Giám sát sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1

Giám sát sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên đàn gia cầm tại các chợ của 3 tỉnh Bắc Trung Bộ thuộc dự án VAHIP bằng phương pháp PCR (Real time RT – PCR

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chănnuôi gia cầm nói riêng đã gặp không ít khó khăn Nhiều dịch bệnh đã xảy rabuộc phải tiêu hủy toàn đàn gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi và nền kinh

tế nước nhà Nhiều dịch bệnh không chỉ xảy ra trên vật nuôi mà còn lây sangcon người gây tử vong Một trong số đó là bệnh Cúm gia cầm

Khi mới xuất hiện ở Việt Nam vào năm 2003, bệnh đã thể hiện là một cănbệnh có tính lây lan nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng Thời gian đầu củadịch bệnh từ ngày 27/12/2003 đến 30/04/2004, chỉ trong vòng hơn 4 tháng dịch

đã làm cho 2574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 57 tỉnh/thành phố mắcbệnh Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và tiêu hủy lên tới 43,9 triệu con Trongthời gian gần đây, mặc dầu chúng ta đã có nhiều biện pháp phòng chống dịchnhưng bệnh vẫn đang xảy ra trên phạm vi rộng và ngày càng nguy hiểm hơn,đặc biệt là số lượng người mắc và tử vong ngày càng tăng Năm 2003 ở Việt

Nam chỉ có 3 người nhiễm và cả 3 người đều tử vong, trên thế giới có 4 ngườinhiễm và cả 4 người đều tử vong Nhưng đến năm 2009, ở Việt Nam có tới 111người nhiễm trong đó có 56 người tử vong, trên thế giới có 423 người nhiễmtrong đó có 258 người tử vong Với đặc điểm của căn bệnh là có nhiều subtypekhác nhau và khả năng tổ hợp biến chủng đã làm cho căn bệnh ngày càng trởnên nguy hiểm hơn gây nhiều thiệt hại cho người chăn nuôi, đe dọa tính mạngcon người đồng thời gây không ít khó khăn cho việc khống chế dịch bệnh chongành thú y.

Trước tình hình trên đặt ra cho chúng ta câu hỏi là: làm thề nào để có thể chủ động biết được nơi đang lưu hành dịch, tỷ lệ lưu hành và nơi đó đang lưu hành chủng gây bệnh nào đồng thời phát hiện thêm các chủng mới một cách

chính xác nhất Chính vì thế mà chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Giám sát

sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên đàn gia cầm tại các chợ của 3 tỉnh Bắc Trung Bộ thuộc dự án VAHIP bằng phương pháp PCR (Real time

RT – PCR)”.

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI.

Góp phần xác định sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên 3 tỉnhthuộc dự án VAHIP: Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên - Huế

Phần IITỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI NIỆM VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM

Cúm gia cầm có tên khoa học là Avian influanza, là một bệnh truyền nhiễmcấp tính gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ Orthomyxovirideae Đây là tácnhân gây bệnh nguy hiểm và nghiêm trọng trên gia cầm, dã cầm, động vật có vúkhắp thế giới và có thể lây sang cho người gây thiệt hại lớn cho ngành chănnuôi nói riêng và kinh tế mỗi quốc gia nói chung Bệnh cúm gà đặc trưng với tỷ

lệ ốm và chết nhanh, cao với các triệu chứng sốt cao và những biểu hiện bệnh lí

ở các cơ quan

Trước đây, bệnh được gọi là bệnh dịch tả gà, nhưng từ Hội nghị quốc tế lần thứnhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville (Mỹ) năm 1981 đã thay thế tên này bằng tênHighly pathogenic avian influenza – HPAI Tên này dùng để chỉ các virus cúm type

A có độc lực mạnh, lây lan nhanh và có tỷ lệ tử vong cao Tổ chức OIE (2003) đã xếpHPAI thuộc danh mục A, là 1 trong 15 bệnh nguy hiểm ở động vật

2.2 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.2.1 Tình hình thế giới

Bệnh đã được mô tả đầu tiên ở Italya vào năm 1878 và nó được nhìn nhận

là một bệnh quan trọng và nguy hiểm Năm 1955 virus gây bệnh mới được xácđịnh thuộc type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 gây chếtnhiều gà, gà tây và các loại chim khác

Vào năm 1971 bệnh đã được mô tả kỹ qua đợt dịch cúm khá lớn trên gà tây

ở Mỹ Các năm tiếp theo bệnh được phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Nam Phi.Đặc biệt năm 1983 – 1984 ở Mỹ, dịch cúm gia cầm do chủng H5N2 ở bangPensylvania, Virginia, Newtersey làm chết và tiêu hủy hơn 19 triệu con gà

Cũng trong thời gian này tại Irelan người ta phải tiêu hủy 270000 con vịt, tuykhông có triệu chứng lâm sàng nhưng đã phân lập được virus H5N8 và bệnh đãđược loại trừ một cách nhanh chóng.

Đến năm 2004, bệnh Cúm gia cầm đã xảy với quy mô lớn và với tốc độbùng phát nhanh ở các nước châu Á với tổng số 11 quốc gia Dịch xuất hiện đầutiên ở Hàn Quốc từ đầu tháng 12/2003, sau đó dịch xảy ra nhiều nước khác vớidiễn biến khá phức tạp Đến cuối tháng 2/2004 đã có 10 nước công bố dịch làHàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc,Hồng Kông, Đài Loan và Pakistan Chủng virus độc lực cao đã được phân lập

và định type là H5N1 đây là type chủ yếu, bên cạnh đó còn có H5N2 ở ĐàiLoan và H7N3, H9N2 ở Pakistan Ngoài ra, tại một số nước khác đã phân lậpđược một số chủng khác như H6 ở Nam Phi, chủng H10N7 ở Ai Cập, H7N3 ởCanada, H7N2 ở Hoa Kì Trong đợt dịch này khoảng 120 triệu gia cầm gồm:

gà, gà tây, gà sao, gà lôi, vịt, ngan, ngỗng, chim cút, bồ câu và một số chimhoang dã đã bị nhiễm bệnh và nằm trong vùng dịch phải tiêu hủy Cùng vớidiễn biến bệnh trên gia cầm, hàng trăm người cũng đã bị lây nhiễm, trong đó cótrên 20 người bị chết (Hội nghị cúm gia cấm tại thành phố Hồ Chí Minh)

