CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN (DI TRUYỀN học) (chữ biến dạng do slide dùng font VNI times, tải về xem bình thường)

Kỹ thuật lai nucleotid Dùng phát hiện các trình tự ADN hoặc ARN chuyên biệt Các yếu tố ảnh hưởng đến sự Nhiệt độ được làm giảm từ từ và điều kiện thích hợp 2 mạch sẽ bắt cặp trở lại =

CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH ADN

ADN là gì?

• ADN là phân tử

chứa TẤT CẢ vật

liệu di truyền của

cơ thể và do đó

chịu trách nhiệm

cho DI TRUYỀN

• Một sợi ADN chứa

nhiều GEN , tất cả

các gen này mã

hóa cho các

ADN có ở đâu?

I CHIẾT TÁCH ADN

KẾT TỦA ADN khỏi

dung dịch bằng Ethanol

CHIẾT TÁCH ADNBước 1: Phá màng tế bào và màng

nhân (tế bào nhân thật), giải

phóng ADN ra môi trường

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không

mong muốn trong mẫu (protein, mảnh vỡ tế bào…)

Bước 3: Kết tủa acid nucleic

TINH CHẾ ACID NUCLEIC

- Siêu ly tâm trên gradient liên tục CsCl độ phân giải 1% đơn vị tỉ trọng

- Siêu ly tâm trên đệm CsCl (gradient không liên tục): để tinh chế một lượng lớn acid nucleic

- Siêu ly tâm trên gradient saccharose: để

phân tách hỗn hợp các acid nucleic có

kích thước chênh lệch nhau nhiều kb

- Sắc ký ái lực: pha tĩnh là

U-Sepharose / oligodT- cellulose

- Sắc ký lọc gel: tách các nucleotid

tự do sau khi tạo mẫu dò đánh dấu

- Sắc ký trao đổi ion trên vi cột:

thu hồi lượng ADN rất nhỏ

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao:

tinh chế các oligonucletid tổng hợp (độ phân giải 1 nt)

plasmid phân tách các đoạn ADN

TINH CHẾ ACID NUCLEIC

II CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SƠ BỘ ACID NUCLEIC

2.2 Điện di

Nguyên tắc: dựa vào sự di chuyển khác nhau trong điện trường của các acid nucleic

Gel được làm bằng agarose hay polyacrylamid

Tốc độ điện di của ADN qua gel tùy thuộc

Kích thước phân tử ADN Cấu dạng của ADN (sợi đơn, sợi đôi, vòng, siêu xoắn)

Điều kiện điện di: nồng độ gel, điện thế sử dụng

Ñieän di

III KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ

ỨNG DỤNG

Khái niệm ADN có thể được cắt tại các trình tự chuyên biệt bởi các RE

Nhiều RE tinh khiết có bán sẵn Mỗi enzym nhận diện trình tự đặc hiệu, 4-8 cặp base

3.1 Cắt ADN bằng enzym giới hạn (RE, restriction enzyme)

HaeIII cắt tạo đầu bằng

EcoRI cắt tạo đầu so le

3.2 Nối các đoạn acid nucleic: LIGASE

ADN ligase xúc tác hình thành liên kết nối

hai đoạn ADN

ARN ligase xúc tác hình thành liên kết nối

hai đoạn ARN

Ly trích từ E coli ( E coli DNA ligase)

từ phage T4 E coli (T4 DNA ligase và T4

RNA ligase )

3.3 Kỹ thuật lai nucleotid

Dùng phát hiện các trình tự ADN hoặc ARN chuyên biệt

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự

Nhiệt độ được làm giảm từ từ và

điều kiện thích hợp

2 mạch sẽ bắt cặp trở lại

= lai phân tử, có tính đặc hiệu tuyệt

đối

Mẫu dò = bản sao của một trình tự acid

dễ nhận biết

chuyên biệt - chỉ lai với trình tự bắt

cặp bổ sung

nhạy do được đánh dấu để phát hiện và định lượng

Tác nhân đánh dấu

các đồng vị phóng xạ: 32 P

35 S

3 H hóa chất: hệ thống avidin (hay

streptavidin) – biotin

hệ thống peroxydase – cơ chất

(các mạch đơn)

trong môi trường

lỏng (ddđệm)

