Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định AND

Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định AND Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định AND luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

đại học quốc gia hà nội

trường đại học khoa học tự nhiên

Lê thị kiều nhi

Nghiên cứu hóa học một số hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa và chống nhiễm khuẩn từ cây hy thiêm ( siegesbeckia orientalis l.) và cây bòn bọt

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Đặt vấn đề

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới châu á, có khí hậu nhiệt đới gió mùa Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 15-270C, lượng mưa lớn (trung bình 1200-2800mm), độ ẩm tương đối cao (trên 80%) [5] Điều kiện khí hậu này rất thuận lợi cho sự phát triển của các loài thực vật nói chung và cây dược liệu nói riêng Theo số liệu gần đây, hệ thực vật Việt Nam đã có khoảng 10.500 loài được thống kê [8], trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong

y học dân tộc [4] Theo dự đoán của các nhà khoa học, hệ thực vật Việt Nam

có lẽ gồm khoảng 12.000 loài, và là một trong những hệ thực vật phong phú nhất thế giới [8]

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã và đang đóng một vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con người Chúng được dùng làm thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, là nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hương liệu và mỹ phẩm Đặc biệt là trong lĩnh vực làm thuốc, nguồn dược liệu thiên nhiên phong phú và đa dạng đã cung cấp cho ngành dược cả nước một khối lượng nguyên liệu lớn để chữa bệnh cũng như xuất khẩu có giá trị kinh tế cao Về lâu dài, đối với sự phát triển các dược phẩm mới, các sản phẩm thiên nhiên có vai trò rất quan trọng, vì nhiều chất này có thể là các chất dẫn

đường cho việc tổng hợp các dược phẩm mới, hoặc dùng làm các chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ các nguyên lý của dược lý học con người

Trong những thập kỷ qua việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài cây cỏ ở nước ta còn có nhiều hạn chế, chưa đáp ứng được yêu cầu điều tra cơ bản để nhằm định hướng sử dụng và phát triển nguồn tài nguyên thực vật một cách hợp lý và có hiệu quả nhất

Tuy nhiên, trong khi các nhà khoa học đang nghiên cứu, tìm kiếm những loài cây mới có giá trị làm thuốc chữa bệnh thì hàng ngày, hàng giờ,

nguồn tài nguyên này đang bị mất đi nhanh chóng về số lượng và tính đa dạng sinh học Một nhóm chuyên gia về thực vật học của Quỹ Quốc tế Bảo vệ thiên nhiên (WWB) đã dự đoán rằng sẽ có khoảng 60.000 loài thực vật (khoảng 1/4 tổng số loài của thế giới hiện nay) bị tuyệt chủng vào những năm 2050, nếu

xu hướng tác động vào thiên nhiên như hiện nay vẫn tiếp tục Đến nay đã có 18.000 loài được đưa vào "Sách đỏ " của nhiều nước để có biện pháp bảo vệ

đặc biệt [8] Việt Nam cũng đã xuất bản "Sách đỏ Việt Nam", Phần thực vật, với 356 loài thực vật thuộc loại quý hiếm cần được bảo vệ [12] Sự mất đi nhanh chóng tính đa dạng sinh học (gồm thực vật, động vật và vi sinh vật) thực sự là một thảm hoạ đối với loài người

Xu thế chung của nhân loại là trở lại sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên Vì vậy, việc điều tra cây thuốc và khảo sát chúng về mặt hoá thực vật

có ý nghĩa to lớn Nhiều hoạt tính sinh học quí báu của những hợp chất quen biết từ lâu lại mới được phát hiện Trong nhiều cây cỏ rất phổ biến và bình thường người ta đă tìm được ra những hoạt chất có giá trị Nhiều cây thuốc và bài thuốc dân gian được truyền từ đời này sang đời khác, nay được làm sáng

tỏ về cơ chế tác dụng chữa bệnh nhờ những kết quả nghiên cứu về hoá thực vật và hoạt tính sinh học Nhờ vậy mà chúng được sử dụng một cách hợp lý hơn, có hiệu quả hơn

Luận án của chúng tôi nằm trong hướng này và có nhiệm vụ nghiên

cứu thành phần hoá học và bước đầu khảo sát một số hoạt tính sinh học của một số chế phẩm thu được từ một số loài cây ở nước ta, đã được sử dụng lâu

đời và phổ biến trong nhân dân để chữa bệnh

Để thực hiện nhiệm vụ đề ra chúng tôi chọn đối tượng để nghiên cứu

trong luận án là cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) và cây bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ., Euphorbiaceae).Đây là hai cây mọc

hoang dại phổ biến ở nước ta và được y học dân gian sử dụng có hiệu quả để

chữa một số bệnh viêm nhiễm như mụn nhọt, lở ngứa, vết rắn cắn, bỏng, tiêu

chảy, lỵ, viêm khớp, , là những bệnh có liên quan tới các chủng vi khuẩn có khả năng gây bệnh, cũng như thường liên quan tới sự sản sinh quá nhiều gốc

tự do ở các tổ chức (mô, tế bào , , ).

Những nội dung chính của luận án là:

*Tìm phương pháp thích hợp để thu nhận các phân đoạn giàu polyphenol (bao gồm cả flavonoit) và tecpenoit cao hơn (di - và tritecpenoit)

là những lớp hoạt chất đang được quan tâm

* Phân tách các hỗn hợp polyphenol và tecpenoit cao hơn nhằm phân lập các hợp chất tinh khiết

* Khảo sát cấu trúc các hợp chất nhận được

* Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và khả năng chống oxi hoá in

vitro của một số phần chiết và hợp chất tinh khiết nhận được

Các kết quả nghiên cứu nhằm góp phần nâng cao hiểu biết về hoá thực vật của hai loài cây thuốc dân gian được nghiên cứu và tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng thực tiễn của hai loài cây này

Chương 1 tổng quan

1.1 Tổng quan về các loài cây được nghiên cứu trong luận án

1.1.1 Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae)

