SAO CHÉP ADN (DI TRUYỀN học) (chữ biến dạng do slide dùng font VNI times, tải về xem bình thường)

Cấu trúc ADN Các dạng hình học khác nhau của chuỗi xoắn kép Dạng "B" của chuỗi xoắn kép DNA xoay 360° cho mỗi 10.6 bp mà không chịu sức căng nào Dạng "A" thường xuất hiện trong các

SAO CHÉP ADN

Mục tiêu

 Trình bày được quá trình sao chép chính xác ADN

 Tóm tắt cách thức sao

chép của acid nucleic ở virus

 Mô tả được quá trình sửa chữa ADN

Nội

dun g

• Khái niệm

• Sự sao chép của ADN

Thí nghiệm của Meselson và Stahl

Các yếu tố cần thiết cho sự sao chép ADN

Sao chép ADN prokaryote (E coli)

Sao chép ADN eukaryote

Sao chép ADN virus

• Sửa sai khi sao chép và khi không

sao chép

Các sinh vật giống nhau ở mức phân tử

dù là cĩ vẻ rất khác nhau

• ADN là vật liệu di truyền (ở hầu hết sinh vật )

• Cùng mã di truyền

• Cĩ cùng cơ chế tổng hợp ADN, ARN, protein

• So sánh các trình tự ADN cho phép suy ra các mối

quan hệ của sự tiến hĩa

Khái niệm

• Học thuyết trung tâm (Central

Dogma)

– Các phân tử và các quá trình

Nhân nguyên thủy

(prokaryote)

Nhân thật (eukaryote)

Cấu trúc xoắn kép cơ bản của ADN

2 chuỗi đường-phosphat ở mặt ngồi các base nitơ ở bên trong nối với nhau bằng các liên kết hydro

Khái niệm

Cấu trúc chung của

nucleotide - đơn vị cơ sở của

Có năm base chính trong acid

nucleic

A, G, T, C cĩ trong ADN

A, G, U, C cĩ trong ARN

Khái niệm

Các tiểu đơn vị nucleotide nối với nhau bởi liên kết phosphodiester

Liên kết Hydrogen bổ

sung nhau giữa các cặp

base (A-T or G-C)

Tương tác kỵ nước giữa

các base hai chiều

DNA tự nhiên là xoắn kép

của chuỗi đối song gắn bổ

sung vào nhau bằng:

Khái niệm

Cấu trúc ADN

Các dạng hình học khác nhau của chuỗi xoắn kép

Dạng "B" của chuỗi xoắn kép

DNA xoay 360° cho mỗi 10.6

bp mà không chịu sức căng

nào

Dạng "A" thường xuất hiện trong các mẫu DNA mất

nước và có thể trong dạng lai DNA-RNA

DNA trong tế bào được methyl hóa cho các mục tiêu điều hòa

có thể mang dạng “Z”

Mean propeller twist +18° +16° 0°

Glycosyl angle anti anti C: anti,

G: syn

Sugar pucker C3'-endo C2'-endo C: C2'-endo,

G: C2'-exo Đường kính 2.6 nm 2.0 nm 1.8 nm

Xen kẽ ?

Bảo thủ ?

Nuôi E coli, nguồn N là amoni

N 14 / N 15

Thí nghiệm Meselson & Stahl

N 15 vài thế hệ

N 14 một thế hệ Chiết ADN và ly tâm

Thí nghiệm Meselson và Stahl

Các yếu tố cần

thiết cho sự sao chép

Incoming dNTP PPi

2 P

Các bước trong tổng hợp ADN ở

tế bào nhân nguyên thủy

A Tách hai sợi ADN bổ sung

B Tạo chạc ba sao chép

C Hướng sao chép

D Mồi ARN

E Kéo dài chuỗi

F Cắt mồi ARN và thay thế bằng ADN

G.ADN ligase

Quá trình sao chép ở E.coli

Quá trình sao chép ADN ở E coli

A Tách hai sợi ADN bổ sung

- Bắt đầu khi protein B nhận biết được

điểm khởi sự sao chép (Ori) trên ADN

B Tạo chạc ba sao chép

Chạc ba sao chép

Chạc ba sao chép

Hướng Hướng

Quá trình sao chép ADN ở E coli

B Tạo chạc ba sao chép

 Các protein cần để tách sợi ADN

- DnaA protein

20-25 DnaA protein gắn vào làm sợi kép ADN tách nhau

- Các protein căng mạch (SSB protein) gắn vào các mạch đơn

- DNA helicase (Rep-protein 3’ 5’); Helicase II, III 5’—3’)

gắn vào các mạch đơn gần chạc ba và di chuyển về vùng kề sợi kép,

cắt các liên kết hydro giữa các base nitơ  chạc ba sao chép

Quá trình sao chép ADN ở E coli

B Tạo chạc ba sao chép

 Giải quyết vấn đề siêu xoắn

- Type I DNA topoisomerases

cắt một sợi của xoắn kép

- Type II DNA topoisomerases: DNA gyrase

cắt cả hai sợi của xoắn kép

Quá trình sao chép ở E coli

• Siêu xoắn là cuộn của cuộn

• Siêu xoắn làm ADN được gói gọn

ADN SIÊU XOẮN (supercoil)

Quá trình sao chép ở E coli

• Siêu xoắn là do sự

căng của cấu trúc.