Trình tự kia (trình tự đích cần tìm) được cố định trên một giá

thể rắn

 Southern blot

dùng phân tích các trình tự ADN chuyên biệt

Nhạy: phát hiện 1 bản copy trình tự ADN trong bộ gen

Ứng dụng

- định vị trình tự đặc biệt trên ADN gen, ADN plasmid, phage,

- lập bản đồ giới hạn của gen

- phát hiện các đa dạng trình tự: đột biến mất đoạn, đột biến điểm, tái tổ hợp

Bản phóng xạ tự ghi

Bản đồ

vị trí cắt giới hạn

Giấy thấmMàng nilon

Gia ù

Màng nilon

Vị trí đa hình

DNA probe

Phương pháp Southern

blot

1 Chuẩn bị ADN và cắt bằng RE

2 Điện di ADN trên gel agrarose

3 Biến tính ADN bằng kiềm và chuyển ADN từ gel gắn vào bề mặt màng ( nitrocellulose, nylon, nylon tích điện âm)

4 Phát hiện ADN bằng đoạn dò đặc hiệu

Kết quả Southern

blot

 Northern blot tương tự Southern blot nhưng dùng phân tích các trình tự ARN

LAI TẠI CHỖ

Trình tự acid nucleic cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô

không cần qua giai đoạn tách chiết ra khỏi mô, tế bào

Ứng dụng: định vị gen trên nhiễm sắc thể,

phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp nghiên cứu mARN chuyên biệt trong tế bào &ø mô

 Fluorescence In situ hybridization (FISH)

Lai huỳnh quang tại chỗ

Công cụ phân tích di truyền tế bào Xác định nst của mỗi cá nhân và vị trí của các trình tự ADN đặc biệt trên nst

Đoạn dò ADN

Đánh dấu đoạn

dò bằng phân tử hùynh quang

Biến tính

Lai

Quan sát

Thư viện Gen

1 Chuẩn bị ADN và cắt

với RE

2 Tạo dòng: lai ADN đã

cắt với plasmid

3 Đưa clone vào vi khuẩn

mang

4 Trải trên thạch: mỗi

khuẩn lạc là một “tập”

của thư viện gen

 mỗi phân đoạn là một tập hợp

oligonucleotid có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt tại cùng 1 loại nucleotid

- Phân tách trên gel polyacrylamid, vị trí

của các oligonucleotid trên gel tương

ứng với kích thước của chúng và

phát hiện nhờ đầu có đánh dấu

phóng xạ

G A G&A C&T C

Hướ

ng của dòn

g điện

bị tác độngPiperidine có tác

dụng thủy giải liên

thúc quá trình hình thành chuỗi

Dideoxynucleotid

- là nucleotid nhân tạo với khung đường ribose thiếu nhóm -OH ở cả hai vị trí C'2 và C'3,

- nếu một dideoxynucleotid được gắn vào thay cho deoxynucleotid trong quá trình kéo dài sợi DNA thì nucleotid tiếp theo không gắn vào được do không có nhóm 3'- OH

 quá trình tổng hợp DNA bị ngừng lại

Phương pháp Sanger

Hướ

ng của dòn

g điện

Pp Sanger và cs – pp enzyme học

Phương pháp Sanger cải tiến – tự động

Hướ

ng của dòn

g điện

Hướ

ng của dòn

g điện

DNA Sequencer

4 PHƯƠNG PHÁP PCR KHUẾCH ĐẠI ADN

Kary Mullis và cộng sự 1985, Cetus Corporation -

California

1993 Nobel prize

một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong bộ gen được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn đó

đã biết

ADN polymerase dùng các đoạn ADN MẠCH ĐƠN làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với sợi này

đun nóng dung dịch ADN mạch kép đến gần nhiệt độ sôi

ADN polymerase cũng đòi hỏi phải có một đoạn ngắn ADN mạch đơn (ĐOẠN MỒI) để khởi đầu quá trình tổng hợp

đoạn mồi oligonucleotid (6 - 30 nucleotid), gắn bổ sung vào ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép

Cả 2 sợi ADN đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu cung cấp mồi

oligonucleotid cho cả 2 sợi

Nguyên tắc cơ bản dựa trên SAO CHÉP ADN

PCR

3' 5'

5'

3'

3' 5'

5' 3'

5' 3'

3' 5'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

Sơ đồ nguyên lý phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

3' 5'

5'

3'

3' 5'

5' 3'

PCR

3 Cách tiến hành một phản ứng dây

chuyền tổng hợp ADN

Vật liệu: ADN có chứa đoạn cần nhân lên

Hai đoạn mồi để xác định điểm bắt đầu tổng hợp ADN

ADN polymerase dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP) Ddđ có Mg 2+