1.1.1.1 Thực vật học [8], [14]

Theo Phạm Hoàng Hộ [8] có hai loài Siegesbeckia (Asteraceae) mọc ở

nước ta: Siegesbeckia integrifolia Gagn (Hy thiêm lá nguyên) và

Siegesbeckia orientalis L (Hy thiêm) Cho đến nay chỉ có cây Siegesbeckia orientalis L., tức Hy thiêm (các tên gọi khác: cỏ đĩ, cứt lợn, cúc dính, chó đẻ,

cỏ bà a, v.v ), được y học dân gian dùng để chữa bệnh

Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) là cây cỏ sống hằng năm, cao

chừng 40cm đến 1m, có nhiều cành, có lông tuyến Lá mọc đối cuống ngắn, hình ba cạnh hay thuôn hình quả trám, đầu lá nhọn, phía cuống cũng thót lại, mép có răng cưa, mặt dưới hơi có lông, dài 4-10cm, rộng 3-6cm Cụm hoa hình đầu, màu vàng, cuống có lông tuyến dính Có hai loại lá bắc không đều nhau: lá bắc ngoài hình thìa dài 9-10mm, mọc toả ra thành hình sao, có lông dính, các lá bắc trong dài 5mm hợp thành một tổng bao Quả bế, màu đen, hình trứng

Cây ra hoa vào tháng 4 - 5, đậu quả vào các tháng 6 - 10 Thu hái cây trước khi ra hoa, đem phơi khô dùng làm thuốc

ở nước ta, nguồn hy thiêm rất phong phú vì cây này mọc ở khắp nơi, rải rác từ miền núi, trung du đến vùng đồng bằng, trừ Tây Nguyên

1.1.1.2 Nghiên cứu hoá học các loài Siegesbeckia

Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) và một số loài Siegesbeckia

khác được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trên thế giới và là cây thuốc

được dùng trong y học dân gian của một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản, bán đảo Triều Tiên, Việt Nam, , nên đã được quan tâm nghiên cứu về hoá học

J Pudles, A Diara và E Lederer [74] phân lập từ Siegesbeckia

orientalis của Madagaskar một -D-glucozit, C26H44O8, và đề nghị đặt tên cho chất này là darutozit Chất này cũng đã được Auffray [Auffray, Bull Soc

Med de l’Il Maurice (1988), x [74],[100] phân lập được từ S orientalis và

gọi tên là darutin

tuyệt đối) và có đnc 2300C khi ngậm một phân tử H2O (kết tinh từ 50% etanol)

Khi bị thuỷ phân bởi emulsin hoặc men elateraza darutozit cho glucozơ

(kết tinh từ benzen rồi etanol) J Pudles, A Diara và E Lederer [74] gọi tên ditecpen ancol này là darutigenol

J Pudles, A Diara và cộng sự [100], [101] đã khảo sát chủ yếu bằng

các phương pháp hoá học và đưa ra cấu trúc của darutigenol 1

CH2OH

20

HO

18 19

H

H

14 1

Darutigenol sau đó cũng đã được tìm thấy dưới dạng aglycon ở trong

thiên nhiên, trong cây Palafoxia arida [43] Cấu trúc của darutigenol được

khẳng định thêm bởi các phổ khối lượng và cộng hưởng từ proton [43]

Trong các công trình nghiên cứu nêu ở trên, cấu hình ở C-15 của darutigenol còn chưa xác định Vấn đề này đã được E Wenkert và cộng sự

darutigenol có cấu hình C(15)R và được biểu diễn bằng công thức 1b

Dựa trên các chuyển dịch của tín hiệu cacbon, J H Kim, K D Han, K Yamasaki và O Tanaka [55] đã chứng minh được là ở darutozit liên kết -D-glucozyl phải định vị ở nhóm 3-equatorial hidroxi của aglycon darutigenol và nhóm hidroxi này có cấu hình R, chứ không phải ở nhóm hidroxi ở C-15 như Diara và những người khác [101] đã dự doán Vậy cấu trúc của darutozit phải

được biểu diễn bởi công thức 2

2

3

C OH

O2C C

HOH2C

CH2Me

3

Glc= -D-glucopyranozyl

Trong một bằng phát minh, P Fabre [33] đã đưa ra một quy trình chiết

darutozit từ Siegesbeckia orientalis bằng butanol

S S Suh và J S Shin [83] đã phân lập được từ cây Siegesbeckia

orientalis của Triều Tiên các phytosterol stigmasterol và -sitosterol

Từ toàn bộ cây Siegesbeckia orientalis khô, T H Yang và cộng sự [96]

đã phân lập được 3, 7-dimetylquercetin và hai tecpenoit không rõ cấu trúc

3,7-dimetylquercetin là chất flavonoit duy nhất cho đến nay được phân lập từ

S orientalis

Từ S orientalis K S Rybalko và cộng sự [75] đã phân lập được một

sesquitecpen lacton và đặt tên cho nó là orientin Cũng theo các tác giả này

orientin có cấu trúc 3 chưa được xác định dứt khoát

R N Baruah và cộng sự 18],[19], đã phân lập được từ S orientalis ba

lacton mới thuộc nhóm melampolid và chứng minh cấu trúc của chúng, đó là các

chất orientalid 4, và các lacton 5 và 6

O

O

12 11

10 98

7 6

5 4

CHO OR"

Mới đây D Guo và cộng sự [37] phân lập từ phần trên mặt đất của S

orientalis các axit cacboxylic thuộc dãy kauran và đặt tên cho chúng là axit

siegesesteric (axit ent-17-axetoxy-18-isobutyryloxy-16-kauran-19-oic) và axit siegesetheric (axit ent-17-etoxy -16-(-)-kauran-19-oic)

J Xiong và cộng sự [91] đã phân lập được từ Siegesbeckia orientalis hai ditecpenoit mới, được đặt tên là orientalin A (ent-15-axetoxi -2,16,19- trihidroxipimar-8(14)-en) và orientalin B (ent-16-axetoxi -2,15,19-