Dịch cúm gia cầm ngày càng lan rộng Tại Thái Lan, đợt dịch thứ nhấtkéo dài từ ngày 23/01/2004 đến giữa tháng 3/2004 đã phải tiêu hủy 30 triệucon Vừa chấm dứt thì đợt dịch thứ hai xuất hiện kéo dài từ ngày 03/07/2004đến 14/02/2005 Ở Indonesia dịch xuất hiện đợt dịch thứ hai vào ngày23/03/2005 Trong tháng 02/2004 một số nước đã tuyên bố khống chế đượcdịch song có một số nước dịch lại tái phát lần 2 như Thái Lan, Campuchia, HànQuốc, Nhật Bản và Việt Nam Có thể nói đây là lần đầu tiên trong lịch sử bệnhCúm gia cầm xảy ra nhanh trên diện rộng với diễn biến khá phức tạp Ngoàithiệt hại về kinh tế tính đến năm 2009 đã có 423 người nhiễm và 258 người tửvong (Ivan Larondelle “ Cúm gia cầm”, Bách khoa toàn thư mởwikipedia.5/2/2010)

Bảng 2.1 Số lượng các ca nhiễm cúm gia cầm trên người

2.2.2 Tình hình dịch Cúm ở Việt Nam

Dịch Cúm gia cầm xuất hiện đầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng

12/2003 tại trại giống của công ty CP ( Thái Lan) làm 8000 gà ốm chết trong 4

ngày Từ đó đến nay đã xảy ra các đợt dịch chính như sau:

Đợt dịch thứ nhất: từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004

Trong thời gian này dịch bệnh đầu tiên được báo cáo xảy ra vào cuối tháng

12/2003 ở một xã thuộc Hà Tây Cùng thời điểm đó, các ổ bệnh cũng xảy ra tại các

tỉnh Tiền Giang và Long An Sau thời điểm này, bệnh đã lây lan nhanh từ tỉnh này

sang tỉnh khác thuộc miền Trung, Tây Nguyên và một số tỉnh phía Bắc

Đây là đợt dịch đầu tiên xảy ra tại Viêt Nam nên ngành thú y gặp nhiều

khó khăn trong công tác khống chế bệnh Đồng thời dịch lây lan một cách nhanh

chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc ở nhiều địa phương khác nhau

đã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi Chính vì thế, chỉ trong 2 tháng đợtdịch đã làm cho gia cầm của 2574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 51tỉnh/thành phố của Việt Nam bị mắc bệnh Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và

bị tiêu hủy hơn 43,9 triệu con và thủy cầm là 13,5 triệu con Ngoài ra còn có14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu hủy (Nguyễn TuấnAnh, 2006)

Đến đầu tháng 2/2004, bệnh Cúm gia cầm đã lan ra hầu như khắp cả nướcvới diễn biến phức tạp Trung bình 1 ngày có khoảng 13 – 230 xã, 15 – 20huyện phát sinh ổ dịch mới trong cả nước Số gia cầm phải tiêu hủy lên tới 2 – 3triệu con/ngày, ngày cao điểm lên tới 4 triệu con Số lượng các ổ dịch cao nhấtvào ngày 6/2/2004 Sau ngày 29/2/2004 không có thông báo về các ổ dịch mới,không còn gia cầm bị tiêu hủy và ngày 30/3/2004 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp vàPhát triển nông thôn đã công bố hết dịch cúm gia cầm trên toàn quốc

Như vây, trong đợt dịch đầu tiên này có 57/61 tỉnh/thành trong cả nước códịch Có 4 tỉnh không có dịch là Tuyên Quang, Phú Yên, Khánh Hòa và BìnhThuận Hầu hết ở các tỉnh có dịch đều có trên 10% số xã có dịch Theo thống kêcho đến đợt dịch cuối, đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long lànhững khu vực có tỷ lệ gia cầm mắc bệnh cao nhất

Đợt dịch thứ 2: từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2004

Các ổ dịch Cúm gia cầm thể độc lực cao đã tái xuất hiện vào giữa tháng4/2004 ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long

Trong đợt dịch tái lại này, bệnh xuất hiện chủ yếu ở các hộ chăn nuôi nhỏ

lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi quy mô lớn nào bị nhiễm bệnh Như vậy

ta thấy dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng chăn nuôi nhiều thủy cầm

và dịch đã xuất hiện ở 46 phường/xã tại 32 quận/huyện thuộc 17 tỉnh/thành.Thời gian cao điểm nhất là tháng 7 sau đó giảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ

có 1 điểm phát dịch Tổng số gia cầm bị tiêu hủy trong đợt này là 84000 con,

Anh, ‘Hội nghị quốc tế lần thứ hai về cúm gia cầm ở Châu Á’.12/4/2005.)