50 l hoặc 20 l Hỗn hợp phản ứng được cho vào ống nhựa nhỏ chịu nhiệt, có nắp

Bước 1: 94 o C > ADN mạch kép tách nhau ra hoàn toàn,

làm khuôn cho các đoạn mồi và ADN polymerase Bước 2: 30 – 65 o C để các đoạn mồi gắn với các trình tự bổ sung trên các phân tử ADN khuôn (Nhiệt độ và

khoảng thời gian tùy thuộc vào chiều dài của đoạn ADN cần nhân lên)

Bước 3: 72 o C trong khoảng 5 phút để ADN được tổng hợp/ ADN polymerase và dNTP  Đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp

Các polymerase chịu nhiệt

đoạn Klenow của ADN polymerase I

xúc tác sự tổng hợp ADN 5’-3’

exonuclease 3’-5’

không chịu được nhiệt

Taq polymerase phân lập từ Thermus aquaticus

Các polymerase chịu nhiệt khác:

Vent polymerase được phân lập từ

Thermococcus litoralis,

Tth polymerase được phân lập từ Thermus thermophilus

thành phần đắt nhất của PCR

1 đơn vị / phản ứng (40 chu kỳ bằng máy PCR)

ADN khuôn

AND bộ gen tách ra từ tế bào, ADN từ các ngân hàng genome hoặc cADN, các ADN bất kỳ,

ARN hoặc ARNm

° Tinh khiết, không có chất ức chế (heparin, EDTA, acid)

° Nồng độ: 1 g - 100 ng

° Hàm lượng GC, nếu cao > thêm formamide, DMSO

Các đoạn mồi - quyết định khuếch đại đặc

trưng, hiệu quả

Nguyên tắc chọn:

- Không có bắt cặp bổ sung giữa các mồi tạo cấu

trúc bậc hai hay dimer giữa các nucleotide ngay trong một mồi của các đoạn mồi

- Phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại,

không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

- 18 - 25 nucleotide

- Khoảng cách giữa hai mồi không dài quá 3 kb

- Tỷ lệ GC ở các mồi thường chiếm khoảng 40-75%

T m = (A+T) x 2 o C + (G+C) x 4 o C Nhiệt độ ủ = T m –5 o C

Phần mềm lựa chọn

Tổng hợp hóa học trên một chất tải rắn trong máy tổng hợp oligonucleotide

Nồng độ mồi khoảng 0,1 mM đến 1 mM Nồng độ thường được xác định dựa vào giá trị OD (optical density) đo ở 260 nm

MgCl 2

MgCl 2 cần cho ADN polymerase

Có tương quan với nucleotid

triphosphat

Nồng độ MgCl 2 tối ưu: xác định =

thực nghiệm

0,5 - 5,0 mM 1,5 mM

30X-40X

94 o C/15s-1min 55-65 o C/15s- 1min

72 o C/30s-3min

Tóm tắt qui trình chạy phản ứng PCR và phát hiện ADN

ƯU NHƯỢC ĐIỂM

PCR

NHANH, NHẠY, CHÍNH XÁC

DỄ BỊ NHIỄM  DƯƠNG GIẢ

PCR “tổ”

2 PCR liên tiếp với 2 cặp mồi khác nhau:

-Cặp mồi ngoại: => khuếch đại đoạn chứa

ADN đặc hiệu, làm khuôn cho PCR lần 2

-Cặp mồi nội: Cặp mồi này bổ sung với

vùng nằm bên trong chuỗi nucleotide thu được với cặp mồi thứ nhất

Kỹ thuật này có độ nhạy và độ chuyên biệt cao Nhược: độ nhiễm cao

Ưùng dụng: phát hiện ký sinh trùng sốt rét

PCR đa thành phần (multiplex

PCR)2 hay nhiều ADN đích được khuếch đại

° Các sản phẩm có kích thước khác nhau

để phân biệt được chúng nhưng không

cạnh tranh ưu tiên khuếch đại

PCR khuếch đại ARN

Rất cần xác định HCV, virus cúm, virus Picorna, rRNA vi khuẩn, hiệu quả của

kháng sinh điều trị

ARN -> cADN >ADN

PCR khuếch đại ARN

Hỗn hợp phản ứng

Tth pol

2 loại mồi (1 cho tổng hợp cADN và cả 2 cho PCR)