• Hầu hết ADN “dãn vặn”

tức là ít lượt vặn hơn

cấu trúc dạng B

• Các tế bào tạo ADN

dãn vặn để dễ nén

• Các Topisomerase là các

enzym thay đổi ADN dãn

vặn

ADN SIÊU XOẮN

Sự tháo xoắn ADN gây ra hiện tượng siêu xoắn

siêu xoắn âm: ít vặn hơn dạng B siêu xoắn dương: vặn xoắn thêm

5 ADN siêu xoắn

1 Vịng

nới lỏng

2 Một phần vịng đè lên phần kia

3 Tạo tiếp xúc giữa xoắn trong 2 chỗ

Lưu ý là chưa

cĩ sinh ra vặn

4 Sau khi topoisomerase II hoạt động, vặn (siêu xoắn âm) được sinh ra

Topoisomerase II làm đứt sợi kép

Sợi kép đứt & hàn lại

Quá trình sao chép ở E coli

Quá trình sao chép ADN ở E coli

Tổng hợp sợi dẫn : tổng hợp sợi mới

liên tục, cùng chiều với chạc ba từ sợi

khuôn 3’  5’

Polymerase III tổng hợp mạch bổ sung từ

3’-OH của mồi ARN, giải phóng SSB protein

Tổng hợp sợi muộn : tổng hợp sợi mới

không liên tục, ngược chiều với chạc ba

từ sợi khuôn 5’  3’: ADN polymerase I xóa

mồi tạo các đoạn Okazaki

C Hướng sao chép

Quá trình sao chép ADN ở E coli

Sự tổng hợp ADN khơng liên tục

đoạn ARN ngắn, đầu 3' - OH tự do, bổ sung được

với ADN khuơn

luơn cần cho sự tổng hợp ADN bởi ADN polymerase

ADN ligase nối lại thành sợi ADN liên tục

Quá trình sao chép ở E coli

D Đoạn mồi ARN 3' - OH

Quá trình sao chép ADN ở E coli

Sự hình thành các đoạn

Okazaki của sợi chậm

ADN do sự sao chép

không liên tục của sợi

gốc

ADN polymerase III

sợi mới mọc theo hướng 5’3’, đối song với sợi mẹ

Sửa sai sợi ADN mới tổng hợp

Quá trình sao chép ở E coli

E Kéo dài chuỗi

Hoạt tính 5’3’ exonuclease và tổng hợp ADN theo

hướng 5’3’ của ADN polymerase I

Quá trình sao chép ở E coli

F Cắt các mồi ARN và thay thế bằng ADN

Xúc tác tạo liênkết phosphodiester giiữa nhĩm

phosphat trên sợi ADN tổng hợp bởi ADN

polymerase III và nhĩm OH tạo bởi AND pol I

G Ligase

Quá trình sao chép ADN ở E coli

SAO CHÉP ADN DẠNG VÒNGCấu trúc theta (θ)

Quá trình sao chép ADN ở E coli

oriC

~300 nt

PROTEIN CHỨC NĂNG

Protein B Nhận biết điểm Ori

N-protein Cho phép primase

họat động Primase Tổng hợp mồi

primase Rep protein Tháo xoắn sợi dẫn

Helicase Tháo xoắn sợi muộn

SSB protein Ổn định sợi ADN đơn

ADNpolymerase III Tổng hợp ADN

ADN

topoisomerase I Cắt khía một sợi đơn ADN

ADN

topoisomerase II Cắt khía cả hai sợi đơn ADN

ADN ligase Nối các đọan Okazaki

Quá trình sao chép ở E coliCác protein sao chép quan trọng của E coli

Các ADN polymerase

Các đặc tính của ADN

5’ 3’

Hoạt tính chức năng

polymerase tổng hợp

3’ 5’ exonuclease sửa

(loại bỏ base khơng liên kết H) “proof-reading”

5’ 3’ exonuclease loại mồi

(chỉ loại bỏ base cĩ liên kết H)

Các ADN polymerase

Sao chép ADN ở nhân

thật

Bộ gen người gồm ADN nhiễm sắc thẳng, lớn và

ADN ty thể (mtDNA)

Chu kỳ tế

bào

G1 : trước khi ADN bắt đầu tổng hợp, phút/giờ/tuần/ hàng năm

G1 bị ngưng trệ Tế bào khơng bao giờ phân chia ( G1= Go )