9 10

O

R3

R 3 Me Me CH2OH CHO CH2OH R 3 H H H OH Meacr = Methacryl = CO

11 12 13 14

15

14

18

6 5 4 3 2 1

10 9

8

7

11 13 12 17

16

15 20

X

Một loài Siegesbeckia khác cũng được quan tâm nghiên cứu nhiều về hoá học và hoạt tính sinh học, đó là cây Siegesbeckia pubescens Makino ở

Nhật Bản phần trên mặt đất của cây này được gọi là "Kiren" và được dùng để chữa bệnh liệt chi [107] và làm vị thuốc có hoạt tính chống oxi hoá [82] ở bán đảo Triều Tiên, cây này được dùng trong y học dân gian để chữa bệnh cao

huyết áp [53] ở Trung Quốc Siegesbeckia pubescens được dùng như một số loài Siegesbeckia khác trong y học cổ truyền để chữa viêm khớp, thấp khớp,

cao huyết áp, sốt rét, suy nhược thần kinh và rắn cắn [92] L.K.Woo và cộng

sự [90] đã chứng minh sự có mặt các ancaloit trong Siegesbeckia pubescens

Từ Siegesbeckia pubescens, F.Yamamoto và cộng sự [94] đã phân lập được

các melampolid 11 có thể được dùng làm thuốc giảm đau và thuốc chống

viêm

CH=O

CH2OH

OAc OR

6 7 8 9

R = (E)- , (Z)- MeCH : CMeCO

11

L.Canonica, B.Rindone, C.Scolastico, K.D.Han và J.H.Kim [25] đã

phân lập được từ Siegesbeckia pubescens một hợp chất C20H34O4, đnc

với các nhóm hidroxi ở C-6, C-15, C-16 và C-18 (cũng xem [39], [41]) T.Murakami và cộng sự [107] đã phân lập lại đúng hợp chất ditecpenoit của

kirenol T.Murakami và cộng sự [107] cũng đã chỉ ra những thiếu sót của cấu trúc do L.Canonica và cộng sự [25] đã gán cho chất này Bằng các nghiên cứu chuyển hoá và dựa trên các dữ kiện phổ 1H NMR, cấu trúc của kirenol đã

được xác định là pimar-8(14)-en-2,15,16,19-tetraol (12) [107]

H HO

J.H.Kim và cộng sự [38], [53] đã thông báo về kết quả phân lập từ S

pubescens một ditecpen glucozit có khung daruten với nhóm O-glucozyloxi ở

C-6 và các nhóm hidroxi ở C-15 và C-16

Từ S pubescens, K.Yamasaki và cộng sự [95] cũng đã phân lập được

darutozit (2)

Đặc biệt một số dẫn xuất kauran cũng đã được tìm thấy trong

Siegesbeckia pubescens cùng với các hợp chất khung pimaran đã được nói đến

ở trên Điều này gợi đến sự phát hiện là pimaradien có thể là tiền thân của

khung (-)-kauran [25] Từ Siegesbeckia pubescens người ta đã phân lập được

axit 16,17-dihydroxi-16-(-)-kauran-19-oic (13a), [25], [39], [41], [56], các dẫn xuất 13b và 13c [39], [41], các dẫn xuất 14a, 14b và 14c [34]

6 5 4

3

2

1

10 9

19 18

17

H COOH

13a, R = CH2OH, R 1 = OH 14a, R = H

13b, R = CH2OH, R 1 = H 14b, R = COCH(CH3)2

13c, R = COOH, R 1 = H 14c, R = CO(CH2)nCH3

(n = 10, 12, 14, 16)

J.Xiong và cộng sự [92] đã phân lập từ Siegesbeckia pubescens của Vân

Nam các ent-kauran ditecpenoit siegesbeckiosid 15, siegesbeckiol 16 và axit

siegesbeckic 17

H GlcO

OH OH

H

OH

OH HO

H

Một vài tác giả đã nghiên cứu về thành phần hoá học của vài loài

Siegesbeckia khác Từ toàn bộ cây Siegesbeckia glabrescens X.Y.Dong và

cộng sự [29] đã phân lập được darutigenol (1b) và darutozit (2) cùng với một chất được các tác giả đặt tên là neodarutozit (18)

18 17

HOH2C

H

OH H H

Từ các bộ phận trên mặt đất tươi của Siegesbeckia glabrescens mọc ở

Liêu Ninh, Trung Quốc, K.Liu và cộng sự [61] đã phân lập được kirenol (12),

16-axetyl-kirenol và isopropyliden kirenol

Theo F.C.Seaman và cộng sự [76], các sesquitecpen lacton kiểu

melampolid (4,5-trans-1,10-cis-germacranolid) xuất hiện phổ biến trong các loài Siegesbeckia ( xem ở các phần trên)

F.Bohlmann và cộng sự [103] đã tìm thấy trong rễ cây Siegesbeckia

jorullensis các hợp chất axetylenic 19 và 20

E Z Z H

O

Me[CC]5CH=CH2 MeC=CH-CH=CH-CC-CH2-CH=CH-(CH2)5-C

19 20

1.1.1.3 Tác dụng chữa bệnh của hy thiêm [15]

ở Việt Nam, cây hy thiêm được sử dụng trong phạm vi y học dân tộc làm thuốc chữa bệnh.Đây là một cây thuốc khá phổ biến, mọc hoang khắp nơi Công dụng của hy thiêm trong y học cổ truyền là làm thuốc chữa một số bệnh như viêm khớp, lở ngứa, mụn nhọt, ong đốt, rắn cắn Hy thiêm còn được dùng để điều trị phong thấp, tê bại, khớp sưng nóng đỏ và đau nhức, đau lưng mỏi gối

Trong y học Trung Quốc, hy thiêm được dùng phối hợp với các cây thuốc khác để điều trị ung thư và chảy máu não kèm theo chứng liệt ở ấn độ,

hy thiêm được coi là có tác dụng chữa các vết loét hoại thư và các chứng đau nhức, các cơn đau thận, có tác dụng trợ tim ở Madagaskar, hy thiêm được dùng với tác dụng gây liền sẹo ở bên ngoài và bên trong cơ thể (đối với loét ống tiêu hoá)