Đợt dịch thứ 3: từ tháng 12/2004 đến tháng 5/2005

Trong đợt này bệnh Cúm gia cầm thể độc lực cao đã xuất hiện ở 670 xãtại 182 huyện thuộc 36 tỉnh/thành phố trong đó có 15 tỉnh phía Bắc và 21 tỉnhphía Nam Thời điểm xuất hiện nhiều ổ dịch nhất là vào tháng 1/2005 với 143 ổdịch xảy ra trên 31 tỉnh/thành Tổng số gia cầm tiêu hủy của đợt dịch này là

460320 con gà, hơn 825000 vịt ngan và 551000 chim cút đã chết và bị tiêu hủy.(Báo cáo về dịch cúm gia cầm - Hội nghị dịch Cúm gia cầm)

Đợt dịch thứ 4: từ 01/10/2005 đến 5/2005

Từ đầu tháng 10/2005 đến 15/12/2005 dịch đã tái phát ở 285 phường/xã,thị trấn thuộc 100 quận/huyện của 24 tỉnh/thành phố Số gia cầm ốm, chết vàtiêu hủy là 3735620 con, trong đó có 1245282 con gà, 2005557 con vịt, 484781chim cút, bồ câu, chim cảnh (Nguyễn Tuấn Anh, 2006)

Đây là đợt dịch có diễn biến khá phức tạp nên buộc các địa phương phải

áp dụng các biện pháp quyết liệt như diệt toàn bộ gia cầm thả rông, đóng cửarừng, đóng cửa các vườn chim, không nuôi gia cầm chim cảnh trong nội thành.Với những biện pháp trên với mục đích là đến năm 2006 không còn dịch Cúmgia cầm, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành lệnh cấm ấp mớithủy cầm đến hết tháng 2/2007

Đợt dịch thứ 5: từ ngày 06/12/2006 đến ngày 04/03/2007

Ở những tháng đầu của năm 2007 dịch bệnh đã xảy ra tại 83 xã/phườngthị trấn, 33 huyện/quận của 11 tỉnh/thành phố; nơi đầu tiên xảy ra dịch là CàMau sau đó lan ra ở các vùng lân cận Tổng số gia cầm bị bệnh là 99040 trong

đó có 11950 con gà, 87090 vịt và ngan Sau thời gian trên dịch bệnh vẫn tiếp tụcdiễn ra trên nhiều điạ phương khác Và theo số liệu thống kê trong năm 2007dịch bệnh đã xảy ra trên 283 phường/xã thuộc 115 huyện/quận của 33 tỉnh/thànhphố Tổng số gia cầm mắc bệnh là 62207 con, số gia cầm chết và tiêu hủy là

314268 con

Như vậy, so với các năm trước thì dịch bệnh đã có xu hướng giảm xuống

về phạm vi mắc bệnh cũng như số lượng mắc bệnh

Dịch bệnh năm 2008

Đầu năm 2008 dịch cúm gia cầm mới chỉ xảy ra trên tỉnh Trà Vinh sau đódịch đã xảy ra trên các tỉnh khác như Thái Nguyên, Tuyên Quang, Quảng Bình,Hải Dương, Nam Định, Nghệ An, Hà Tĩnh và nhiều tỉnh khác Trong năm 2008dịch đã xảy ra trên 80 phường/xã thuộc 57 huyện/thị trấn của 27 tỉnh Tổng sốgia cầm mắc bệnh là 13007 con và tổng số gia cầm tiêu hủy là 106058 con

(Phòng dịch tễ,’ Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2009 và phương hướng năm 2010’, Cục thú y, trang 1 – 4).

Dịch bệnh năm 2009

Tính từ đầu năm 2009 đến ngày 22/12/2009 cả nước đã có 129 ổ dịch tại

71 xã/phường của 35 huyện/thị xã thuộc 17 tỉnh/thành phố phát dịch cúm giacầm là: Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, Điện Biên, Đồng Tháp, Hậu Giang,Khánh Hòa, Nghệ An và một số tỉnh khác Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết vàtiêu huỷ là 105.601 con, trong đó gà 23733 con (chiếm 22,51 %), vịt 79138 con(chiếm 74,94 %) và ngan 2690 con (chiếm 2,55 %) Trong năm 2009 dịch bệnh

đã diễn ra trên 72 xã/phường thuộc 18 huyện/thị trấn của 18 tỉnh Tổng số giacầm mắc bệnh 68463 con, tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 105601 con

((Phòng dịch tễ,’ Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2009 và phương hướng năm 2010’, Cục thú y, trang 1 – 4).

Qua những số liệu trên ta thấy năm 2009 dịch bệnh đã giảm về phạm vi(số phường, xã) tuy nhiên số lượng gia cầm chết và tiêu hủy năm 2009 tươngđương năm 2008 và bằng 1/3 so với năm 2007 Tình hình dịch cúm gia cầmtrong 3 năm 2007, 2008, 2009 được thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trong 3 năm (2007 – 2009)

Giai đoạn Số tỉnh Số huyện

có dịch

Sốxã/phường

có dịch

Số gia cầmmắc bệnh(con)

Số gia cầm chết,tiêu hủy (con)

Dịch bệnh năm 2010

Trong những tháng đầu năm 2010 dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở nhiều tỉnh

trên toàn quốc Dịch xảy ra đầu tiên ở Cà Mau, sau đó dịch lan ra ở một số

huyện ở Sóc Trăng Tiếp đó dịch xảy ra ở Kon Tum, Quảng Trị, Nghệ An, Nam

Định, Khánh Hòa và một số tỉnh khác Trong gian đó, ở vùng Bắc Trung Bộ

dịch xảy ra cũng khá phức tạp Ở Hà Tĩnh dịch đã xảy ra ở huyện Cẩm Xuyên,

Thành phố Hà Tĩnh, huyện Thạch Hà Tổng số gia cầm ốm là 3527 con và tổng

số tiêu hủy là 5726 con Dịch cũng đã xảy ra ở một số huyện ở tỉnh Nghệ An

như Huyện Nam Đàn, Huyện Nghi Lộc, Thành phố Vinh làm cho 370 con bị

ốm và 1139 con tiêu hủy Ở Quảng Trị, dịch mới chỉ xảy ra ở huyện Triệu

Phong đã làm cho 495 gia cầm bị ốm và 1440 con gia cầm tiêu hủy

Có thể nói rằng dịch cúm gia cầm ngày càng diễn ra phức tạp trên phạm vi

toàn quốc Do vậy công tác phòng chống dịch ngày càng phải chặt chẽ hơn, ý

thức người dân cũng phải nâng cao hơn

2.3 VIRUS HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM TYPE A

2.3.1 Cấu trúc chung của virus cúm

Virus cúm gia cầm type A là thành viên của họ Orthomyxoviridae

Virus có vỏ ngoài với bộ gen là ARN cực âm một sợi Hạt virus (virion) códạng hình khối tròn, hình trứng hoặc hình khối kéo dài có đường kính 80 – 120

nm Đôi khi virus có hình sợi kéo dài đến vài µm Phân tử lượng của hạt viruskhoảng 4.6 – 6.4 Dalton Virus được bọc bên ngoài bằng các Protein và cómàng Lipit ở ngoài cùng Bề mặt ngoài phủ bằng hệ thống Protein bao gồmProtein có phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (hemagglutinin), Protein enzymcắt thụ thể NA (neurominidase)

