phân lập một số dòng vi khuẩn cố đinh Đạm Azospirillum trên Lúa

phân lập một số dòng vi khuẩn cố đinh Đạm Azospirillum trên Lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA

PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ HOÀNG THĂNG

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA 30

Năm 2008

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

-–˜™— -

Sau bốn năm học tập, rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ và được thực hiện đề tài tốt nghiệp, với sự hướng dẫn và động viên tận tình của quý Thầy, Cô và sự giúp đỡ của bạn bè, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công Nghệ Sinh Học, dù phải gặp rất nhiều khó khăn trở ngại Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Thầy PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp, Trưởng Bộ môn Vi Sinh Vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ

đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

- Thầy Thạc Sĩ Trần Nhân Dũng - Viện Nghiên Cứu và PhátTtriển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ đã chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ dụng cụ thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Cử nhân Phạm Thị Khánh Vân, Cử nhân Nguyễn Thị Phương Tâm, cán bộ nghiên cứu, Bộ môn Vi sinh vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Quý Thầy Cô Bộ Môn Sinh - Khoa Khoa Học, Viện Nghiên Cứu

và Phát Triển Công nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Cần Thơ

- Xin ghi ơn Cha mẹ và gia đình những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, giúp đỡ, động viên, chia sẽ những khó khăn cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và thực hiện đề tài này

- Bạn Nguyễn Như Phương và Bùi Việt Sang lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 30, đã luôn động viên và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài

LÊ HOÀNG THĂNG

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TÓM LƯỢC Trang 1 ABSTRACT Trang 1 PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ Trang 2 PHẦN II – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Giới thiệu về cây lúa

1 Oryza satival L Trang 4

2 Oryza rufipogon Griff Trang 4

3 Đặc điểm sinh trưởng của lúa Trang 4

4 Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam Trang 4

II Tầm quan trọng của đạm đối với lúa Trang 5 III Sự cố định đạm sinh học Trang 6

IV Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp

1 Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum Trang 7

2 Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum

Trang 9

V Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử

1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Trang 10

2 Điện di agarose gel .Trang 11

PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

I Địa điểm và thời gian

1 Địa điểm Trang 12

2 Thời gian .Trang 12

II Vật liệu thí nghiệm .Trang 12 III Phương tiện

1.Phương tiện để phân lập vi khuẩn .Trang 12 2.Phương tiện trích DNA, thực hiện phản ứng PCR, điện di

Trang 13

IV Hóa chất

1 Hóa chất để phân lập vi khuẩn .Trang 13 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3 Hóa chất trích DNA Trang 14

4 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR .Trang 15

5 Hóa chất điện di Trang 15

V Phương pháp

1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum Trang 15

2 Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn Trang 17

3 Nhuộm Gram Trang 17

4 Đo kích thước tế bào vi khuẩn Trang 18

5 Trích nhanh DNA từ vi khuẩn Azospirillum Trang 19

6 Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập

bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .Trang 19

PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

I Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum

1 Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm môi

trường nuôi cấy các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập

II Kết quả kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ

thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Trang 30

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

I Kết luận Trang 32

II Đề nghị Trang 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 33

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã

phân lập trên lúa trồng và lúa hoang Trang 23 Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã

phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) Trang 24 Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã

phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) Trang 25

Bảng 2 Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi

khuẩn đã phân lập Trang 26 Bảng 2 Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi

khuẩn đã phân lập (tt) Trang 27 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào Trang 28 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt) Trang 29 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt) Trang 30 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.) Trang 12 Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên lúa Trang 17 Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt môi

trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi trường Trang 21

Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb đặc

làm thay đổi màu môi trường Trang 22 Hình 5: Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần cho thấy

vi khuẩn Azospirillum bắt màu hồng khi nhuộm Gram Trang 28 Hình 6 : Kết quả điện di các dòng vi khuẩn Azospirillum với cặp mồi chuyên

biệt Azospirillum lipoferum .Trang 31

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TÓM LƯỢC

44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ lúa hoang, lúa mùa và

lúa cao sản tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Các dòng vi khuẩn

Azospirillum phân lập được có một số đặc tính giống như mô tả của các tác giả

khác trước đây Chúng có chung các đặc điểm: vi khuẩn Gram âm, chuyển động được, hình que ngắn hay que dài, que ngắn dính nhau thành cặp, khuẩn lạc màu trắng trong, xanh Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt thiết kế dựa

trên gen nifH, chúng tôi nhận diện được 2 dòng vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum là AR8 và AR41