Hy thiêm có thể dùng riêng hay kết hợp với một số thuốc khác dưới dạng sắc, cao mềm hoặc hoàn tán

Viên Hydan (bào chế từ ba dược liệu hy thiêm, ngũ gia bì và mã tiền trong đó hy thiêm có vai trò quan trọng hơn cả) đã được nghiên cứu ứng dụng trên tổng số 60 bệnh nhân viêm đa khớp dạng thấp và 55 bệnh nhân thấp khớp Thuốc có tác dụng:

- Chống viêm trên những bệnh nhân viêm đa khớp dạng thấp, tỷ lệ bệnh nhân khỏi và đỡ đạt 80% Thuốc tỏ ra tốt ở giai đoạn sớm của bệnh

- Giảm đau trên những bệnh nhân đau nhức khớp không rõ nguyên nhân, tỷ lệ đạt 80% Tác dụng giảm đau kém hơn so với tác dụng tiêu viêm

Gần đây Nguyễn Hải Nam đã thử hoạt tính gây độc tế bào của một số sản phẩm từ hy thiêm đối với một số dòng tế bào ung thư [68]

1.1.2 Cây bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ., Euphorbiaceae)

1.1.2.1 Thực vật học [10]

Cây bòn bọt còn được gọi là cây chè bọt, có tên khoa học là Glochidion

eriocarpum Champ., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Cây bòn bọt là một loại cây nhỏ, lá mọc so le, cành non màu đỏ tím có rất nhiều lông ngắn, trắng, cành già có màu xanh nhạt Phiến lá nguyên, hình trứng, đầu lá thuôn nhọn, dài 6-8cm, rộng 2-3cm, hai mặt phiến có nhiều lông ngắn, màu trắng, mặt dưới có nhiều lông hơn, cuống lá ngắn 1-1,5 mm Hoa bòn bọt rất nhỏ, là loại hoa đơn tính, mọc ở kẽ lá, thành cụm 3 hay 4 hoa một, trong đó có 1 hoa đực và 2 hay 3 hoa cái Quả hình bánh xe màu xanh, khi

chín có màu đỏ, quả cũng có lông trắng Mùa hoa vào khoảng tháng 3 đến tháng 4

1.1.2.2 Nghiên cứu hoá học về các loài Glochidion

Các loài thuộc chi Glochidion, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), mọc phổ

biến ở các vùng nhiệt đới (Châu á, australia, ), trong đó có 16 loài đã ít nhiều được nghiên cứu về mặt hoá học.Theo một số tác giả thì đặc trưng cho chi này là các tritecpenoit, thuộc nhóm dẫn xuất lupen, tuy nhiên điều nay đã không thật nghiệm, vì gần đây người ta cũng đã tìm thấy các khung tritecpen

khác (oleanan) trong các loài Glochidion

Các hợp chất đã được tìm thấy trong các loài Glochidion được nêu ở

bảng 1.1

Bảng 1.1 - Các hợp chất đã được tìm thấy trong các loài Glochidion

Tài liệu Nguồn gốc Các hợp chất phân lập được

[49],

[50]

Lá của một loài Glochidion

của New Guinea, có thể là

G.philippicum (Cav.) C B

Rob

Các ancaloit: glochidin, glochidicin, N oxodecanoyl)-histamin và N-cinnamoyl- histamin

-(4-Vỏ của loài cây này Glochidicin, N-cinnamoyl-histamin

Glochidonol (23), friedelin, lupenon, glochidon,

friedelan-3-ol, lupeol, -sitosterol, glochidiol

Lá cây G.wrightii Friedelin, glochidon, friedelan-3-ol, -sitosterol,

glochidiol

"Xeton A", "diol B", glochidon, glochidonol,

glochidiol, lup-20(29)-en-1, 3diol (24),

-sitosterol, stigmasterol, friedelin, friedelan-3-ol

L¸ c©y G.macrophyllum -Sitosterol, stigmasterol, friedelin,

friedelan-3-ol

[45] Th©n c©y G macrophyllum

Benth

Lup-20(29)-en-3, 23-diol (25)

[16] L¸ c©y G.venulatum Sitosterol, glochidon

[85] G.multiloculare Glochilocudiol (26), glochidiol, glochidon,

dimedon

[84] Vá rÔ vµ vá th©n c©y

G.accuminatum Muell Arg

Glochidon, glochidonol, -sitosterol

L¸ c©y G.thomsoni Hook f Glochidon, lup-20(29)-en-1, 3-diol,

-sitosterol

RÔ vµ vá c©y G.thomsoni Glochidon, -sitosterol

[46] Th©n c©y

G.eriocarpum Champ

Glochidol (27), lupenon, glochidon, lupeol,

sitosterol, glochidonol, glochidiol, 1, 3-diol

lup-20(29)-en-L¸ c©y G.eriocarpum Sitosterol, glochidiol

[47] G.macrophyllum Benth §· chøng minh c¸c "chÊt míi" A vµ B [50] lµ

metyl betulinat vµ glochilocudiol

L¸ c©y G.puberum Hutch Friedelin, friedelan-3-ol, lupeol, sitosterol,

lup-20(29)-en-1,3-dion (28)

Th©n c©y G.puberum Friedelin, lupenon, glochidon, friedelan-3-ol,

sitosterol, glochidonol, glochidiol, 1, 3-diol, lup-20(29)-en-1-ol-3-yl axetat, lup-20(29)-en-3-ol-1-yl axetat

lup-20(29)-en-[59] G.rubrum Blume Glochidon, -sitosterol, glochidonol

G.hongkongense Muell

-Arg

Glochidon vµ glucozit cña nã, glochidonol, mannitol

[60] G.rubrum Blume Bergenin

[27] Th©n c©y G.moonii Thw Glochidonol, lup-20(29)-en-3, 23-diol,

glochidiol, sitosterol

Gç mét loµi Glochidion míi

cña Sri Lanka

Glochidonol, lup-20(29)-en-3, 23-diol, glochidiol, sitosterol

Vá mét loµi Glochidion míi

cña Sri Lanka (c©y nªu trªn)