Hình 2.1 Cấu trúc bên ngoài của virus cúm gia cầm

Capsid bên ngoài nhân của virus được cấu tạo từ Protein, cấu trúc đối xứngxoắn, độ dài 130 – 150 nm, đường kính 9 – 15 nm tạo thành giới hạn vòm củamỗi phân đoạn và liên kết với nhau một cách riêng biệt

Cùng với virus cúm A thuộc họ Orthromyxoviridae còn có 3 nhóm khác là: Virus cúm type B chỉ gây bệnh cho người

Virus cúm type C chỉ gây bệnh cho người và lợn

Virus nhóm Thogovirus

2.3.2 Nét đặc trưng về cấu trúc hệ gen

Hệ gen của virus cúm chứa duy nhất axit ribonucleic (RNA) một sợi SợiRNA có độ dài 10.000 – 15.000 nucleotide tùy loại virus, chúng không được nốivới nhau tạo thành một sợi RNA hoàn chỉnh mà được chia thành 7 – 8 phânđọan, mỗi một phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho các Protein khác nhau

Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, bao gồm:

- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein

enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase củavirus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus Protein PB2 có khốilượng phân tử theo tính toán khoảng 84000Dalton

- Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp

enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quátrình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA

- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn

cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toánkhoảng 83000Dalton PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệmkéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus

Hình 2.2 Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A

Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus

- Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài

thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thayđổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, khángnguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng

50000Dalton Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phầnđầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổicao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quátrình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khácnhau Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biếntrượt - xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho

độ dài vốn có trước đây của NA(N1) là 1410 bp còn 1350 bp

Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vậnchuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ

- Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho

protein đệm (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2

được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạnRNA), cùng với HA và NA có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid củavirus cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin Protein M1 làmột protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo

nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus Protein M2

là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11000Dalton,

là protein chuyển màng - kênh ion (ion channel) cần thiết cho khả năng lây

nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương

tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ

- Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc, có độ dài

ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóatổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), cóvai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng.NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27000Dalton chịu trách nhiệm vậnchuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác độnglên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ.NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loạiprotein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14000Dalton đóng vai tròvận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân

Trong các đoạn trên, đoạn RNA có trọng lượng nhỏ nhất mang mật mãcho 2 loại Protein không cấu trúc là NS1 và NS2, chúng dễ dàng tách được ởcác tế bào bị nhiễm Tất cả 8 đoạn của sợi RNA có thể tách và phân biệt dễdàng qua phương pháp điện di

2.3.3 Kháng nguyên của virus

Dựa trên yếu tố ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin viết tắt là H ) vàtrung hòa (Neuraminidase viết tắt là N) là những kháng nguyên có vai trò trongmiễn dịch bảo hộ và có tính đa dạng cao mà virus Cúm type A được phân type.Đến nay, có tất cả 16 loại gen H (H1 – H16) và 9 loại gen N (N1 – N9), mỗi

Haemagglutinin(HA) một đặc tính kháng nguyên quan trọng của virus

cúm là khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loại động vật mà thực chất

là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt virus với thụ thể cótrên bề mặt hồng cầu làm cho hồng cầu ngưng kết lại với nhau tạo mạng ngưngkết qua cầu nối virus Từ đặc tính kháng nguyên này có thể sử dụng các phảnứng ngưng kết hồng cầu HA và ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI trong việc chẩnđoán bệnh HA là một loại kháng nguyên vừa quyết định tính kháng nguyênvừa quyết định tính độc lực của virus Cúm type A

Neuraminidase (NA) là một enzyme có bản chất là glycoprotein mang

tính kháng nguyên trên bề mặt virus cúm Có 9 gen N nhưng trong đó chỉ có N1

và N2 có liên quan đến các vụ dịch ở người Neuraminidase có tác dụng hỗ trợgiải phóng virus ra khỏi tế bào vật chủ Neuraminidase cắt liên kết giữa gốcsialic acid tận cùng khỏi phân tử carbonhydrate của tế bào và virus, từ đó ngăncản quá trình kết hợp của virus và cho phép giải phóng các hạt virus ra khỏi tếbào bị nhiễm

Nguy hiểm nhất về kháng nguyên virus cúm type A là chúng có khả năng

tổ hợp biến chủng dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên Chúng cóhai khả năng đột biến:

- Đột biến điểm (còn gọi là đột biến ngẫu nhiên hoặc hiện tượng trôi trượt,lệch lạc về kháng nguyên – antigenic drift) Đây là kiểu đột biến xảy ra thườngxuyên, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N tạo ra những thayđổi nhỏ về trình tự Nucleotide của gen mã hóa cho kháng nguyên H và khángnguyên N Nếu quá trình dập tắt dịch không triệt để, virus vẫn còn tồn tại thì hiệntượng đột biến này sẽ xảy ra Kết quả là sẽ tạo ra type Cúm hoàn toàn mới

- Đột biến do tái tổ hợp di truyền (còn gọi là đột biến thay đổi bản chấtkháng nguyên – antigenic shift) Đột biến này là sự tái tổ hợp di truyền xảy rađịnh kỳ trong đó có sự sắp xếp lại các Nucleotide do sự trộn lẫn 2 bộ gen củavirus khác nhau Điều này đã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virusđời con so với đời bố mẹ