Từ khóa: Azospirillum lipoferum, lúa hoang, PCR, nifH

ABSTRACT

Forty four strains of Azospirillum were isolated from the root system of

wild rice, winter crop and high productivity rice in some provines of the Mekong Delta These strains have some characteristics which are the same to the descriptions of previous research All of them are negative Gram, motile, short rods or long rods, short rods in pair, white or blue colony Using PCR technique

with specific primers of nifH gen, 2 strains AR8 and AR41 strains were identified Azospirillum lipoferum

Key words: Azospirillum lipoferum, wild rice, PCR, nifH

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản, là cây lương thực quan trọng

cho khoảng 3 tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam Năm 2007, sản lượng lúa thế giới đạt khoảng 645 triệu tấn (International Rice Research Institute (IRRI), 2007) Trong tình hình dân số thế giới đông (hơn 6,6 tỷ người) ngày càng tăng như hiện nay, nhu cầu về lương thực là rất quan trọng Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới tiếp tục gia tăng trong vòng 20 năm tới, thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đáp ứng cho nhu cầu sống còn của cư dân mới Trong điều kiện eo hẹp đó, người ta phải suy nghĩ đến một chiến lược để tăng sản lượng lúa gạo Một trong những chiến lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông nghiệp và qua đó, hi vọng sẽ đem lại cho thế giới một nguồn thực phẩm an toàn

và có giá trị kinh tế cao

Ở Việt Nam, Đồng Bằng Sông Cửu Long được xem là vựa lúa lớn nhất của cả nước, cung cấp hơn 52% sản lượng lúa cả nước (http://www.onthi.com/ly-thuyet/dong-bang-song-cuu-long_471.html) Để cung cấp đủ lương thực thì tăng năng suất cây trồng là điều quan trọng vì diện tích đất canh tác không thể mở rộng thêm được mà ngày càng bị thu hẹp Muốn đạt năng suất cao chúng ta phải kiểm soát tốt các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, nước, phòng trừ sâu bệnh,…Trong đó việc bón phân được xem là nhân tố quan trọng vì

nó quyết định năng suất cây trồng và mùa vụ

Đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây trồng Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm mà cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa

Để đạt được năng suất cao, nông dân phải dùng rất nhiều phân bón hóa học đặc biệt là đạm vì nó là nguồn dinh dưỡng chính giúp cây phát triển Điều này đã nảy sinh nhiều mối lo ngại Hầu hết phân bón hóa học được sản xuất theo qui trình Haber - Borsch, cần rất nhiều khí tự nhiên, than hay xăng, tất cả các nguồn năng lượng này đều thuộc dạng tài nguyên không phục hồi được Điều này

sẽ dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên Hơn nữa việc sản xuất phân Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

bón sẽ sinh ra khí CO2 là một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính (Shenoy và ctv, 2001)

Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và bốc hơi ở dạng NH3, NOx, N2 (Nguyễn Huy Phiêu, 2000) Bên cạnh đó, sự lạm dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006) Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giải pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ngại Việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm trong đó có Việt Nam, nhằm tạo ra một sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững

Qua nhiều nghiên cứu, dòng vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định

đạm giúp tăng suất cây trồng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Dòng

Azospirillum với nhiều đặc điểm thuận lợi như: có khả năng cố định đạm tự do

trong không khí, tổng hợp được các chất kích thích sinh trưởng làm hệ thống rễ phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985)

Việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng Azospirillum làm phân bón trong

nông nghiệp là rất cần thiết, đặc biệt trên lúa nhằm thay thế một lượng đạm hóa học đáng kể cho cây, bảo vệ môi trường và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Đồng thời, gia tăng sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người nông dân

Ä Mục tiêu đề tài:

Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên cây lúa

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Giới thiệu về cây lúa

1 Oryza sativa L

Cỏ nhất niên, cao 0,5 - 1,7m Lá có phiến dài, bìa hơi “cắt”, bẹ dài, có mép cao trắng, tai cong, có lông Chùm tụ tán, dĩnh nhỏ, hoa 1, tiểu nhụy 6, chỉ dài Dĩnh quả (hạt gạo lức) dính chặt vào trấu (hạt lúa), 2n = 24 (Phạm Hoàng

Hộ, 2000)

2 Oryza rufipogon Griff (Lúa hoang hay lúa ma)

Nê thực vật đa niên nổi, có thân nằm rồi đứng, dài 1,5 - 4m, thân to 4 -

6 mm, lóng dài 10cm Lá có phiến dài vào 20cm, rộng vào 1cm, mép các lá dưới cao hơn 1,5 - 3cm, có rìa lông Chùm tụ tán đứng cao 10 - 15cm, gié hoa, nâu nâu, dài 7 - 9,5mm, rộng 1,8 - 1,9mm, có lông gai dài đến 11cm, dĩnh mỏng, cao 3mm (Phạm Hoàng Hộ, 2000)