Glochidon, glochidonol, lup-20(29)-en-3, diol, glochidiol, lup-20(29)-en-1, 3, 23-triol

glucopyranosyl-(13)-0--L-arabinopyranosyl)-[80] G heyneanum Glochidioside N (31), tức

(3-[0--D-

glucopyranosyl)oxy]-16-benzoyloxy-olean-12-en-21, 23, 28-triol), glochidioside Q (32), tức

glucopyranosyl)-oxy]-16-benzoyloxy-olean-12- en-21, 23, 28-triol), glochidon, glochidonol, glochidiol, lup-20(29)-en-1, 3-diol, axit epimachaerinic, -amyrin, sitosterol--D- glucozit, D-mannitol, stigmasterol

(3-[0--D-glucopyranosyl-(12)-0--D-[28] Lá cây G.rubrum Blume Các tannin thuỷ phân được:

glochiin M1 D-glucopyranozit, glochiin M2 (phloroglucinol- (3,6-di-0-galloyl)--D-glucopyranozit, glochiin

(phloroglucinol-(2,6-di-0-galloyl)--C1 (hợp bởi gallocatechin glucozit được axyl hoá

ở cả phần gallocatechin lẫn phần glucozơ)

Như vậy, về hoá học của cây bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.),

cho đến nay mới chỉ có một công trình nghiên cứu [46] Các hợp chất được tìm thấy trong cây này là một số dẫn xuất lupen và sitosterol

Dưới đây là công thức hoá học của một số tritecpenoit được phân lập từ

các loài Glochidion

2

3 1

H

H

HOH2C

H H

HO

25 24

H HOH2C

HO

29 28

1 2

CH2OH OH

CH2OH GlcO

O CO

1 2

1 6 28 21

2 3

31

O OH OH

HOH2C

HO

O

CO O O

OH

CH2OH

O OH

HOH2C

HO

O OH

OH

CO O O

CH2OH

OH H

CH2OH

O OH HO

1.1.2.3 ứng dụng thực tế và hoạt tính sinh học của các loài Glochidion

ở Đài Loan, lá cây Glochidion rubrum Blume được dùng trong y học

dân gian để chữa rối loạn tiêu hoá ở Fiji, cây Glochidion cordatum được

dùng chữa đau dạ dày và một số bệnh khác [28]

Phần chiết etanol của các bộ phận trên mặt đất của cây Glochidion

heyneanum Wall thể hiện hoạt tính chống ung thư trong hệ thống PS [79]

ở Việt Nam, theo [3] thì cây bòn bọt được nhân dân dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa phù tim, phù thận, điều trị rắn cắn, điều trị tiêu chảy, chữa lỵ Bệnh viện Quân y 108 và bệnh viện Bắc Giang đã dùng bòn bọt thử nghiệm để chữa một số trường hợp phù thận do thiếu dinh dưỡng và phù suy tim Viện Bỏng Quốc gia, bệnh viện Vĩnh Yên đã dùng cao bòn bọt để chữa vết bỏng nông cho kết quả tốt [10]

Vì luận án của chúng tôi quan tâm đến các hợp chất phenolic và các tecpenoit cao hơn ở trong các loài cây được nghiên cứu nên dưới đây nêu một

số nét đại cương về hai lớp hoạt chất sinh học hiện đang được quan tâm này

1.2 Đại cương về các hợp chất phenolic thiên nhiên

1.2.1 Vài nét giới thiệu chung về các hợp chất phenolic thiên nhiên [99]

Các hợp chất phenolic thiên nhiên tạo thành một tập hợp chất rất lớn khiến khó có thể định nghĩa chúng một cách đơn giản Yếu tố cấu trúc cơ bản

đặc trưng cho lớp chất này là sự có mặt ít nhất một nhân benzen liên kết trực tiếp với ít nhất một nhóm hidroxi ở dạng tự do hoặc liên kết trong một nhóm chức khác: ete, este, heterozit Tuy vậy một định nghĩa hoá học thuần tuý không đủ để định rõ đặc trưng của các hợp chất phenolic thực vật, vì định nghĩa này sẽ bao gồm các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có chứa các yếu tố cấu trúc này ngay cả khi chúng rõ ràng thuộc vào các nhóm hoá chất thực vật rất khác nhau Chẳng hạn như nhiều chất ancaloit (morphin, boldin, ) và khá nhiều tecpenoit (thymol, gossypol, ) có chứa nhân benzen và nhóm hidroxi

phenolic trong cấu trúc của chúng Do vậy cần phải dựa vào một tiêu chuẩn sinh tổng hợp để có thể xác định một cách tốt hơn ranh giới cho lớp chất phenolic thiên nhiên

Trong thiên nhiên việc tổng hợp ra nhân thơm là công việc của riêng các loài thực vật và vi sinh vật Các cơ thể động vật hầu như luôn phải lệ thuộc vào nguồn thực phẩm của chúng hoặc vào một sự cộng sinh để điều chế ra các sản phẩm trao đổi chất thiết yếu đối với chúng và có yếu tố cấu trúc này (cũng

có một vài ngoài lệ, như trường hợp tổng hợp các estrogen)

Các hợp chất phenolic thực vật là các "chất thải" của hai con đường tạo nhân thơm lớn :

a Con đường phổ biến hơn là con đường đi qua shikimat (axit

shikimic) để chuyển các ozơ thành amino axit thơm (phenylalanin và tyrosin), rồi bằng cách deamino hoá (loại nhóm amino) các amino axit này mà chuyển thành các axit xinamic và rất nhiều dẫn xuất của chúng: các axit benzoic, các axetophenon, các lignan và các lignin, các cumarin, [87],[99]

Các phản ứng sinh tổng hợp này đều được xúc tác bởi enzym Phản

ứng đầu tiên của chuỗi sinh tổng hợp này là sự ngưng tụ của photphoenol

3-desoxy-D-arabino-heptulozonat-7-photphat (DAHP) DAHP đóng vòng thành 3-dehidroquinat, và chất này chuyển thành shikimat đi qua bước 3-dehidroshikimat