Chính khả năng tổ hợp biến chủng này đã gây ra nhiều tai họa không chỉtrên gia cầm mà còn trên con người Năm 1918 ở Tây Ban Nha do biến chủngH1N1 làm chết 20 – 40 triệu người, năm 1957 ở châu Á do chủng H2N2, năm

1968 dịch cúm ở Hồng Kông do H3N2, dịch cúm năm 1977 ở Nga do H1N1.Hầu như tất cả các biến chủng virus cúm type A gây ra đều là sản phẩm tái tổhợp của subtype có nguồn gốc từ động vật trước hết là chim và gia cầm Dotrên người có một số chủng virus gây bệnh cúm thông thường, nó sẽ là mộtnhân tố trong quá trình trao đổi gen giữa virus cúm thông thường trên người vàvirus cúm trên gia cầm tạo nên tổ hợp biến chủng mới Và tổ hợp biến chủngnày sẽ thích ứng trên người nên chúng rất nguy hiểm cho nhân loại

2.3.4 Độc lực của virus

Để đánh giá độc lực của virus cúm người ta sử dụng phương pháp gâybệnh cho gà 3 – 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2ml nước trứng đã gâynhiễm virus với tỉ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ nhiễm của gà đểcho điểm (chỉ số IVPI: Intravenous Pathogenicity Index) Điểm tối đa là 3 đó làvirus có độ độc lực cao nhất Theo quy định của Ủy ban châu Âu Bất cứ virusCúm nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên thuộc loại LPAI - độc lực cao

Trong thực tế, virus cúm gây bệnh ở loài chim được phân chia theo tínhgây bệnh với 2 mức độ độc lực khác nhau: Loại độc lực cao (HPAI - Highlypathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avianinfluenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên

- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quannội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% sốgia cầm bị nhiễm trong vòng 48h sau nhiễm Loại này rất nguy hiểm gây longại cho cộng đồng Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tếbào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin

- LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnhcúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ

Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên củavirus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực caođồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm.

Cho đến nay, hầu như các vụ dịch lớn đều do virus HPAI gây ra thường

là virus có kháng nguyên H5, H7, H9 Riêng H5 và H7 thông thường bắt nguồn

từ virus độc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút độc lực tănglên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn

2.3.5 Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus

Virus cúm A/H5N1 có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu môđường hô hấp, hơn nữa đây là loại virus sống kí sinh nội bào bắt buộc nênquá trình xâm nhiễm và nhân lên chủ yếu xảy ra ở đường hô hấp

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của

HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giảiphóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 2.3)

Hình 2.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào vật chủ

- Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tếbào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trongnguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễmnhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chu trình xâm nhiễm vàgiải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6h).

Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bàonày bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theochương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ

- Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus

sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vậnchuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription) Phức hợp protein –RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào

- Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợidương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổnghợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi này không

được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết

hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoànchỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các RNA thông tincủa virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus,

và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đóđược vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợpnên các protein của virus

- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyểngắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng

“nảy chồi” của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào

để kết hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng các RNP của virus được

hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế

bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt cácliên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tếbào khác

2.3.6 Sức đề kháng của virus

Virus cúm type A tương đối nhạy cảm với các hóa chất và các tác nhânvật lí Các hạt virus tồn tại thích hợp pH trong khoảng 6,5 – 7,9, ở pH quá kiềmhay quá acid thì khả năng lây nhiễm của virus giảm Lớp vỏ bên ngoài có bảnchất là lipid nên dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, các chất tẩy rửa

và các chất sát trùng: fomaldehyde, phenol, β- propiolacton, sodiumhypochloride, acid loãng và hydroxylamine

Virus bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40h, tồn tại được 15 ngày ánhsáng thường Tia tử ngoại bất hoạt được virus mà không phá hủy được khángnguyên virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và

60oC/30 phút Trong phân gia cầm ở nhiệt độ thấp tồn tại ít nhất 3 tháng, trongphủ tạng có thể tồn tại 24 – 39 ngày, nếu bảo quản ở nhiệt độ - 70oC thì có thểtồn tại hàng năm

2.4 TRUYỀN NHIỄM HỌC

2.4.1 Động vật cảm nhiễm

Tất cả các loại chim thuần dưỡng (gia cầm) hoặc hoang dã (đặc biệt làloại thủy cầm di trú) đều mẫn cảm với virus cúm type A Bệnh thường pháthiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút) Phần lớn các loạigia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A Ngoài ra, virus cúm type A

có thể gây bệnh cho các loài động vật có vú như lợn, ngựa, thú hoang dã và

cả con người

Mỗi một loại kí chủ có vai trò khác nhau trong việc lưu trữ, phân tán vàlây bệnh Có 3 loại kí chủ:

- Kí chủ lưu trữ hay mang mầm bệnh: đây là kí chủ thường nhiễm virusnhưng không phát bệnh hoặc phát bệnh rất nhẹ hoặc con non mắc bệnh còn contrưởng thành có thể tạo miễn dịch Trong trường hợp này, các loại thủy cầmđược coi là kí chủ mắc bệnh tuy nhiên còn phụ thuộc vào độc lực của virus.

