ớt bị bệnh héo xanh tới 30-40%, có nơi không thể trồng được 2 loại cây này nữa, vì mầm bệnh tiềm tàng trong đất rất lớn và rất lâu Trước tình hình thực tế trên, luận án sẽ đi sâu nghiên cứu bệnh HXVK ở cây lạc, ớt và phân lập, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng

(VKĐK) cũng như xác định cơ chế kháng vi khuẩn R solanacearum của các chủng

VKĐK tuyển chọn để sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và ớt

2 Mục tiêu của luận án

Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn đối kháng có khả năng kháng cao với vi

khuẩn R solanacearum để sản xuất chế phẩm vi sinh ứng dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh cây ớt và lạc Xác định được cơ chế kháng vi khuẩn R solanacearum

của các chủng VKĐK tuyển chọn

14

3 Nội dung nghiên cứu của luận án

3.1 Khảo sát tình hình bệnh héo xanh cây ớt và lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt

Nam; Phân lập vi khuẩn R.solanacearum

3.2 Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R solanacearum

3.3 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh HX

3.4 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và lạc

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Góp phần làm sáng tỏ mức độ đa dạng sinh học của quần thể vi khuẩn R

solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng Bổ sung một số chủng VKĐK với R solanacearum vào bộ sưu tập giống VSV nông nghiệp Việt Nam Cung cấp những

luận cứ và cơ sở khoa học về hướng ứng dụng VSV đối kháng trong phòng chống bệnh héo xanh cây trồng nói chung, cây ớt và lạc nói riêng Sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh (HX) trong phòng chống bệnh héo xanh cây ớt và lạc có hiệu quả cao, thân thiện với môi trường

5 Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nam; bệnh héo xanh vi khuẩn; chế phẩm vi sinh phòng bệnh héo xanh

học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Thành phố Hà Nội, tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa

6 Những đóng góp mới của luận án

- Phân lập, tuyển chọn mới được 2 chủng vi khuẩn B subtilis ĐKB1 và P

fluorescens ĐKP1, ức chế mạnh vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh

- Xác định được một số cơ chế chính kháng R solanacearum là do 2 chủng

VKĐK sinh kháng sinh Phenazine, Iturin A và siderophore tiêu diệt hoặc làm giảm

tính độc của R solanacearum trên cây ớt và lạc

- Sản xuất được chế phẩm vi sinh HX chứa 2 chủng VKĐK trên nền chất mang là: than bùn + 5% rỉ đường + 1% bột vỏ tôm cua có khả năng hạn chế 89,82% bệnh héo xanh cây ớt và 89,39% bệnh héo xanh cây lạc trên đồng ruộng

15

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình trồng ớt, lạc ở Việt Nam và trên Thế giới

1.1.1 Tình hình trồng ớt và lạc ở Việt Nam

* Cây ớt: Ở Việt Nam, ớt cay được trồng ở nhiều tỉnh thành trong cả nước,

phổ biến nhất là Hải Dương, Hải Phòng, các tỉnh miền Trung, thành phố Hồ Chí Minh Riêng tỉnh Quảng Trị hàng năm trồng tới 100.000 ha ớt cay để xuất khẩu

Quảng Bình cũng là một trong những tỉnh có diện tích trồng ớt lớn, mỗi năm trồng

khoảng 125.000 ha Năm 2011, Thái Bình có diện tích trồng ớt 1.200 ha, năm 2012

đã tăng lên 1.500 ha Một số tỉnh miền Trung có nơi trồng tới 15.000-20.000 ha ớt đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn trồng lúa và có thể đạt 400 triệu đồng/ha/năm Ớt ngọt được trồng ở Vĩnh Phúc khoảng 200 ha Từ 41 ha (vụ Đông 2011-2012), đến nay, diện tích trồng ớt của huyện Yên Định, Thanh Hóa đã mở rộng lên 215 ha, thu hút hàng trăm hộ tham gia, cây ớt đã cho nguồn thu từ 40 đến 45 tỷ đồng/năm Ở Bình Định, huyện Phù Mỹ là địa phương có phong trào trồng ớt mạnh nhất, trong vụ Đông Xuân 2012-2013 diện tích trồng ớt cũng tăng đột biến lên 800 ha, tăng hơn

200 ha so cùng kỳ năm trước [23]

* Cây lạc: Lạc là cây có dầu quan trọng trong số các loại cây có dầu đang

trồng trên thế giới, sản phẩm của lạc có nguồn protein cao làm thức ăn tốt cho người

và gia súc, làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến Sản phẩm lạc là một mặt hàng có kim ngạch xuất khẩu khá lớn Hàng năm, Việt Nam xuất khẩu 100.000-135.000 tấn lạc (đạt khoảng 65-120 triệu USD) [13, 24]

Năm 2012, diện tích trồng lạc của cả nước đạt 220.500 ha Tới năm 2014, tổ chức USDA (Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) dự báo diện tích gieo trồng sẽ tăng lên 230.000 ha và sản lượng cũng tăng 7,8% ở mức 530.000 tấn Điều kiện thời tiết thuận lợi và những cải thiện về giống sẽ góp phần thúc đẩy năng suất và sản lượng lạc Năm 2015, sản lượng lạc được dự báo tăng lên 550.000 tấn cùng với sự mở

16

rộng về diện tích gieo trồng Khu vực trồng lạc chủ yếu tập trung ở bờ biển Bắc

Trung Bộ, khu vực miền núi và trung du Bắc Bộ và Duyên Hải Nam Trung Bộ [23]

1.1.2 Tình hình trồng ớt và lạc trên Thế giới

* Cây ớt: Diện tích trồng ớt cay trên thế giới khoảng 1,7 triệu ha, tổng sản

lượng 11,25 triệu tấn, trong đó châu Á chiếm khoảng 1/3, tập trung ở Ấn Độ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Indonesia, Thổ Nhĩ Kỳ và Malaysia Tính đến 2008, Trung Quốc

là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới, tiếp theo là Mexico

Sản lượng ớt ở những nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Pêru, Bănglađét, Hungari và những nước khác đang tăng lên, với tốc độ tăng khoảng 5,2% mỗi năm, sản lượng của Ấn Độ hàng năm chiếm từ 50 đến 60% tổng sản lượng toàn cầu Sản lượng của Trung Quốc và Pêru tăng nhanh, trong khi sản lượng của Hungari giảm

Ấn Độ có diện tích trồng ớt năm 2005 là 737.000 ha, giảm xuống 654.000 ha năm

2006, nhưng tăng lên 737.000 ha năm 2007 Năm 2008, diện tích trồng là 805.000ha

và năm 2009 là 750.000 ha Sản lượng ớt Ấn Độ năm 2005 đạt 1.185 triệu tấn, năm

2006 đạt 1.014 triệu tấn, năm 2007 tăng lên 1.242 triệu tấn, năm 2008 ở mức 1.297 triệu tấn và năm 2009 đạt 1.167 triệu tấn [64]