MnCl 2 và tất cả các thành phần khác cần cho RT và PCR

Chu kỳ nhiệt

70 o C trong 15 phút (reverse transcriptase hoạt động)

95 o C (biến tính phức hợp ARN-ADN)

Real time PCR định

lượng

Phản ứng PCR cho phép theo

dõi sự khuếch đại ADN khi nó

xảy ra

Cho phép định lượng chính xác nồng độ khuôn ban đầu

Bổ sung chất nhuộm ADN (EtBr)

vào PCR

Định lượng dựa vào: số lượng bản

đích ban đầu càng cao thì số chu

kỳ để phát hiện càng sớm

62

Các lĩnh vực ứng dụng của kỹ

thuật PCR

Trong nghiên cứu khoa học:

xác định trình tự nucleotid của các đoạn ADN được nhân,

tách dòng những đoạn ADN đặc hiệu, phát hiện đột biến,

nghiên cứu ARNm hoặc tạo các đột biến gien, phân tích liên kết gien từ những tế bào

Các lĩnh vực ứng dụng của kỹ

thuật PCR

Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng

rất khó khăn, cần nhiều năm >< vài ngày, vài

giờ, hiệu quả rất cao

Trong y học

chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng

nấm, kể cả HIV-AIDS

chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung thư …

Trong tư vấn di truyền y học

chẩn đoán nhanh, chính xác các bệnh di truyền

chẩn đoán trước sinh giới tính và các dị tật bẩm sinh

(thai 8 tuần tuổi, không cần chọc ối, chỉ cần

1 giọt máu ngoại vi của mẹ)

Các lĩnh vực ứng dụng của kỹ

thuật PCR

Trong khoa học hình sự

chẩn đoán nhanh, chính xác thủ phạm chỉ từ

một vết máu khô, một sợi tóc hoặc một sinh phẩm nào đó mà thủ phạm để lại trên hiện trường

cho phép xác định chính xác quan hệ huyết

thống cha-con, ông-cháu v.v… cũng chỉ trong vài giờ

Trong bảo vệ môi trường

xác định rất hiệu quả và nhanh chóng mức độ

ô nhiễm sinh học

PCR trong chẩn đoán các tác nhân ngoại lai

Thuận lợi hơn so với các phương pháp cổ điển, đó là:

- Tiết kiệm thời gian.

- Là biện pháp duy nhất khi tác nhân gây bệnh không

thể hay khó nuôi cấy: trực khuẩn Koch, Brucella, Chlamydia,

virut viêm gan siêu vi B HBV (Hepatitis B Virus).

- Độ nhạy rất cao (chỉ cần có 1 vi sinh vật để ly trích được ADN).

- Không đòi hỏi nhiều kỹ thuật

- Phổ áp dụng rất rộng: có thể phát hiện được vi khuẩn , virus, nấm….

Haemophilus influenzae Helicobacter pylori

Legionella pneumophila Leptospira sp.

Listeria monocytogiens

M aviumintracellulare

M leprae

M tuberculosis Mycobacterium sp.

Mycoplasma fermantans Mycoplasma gienitalium Mycoplasma pneumoniae

Vi sinh vật gây bệnh có thể định danh bởi PCR

Mycoplasma sp.

Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Rickettsia sp.

S.aureus toxins Salmonella typhimurium Shigella sp.

Staphylococcus aureus, Treponema pallidum Ureaplasma urealyticum Vibrio cholerae

Whipple's do vi khuẩn

Yersinia pestis, Y.enterocolitica

Rhinovirus Rubella virus Sốt xuất huyết (Dengue) Varicella-zoster virus,

Viêm gan A (HAV) Viêm gan B virus (HBV) Viêm gan C virus (HCV)

Vi sinh vật gây bệnh có thể định danh bởi PCR

Candida albicans Coccidioides immitis Cryptococcus

capsulatum

Pneumocystis carnii Trichosporon beigelii

Vi sinh vật gây bệnh có thể định danh bởi PCR

PCR trong chẩn đoán các tác nhân ngoại

lai

Nguyên sinh động vật

Babesia bigemina, B bovis, B.microti Entamoeba histolytica

Giardia lamblia Leishmania sp.

Naegleria fowleri Plasmodium falciparum Toxoplasma gondii

Trichomonas vaginalis Trypanosoma sp.

Vi sinh vật gây bệnh có thể định danh bởi PCR