- Kí chủ hứng chịu: đây là loại kí chủ mẫn cảm với virus cúm và đào thảivirus ra môi trường ngoài Loại kí chủ này khi bị nhiễm thường phát bệnh rấtnặng và các loại gà (gà, gà tây, gà lôi, đà điểu ) thường được coi là kí chủhứng chịu

- Ký chủ lệch: là loại động vật hiếm khi bị nhiễm virus Khi bị nhiễmbệnh nặng thì không hoặc bài thải rất ít virus ra môi trường bên ngoài

2.4.2 Sự truyền lây bệnh

Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp

và đường tiêu hóa Sự truyền lây bệnh được thực hiện theo hai phương thứctrực tiếp và gián tiếp

- Lây trực tiếp do vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông quacác hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn, nướcuống bị nhiễm

- Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gầnhoặc những công cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lâyqua chim thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển Có thểnói đây là phương thức lây truyền chủ yếu

Như vậy virus cúm dễ lây truyền tới những vùng khác do con người,phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi Đối với các virus gây bệnh cúmtruyền nhiễm cao ở gia cầm thì sự lây truyền chủ yếu qua phân, đường miệng

2.5 TRIỆU CHỨNG, BỆNH TÍCH

2.5.1 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh từ vài giờ đến 3 ngày tùy thuộc vào số lượng, độclực của virus, đường nhiễm bệnh, loài cảm nhiễm virus gây bệnh Một sốnghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thể dài hơn đến

7 ngày và lâu nhất là 14 ngày

Biểu hiện triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus,

số lượng virus, loài nhiễm, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường (nhiệt độ, ánhsáng, thành phần không khí ) chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vậtchủ trước khi nhiễm bệnh, sự bội nhiễm của VSV khác như: E.Coli, virusNewcastle, virus gumboro

Nhìn chung, khi mắc bệnh đàn gia cầm sẽ có triệu chứng:

 Toàn đàn suy sụp, ũ rủ, lông xù, xơ xác Nếu nhiễm virus độc lực caothì gà chết đột ngột không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ tử vong cao

có khi đạt đến 100% trong vài ngày

 Có các biểu hiện về đường hô hấp thường xuất hiện đầu tiên và kháđiển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vảy mỏ, chảy nhiều nước mũi,nước mắt

 Mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng và có chiều hướng lan xuống

cổ và ức do vậy gà bệnh có động tác vươn cổ ra để thở

 Mào dày lên do thủy thũng, tím tía, có nhiều điểm xuất huyết Thịt gà

bị bệnh thường thâm xám, dưới da vùng chân có điểm xuất huyết

 Bên cạnh các triệu chứng về đường hô hấp, gia cầm bị bệnh còn cótriệu chứng thần kinh: đi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi, nằm lì bì tụđống với nhau Ngoài ra, gia cầm bị bệnh thường tiêu chảy mạnh, phân loãngtrắng xanh, sản lượng trứng giảm

2.5.2 Bệnh tích

Bệnh tích bệnh cúm rất đa dạng Nhìn chung sẽ có các bệnh tích đặc trưng:

 Mào, yếm sưng to, tím sẫm, phù mí mắt

 Phù keo nhầy và xuất huyết cơ đùi (phần giáp đầu gối)

 Da chân xung huyết, đỏ sẫm

 Dạ dày cơ xuất huyết, đôi khi xuất huyết dạ dày tuyến như ở Newcastle

 Niêm mạc khí quản, niêm mạc đường tiêu hóa viêm cata và viêm tơ huyết

 Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy Dịch nhầy có thể đông đặc nhưphomat

 Các cơ quan nội tạng như màng bao tim, màng gan, màng ruột viêm tơhuyết

 Ruột viêm cata và xuất huyết Hạch ruột sưng

 Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử màu vàng, màu xám

 Mỡ vành tim xuất huyết Với gà trống xuất huyết bên trong dịch hoàn

 Gà mái đẻ viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non

 Tuyến tụy xuất huyết và hoại tử Tuyến tụy chuyển sang màu vàng có vết sẫm

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

Việc chẩn đoán cúm gia cầm do nhiễm virus cúm type A chủ yếu phảiphân lập và định danh virus kết hợp với chẩn đoán dựa trên triệu chứng lâmsàng, bệnh tích đại thể, dịch tễ học và một số phản ứng huyết thanh

2.6.1.Dựa vào dịch tễ.

Bệnh cúm gia cầm có tính lây truyền nhanh và mạnh

Loài mắc bệnh thường là gia cầm và chim Chim hoang dã là nguồntruyền lây bệnh

Một số động vật có vú cũng có thể mắc bệnh: người, lợn, ngựa

2.6.2 Dựa vào triệu chứng, bệnh tích

2.6.2.1 Dựa vào triệu chứng

Gia cầm bị bệnh thường bị xù lông, ũ rũ, bỏ ăn, giảm đẻ

Đầu, mặt sưng, phù quanh mắt Mào yếm sưng, xuất huyết

Mắt bị viêm kết mạc và có thể bị xuất huyết

Chân giữa vùng bàn và khuỷu bị xuất huyết

Có các triệu chứng ở đường hô hấp

Nếu virus có độc lực cao thì gà có thể chết nhanh, gà thường chết trongvòng 24h – 48h sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên

2.6.2.2 Bệnh tích

Xuất huyết lan tràn ở các cơ quan nội tạng

Dưới da vùng đầu, cổ, ngực bị phù thũng

Miệng chứa nhiều dịch

Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhầy

Đường tiêu hóa xuất huyết

Gà đẻ buồng trứng xuất huyết hoặc bị viêm, có nhiều trứng non vỡ

2.6.3 Phân lập và định danh virus

Đây là phương pháp chẩn đoán cơ bản có ý nghĩa quyết định

Để phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản,não, lách Sau khi xử lí bệnh phẩm ta tiêm vào phôi gà 9 – 11 ngày tuổi, ấp

37oC trong 7 ngày thì thu hoạch trứng (Virus cũng có thể phân lập trên môitrường tế bào)

Sau khi phân lập được virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng thì

có thể giám định virus bằng các HI test để giám định subtyp H và N

Gần đây, phương pháp real – time PCR (RT – PCR ) trực tiếp sử dụngnguồn gen của virus cúm A và cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm cũng đượcđưa vào ứng dụng cho phép chẩn đoán chính xác, tin cậy cao và phân biệt sựhiện diện của các chủng virus cúm A gây bệnh chỉ với một lượng nhỏ mẫubệnh phẩm.