* Cây lạc: Cây lạc được trồng ở tất cả các châu lục với hơn 100 nước trên thế

giới, với tổng diện tích ít biến động ở các vụ trong năm Năm 2009, diện tích trồng lạc trên thế giới khoảng 23,95 triệu ha, năng suất trung bình đạt 15,2 tạ/ha và sản lượng đạt 36,41 triệu tấn/năm

Tuy nhiên, sự phân bố về diện tích, năng suất, sản lượng lại tập trung không đều giữa các khu vực trồng lạc khác nhau trên thế giới Sản xuất lạc phát triển mạnh

ở châu Á (chiếm 50% tổng diện tích toàn cầu và 64% tổng sản lượng lạc của thế giới) và châu Phi (chiếm 46 % tổng diện tích toàn cầu và 28% tổng sản lượng của thế giới) Những nước trồng lạc lớn trên thế giới là Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ, Nigeria và Myama [64]

17

1.2 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.2.1 Đặc điểm phân loại vi khuẩn R solanacearum

Tế bào loài R solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu,

thường thấy ở dạng đơn, ghép đôi hoặc ghép 4, nhưng ít khi kết thành chuỗi, không hình thành nội bào tử Tuy có sự dao động đáng kể nhưng kích thước tế bào của

(non-encapsulated) R solanacearum dương tính với catalaza, oxidaza và làm giảm hàm

lượng nitrat, không thủy phân tinh bột và gelatin, bị ức chế trong môi trường thịt có NaCl lớn hơn 2% [144] Hầu như chúng luôn chuyển động, có một đến vài tiên mao

ở một cực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thường nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy, màu trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng (hình 1.1) Cả chủng có tính

độc cao và tính độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa [111] Vị trí phân loại của R

solanacearum được sắp xếp theo NCBI (2005) như sau: Giới: Bacteria; Ngành: Proteobacteria; Lớp: Betaproteobacteria; Bộ: Burkholderiales; Họ:

Burkholderiaceae; Chi: Ralstonia; Loài: solanacearum

Hình 1.1 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn R solanacearum Pss4 , nuôi cấy trên môi trường TTC (nguồn: Viện Thổ nhưỡng nông hóa)

Các nhà khoa học đã chia R solanacearum thành 5 race khác nhau, sự phân

chia các race thường rất phức tạp do phụ thuộc vào thành phần cây chủ và phạm vi phân bố của chúng [39] Race 1 là nhóm gây hại với phổ ký chủ rộng và phổ biến ở các nước khu vực châu Mỹ, châu Phi, châu Á và Nam Mỹ Race 2 chủ yếu gây bệnh

18

cho chuối và tập trung ở Trung tâm châu Mỹ và Đông Nam Á Race 3 phân bố rộng khắp trên thế giới và liên quan chủ yếu đến cây khoai tây Race 4 gây hại trên cây gừng ở Châu Á và Hawaii; Race 5 gây hại đến cây dâu tằm ở Trung Quốc [56, 93,

119] Race 2 và 3 là các race quan trọng của R solanacearum (bảng 1.1) và gây

bệnh trên nhiều loại cây trồng có giá trị cao trong nông nghiệp

Dựa trên các đặc điểm sinh hoá, khả năng sử dụng và ôxy hóa một số disaccharide (cellobiose, lactose và maltose) và rượu hexose (dulcitol, manitol và

sorbitol), He và cs (1983) đã chia R solanacearum thành 5 biovar khác nhau

Biovar 1 và 2 thuộc loại dinh dưỡng kém linh hoạt so với biovar 3 và 4, giữa các biovar khác nhau bởi các hình ảnh điện di đồ, các protein màng Biovar 1 và 2 còn khác biovar 3, 4 và 5 trên cơ sở phân tích các mẫu ADN và RFLP [79, 112]

Bảng 1.1: Các race quan trọng nhất, cây ký chủ và phân bố địa lý

của R solanacearum

(Nguồn: Denny và Hayward, 2001)[55]

Biovar 1 và 2 chiếm ưu thế ở châu Mỹ, biovar 3 ở châu Á Ở Philippin thấy

có mặt cả 4 biovar, còn biovar 2 có phân bố địa lý rộng nhất, trong khi đó biovar 3

có đặc điểm dinh dưỡng linh hoạt hơn cả Có một bằng chứng cho rằng R

solanacearum là một loài cổ, chỉ có quan hệ xa với các loài thuộc chi Ralstonia

19

Theo phân loại, R solanacearum như là một nhóm thuộc Ralstonia đã được biết

trong nhiều năm dựa vào phân tích số liệu của những đặc điểm hình thái, lai ADN - ADN hoặc ARN-ARN [57]

Dựa vào sự đa hình về chiều dài đoạn ADN được tạo ra bởi các enzym cắt giới hạn (RFLP), Cook đã chia các biovar thành hơn 40 nhóm RFLP [52]

Trình tự nucleotide của R solanacearum FQY-4 khoảng 3,715,422 bp, trong

đó tỉ lệ G+C trung bình là 66,8% [51]

Theo Fegan (2005), R solanacearum được chia làm 4 phylotype, liên quan

đến 4 nhóm gen chính, mỗi nhóm lại liên quan đến khu vực địa lý xuất hiện

Phylotype I gồm tất cả các chủng R solanacearum thuộc biovar 3,4,5 được phân lập

từ châu Á Phylotype II bao gồm các chủng thuộc biovar 1, 2 và 2T (là phân nhóm dưới biovar 2, khu vực nhiệt đới), phân lập từ châu Mỹ; tất cả các chủng thuộc race 3 gây bệnh cho khoai tây và race 2 gây bệnh cho chuối Phylotype III gồm các chủng thuộc biovar 1 và 2T, từ châu Phi và các khu vực bán đảo xung quanh Phylotype IV, nhiều hỗn tạp, với biovar 1, 2 và 2T từ Indonesia, Australia và Nhật Bản, cũng như

loài R syzygii và vi khuẩn gây bệnh máu (BDB) [65]

Tài liệu ngày 02 tháng 11 năm 2014 của Tổ chức phi lợi nhuận (Wikimedia Foundation) đăng trên http://en.wikipedia.org/wiki/Ralstonia_solanacearum, khẳng

định rằng: Vi khuẩn R solanacearum là một loại vi khuẩn gây bệnh cây trồng quan

trọng nhất trên thế giới vì khả năng gây chết, tồn tại, phổ cây chủ, phân bố địa lý rộng và gây thất thoát năng suất cây trồng của nó