Cây lúa hoang (Oryza rufipogon) mọc hoang ở các nơi đầm lầy, hoặc

dọc theo các kênh mương ở Đồng Tháp Mười, và các vùng nước sâu trung bình ở các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, Tiền Giang Năng suất lúa rất thấp, khoảng 0,2 đến 0,4 tấn/ ha Ngày nay, khi các cánh đồng đã phủ kín lúa cao sản thì cây lúa hoang gần như bị tiêu diệt hết, vì vậy để bảo tồn nguồn gen quí này người ta đã đưa giống lúa hoang sang viện lúa Quốc Tế IRRI để lưu trữ (http://www viettribune com /vt/ index.php?id=629)

3 Đặc điểm sinh trưởng của lúa

Thời gian sinh trưởng tính từ lúc nảy mầm cho đến lúc chín khoảng 90

đến 180 ngày, tùy theo giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ gieo cấy

Về mặt nông học có thể chia thành 3 thời kỳ: sinh trưởng dinh dưỡng

từ lúc nảy mầm; sinh trưởng sinh sản từ làm đòng đến trổ bông và thời kỳ chín từ trổ bông đến thu hoạch Nắm được qui luật sinh trưởng, phát triển của cây lúa, chúng ta có thể chủ động áp dụng các biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhằm tạo năng suất cao

4 Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam

Đối với Việt Nam cây lúa có vai trò quan trọng trong việc giải quyết nhu cầu lương thực cho nhân dân Gắn liền với quá trình phát triển của lịch sử, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

cây lúa được coi là người bạn gần gũi nhất đối với đồng ruộng và người nông dân Với tập quán canh tác và tiêu dùng lúa gạo, hàng năm lúa gạo đáp ứng trên 80% nhu cầu lương thực của cả nước Người ta thống kê được, sản lượng lúa vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng từ 9,5 triệu tấn (năm 1990) lên 19,2 triệu tấn (năm 2007) (http://www.vietnamnet.vn/kinhte/2006/10/622312/ và http: //www sgtt.com.vn/detail3.aspx?newsid=32713&fld=HTMG/2008/0410/32713)

Vụ lúa đông xuân năm 2008, tổng sản lượng toàn vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đạt 9,4 triệu tấn, tăng 300 ngàn tấn so với năm 2007 Tính chung

cả nước thì vụ đông xuân năm 2008 này sản lượng lúa đạt 17,2 triệu tấn, tăng khoảng 200 ngàn tấn so với vụ trước (http://www6.thanhnien.com.vn/Kinhte /2008/4/27 /236353.tno)

Các số liệu trên cho thấy cần đánh giá lại một cách nghiêm túc vai trò của lúa gạo cả nước nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng để đảm bảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia và ổn định lượng gạo xuất khẩu

II Tầm quan trọng của đạm đối với lúa

Đạm là một chất có vai trò quan trọng trong đời sống thực vật và động vật Đạm là cơ cấu của protein, nhất là của protein nhân, chiếm khoảng 2 - 4% trọng lượng của chất khô, nó còn là cơ cấu của diệp lục tố, pyrimidine và purine, thành phần cấu trúc của một số vitamin nhóm B (B1, B2, B6,…) và các hợp chất khác (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

Đạm là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng hàng đầu đối với sự sống tế bào, là yếu tố giới hạn năng suất cây trồng (Shenoy và ctv, 2001) Bón phân đạm thúc đẩy quá trình tăng trưởng của cây trồng, giúp cây ra nhiều nhánh, phân cành, ra nhiều lá, lá có kích thước to giúp cây quang hợp mạnh Do đó, khi bón phân đạm sẽ giúp gia tăng năng suất và chất lượng sản phẩm (Vũ Hữu Yêm, 1995)

Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2004) cây thiếu đạm thường sinh trưởng kém, diệp lục tố khó thành lập nên lá thường bị vàng úa, cây còi cọc, lùn, năng suất kém; số lá, số chồi, số nhánh ít, kích thước lá nhỏ Thừa đạm lá có màu xanh đậm, kích thước lá tăng, nhất là về mặt diện tích lá; cây thường có hệ Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

thống rễ kém phát triển; lá mỏng, kém hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời, dễ

bị côn trùng phá hoại, đồng thời dễ đổ ngã dẫn đến năng suất giảm

Đối với cây lúa, đạm là yếu tố rất quan trọng quyết định năng suất, mùa vụ Mất khoảng 1kg đạm để sản xuất 15 - 20kg lúa (Shenoy và ctv, 2001) Trong cây lúa, đạm tập trung nhiều ở phiến lá hơn là các cơ quan khác và cũng là nguồn protein chủ yếu cho sự hình thành hạt, chính vì vậy đạm mang lại hiệu quả cao trong thực tế sản xuất rõ hơn các yếu tố khoáng khác