Ngoài ra còn có các phương pháp chẩn đoán khác như: kỹ thuật ELISA,

kỹ thuật khuếch tán trên thạch, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

2.7 PHÒNG BỆNH

2.7.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh

2.7.1.1 Các biện pháp vệ sinh tổng hợp

Do đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như đặc tính biến đổi kháng nguyên

bề mặt của virus khá phức tạp Do vậy, để phòng bệnh và ngăn chặn bệnh xảy

ra thì các biện pháp vệ sinh thú y tổng hợp như: vệ sinh chuồng trại, khu vựcchăn nuôi, thiết bị cho ăn uống phải được áp dụng định kỳ ở những vùng chưa

có dịch Đối với những vùng nguy cơ có dịch, vùng có dịch thì phải được ápdụng một cách thường xuyên và nghiêm ngặt

2.7.1.2 Phòng bệnh đối với những địa phương chưa có dịch xảy ra hoặc nguy cơ có dịch.

Trong thời gian xảy ra dịch ở các địa phương khác thì các trại chăn nuôigia cầm giống áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nhằm ngăn cản mầmbệnh đưa vào Dụng cụ chăn nuôi, xe chuyên chở, dụng cụ bảo hộ lao động vàcon người ra vào trại phải được vệ sinh, khử trùng Thức ăn, nước uống, chấtđộn chuồng phải đảm bảo không chứa mầm bệnh

Trên các trục đường giao thông chính thành lập các chốt kiểm dịch tạmthời nhằm ngăn chặn việc dịch chuyển gia cầm, sản phẩm gia cầm từ các địaphương có dịch vào Các phương tiện giao thông ra vào phải được tiêu độc

Tăng cường kiểm tra, giám sát phát hiện bệnh và tiêu hủy tất cả gia cầm,sản phẩm gia cầm có nguồn gốc từ các địa phương đang có dịch Đồng thời tiếnhành tổ chức dập dịch nhanh chóng khi còn ở diện hẹp.

2.7.1.3 Khống chế dịch ở các địa phương đang có dịch xảy ra.

Là bệnh có tính lây lan nhanh, do vậy chúng ta cần tiến hành chẩn đoánphát hiện bệnh một cách nhanh chóng và chính xác dựa trên triệu chứng, bệnhtích điển hình Đồng thời tiến hành lấy mẫu xét nghiệm

Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm, do vậy sự bùng phát của bệnhvẫn tuân theo những quy luật chung của quá trình sinh dịch Do vậy khống chếbệnh chính là tác động vào các khâu của quá trình sinh dịch nhằm phá vỡ vòngtruyền lây tác nhân gây bệnh, đó là 3 yếu tố: nguồn bệnh, động vật cảm thụ, yếu

tố truyền lây bệnh truyền nhiễm nói chung Theo khuyến cáo của OIE thì đó làcác hoạt động:

Loại trừ tác nhân gây bệnh: tiêu hủy gia cầm, sản phẩm gia cầm nhiễmbệnh và tiến hành sát trùng, tiêu độc

Giảm tiếp xúc giữa tác nhân và vật chủ: sử dụng vacxin phòng bệnh,tăng cường chăm sóc nuôi dưỡng nhằm nâng cao sức đề kháng

Thay đổi môi trường sống: thực hiện các biện pháp an toàn sinh học,ngăn chặn tác nhân gây bệnh xâm nhập vào môi trường bằng cách cách ly triệt

để toàn bộ khu vực có dịch

Song song với những việc làm đó tiến hành tuyên truyền cho tất cả cácchủ vật nuôi gia cầm biết cách phát hiện và phòng bệnh cúm gia cầm

2.7.2 Phòng bệnh bằng vacxin.

2.7.2.1 Các loại vacxin cúm đang được sử dụng.

Các chủng virus cường độc A/H5N1 sau năm 1996, qua thời gian tiếnhóa có xu hướng biến đổi nội gen nhằm tăng tính gây bệnh và thay đổi thành

phần nội gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và cácchủng vacxin được tạo ra Do vậy, vấn đề này phải được hết sức chú ý trongchiến lược chế tạo vacxin.

Đối với bệnh truyền nhiễm, vacxin được coi là biện pháp có tính chiếnlược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch Đối với dịch cúmA/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triểnvacxin không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà cònkhống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người Khángthể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trongvacxin, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình kháccủa virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khichúng xâm nhập vào Các vacxin phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loạichính: vacxin truyền thống và vacxin thế hệ mới

 Vacxin truyền thống

Bao gồm vacxin vô hoạt đồng chủng và dị chủng

Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại

vacxin được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủnggây bệnh trên thực địa

Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vacxin sử dụng các

chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng cókháng nguyên NA dị chủng

Vacxin thế hệ mới hay vacxin công nghệ gen: là loại vacxin được sản

xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được

nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:

 Vacxin tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậugia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1

và H7N1

 Vacxin dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp vàtách chiết làm vacxin.

 Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặcNewcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen khángnguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vacxinphòng chống virus cúm A/H5N1

 Vacxin DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA,

NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen

Vacxin nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật

di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen,

trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ

thuật gen

Có 3 loại vacxin đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ

an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vacxin trên thế giới hiệnnay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) vàVNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC)

2.7.2.2 Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và khuyến cáo OIE

Các nhà khoa học của tổ chức OIE, WHO đã khuyến cáo các nước cócúm gia cầm như sau:

- Sử dụng vacxin vào mục đích khống chế dịch bệnh cúm gia cầm chỉ làmột giải pháp hỗ trợ để dập dịch, khoanh vùng dịch và khống chế dịch vàvacxin chỉ hạn chế bài xuất virus cường độc ra ngoài môi trường chứ không loại

bỏ được tận gốc bệnh cúm

- Chỉ tiêm phòng vacxin khi thật khẩn cấp

- Để có quyết định tiêm phòng phải dựa vào năng lực và điều kiện sau:

 Phải có hệ thống chẩn đoán đủ năng lực xác định được cúm gia cầm

có độc lực cao (HPAI) hay có độc lực thấp (LPAI).