Shikimat được photphoryl hoá, và sản phẩm được ngưng tụ với một phân tử PEP mới để tạo thành 5-enolpyruvylshikimat-3-photphat (EPSP), chất này được chuyển thành chorismat bởi một sự tách loại 1,4 không bình thường

Axit chorismic chiếm một vị trí chìa khoá trong sự chuyển hoá tiếp, nó chịu một chuyển vị pericyclic kiểu Claisen để thành prephenat, và rồi qua

bước L-arogenat thành L-tyrosin hoặc L-phenylalanin Prephenat cũng có thể

đi qua phenylpyruvat để chuyển thành L-phenylalanin

Sơ đồ tóm tắt của các quá trình này được nêu ở hình 1.1

O

OH OH

COOHO

-O

OOC

prephenat

OH

OOC

-COOO

-OH

OOC

Như vậy con đường axit shikimic đã dẫn đến phenylalanin và tyrosin

là các đại diện cho một số rất lớn các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc đặc

được tạo thành từ phenylalanin (và cũng từ tyrosin) do sự tách loại amoniac bởi enzym (sự tách loại ,) được tiếp theo bởi sự hidroxyl hoá nhân thơm và trong một số trường hợp cả sự metyl hoá nữa [87]

Sự cắt ngắn mạch nhánh của các axit xinamic bởi sự oxi hoá  là một trong những con đường chủ yếu dẫn đến các axit benzoic Thời gian chính xác cần cho sự hidroxyl hoá nhân thơm thay đổi tuỳ theo cây, nhưng nói chung ở

mức C6 C1 Thí dụ, ta có thể đến được axit vanilic hoặc theo con đường axit cumaric  axit cafeic  axit ferulic hoặc theo con đường axit cumaric  axit p-hidroxibenzoic  axit protocatechuic [87]

Con đường sinh tổng hợp các axit hidroxi xinamic và axit hidroxi benzoic này được nêu ở hình 1.2

phenylalanin axit xinamic axit benzoic

axit p-OH-benzoic axit p-OH-xinamic

(axit p-cumaric)

tyrosin (cũng xem hình 1.1)

HO

HO HO

COOH

HO

H3CO COOH

CO2

oxi hoá 

Hình 1.2 - Mạng lưới sinh tổng hợp các axit xinamic và các axit benzoic

Sự dehidrat hoá và dehidro hoá axit 3-dehidroshikimic (x hình1.1) cho trực tiếp axit protocatechuic và axit galic Mặt khác phenylalanin chuyển hoá

thành axit galic trong Rhus typhina, gợi ra rằng con đường phenylalanin 

axit xinamic  axit p-OH-xinamic  axit cafeic axit 3,4,5-trihidroxi- xinamic  axit galic được ưu tiên trong trường hợp này Những điều vừa nêu

được minh hoạ ở hình 1.3 [87]

OH OH O

COOH

COOH

OH HO

COOH

OH OH HO

axit 3-dehidroshikimic

[O]

Các tannin

Hình 1.3 - Sinh tổng hợp axit galic, thành phần chính của các gallotannin

b Một con đường khác xuất phát từ axetyl-coenzym A (Me-C-SCoA,

được tạo ra từ axetat) và dẫn đến các poly--xetoeste với độ dài thay đổi-các polyketit- và rồi thông qua sự đóng vòng để cho nhiều loại hợp chất thơm khác nhau Hình 1.4 minh họa sự hình thành một số polyphenol theo con

đường polyketit này[64],[87],[99],[102]

O MeC CH2 C

O SCoA

axetoaxetyl-coenzymA (diketit)

SCoA

O MeC (CH2 C)n

O

CH2 C O

(polyketit, n1)

COOH OH

O

Me O

OH HO

OH

enol hoá

phloraxetophenon

Hình 1.4 - Sinh tổng hợp một số polyphenol theo con đường polyketit

Những điều đã nêu về sự sinh tổng hợp đã cho phép định nghĩa tốt hơn khái niệm hợp chất phenolic thiên nhiên: đó là các hợp chất không chứa nitơ

mà (các) vòng thơm chủ yếu là sản phẩm chuyển hoá của axit shikimic hoặc của một polyketit

1.2.2 Vài nét về các flavonoit [64],[87],[99]

Về mặt cấu trúc các flavonoit được đặc trưng bởi sự có mặt của hai nhân thơm được hidroxyl hoá, A và B, nối với nhau bởi một mảnh ba cacbon Như vậy các flavonoit cũng thuộc vào nhóm các polyphenol (x 1.2.1) Tuy

nhiên về mặt nguồn gốc các flavonoit có sự sinh tổng hợp hỗn hợp, nghĩa là chúng có nguồn gốc từ một polyketit (các đơn vị ba axetat) và một axit xinamic (axit shikimic) Thêm vào đó các flavonoit là một lớp chất quan trọng

về mặt hoạt tính sinh học, do đó thường được xét riêng Hình 1.5 nêu các phân lớp flavonoit và mối liên quan phát sinh sinh vật giữa chúng

O OH

Dihidroflavonol (flavanonol)

Hình 1.5 - Cấu trúc và mối liên quan phát sinh sinh vật của các flavonoit

Các flavonoit là các chất có màu đóng góp vào vẻ đẹp và sự lộng lẫy của hoa trái trong thiên nhiên Ngày nay ta biết đến khoảng 3000 flavonoit

Các flavon cho màu vàng hoặc da cam; các anthocyanin có màu đỏ, tím hoặc xanh, nghĩa là đủ các màu của cầu vồng, trừ màu lục Sự xuất hiện của lớp