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn R solanacearum

R solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử, có khả năng

tổng hợp poly-3-hydroxybutyrat (PHB) như là nguồn cacbon dự trữ, oxy là chất nhận điện tử cuối cùng của chuỗi biến đổi thức ăn, trong vài trường hợp nitrat được

sử dụng như là chất nhận điện tử, một vài loại lại oxy hoá hợp chất vô cơ không bắt

nguồn năng lượng chính Vì vậy, R solanacearum có thể sinh trưởng trên nhiều loại môi trường khác nhau, khi nuôi cấy R solanacearum có thể dùng các loại môi

trường chứa cao nấm men, pepton, cazein, đường, glycerin trong điều kiện hiếu khí

20

hợp cho R solanacearum phát triển, trong thân cây mật độ tế bào của chúng có thể

PHB là một loại PHA (polyhydroxyalkanoate) được sinh ra từ nhiều loại vi khuẩn, trong điều kiện dư thừa cacbon và thiếu hụt dinh dưỡng dẫn đến tích lũy cacbon và năng lượng trong tế bào [147] 3 gen qui định các enzyme điều khiển 3 phản ứng quá trình sinh tổng hợp PHB là Acetoacetyl CoA reductase, - ketotiolase, PHB polymerase [106]

R solanacearum và một số vi khuẩn gram âm như Pseudomonas, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacterium…không sử dụng con đường đường phân thông thường

hay pentose- phosphate mà sử dụng con đường Entner- Doudoroff Con đường Entner- Doudoroff phân giải glucose thành pyruvate, ATP, ADH và ADPH [132]

Mặc dù không tạo ra sắc tố phát huỳnh quang, nhưng nó có thể tổng hợp sắc

tố mầu nâu khi khuếch tán trên môi trường thạch có chứa tyrozin R solanacearum

có thể khử nitrat thành nitrit, nhưng không thuỷ phân tinh bột, hoá lỏng yếu hoặc

không hoá lỏng gelatin R solanacearum có phản ứng khác nhau với chất kháng

sinh, các nòi của chúng có thể mẫn cảm với streptomyxin, chống chịu với penixilin, viomyxin, [79]

Năm 1963, Sequeira và William đã phát hiện cả 2 dạng độc và không độc của

R solanacearum đều tổng hợp IAA dễ dàng ngay cả khi không có mặt tryptophan

trong môi trường nuôi cấy Hơn nữa, một chủng R solanacearum có tính độc đã

tổng hợp IAA từ nhân vòng của tryptophan chứ không phải từ các chuỗi thẳng Như vậy, chủng có dạng khuẩn lạc chảy lỏng và có tính độc này đã không tuân thủ trình

tự chuyển hoá Tryptophan > Indol - Axetaldehit > IAA như đã thấy ở hầu hết các

vi sinh vật (VSV) và thực vật bậc cao [138] Trong khi đó, một đột biến có dạng khuẩn lạc hình chai, không độc lại chuyển hoá cả nhân vòng và mạch thẳng của tryptophan thành IAA [138, 140]

1.2.3 Các hình thức xâm nhập của R solanacearum vào cây chủ

R solanacearum có nhiều gen điều khiển 6 hệ thống tiết ra protein, trong đó

được nghiên cứu nhiều nhất là “Hệ thống tiết kiểu 3” (T3SS hoặc TTSS) Nhờ đó R

21

solanacearum tiết ra những protein gọi là “T3Es” kích thích và thúc đẩy nhanh quá

trình xâm nhiễm của R solanacearum vào tế bào cây chủ T3SS được mã hóa bởi

các gen hrp [63, 87]

Vi khuẩn R solanacearum được lưu tồn từ đất và nước, các dòng chảy là

nguồn phát tán chủ yếu vi khuẩn vào môi trường [62] Nhờ khả năng tạo một quần

thể trong quản bào và mao mạch thân gỗ, R solanacearum rất khác biệt với phần

lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa và gây thối ở những chỗ vi khuẩn tấn công, trước tiên là các mô mềm (nhu mô) Người ta thường thấy những hình thức xâm nhập của

R solanacearum vào cây chủ có quan hệ mật thiết với các cơ thể đơn bào ăn rễ ở

trong đất (Meloidogyne spp.), khi có sự tương tác giữa giun tròn với R

solanacearum thì tốc độ xâm nhiễm của vi khuẩn vào thân cây chủ sẽ tăng, đồng

thời khả năng tồn tại cũng tăng [88]

Bệnh phát triển mạnh nhất khi R solanacearum và giun tròn được nhiễm

đồng thời, tỉ lệ mắc bệnh cao khi giun tròn được nhiễm vào đất trước vi khuẩn

Nhiễm R solanacearum đơn lẻ thì mức độ bệnh sẽ giảm, điều này chứng minh rằng

giun tròn đã làm tổn thương bộ rễ của cây và qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào bên trong mô mạch Mức độ xâm nhiễm của vi khuẩn vào rễ nhờ đơn bào được biểu thị qua chỉ số vết thương trên rễ, tuy nhiên những đơn bào cũng có thể làm thay đổi trạng thái của mô, làm mô trở nên thuận lợi hơn cho sự quần tụ của vi khuẩn Khi vi khuẩn đã xâm nhập vào cây chủ, thì tại đó các enzyme pectinase, cellulase và protease bắt đầu hoạt động, gây nên sự phá huỷ tế bào của cây [77]

Bên cạnh đó còn có các hình thức xâm nhập khác thông qua côn trùng như:

ong, kiến hoặc các loại sâu gây hại khác v v có mang R solanacearum, chúng

chích vào cây, qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào cây chủ, hình thức này rất phổ biến và lan truyền nhanh Ngoài ra, còn do sự chăm sóc dẫn đến đứt rễ, sây sát thân, dập lá cây, lúc này vi khuẩn tiềm tàng trong đất có cơ hội xâm nhập vào cây

chủ Hơn nữa, R solanacearum gây bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác, hoặc

từ vùng này đến vùng khác là do: Di chuyển vật liệu trồng trọt và hạt giống cũng có thể là vật mang mầm bệnh [11]

22

1.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn R solanacearum

1.2.4.1 Nhiệt độ không khí

vĩ tuyến Nam xa xích đạo nhưng thường không nặng, vì nhiệt độ mùa đông tại đây quá thấp Tốc độ phát triển của bệnh tăng sau khi lây nhiễm nếu nhiệt độ tăng trong

bệnh trong cây chủ, dẫn đến cây bị héo nhanh hơn, số lượng vi khuẩn chuyển dịch vào đất nhiều hơn, dẫn đến sự xâm nhiễm vào cây bên cạnh cũng tăng lên [92]

1.2.4.2 Nhiệt độ của đất

mặc dù sự xâm nhiễm vẫn xảy ra [114, 161] Người ta thấy rằng ở lớp đất trên thuộc

các cánh đồng trồng thuốc lá ở Nhật Bản, R solanacearum tồn tại ngắn hơn ở lớp

đất dưới (nơi có nhiệt độ thấp hơn), khi khảo sát đất ở độ sâu 15-75 cm tại 2 cánh đồng trồng cà chua cũng cho kết quả tương tự Lây nhiễm nhân tạo vào đất trong túi