 Phải có ngân hàng vacxin đủ các chủng loại kháng nguyên H và Nnhằm hạn chế tối đa hậu quả biến chủng virus cúm sau khi tiêm phòng

 Phải có hệ thống kiểm soát thú y chặt chẽ từ trung ương đến địaphương nhằm kiểm soát những đàn đã sử dụng vacxin với những đàn chưa sửdụng vacxin

Với những điều kiện trên thì nước ta còn gặp nhiều khó khăn, do vậy việctiêm phòng, quản lí tiêm phòng chưa được triệt để Tuy nhiên với những nổ lựccủa ngành trong năm 2004, 2005 đã có nhiều đề tài, dự án, thử nghiệm và khảonghiệm vacxin cúm đã được triển khai và thu được kết quả khả quan

Phần IIIĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG

- Gà, vịt bán tại một số chợ của 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên –Huế

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tiến hành thu nhận mẫu

- Xử lí mẫu

- Tiến hành chiết tách RNA

- Tiến hành template mẫu

- Tiến hành làm phản ứng Real time RT – PCR

- Đọc kết quả

- Xử lí số liệu và phân tích kết quả

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Nguyên liệu

3.3.1.1 Mẫu thí nghiệm

Mẫu swabs được lấy theo công văn hướng dẫn chương trình giám sátcúm gia cầm năm 2010 của dự án VAHIP

3.3.1.2 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu được gửi theo quy định của dự án VAHIP Thường mẫu được gửiđến là mẫu Swab

Phương pháp lấy mẫu Swab:

Ngoáy ổ nhớp: cho que ngoáy vào sâu trong hậu môn gia cầm, ngoáy quanhthành hậu môn rồi rút ra cho vào ống chứa dung dịch bảo quản, đậy nắp kín

Ngoáy họng, khí quản: đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thudịch nhầy, sau đó từ từ rút ra rồi đưa và ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ quecho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp

3.3.1.3 Phương pháp bảo quản mẫu.

Sau khi ngoáy ở các lỗ tự nhiên, que ngoáy được bảo quản trong dungdịch BHI ( Brain Heart Influsion)

Sau khi xử lí mẫu các ống eppendorf được bảo quản ở nhiệt độ bìnhthường nếu tiến hành tách RNA ngay sau đó Nếu mẫu không được tách RNAngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C và trước khi tách mẫu đượcmang ra rải đông

3.3.1.5 Dụng cụ, máy móc, hóa chất.

- Bộ Micropipet các cỡ, ống eppendorf có thể tích khác nhau

- Bộ kít RNeasy Mini kit Qiagen, hệ thống chiết tách bằng chân khôngdùng trong chiết tách RNA

- Kít RT – PCR Qiagen one step dùng trong Master mix tạo hỗn hợp choquá trình nhân gen (nếu có)

- Máy Real time RT – PCR Bio – rad hoặc smart cycler và các tube phùhợp với từng máy.

3.3.2 Phương pháp tiến hành phản ứng Real time RT – PCR

3.3.2.1 Nguyên lí phản ứng Real time PCR (RT – PCR)

- Phản ứng Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm củaquá trình sao chép DNA Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuyếchđại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên genagarose khi phản ứng kết thúc Ngược lại, RT – PCR cho phép phát hiện và địnhlượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Khả năng nàyđược phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang.Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và nhữngtrình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe Khi DNAtương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệuhuỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA Khi sử dụng máy BIO – RAD, máy

có bộ phận (Camera) có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếchđại xảy ra Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện

sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm

mũ Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnhquang có thể phát hiện được Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle ofthreshold) Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng

Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứngreal time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → DNA gọi làReverse transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT – PCR

- Nguyên lí hoạt động của Probe.

Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên Primer và Probe, hóachất được sử dụng trong phản ứng Real time RT – PCR là Taqman Probe

Hình 3.1 Cơ chế hoạt động của Taqman probe

Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu,gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer

Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấpphụ huỳnh quang ở đầu 3’ Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnhquang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp

và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích vàhoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứtđầu gắn chất huỳnh quang Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ

và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu

3.3.2.2 Các bước tiến hành phản ứng Real time RT – PCR.

Các bước tiến hành phản ứng được thực hiện theo quy trình chung

“hướng dẫn của cục thú y” trong phòng thí nghiệm Bao gồm các bước:

1) Chiết tách RNA

2) Chuẩn bị Master mix

3) Template mẫu.

4) Chạy PCR trên máy Bio – Rad hoặc Smart Cycle

5) Đọc kết quả

3.3.2.2.1 Quy trình chiết tách RNA

Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch đệm RLT bổ sung2-mecraptoethanol tỷ lệ 1:100 và RPE bổ sung 4 lần thể tích ethanol Mẫu saukhi được xử lí sẽ tiến hành chiết tách RNA theo các bước sau [9]:

1) Cho 600µl đệm RLT đã được bổ sung 2-mecraptoethanol vào ốngeependorf 1,5ml

2) Chuyển 200µl mẫu vào ống eependorf Vortex trong 15s sau đó spin ở5000vòng/phút trong 5s cho lắng xuống Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

3) Cho thêm 480µl ethanol 96 – 100% và 120µl nước Nuclease freewater Vortex 10s rồi ly tâm 9000 vòng/phút trong 5 phút

4) Lắp khóa van vào hệ thống và gắn cột lọc vào van Bật máy hút chânkhông, điều chỉnh khóa van để P = 600

5) Cho hết toàn bộ mẫu trên vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc.6) Cho 700µl RW1 vào cột lọc, rút hết dung dịch rửa trong cột lọc

7) Cho 500µl RPE vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc

8) Lặp lại bước 7

9) Lấy cột lọc ra cho vào ống lọc, li tâm 1400 vòng/phút trong 3 phút10) Lấy cột lọc đặt vào ống eppendorf, cho vào cột lọc 50µl đệm DW.Sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 1100 vòng/phút trong 3 phút

11) Bỏ cột lọc, thu lấy RNA