đông đảo các dị vòng oxi này (thường dưới dạng các glycozit) hạn chế ở các cây thượng đẳng và cây dương xỉ Các loài rêu chứa một ít kiểu flavonoit, nhưng flavonoit không có mặt trong tảo, nấm và vi khuẩn Các kiểu hidroxyl hoá và metyl hoá hình như được quyết định bởi di truyền, có nghĩa là sự phân

bố của các flavonoit là một công cụ hỗ trợ hữu ích cho các mục đích phân loại Về mặt sinh học các flavonoit đóng một vai trò chủ yếu đối với sự thụ phấn của hoa bởi sâu bọ hoặc với việc sâu bọ ăn cây; tuy nhiên một số flavonoit có vị đắng nên xua đuổi các loài sâu khỏi ăn lá

hiện ở cấu trúc 33 Bằng các thí nghiệm đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ

tiểu đơn vị kia (nhân thơm A) có nguồn gốc polyketit Kiểu kết hợp oxi của

vòng A được chỉ ra ở 33, và vòng B có thể có kiểu thế 4-hidroxi, 3,4-dihidroxi,

hoặc 3,4,5-trihidroxi Sự oxi hoá tiếp, khử hoá, và ankyl hoá của bộ khung cơ

sở cũng có thể xảy ra để sinh ra những đặc trưng cấu trúc bổ sung

O RO

OR

(OR)n

2 1

3 4 5 6

33

Phenylalanin (chứ không phải tyrosin) là tiền thân của tiểu đơn vị

hidroxyl hoá của vòng A hầu như được thiết lập dứt khoát ở giai đoạn đóng vòng, trong khi sự hidroxyl hoá của vòng B có thể chưa được xác định cho đến thời điểm khá chậm trong quá trình Sơ đồ sinh tổng hợp khung flavon cơ sở

được nêu ở hình 1.6; axit axetic và phenylalanin được đánh dấu một cách rõ ràng cụ thể đã bị sát nhập như nêu ở hình này

C

O

OH CoA

sự sinh trưởng của cây và phát triển của hoa quả [2]

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hoạt tính sinh học của các flavonoit đã được đặc biệt quan tâm Vai trò của các flavonoit trong y dược học đang ngày càng được khẳng định Từ năm 1936, Ruszyak và các cộng sự

đã phát hiện ra khả năng nâng cao tính bền thành mạch của một hỗn hợp flavonoit có chứa trong quả chanh, và sau này người ta đã nhận biết được chúng là các catechin, các leucoanthocyan, các flavonol (rutin,quercetin) và flavanon [42]

Thực nghiệm cho thấy các flavonoit có nhóm OH tự do ở vị trí 3,4 có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch Rutin là chất tiêu biểu về tác dụng này

Từ nhiều năm nay các công trình nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn, chống viêm thực vật, trong đó có các polyphenol, đã được tiến hành một cách tích cực với những kết quả khả quan và đã được công bố [17],[20],[31],[63]

Có thể nêu ra đây một số ví dụ, như tác dụng kìm hãm của 24 anthocyanidin,

leucoanthocyan và axit phenolic lên Salmonella [72], tác dụng chống giun của

các chalcon và những chất tương tự [63], khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của các flavonoit chiết xuất từ thực vật và tổng hợp [77]

Hiện nay các gốc tự do được coi là nguyên nhân hoặc là một trong các nguyên nhân của hơn 60 bệnh thường gặp: ung thư (do biến đổi DNA); các bệnh tim mạch như cao huyết áp, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim; mất trí nhớ tuổi già; các trạng thái viêm; và nhất là quá trình lão hoá cơ thể Trong số các chất chống oxy hoá được công nhận rộng rãi có thể kể đến: Vitamin E +Selen, Vitamin C, Vitamin A (dưới dạng -caroten là tốt nhất) Tác dụng chống oxy hoá của các chất này đã được chứng minh bằng thực nghiệm trên người Nhiều công trình nghiên cứu trên động vật hay bằng các phương pháp hoá, lý đã chứng minh về khả năng bẫy gốc của các polyphenol trong đó có các flavonoit dựa trên cân bằng quinon-hydroquinon [1],[23],[51],[97] Ngày nay nhiều nhà hoá sinh học đã cho rằng các flavonoit là những chất chống oxy hoá lý tưởng đối với con người

1.3 Đại cương về các tecpen và tecpenoit [32],[64],[69],[87],[108]

Khái niệm “tecpen” được dùng để chỉ một lớp chất thiên nhiên có cấu

trúc có thể phân chia ra thành các đơn vị isopren Tuỳ theo số đơn vị isopren

có thể có cấu tạo mạch hở, hoặc một, hai, ba, bốn, năm vòng; các vòng có thể

các sản phẩm thoái biến của các hợp chất này

1.3.1 Sinh tổng hợp các tecpenoit

Ngày nay khoa học đã chứng minh được rằng trong sự sinh tổng hợp các tecpen hình thành theo con đường axit mevalonic, chất này được được tạo thành từ ba phân tử axetyl-coenzym A Từ ba phân tử axetyl-coenzym A (I) qua ngưng tụ kiểu Claisen rồi andol lần lượt tạo thành axetoaxetyl-SCoA (II) rồi 3-hidroxi-3-metyl-glutaryl-SCoA(III) tức HMG-CoA Sự khử hoá theo hai bước đi qua hemithio-axetal (IV) cho axit 3R-mevalonic (3R-MVA) (V) Photphoryl hóa MVA cho pyrophotphat của axit mevalonic (VI) Từ (VI) thông qua sự decacboxyl hoá và tách loại nước mà isopent-3-enylpyrophotphat (IPP) (VII) được tạo thành, chất này được đồng phân hoá thành 3,3- dimetyl-allylpyrophotphat (DMAPP) (VIII) là đồng phân bền hơn

IPP và DMAPP là hai đơn vị C5 được hoạt hoá, chúng là các đơn vị tương đương sinh học của isopren được gọi là "isopren hoạt động" và các isoprenoit là các sản phẩm của sự hợp nhất giữa chúng

Các quá trình nêu ở trên được trình bày một cách giản lược ở hình 1.7

O

MeC CH2COSCoA O

(Ngưng tụ kiểu Claisen)