1.2.4.3 Độ ẩm của đất

Độ ẩm đất cao rất thuận lợi cho bệnh HXVK phát triển Sức đề kháng của vi khuẩn gây bệnh là rất lớn ở những nơi đất ẩm, nhưng chúng sẽ bị tổn thương nặng khi đất gặp hạn và ngập nước, nhưng không tăng sinh ở đất khô Mức độ giảm quần

thể R solanacearum trong đất bị sấy khô xảy ra chậm hơn so với đất bị xử lý ướt (ngập nước) Nhìn chung, đất khô chứa nhiều tế bào R solanacearum hơn đất ngập

nước Sau khi mưa to, thời tiết nóng lên hoặc xen kẽ giữa những ngày mưa và nắng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển và kết quả là hiện tượng héo và chết cây sẽ nghiêm trọng hơn [149]

1.2.4.4 Ảnh hưởng của các loại đất

Quan sát những cánh đồng tại khu vực Đông Nam Á cho thấy, đất ngập nước, đất trồng mía có mùa khô thật sự, những cánh đồng ngập nước sông với chu kỳ mỗi

23

năm một lần đều thuộc loại không chứa R solanacearum Sự luôn có mặt của R

solanacearum trong 4 loại đất ở Bắc Caroline (Mỹ) là rất khác nhau và điều này cho

thấy, yếu tố đất đã ảnh hưởng đến sự ổn định của quần thể R solanacearum từ mùa

này sang mùa khác và sự xâm nhiễm không xảy ra ở trên cát, nhưng nó lại cao nhất

ở đất thịt nặng Cấu trúc đất, thành phần hữu cơ, pH, vi sinh vật đất, cacbon hữu cơ

hòa tan (DOC)… là các nhân tố ảnh hưởng đến sự sống sót của R solanacearum trong đất [112, 113] Ngăn chặn ảnh hưởng của R solanacearum trong các loại đất

khác nhau bởi việc bổ sung hữu cơ vào đất đã được đề cập [114, 157]

1.2.4.5 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

thức thích nghi để tồn tại như giảm kích thước tế bào và thay đổi hình dạng [135], cũng như hình thành tình trạng “không sinh trưởng” (viable but non-culturable, VBNC), nghĩa là vi khuẩn ở trong tình trạng trao đổi chất rất thấp, không phân chia nhưng vẫn còn sống và có khả năng sinh trưởng, phát triển bình thường trở lại khi

được hoạt hóa [127] R solanacearum cũng có khả năng trở thành VBNC khi sống

trong điều kiện có Cu, nhiệt độ thấp của đất và nước [43, 157, 158, 159]

1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh HXVK ở Việt Nam và trên Thế giới

1.3.1 Bệnh héo xanh do vi khuẩn

Bệnh héo xanh do vi khuẩn là một trong những bệnh thực vật nguy hại nhất, bệnh này được E.F Smith mô tả lần đầu tiên năm 1896 trên khoai tây, cà chua và

không được xác định chính xác, nhiều báo cáo đầu tiên thông báo không xuất hiện ở

và nhiệt đới nóng ẩm trên thế giới [77, 90, 115] Nguyên nhân gây bệnh héo xanh

cũng đã được xác định do vi khuẩn R solanacearum Vi khuẩn này có phạm vi ký

chủ rộng trên 200 loài thuộc 50 họ thực vật [32]

Khi bị xâm nhiễm bởi R solanacearum sau một thời gian (phụ thuộc vào điều

kiện môi trường) cây chủ bắt đầu bị héo toàn bộ cây và chết, hiện tượng này là do vi khuẩn ký sinh trong cây đã làm mất cân bằng chuyển hóa cacbon tạo ra các loại polyme như: PHB – poly3hydroxybutyrat; PHA- polyhydroxyalkanoate; PHV -

chủng đột biến của R solanacearum có thể được phát hiện dễ dàng khi canh khuẩn

được cấy vạch trên môi trường thạch Kelman có 2, 3, 5 Triphenyl tetrazolium clorit, khi quan sát sau 36 - 48 giờ dưới ánh sáng xuyên chéo Những đột biến có tính độc yếu hoặc không có tính độc hình thành các khuẩn lạc nhỏ hình chai, có một quầng

đỏ xẫm nổi bật Chủng dại có độc tính hình thành những khuẩn lạc màu trắng, thể lỏng, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm Những đột biến hình chai mất độc tính có thể tách trực tiếp từ cây bệnh nhưng với số lượng ít so với loại

có độc tính [87, 91]

Tổng hợp polisaccarit là một thuộc tính chung của tất cả các chủng R

solanacearum có độc tính Bản thân tính độc phức tạp hơn nhiều, nên không thể giải

thích khi chỉ căn cứ vào có hay không có polisaccarit, vì tính độc nếu xem xét trong phạm vi mối quan hệ với tính đặc hiệu loài thì không liên quan tới sự tổng hợp polysaccarit [74] Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng sự tương tác giữa gen-gen đóng

vai trò quan trọng trong việc thể hiện tính độc của R solanacearum [69, 131 ] Một

sự tương quan chặt chẽ giữa việc tạo ra exopolisaccarit (EPS) và tính độc được chứng minh bằng việc tạo ra những đột biến không độc, gen điều khiển EPS nằm ở

vùng eps [54] và ops [52] Cấu trúc của polisaccarit đã được xác định, những đột

biến không sinh polisaccarit và không độc sẽ không có khả năng hình thành khuẩn lạc trên rễ cây chủ [128] Số liệu này cho thấy, đã có mối liên quan giữa tính độc, tính xâm thực vào rễ và chất lượng của polisaccarit được tạo ra trong thân cây Triệu chứng của bệnh héo xanh đã quan sát được như sau: ban đầu các lá non trên phần ngọn cây héo rũ xuống vào ban ngày Ban đêm hoặc khi trời mát cây có thể phục hồi không biểu hiện triệu chứng này Dần dần, hiện tượng héo tiếp tục lan đến các lá phía dưới, cuối cùng toàn bộ tán lá bị héo và cây chết hàng loạt [78, 79, 148] Có thể

tóm tắt một số giai đoạn và cơ chế phát sinh bệnh héo xanh do R solanacearum gây

ra ở cây trồng như sau:

25

1- Đầu tiên là sự xâm nhập của một số ít tế bào vi khuẩn gây bệnh vào tiểu phần mô gỗ 2 - Vi khuẩn nhân lên ở vùng mạch dẫn và lan truyền đến vùng mô mềm cận gỗ hoặc các tế bào libe 3 - Tiết polisaccarit ngoại bào với số lượng lớn làm tắc các bó mạch, nước không được vận chuyển lên nuôi cây, dẫn đến toàn bộ cây bị héo rất nhanh 4 - Vi khuẩn sinh trưởng, phá huỷ thành tế bào và các tế bào nhu mô kế cận 5- Xuất hiện những biến đổi thành phần của nhu mô, dẫn đến suy yếu nghiêm trọng sự dẫn nước trong cây và xảy ra hiện tượng héo xanh

Hình 1.2: Cây lạc bị chết do bệnh héo xanh vi khuẩn (mẫu bệnh héo xanh lạc

thu thập tại Tĩnh Gia, Thanh Hóa)(Nguồn: Viện TNNH)

Quan sát dọc theo phần gỗ phía trong thân cây bệnh cho thấy, càng lên cao dọc theo thân những vết bệnh này càng mỏng và có mầu sáng hơn (hình 1.2) Khi nhúng đoạn thân có vết bệnh vào một cốc nước và bóp mạnh ta sẽ thấy một dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa thôi ra (hình 1.3-B)[46, 134]

Hình 1.3: A - Cây ớt bị chết do bệnh héo xanh vi khuẩn (tại Mê Linh, Hà Nội, 2011); B - Dịch vi khuẩn R solanacearum màu trắng sữa thôi ra từ thân cây

bị bệnh HXVK (Nguồn: Viện TNNH và Đại học Florida, Mỹ)

26

Các kết quả trên, cũng đã được Belen, 2010 khẳng định lại trong “On the life

of Ralstonia solanacearum, a destructive bacterial plant pathogen“ [37]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh HXVK ở Việt Nam

Bắt đầu từ những năm 1960, người ta đã phát hiện bệnh chết cây lạc trên đồng ruộng và đặc biệt ở những vùng trồng lạc tập trung và tiếp tục gia tăng ở những nơi

mà lạc được trồng liên tiếp trong nhiều năm Năm 1967-1968, kết quả điều tra của

Bộ Nông nghiệp tại một số tỉnh trồng lạc thuộc miền Bắc cho thấy hiện tượng cây lạc bị chết xanh hàng loạt (tại Bắc Thái, Hà Bắc, Nghệ An, Vĩnh Phú) Năm 1977-

1978, Viện Bảo vệ thực vật đã điều tra bệnh hại lạc tại một số tỉnh miền Nam cho

thấy, bệnh hại lạc chủ yếu do nấm Rhizostonia và S rolfsii gây ra, tùy từng loại đất

và điều kiện canh tác mà mức độ bệnh hại của chúng có khác nhau

Năm 1980, phòng Bệnh cây - Viện Bảo vệ Thực vật đã tiến hành nghiên cứu bệnh ở cây lạc và cho thấy, lạc có một số bệnh do các tác nhân chủ yếu sau gây nên:

nấm A niger, Fusarium, Veticillum, Rhizoctonia và vi khuẩn R solanacearum Các

tác giả đã tiến hành xử lý hạt giống để phòng trừ các bệnh này, tuy nhiên kết quả chỉ dừng lại ở phạm vi trong phòng thí nghiệm

Nguyễn Xuân Hồng và cs (1993) khi điều tra, khảo sát bệnh héo xanh cây lạc

do vi khuẩn R solanacearum cho biết: bệnh xuất hiện phổ biến ở hầu hết các vùng,

mức độ bị bệnh có sự thay đổi giữa các vùng sinh thái Bệnh hại nghiêm trọng ở một

số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa, với tỷ lệ dao động từ 15 – 35%

và ở vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là 20 – 30% [7]

Báo cáo tại Hội nghị Quốc tế các nhóm công tác nghiên cứu về bệnh HXVK hại lạc lần thứ 3 tại Trung Quốc do Viện Nghiên cứu cây trồng cạn Quốc tế (ICRISAT) tổ chức, Nguyễn Xuân Hồng đã báo cáo hiện trạng bệnh HXVK hại lạc tại Việt Nam Tác giả cho biết bệnh HXVK hại lạc là một trong những loại bệnh phổ biến, bệnh phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ tương đối cao, sẽ là nghiêm trọng trên đất nghèo dinh dưỡng, bệnh gây hại nặng hơn ở vụ lạc thu so với lạc xuân [8]

27

Theo Lê Lương Tề (1997), bệnh HXVK hại lạc thường phát sinh ở cả hai thời

vụ trồng lạc (vụ Xuân và vụ Thu) Trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, ẩm ướt, cây sinh trưởng kém, đất cát thô, nhất là trên đất trồng độc canh thì bệnh gây hại càng nặng Biện pháp canh tác để phòng bệnh này chủ yếu là luân canh với lúa nước

và tăng cường bón vôi và kali (bón lót và thúc) trước thời kỳ ra hoa [16]

Nghiên cứu đặc điểm phân bố, tác hại của bệnh HXVK hại lạc, xác định race,

biovar của loài vi khuẩn R solanacearum ở phía Bắc Việt Nam, Nguyễn Xuân

Hồng và cs (1997) đã cho rằng bệnh HXVK phát sinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sông, còn trên đất luân canh với lúa nước thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn Nghiên cứu đặc tính sinh học của các nguồn vi khuẩn phân lập từ các vùng

sinh thái khác nhau kết quả cho thấy, các nguồn vi khuẩn R solanacearum phân lập

được kiểm tra đều có tính độc cao đối với lạc và một số cây ký chủ khác và các mẫu phân lập được đều thuộc race 1, biovar 3 và biovar 4 Khi điều tra tình hình bệnh HXVK hại lạc trong sản xuất ở miền Bắc cho thấy: hầu hết các giống lạc đang được trồng phổ biến trong sản xuất là không kháng bệnh HXVK (tỷ lệ cây chết trung bình trong vụ Xuân là 15 – 25%), ở những vùng có ổ dịch thì bệnh gây chết khoảng 90 – 100% Các tác giả cho rằng đây là một trong những nguyên nhân chính làm tỷ lệ cây lạc nhiễm bệnh HXVK ngày càng gia tăng

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (cũ) nay là Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu nhiều về nguyên nhân gây bệnh, quy luật phát sinh trên đồng ruộng của bệnh héo xanh hại cây trồng (cây lạc, cây cà chua…)[2, 5, 12], cũng như những yếu tố sinh thái khác có ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh Các nghiên cứu

trên cây lạc cho thấy, bệnh héo xanh hại lạc do vi khuẩn R solanacearum gây ra,

phát sinh và gây hại nặng từ giai đoạn cây lạc ra hoa rộ - quả non Trên đất luân canh với lúa nước thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn so với độc canh cây lạc hay luân canh với cây trồng khác Từ các kết quả nghiên cứu về đa dạng ADN các chủng vi

khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc bằng kỹ thuật RADP, các tác giả

cho biết: vi khuẩn gây bệnh có phạm vi ký chủ rộng, ngoài lạc còn gây bệnh cho cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và vừng,…v…v… [5, 16]