S : ADN được sao chép và lượng ADN tăng gấp đơi cùng với

histone mới  2 bộ nhiễm sắc thể, các nhiễm sắc tử vẫn dính chung cho đến khi phân chia

G2 : ngắn G1, ít biết Kết thúc khi bắt đầu phân bào

M = pha phân bào : hịa tan màng nhân, tách nst & phân chia tế bào

Sao chép ADN ở nhân thật và phân chia tế bào cùng

tạo ra chu kỳ tế bào

Đặc điểm Nhân nguyên

thủy Nhân thật

Tốc độ sao

Sao chép ADN

Vai trò của enzym và protein trong sao chép

Nhân thật

Tên polymerase Chức năng

ADN polymerase α (pol α) Primer

pol β Sửa chữa cắt bỏ base

pol γ Sao chép và sửa chữa ADN ty thể

pol δ Sao chép ADN; sửa chữa cắt bỏ nt và base pol ε Sao chép ADN; sửa chữa cắt bỏ nt và base pol ζ Tổng hợp translesion?

pol η Tổng hợp translesion chính xác

pol θ Sửa chữa ADN liên kết chéo

pol λ Sửa chữa ADN liên quan đến phân bào

pol µ Siêu đột biến sinh dưỡng

Deoxycytidyl transferase (REV1) Tổng hợp translesion

Sửa chữa

Sao chép ADN ty thể

Sao chép ADN nst (sợi dẫn)

Sao chép ADN nst

Mô hình sao chép ở nhân thật

Helicase PCNA

3’ 5’

PCNA = proliferating cell nuclear antigen

kháng nguyên tăng sinh nhân tế bào

Pol δ  t/h sợi dẫn

Pol α  t/h sợi muộn

Sợi muộn được thắt

nút xung quanh pol α

Sao chép ADN ty thể và lạp thể

Ty thể cĩ ADN polymerase γ

Sự sao chép tạo nên cấu trúc D

Khi 1 sợi ADN gốc

sao chép được 1

nửa đường thì sợi

thứ 2 bắt đầu sao

chép

Nhờ ADN polymerase

gamma

Tạo 2 vòng ADN

lồng ghép vào

nhau, tách ra nhờ

topoisomerase

NUCLEOSOME VÀ SAO

CHÉP

Sao chép ADN ở tế bào

nhân thật

G1

G o

S M

Mộ t chu kỳ tế bà o

X

2X

G2 G1

Lượng ADN được tạo ra

trong chu kỳ tế bào

Chu kỳ tế bào nhân thật

Sao cheùp ADN virus

Bộ gen là ADN dạng vòng đôi  sao chép bình thường

ADN dạng thẳng ADN sợi đơn hay ARN

sao chép đặc biệt

Sao cheùp ADN virus

Sao cheùp ADN virus

trên ADN vòng, tạo ra sản phẩm ADN dạng thẳng

Nếu cứ tiếp tục  sợi ADN phức chứa nhiều bản

sao liên tiếp của phân tử ADN vòng

= nhiều bản sao của bộ gen được tạo ra

phage lambda tạo ra nhiều bản sao nối tiếp phage M13 chỉ tạo 1 bản sao

Sự sao chép theo kiểu lăn vòng

Sự sao chép ở phage Lambda

bộ gen là ADN sợi đôi thẳng, đầu dính 12 nt

 2 đầu có thể gắn bổ sung với nhau (vị trí cos )

Trong E coli, nst của phage Lambda vòng hóa và sao

chép theo chu trình tiêu giải tiềm ẩn

Giai đoạn sớm

  theo mô hình theta, kéo dài khoảng 5 - 15 phút

Giai đoạn muộn

sao chép lăn vòng  ADN kép dài chứa nhiều bản

sao liên tiếp cách nhau bằng cos enzym Terminase nhận diện vị trí cos và cắt

Sao cheùp ADN virus

Sự sao chép của phage M13

bộ gen là một phân tử ADN sợi đơn vòng lệ thuộc hoàn toàn vào bộ máy của tế bào chủ

một phần của bộ gen có dạng kẹp tóc sợi đôi  ~ promoter cho ARN polymerase của tế bào chủ,

để phiên mã một đoạn mồi ARN ngắn theo kiểu lăn vòng

Sản phẩm: 1 phân tử ADN vòng đơn (sợi bị thế ra

được nối lại thành vòng)

1 phân tử ADN sợi đôi là RFI

(replicative form I)