O Me OH -

Đồng phân hoá

Me

OPP H

VII VIII

O SCoA MeC

MeC SCoA O

(Ngưng tụ andol)

Khử hoá

Hình 1.7 - Sinh tổng hợp các "isopren hoạt động"

3,3- Dimetyl-allylpyrophotphat là một tác nhân electrophil mạnh và tấn công bằng cách cộng hợp vào nối đôi của isopentenylpyrophotphat (sự ngưng

tụ đầu- đuôi)

geranyl pyrophotphat (GPP)

Kết quả là hình thành geranylpyrophotphat (GPP) GPP lại có thể tác dụng như là một dẫn xuất allyl có tính chất electrophil mạnh và tấn công vào một phân tử IPP Quá trình này được tiếp tục, và dẫn đến các tiền thân không vòng của các hợp chất tecpenoit thiên nhiên (Hình 1.8)

geranyl-pyrophotphat (GPP)

+C5

Các monotecpen, C10 polytecpen

Các ditecpen, C20 Các tetratecpen, C40

D

Các sestertecpen, C25

pyrophotphat (GFPP)

geranyl-farnesyl-Hình 1.8 - Sơ đồ sinh tổng hợp các hợp chất tecpenoit

D = dime hoá theo cách ngưng tụ đuôi - đuôi

Bên cạnh sự ngưng tụ đầu- đuôi ở trên còn có thể xảy ra sự ngưng tụ

đuôi - đuôi, dẫn đến sự dime hoá (D, hình thành các tri- và tetratecpen):

2

P P

6 7

8 9

1 2 3 4 5

6 7

1 2 3 4

5 6 7 8 9 10

Sesquitecpen

1 2 3 4 5 6 7

Ditecpen

pimaran

17

18 19

16 15

20

12 13 11

7 8 9 10

1 2 3 4 5 6

12 13 14

15

16

17

18 19

22 28

30 29

26

24 23

26

29 30

28 22

21 19

18 17 16 15 14 13 12 11

20

1 2

8 9 10

25

oleanan

1.3.2 ứng dụng thực tiễn của các tecpenoit

Các tecpenoit có những ứng dụng rất phong phú trong nhiều lĩnh vực khác nhau như làm chất thơm và chất tạo hương vị, làm dược phẩm, làm chất diệt trừ sâu hại

Về mặt ứng dụng thực tiễn, nhiều monotecpen và sesquitecpen là những chất thơm và tạo hương vị rất có giá trị

Là những chất quang hoạt dễ kiếm và rẻ tiền, một số monotecpen, thí

dụ (-)--pinen, (-)- và (+)- limonen cũng như (+)-3-caren được dùng làm các

chất đầu để tổng hợp một số sản phẩm quang hoạt, thí dụ (+)- và (-)- carvon

là chất có mùi thơm của cây thì là, và để sản xuất một số tác nhân dùng trong việc phân tách các raxemat

Một số tecpen được dùng làm thành phần để điều chế nhựa tổng hợp hoặc được dùng làm dung môi pha sơn Nhiều tinh dầu được dùng làm dược phẩm Thí dụ tinh dầu bạc hà và menthol từ tinh dầu này Trong số các chất kháng sinh có nhiều chất thuộc dãy sesquitecpen, ditecpen hoặc tritecpen, thí

dụ axit fusidic là một chất kháng sinh thuộc dãy tritecpen từ lâu đã được phép lưu hành trên thị trường Các hocmon juvenil của sâu bọ là các dẫn xuất sesquitecpen, và hocmon thực vật thuộc nhóm gibberellin đều là các ditecpen Một số sesquitecpen và ditecpen có tác dụng kìm hãm sự phát triển của các tế bào ung thư, mà điển hình nhất là chất ditecpen taxol được phân lập từ cây

Taxus brevifolia, một chất đã chứng tỏ tác dụng điều trị rất có hiệu quả đối với

ung thư vú và ung thư buồng trứng Chất sesquitecpen artemisinin được phân

lập từ cây Artemisia annua L đã được sử dụng có hiệu quả trong điều trị bệnh

sốt rét

Chương 2 phương pháp nghiên cứu

2.1 Mẫu thực vật

Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm Mẫu tươi

rồi xay thành bột mịn Bột nguyên liệu thực vật được chiết nóng với etanol rồi phân bố chọn lọc với các dung môi thích hợp Các dung môi thường dùng là ete dầu hoả (khoảng sôi 300-600C, PE), clorofoc, etyl axetat (EtOAc), n-butanol (n-Bu) (xem Phần thực nghiệm-Chương 3)

Các mẫu thực vật đều được GS Vũ Văn Chuyên, Trường Đại học Dược

Hà Nội, và TS Trần Ngọc Ninh, Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật-Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, giám định

2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách các phần chiết của các cây được nghiên cứu cũng như phân lập các hợp chất đã sử dụng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký lỏng trung áp (MPLC) và các phương pháp kết tinh phân đoạn

Cấu trúc các hợp chất đã được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS),phổ tử

ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D

2.4 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

Các phần chiết từ các loài cây được nghiên cứu và một số hợp chất phân

lập được đã được khảo sát in vitro về hoạt tính kháng vi sinh vật

(antimicrobial activity) và hoạt tính chống oxy hoá (antioxydant activity)

Việc thử hoạt tính kháng vi sinh vật, cụ thể là tác dụng đối với một số vi khuẩn gram dương, gram âm và vi nấm, được thực hiện với kỹ thuật khuếch tán trên môi trường đặc [58], [86]

Việc thử hoạt tính chống oxy hoá được tiến hành theo phương pháp xác

định lượng malonyl diandehit (MDA) hình thành trong quá trình peoxy hoá lipit [110]

Điều chế thuốc thử sắt (III) clorua (FeCl 3 ) [109]: pha dung dịch FeCl3

3% trong nước và thêm 1-2 giọt axit clohidric đặc làm môi trường tránh cho dung dịch khỏi bị thuỷ phân

Điều chế thuốc thử nhôm clorua (AlCl 3 ) [109]: pha dung dịch AlCl3 5% trong nước