28

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (cũ) và Viện Nghiên cứu Rau Quả cũng đã có những nghiên cứu về bệnh héo xanh trên một số cây chủ như khoai tây, lạc, ớt, cà chua Đã phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn có tính độc

để phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng [8]

Phòng Di truyền và Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp cũng đã

có những khảo sát, nghiên cứu bệnh do vi khuẩn này, bước đầu đã lưu giữ được các

biovar khác nhau của R solanacearum và cho rằng, bệnh héo xanh không còn mang

tính cục bộ mà đã phổ biến ở hầu hết các vùng trồng lạc và làm giảm sản lượng từ

50 – 80% Vùng đất bãi ven sông Lam, Nghệ An được coi là vùng đất có bệnh héo xanh cao nhất [10]

Nguyễn Tất Thắng và cs (2012) đã báo cáo bệnh HXVK là bệnh gây hại phổ biến trên cây khoai tây ở vùng Hà Nội và phụ cận vụ Đông 2008 và 2009, bệnh phát sinh gây hại rõ nhất ở giai đoạn cây khoai tây đang hình thành củ Biện pháp sử dụng chế phẩm vi sinh đối kháng kết hợp với thuốc hóa học cho hiệu quả phòng trừ bệnh HXVK hại khoai tây cao [18]

Viện Thổ nhưỡng Nông hóa trong các giai đoạn từ 2006 đến hiện nay đã thực hiện các đề tài nghiên cứu bệnh HXVK trên cà chua, lạc, ớt, khoai tây, vừng và

phân lập các chủng vi khuẩn R solanacearum làm vật liệu cho nghiên cứu tuyển

chọn VSV đối kháng phòng bệnh héo xanh cây trồng

Nhìn chung, trong thực tế sản xuất nông nghiệp nước ta, đặc biệt ở miền Bắc, bệnh héo xanh do vi khuẩn đã phát sinh ở hầu hết các địa phương có trồng ớt, cà chua, lạc, khoai tây, vừng, dưa chuột và thuốc lá ở các tỉnh, thành phố: Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên, Bắc Giang, Hải Dương, Hải Phòng, Thái Nguyên, Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho sản xuất nông

nghiệp Tuy nhiên, những nghiên cứu về bệnh héo xanh do R solanacearum ở Việt

Nam còn chưa nhiều, chưa toàn diện và chưa sâu, song bước đầu đã đóng góp một

phần quan trọng vào việc nghiên cứu loài vi khuẩn R solanacearum và cũng đã có

một số ứng dụng nhất định trong thực tiễn sản xuất cũng như nghiên cứu khoa học

29

Hiện nay, việc nghiên cứu R solanacearum đã trở thành một chủ đề quan trọng

trong công tác bảo vệ thực vật

1.3.3 Tình hình nghiên cứu bệnh HXVK trên Thế giới

Năm 1892, Halsted là người khởi đầu nghiên cứu bệnh héo xanh cây cà chua Sau này, E.F.Smith đã phát hiện thêm và nghiên cứu trên nhiều loại vi khuẩn gây hại và trên hầu hết các loại cây trồng Năm 1896, E.F Smith đã mô tả bệnh HXVK

ở khoai tây, cà chua và cà tím, năm 1909 ông lại phát hiện thấy bệnh này ở thuốc lá Càng về sau này càng có nhiều công trình nghiên cứu về các đặc điểm sinh lý, sinh

hoá, di truyền, sinh học phân tử và phân tích genome của vi khuẩn R solanacearum Kelman (1954) đã công bố rằng chính polisaccarit ngoại bào tạo ra bởi R

solanacearum là chất gây nên bệnh héo xanh [91] Cook và Sequeira đã tách thành

công những gen phức tạp điều khiển quá trình sinh tổng hợp Exopolisacharids EPS [52] Tính chất axít trong thành phần của EPS và đơn vị của 2 loại đường không thay thế là baclozamin (2, 4, 6 trideoxy-glucoza) và axít galactozaminuronic đã được làm sáng tỏ [91, 128]

Viện Nghiên cứu và Phát triển Rau châu Á - Đài Loan (Asian Vegetable Research và Development Center - AVRDC – Taiwan) đã có nhiều công trình

nghiên cứu về R solanacearum, phân lập được chủng vi khuẩn Pseudomonas

solanacearum Pss.4 có độc tính cao, đại diện cho quần thể vi khuẩn gây bệnh héo

xanh ở Đài Loan Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR),

Trung tâm Khoai tây Quốc tế (International Potato Center – CIP) ở Peru cũng là những nơi nghiên cứu sâu nhất về loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh này

Tại hội nghị chuyên đề về vi khuẩn gây bệnh héo xanh được tổ chức tại Pháp ngày 22 - 27 tháng 6 năm 1997, một số công trình nghiên cứu quan trọng liên quan đến việc nghiên cứu và phòng chống bệnh này đã được công bố như: Hiệu quả của việc luân canh cây trồng và bỏ hoang đất trong phòng chống bệnh héo ở chuối [93];

Cảm ứng kháng bệnh có hệ thống sau khi nhiễm các tế bào R solanacearum bị sốc

nhiệt vào lá thuốc lá [139]; Phương pháp phòng trừ sinh học bằng cách sử dụng các

chủng đột biến gen hrp, chúng có thể xâm nhập và nhân lên bên trong rễ cây chủ

30

[154] Đến nay, các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu bệnh HXVK đã và đang có nhiều hứa hẹn, để trả lời những câu hỏi còn bỏ ngỏ về tác nhân gây bệnh của hai nhà khoa học Buddenhagen và Kelman (1964) đặt ra hơn 50 năm trước [42]

Xét về tầm quan trọng, mức độ nghiên cứu sâu rộng của bệnh và nhân tố gây bệnh HXVK trong suốt nhiều thập kỷ qua, chúng ta phải kể đến các công trình nghiên cứu của các tác giả: Kelman, 1953; Hayward, 1991; Sequiera 1992; Hayward, 1994; Chakraborty, 1994; Van Elsas và cs., 2000; Denny, 2001, 2006;

Poueymicro và cs., 2009; Milling và cs., 2011; Tanja và cs., 2011; Citation Yi Cao

và cs., 2013 [45, 51, 55, 56, 77, 78, 90, 115, 131, 140, 150, 158]

Tất cả các nghiên cứu đều tập trung vào vi khuẩn R solanacearum và các biện

pháp phòng trừ, trong đó sử dụng VSV đối kháng cũng là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Nhiều tác giả cho rằng, sử dụng chất hóa học kiểm soát bệnh HXVK là rất khó khăn và không hiệu quả, vì loại vi khuẩn này thường sống ở bên trong thân cây và có khả năng sống sót rất lâu trong đất [76]