Theo Nguyễn Huy Phiêu (2000), bình quân từ một ha đất lúa có thể huy động được 30 - 50kg đạm, nhưng một vụ lúa một ha đất mất đi tới 150kg đạm Nếu không bón đủ để bù đắp lượng dinh dưỡng lấy đi do nông phẩm cũng như thất thoát do rửa trôi thì không thể duy trì độ phì nhiêu và nâng cao năng suất cây trồng được Người ta dự đoán, nhu cầu phân đạm ở Việt Nam sẽ tăng từ 1.271.000 tấn (năm 2000) lên 1.627.000 tấn (năm 2010) (http://www.Fadinap org/vietnam/fertilizer.html)

III Sự cố định đạm sinh học

Khí quyển là nguồn dự trữ đạm N2 rất lớn, trong khoảng không khí bên trên mỗi km2 đất đai có khoảng 8 triệu tấn nitơ Tuy nhiên, loại nitơ này cây trồng không thể hấp thu được trực tiếp mà phải được vi sinh vật biến đổi thành

Sự cố định đạm sinh học phụ thuộc vào hoạt động của enzyme nitrogenase được xúc tác bởi năng lượng Để thực hiện phản ứng này cần cung cấp 17 ATP và enzyme nitrogenase để phá vỡ liên kết ba của phân tử nitơ Nitrogenase là một phức hợp enzyme, chúng cấu tạo bởi 2 thành phần là protein sắt và protein sắt - molybden Nitrogenase không chỉ xúc tác việc khử N2 thành Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

NH3 mà còn có thể xúc tác việc khử C2H2, , HCN,…thành các sản phẩm tương ứng như: C2H4, CH3NH2… (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1997)

Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:

NH3 được tạo thành sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành protein:

NH3 + Acid hữu cơ Acid amino Protein Chính vì vậy mà vai trò của sự cố đinh đạm sinh học có một ý nghĩa hết sức quan trọng đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp sản xuất phân hóa học chưa phát triển mà Việt Nam là một ví dụ điển hình Trong tương lai, khả năng cố định đạm trong cây không phải họ đậu có thể làm giảm và thậm chí là loại bỏ hẳn sự cần thiết sử dụng phân bón vô cơ trong nông nghiệp, đồng thời cũng có thể cải thiện được năng suất của mùa màng khi

sự cộng sinh cung cấp nguồn đạm liên tục cho cây trồng (http://www.vinachem com.vn )

IV Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp

1 Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum

Năm 1974 lần đầu tiên người ta phân lập được một loài xoắn khuẩn

sống trên rễ một số cây cỏ nhiệt đới và đặt tên là Spirillum lipoferum (Döbereiner

và cộng tác viên (ctv), 1987) Về sau căn cứ vào tỷ lệ các base trong ADN người

ta xác định chúng thuộc về một giống mới, được đặt tên là Azospirillum (Döbereiner và ctv, 1995) Azospirillum có số lượng khá lớn ở vùng rễ và trong

lớp tổ chức ở bề mặt rễ (khoảng 106-107 tế bào/gram rễ khô) (Nguyễn Mỹ Nhung 2007)

Từ đó đến nay, người ta đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn

Azospirillum Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm tự do hoặc kết hợp

với vùng rễ của cây họ hòa bản, đặc biệt vùng rễ của cây cỏ nhiệt đới , lúa nước, mía, ngô, lúa mì (Boddy và ctv, 1995) Saleeana và ctv (2002) đã tìm ra những

loài vi khuẩn thuộc giống Azospirillum trong rễ lúa trồng ở Tamil Nadu, Ấn Độ

Nitrogenase

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2005) cũng tìm ra dòng vi khuẩn

Azospirillum cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu

Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ,

vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ (Döbereiner và ctv, 1995)

Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài vi khuẩn đã được phát hiện: Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense (Tarrand và ctv, 1978); Azospirillum amazonese (Magalhaes và ctv, 1983); Azospirillum halopraeferrans (Reinhold và ctv, 1987); Azospirillum irkense (Khanmas và ctv, 1989); hai loài còn lại là Azospirillum doebereinerae và Azospirillum largomobile được Dekhil

và ctv tìm ra năm 1997 Chúng có những đặc điểm chung như: là vi khuẩn Gram

âm, hình que cong hay hình chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5µm, sinh trưởng tốt ở