Sự sao chép của phage T7

bộ gen là dsADN thẳng, dài 39.937 bp

Sự sao chép bắt đầu tại một điểm cách đầu tận bên trái khoảng 5900 bp và diễn ra theo cả hai hướng

có 160 bp ở đầu bên trái giống hệt 160 bp cuối cùng ở

bên phải = gọi là các phần thừa ở đầu

Sau vòng sao chép đầu tiên hai phân tử con thu

được có một đầu dính với trình tự của phần thừa

Sao cheùp ADN virus

Sự sao chép của phage T7

Phức nối được cắt ra và tái tạo bộ gen

Sao cheùp ADN virus

Sửa sai trong sao chép và khi

không sao chép

Tỉ lệ sai sót

10-9

Sai sĩt hố học trong quá trình nhân đơi:

một base đã bị bỏ qua,

chèn thêm, sao chép nhầm chuỗi DNA bị đứt gẫy hoặc gắn với chuỗi DNA khác NGẪU NHIÊN và XÁC SUẤT RẤT THẤP

Cơ chế sửa sai sao chép ở vk

Hướng sao chép

5’-3’ ADN polymerase I, III

Polyme hóa

Họat tính exonuclease 5’- 3’ và 3’-5’

Sửa sai khi không sao chép

Enzym gắn vào trình tự sai cắt đọan sai

hóá trị sai

Bắt cặp sai

HO O

HN NH

O OH

N

6 -Thioguanin

N NH N

N

8 -Azaguanin

N NH N

Các chất tổng hợp có cấu tạo

tương tự nucleotid

được dùng trong hóa trị liệu

• Kháng ung thư

• Ưùc chế tổng hợp ADN bằng cạnh tranh ADN polymerase với dCTP,

đóng vai trò là chất kết thúc chuỗi làm chết tế bào đang phân

cytosine arabinoside (araC)

Liệu pháp đồng đẳng nucleosid

O HO-CH 2

H

H

H

Inosin e

H

O HO-CH 2

H N3

H H

Thymi ne H

Inosine là tiền thể cho

purine guanine và

adenine; ức chế chọn

lọc reverse transcriptase

của HIV,  kết thúc

 kết thúc chuỗi

Ức chế reverse transcriptase của HIV

ức chế mạnh virus herpes

simplex (HSV)

ức chế ADN polymerase

của HSV, có tác động

yếu trên ADN polymerase

của tế bào

O HO-CH 2

H

Guanin e

H H

Kháng virus khác

Liệu pháp đồng đẳng nucleosid

Acyclovir

Các chất ức chế topoisomerase

Quinolones

Coumarins và cyclothialidine ức chế GyrB

subunit của DNA gyrase

Các chất ức chế DNA-dependent RNA Polymerases

E:\Baocao_5-2008\ChuyenNganh_CNDP_BC\dPhamDinhDuy_CH\TLTK\Birge_Bacterial and Bacteriophage Genetics 5th ed.pdf

Genetic Locus

in Bacteria Functional Equivalent

(E coli) Protein Function in Archaea

DnaA ATP binding protein; initiates Cdc6/Orc1(origin replication; binds to

origin of recognition replication; also can shut off complex) transcription of itself and other genes

DnaB DNA helicase; unwinds DNA to Minichromosome allow primer

synthesis maintenance (MCM)

DnaC Part of initiation complex; Cdc6/Orc1 loading factor for helicase

DnaG DNA primase, not sensitive to Primase homolog rifampin

DnaN β Subunit of DNA polymerase III; Proliferating cell sliding clamp

(dimer) nuclear antigen (PCNA)

DnaQ ε Subunit of DNA polymerase III; fidelity of replication;

proofreading exonuclease (3′→ 5′)

DnaX δ Subunit of DNA polymerase III

DnaZ τ Subunit of DNA polymerase III; connects holoenzyme to primase Gyr DNA gyrase adds and removes DNA gyrase

Genetic Locus

in Bacteria Functional Equivalent

(E coli) Protein Function in Archaea

Lig (NAD- DNA ligase; joins Okazaki DNA ligase I

dependent) fragments (ATP-dependent)

NrdAB Ribonucleotide reductase that

synthesizes deoxyribonucleotides

from ribonucleotides

PolA, Removal of primers, repair enzyme Flap endonuclease I

RNase H Removal of primers, repair enzyme RNase H

PolC α Subunit of DNA polymerase III;

polymerase function

RpoA α Subunit of RNA polymerase

RpoB β Subunit of RNA polymerase

RpoD σ Subunit of RNA polymerase;

responsible for normal

promoter binding

Ssb Single-strand DNA binding protein; RPA/SSB

facilitates melting of helices and

stabilizes single strands

1 Why does DNA replication gradually stop when protein

and/or RNA synthesis

stop? Inhibition of which enzyme functions would cause a

the base sequence that it recognizes?

3 Both PCR and Southern blotting serve to identify specific sequences in

DNA What are the advantages and disadvantages of both the techniques?

4 How would you determine whether a particular protein

interacted with DNA

or with another protein?