Năm 2012, Scholarly Editions đã xuất bản cuốn sách “Advances Bacteria

Research and Treatment”, trong đó có đề cập đến những tiến bộ trong nghiên cứu

về vi khuẩn R solanacearum và các biện pháp xử lý Năm 2013 Scholarly Editions

đã tái bản và bổ sung các nghiên cứu mới vào cuốn sách Điều này càng nói lên tầm

quan trọng của việc nghiên cứu sâu và rộng về vi khuẩn R solanacearum trên thế

31

vệ môi trường do việc giảm sự phụ thuộc vào chất hóa học và là nhân tố chìa khóa

để tạo một nền nông nghiệp bền vững

Phương pháp phòng trừ sinh học đã được sự quan tâm và đầu tư rất lớn của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới trong những thập kỷ qua [155] Các VSV đối kháng chủ yếu tác động lên các loài khác mà không ức chế các chủng cùng loài Bằng cách sử dụng các sản phẩm trao đổi chất của mình, mỗi VSV đối kháng có khả năng ức chế các tác nhân gây bệnh ở một mức độ nhất định Cho và cs (2003), Stein

(2005) và Myint và cs (2006) cho rằng, các chủng B subtilis có thể tiết ra iturin, chất này có khả năng ức chế sinh trưởng của R solanacearum [49, 123, 145]

VSV đối kháng thường được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn

từ những vùng đất và rễ cây trồng không có mầm bệnh và phổ biến nhất ở các

nhóm: P fluorescens, Pseudomonas spp, P putida, Agrobacterium radiobacter,

Bacillus spp, Streptomyces spp, Pasteuria penetrans Nấm đối kháng: Trichoderma harzianum, T viridae, Coniothyrium minitans, Spporidesmium sclerotivorum,

Athrobotrys, Dactylaria, Dactycella, Monacrospporium [30, 75, 86, 99, 113, 155] 1.4.1.1 Vai trò của vi khuẩn đối kháng

Các loài vi khuẩn đối kháng (VKĐK) luôn tồn tại trong tự nhiên, đa số trong chúng đều có lợi cho con người Đối với nông nghiệp, những VKĐK đều thuộc hệ VSV sống ở vùng rễ cây trồng và sống hoại sinh trong đất Trong quá trình sinh trưởng chúng tiết ra các chất trao đổi thứ cấp như: kháng sinh, enzyme, siderophore, chất điều hòa sinh trưởng, axít hữu cơ, v v Những chất này có tác dụng hỗ trợ cho sự phát triển của cây trồng như: kháng bệnh, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, kích thích sinh trưởng, hòa tan dinh dưỡng trong đất từ dạng khó tiêu thành dễ tiêu

để cây trồng hấp thụ tốt hơn, v v

Trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu về hiệu lực của VKĐK với các tác nhân gây bệnh cây (do vi khuẩn hoặc nấm) Kết quả nghiên cứu cho thấy, các loài VKĐK có thể bảo vệ cây trồng, chống lại các VSV gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt hơn [26, 32, 61, 142]

32

VKĐK có khả năng cạnh tranh nguyên tố sắt (Fe), sản sinh ra cyanide, làm tăng tính chống chịu của cây, tạo chất kích thích sinh trưởng và phân giải độc tố do VSV gây bệnh tiết ra, cạnh tranh, chiếm chỗ thuận lợi ở vùng rễ của cây trồng [104, 105], chống lại nhiều loài VSV gây bệnh [58] Trong thực tế sản xuất, phòng chống

bệnh HXVK là vấn đề rất khó khăn, vì R solanacearum là loại có nhiều chủng sinh

lý và nòi sinh học khác nhau, phân bố ở nhiều loại ký chủ, tồn tại lâu trong tàn dư thực vật và trong đất, sử dụng các loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh này hiệu quả không cao [103]

Do đó, việc nghiên cứu, tuyển chọn các chủng VKĐK có phổ tác động rộng,

có nhiều hoạt tính sinh học, đối kháng vi khuẩn gây bệnh theo nhiều cơ chế khác nhau, hiệu quả cao, ổn định lâu dài và an toàn sinh học là việc làm hết sức cần thiết hiện nay

1.4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quan hệ đối kháng giữa các VSV

Trong môi trường tự nhiên, quan hệ đối kháng giữa các VSV cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố Ở đây chỉ xem xét các điều kiện và các nhân tố ảnh hưởng chủ yếu đến việc ứng dụng các VSV đối kháng trong phòng chống bệnh thực vật i) Điều kiện môi trường có ảnh hưởng rất lớn tới quan hệ giữa VSV đối kháng và VSV gây bệnh ii) Một VSV đối kháng chỉ có thể chống lại một số mầm bệnh thực vật chứ không phải tất cả, đó có thể là tính đặc hiệu của VSV đối kháng iii) Mối quan hệ giữa mật độ nhiễm vào của VSV đối kháng và mật độ của VSV gây bệnh (cao hoặc thấp) cũng là yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đối kháng của VSV Khi mật độ VSV đối kháng nhiễm vào thấp thì ít thấy sự tăng hoặc giảm của bệnh, nhưng khi mật độ nhiễm vào cao hơn thì mức độ bệnh sẽ bị giảm đột ngột iv) Sự hấp thụ, tính hoạt động và không hoạt động của những chất kháng sinh cũng phụ thuộc vào pH của

đất, ở pH bằng 3,2 thì độ hấp thụ kháng sinh là 4.000 g/g, trong khi đó pH bằng 5,6

- 7,6 độ hấp thụ này chỉ là 400 g/g, ít hơn 10 lần

Những số liệu trên đã giúp chúng ta thay đổi quan niệm về sự bảo tồn chất kháng sinh ở trong đất Sự hoạt động của chất kháng khuẩn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, pH, đặc điểm thổ nhưỡng cũng như đặc tính hoá học của chất kháng khuẩn

33

Vì vậy, sự đối kháng của VSV với VSV gây bệnh mạnh hay yếu thì đất đóng một vai trò rất quan trọng

1.4.2 Cơ chế đối kháng của vi sinh vật

Trong quần thể VSV, mỗi loài đều phải đấu tranh sinh tồn suốt cả quá trình tiến hóa dưới các hình thức khác nhau và rất linh hoạt VSV có thể chiếm vị trí của các thể cạnh tranh bằng cách nhân lên với số lượng lớn, hoặc có thể hình thành các chất đặc hiệu hay không đặc hiệu trong quá trình chuyển hoá vật chất, nhằm ức chế sinh trưởng của VSV khác Các chất không đặc hiệu có thể là các axít hữu cơ, rượu, kháng sinh, siderophore, enzyme hoặc các hợp chất khác [67, 110, 145]

1.4.2.1 Cơ chế do kháng sinh

Kháng sinh là một chất quan trọng sinh ra trong quá trình sinh trưởng của VSV để tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất, giúp cây trồng phát triển Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn một cách đặc hiệu

Và tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là ở một vị trí quan trọng hay một phản ứng trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn [133]

Wang.J.S Hou và cs (1983) cho rằng, các chế phẩm có nguồn gốc kháng sinh được coi là có triển vọng, do thuốc kháng sinh được hấp phụ và chuyển dịch tốt trong mạch dẫn và mô cây dễ dàng Khi khảo nghiệm thuốc kháng sinh để trừ bệnh

HXVK ở lạc tác giả đã kết luận rằng, các vi khuẩn chi Pseudomonas là loại VKĐK nội sinh quan trọng, có thể ức chế R solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ

cà [161]

Olga V Mavrodi và cs (2012) cho rằng, vi khuẩn Pseudomonas spp cộng

sinh khoảng 58-100% rễ cây lúa mì ở Columbia, chúng có thể tạo ra kháng sinh

một số bệnh trên cây lúa [126]

Những chủng VKĐK có thể tạo ra 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), pyrrolnitrin pyoluteorin và phenazine-1-carboxylate Chất DAPG có thể ức chế tác

nhân gây bệnh cả trong trường hợp invitro và nhà lưới Điều này dẫn đến một giả

34

định rằng, DAPG có thể hoạt động theo một cơ chế quan trọng và cùng với các cơ chế khác như tạo siderophore đã gây ra tính kháng để giảm tỉ lệ bệnh héo do vi khuẩn ở cây cà [107]

Cơ chế tác động của kháng sinh:

- Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn Các nhóm kháng sinh gồm

có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác động lên quá trình tổng hợp vách tế bào nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

- Ức chế chức năng của màng tế bào chất Các nhóm kháng sinh gồm có: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

+ Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

+ Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferaza ngăn cản việc gắn các axít amin mới vào chuỗi polypeptide

+ Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các axít amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

- Ức chế quá trình tổng hợp axít nucleic

+ Nhóm refampin gắn với enzyme ARN polymeraza ngăn cản quá trình sao

mã tạo thành mARN (ARN thông tin)

+ Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme ADN gyraza làm cho hai mạch đơn của ADN không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của ADN

+ Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzonic axít) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp axít nucleic

+ Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo axít nucleic

35

1.4.2.2 Cơ chế do siderophore

VSV đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với nguồn bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh, tạo siderophore v v để sinh trưởng Trong đó, siderophore là một loại protein sinh ra trong quá trình sinh trưởng

phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của chúng, dẫn tới môi trường xung

trưởng của mình Trên cơ sở đó, người ta có thể sử dụng các chủng VSV có khả năng sinh siderophore cao trong kiểm soát sinh học [33]

Kiểm soát sinh học trên cơ sở cạnh tranh thường ít gặp, tuy nhiên việc thu nhận những chất vi lượng như sắt của VSV cũng đã được nghiên cứu nhiều Sắt là chất cực kỳ hiếm ở hệ rễ, chúng phụ thuộc vào pH đất Ở đất có độ thông khí và oxi hóa cao, sắt thường ở dạng ferric [100], chúng không hòa tan được trong nước (pH

trong môi trường như vậy, VSV đã phải tạo ra một cơ chế để liên kết với sắt được gọi là siderophores, liên kết này có ái lực cao để thu hút sắt từ môi trường

Hầu hết tất cả VSV đều tạo ra siderophores, ở dạng catechol hoặc ở dạng hydroxamate Siderophore lần đầu tiên được chứng minh tầm quan trọng của nó và

coi như là một cơ chế trong kiểm soát sinh học Erwinia carotovora của vài chủng P

fluorescens [36]

Những tế bào VSV đột biến không có khả năng tạo siderophores, dẫn đến giảm khả năng ức chế những tác nhân gây bệnh thực vật khác nhau [100] Hiệu quả thu nhận sắt tăng của những VSV hội sinh được cho là nhân tố góp phần tích cực vào khả năng hình thành khuẩn lạc trên rễ cây và là tác nhân để những VSV gây hại

di chuyển ra khỏi vị trí rễ cây

36

1.4.2.3 Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây (kích kháng)

Thực vật rất tích cực đáp ứng lại trạng thái thay đổi và kích thích của môi trường, bao gồm: ánh sáng, nhiệt độ, nước và dinh dưỡng có lợi Thực vật cũng đáp ứng lại trạng thái thay đổi của kích thích hóa học tạo ra bởi đất và VSV liên kết với cây trồng Như vậy, tác nhân kích thích có thể gây ra hoặc là điều kiện cho cây chủ phản ứng lại những thay đổi sinh hóa để tăng cường tính kháng chống lại sự thay đổi của những tác nhân gây bệnh, gọi là “Sự kích thích tính kháng của cây chủ” (Induction of host resistance)

Tác dụng của VSV kích thích sinh trưởng thực vật

Tác dụng của VSV kích thích sinh trưởng thực vật: Vi khuẩn kích thích sinh

trưởng thực vật (Plant Growth-Promoting Bacteria – PGPB) khi tương tác với rễ cây

có thể tạo ra tính kháng của cây chống lại vi khuẩn, nấm và virut gây bệnh Hiện tượng này được gọi là “tính kháng hệ thống“ (Induced Systemic Resistance - ISR), cũng giống như tính kích kháng hệ thống có điều kiện - SAR (Systemic Acquired Resistance) [136] SAR được phát triển khi cây trồng nhận ra mầm bệnh và phản ứng lại bằng cách biến đổi cấu trúc và phản ứng sinh hóa của mình nhằm ngăn chặn mầm bệnh ISR cũng là kết quả phản ứng đề kháng của cây trồng, nhưng được kích hoạt bởi PGPB thông qua các chất như siderophore và lipopolysaccharide [156]

Các chất được sản sinh bởi PGPB giúp kiểm soát nấm bệnh cho cây trồng gồm: Các hợp chất chứa sắt (siderophore), các kháng sinh, enzyme thủy phân và các enzyme khử độc hoặc phân giải các tác nhân gây độc của mầm bệnh [146, 162] Một

số PGPB còn có thể kéo nguyên tố sắt trong các siderophore của các VSV khác [100] Compant và cs (2005) cho rằng, PGPB sản sinh ra các kháng sinh ngăn chặn

sự phát triển của mầm bệnh như amphisin, 2,4-diacetylphloroglucinol, hydrogen cyanide, oomycin A, phenazine, pyoluteorin, pyrrolnitrin, tensin, tropolone, cyclic lipopeptides, oligomycin A, kanosamine, zwittermicin A và xanthobaccin [53]

Cơ chế kích thích sinh trưởng thực vật (Mechanisms of Plant Growth Promotion) là nhờ sự tương tác giữa quần thể VSV ở hệ rễ thông qua việc tạo ra