300C và pH từ 6,0 - 7,0 (Bashan và ctv, 2004) Azospirillum có thể chuyển động

được trong môi trường lỏng nhờ có những chiên mao dài ở một đầu (polar flagellum) tế bào (Đào Thanh Hoàng, 2005)

Vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum sinh trưởng dưới 2 điều

kiện hiếu khí và kỵ khí Tuy nhiên, chúng phát triển thích hợp và tối ưu nhất ở điều kiện vi hiếu khí với sự có mặt hoặc không của đạm trong môi trường (Döbereiner và Pedrosa, 1987) Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của những vi khuẩn này là 35 - 370C Khuẩn lạc của chúng phát triển trên môi trường agar - khoai tây có màu hồng nhạt hay đậm

Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng thực vật như

IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (Abscisic acid) và Cytokynin (Bashan và Levanony, 1990) Sự sản xuất hormone thực vật

của vi khuẩn Azospirillum đã làm tăng chiều dài rễ, tăng hấp thu khoáng, từ đó

giúp tăng khả năng sinh trưởng của cây (Okon và Kapulnik, 1986), giúp cây

chống chịu khô hạn Ứng dụng Azospirillum có thể giảm được khoảng 30%

lượng phân bón trong nông nghiệp (http://www.hinduonnrt.com/thehindu/seta /2002/04/04/stories/2002040400120400.htm)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Để phát hiện loài vi khuẩn Azospirillum lipoferum, người ta dùng cặp mồi chuyên biệt dựa trên trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công

bố trên website ngân hàng gen để nhận diện chúng (http://www.ncbi.nlm nih.gov/Genbank/index.html)

2 Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum

Thí ngiệm về tác động của các dòng Azospirillum lên năng suất cây

trồng đã được tiến hành ở nhiều loài cây và các nơi trên thế giới

Năng suất mùa vụ đã tăng từ 3 - 54% khi được chủng Azospirillum là

kết quả của 18 thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện tại Ý (Favilli và ctv, 1987)

Ngoài ra Azospirillum còn làm tăng sản lượng lúa mì ở Mexico từ 23 - 26%

(Paceres và ctv, 1988), ở Argentina 13 - 30 % (Rodriguez - Caceres, 1982)

Thí nghiệm ngoài đồng trên lúa Miến cho thấy khi có chủng giống

Azospirillum brasilense vào hạt lúa Miến (107CFU/hạt) làm gia tăng năng suất từ

10 - 15% (Okon và ctv, 1994)

Ủ hạt với vi khuẩn cho kết quả tốt hơn khi ủ với phân bón hóa học Ủ

hột lúa mạch với Azospirillum liên tục khoảng 3 năm tại ICRISAT cho thấy

chúng cố định được 26kg đạm/ha so với không ủ và lượng NPK chứa trong cây tăng 80 - 90% (Fages và ctv, 1994)

Theo dữ liệu của thế giới ở thập kỷ qua, khi ủ thử nghiệm hột giống

với Azospirillum hoặc kết hợp với vi khuẩn cố định đạm khác dẫn đến kết quả là

vi khuẩn có khả năng gia tăng sản lượng nông nghiệp trên những loại đất và khu vực khác nhau (Sumner và ctv, 1990; Fages và ctv, 1994) Điều này được giải

thích như sau: khi ủ hạt giống với vi khuẩn với Azospirillum không chỉ giúp cố

định đạm trong vùng rễ mà còn làm cho hệ thống rễ phát triển nhiều hơn, gia tăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong sự thẩm thấu nước và chất dinh dưỡng, giúp tăng năng suất cây trồng (Bashan và Holguin, 1997; Boddey và ctv, 1986)

v Một số nghiên cứu về Azospirillum tại Việt Nam

Theo Nguyễn Thái Huy (1999), sử dụng phân đạm vi sinh (nhóm

Azospirillum, loài Pseudomonas, Enterobacter ) cho thấy lúa có thể tăng năng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Tại Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, ở bộ môn Vi

sinh vật học, thí nghiệm về xử lý mầm mạ với chế phẩm Azospirillum cho thấy

mạ cứng chắc và lớn hơn, chống chịu rét tốt hơn nếu mạ gặp rét đậm kéo dài (dưới 100C) Lúa chín sớm hơn từ 3 - 5 ngày so với cây lúa không xử lý với chế

phẩm Azospirillum (Nguyễn Bảo Vệ, 2004)

Theo Phạm Thị Ngọc Lan và Lý Kim Bảng (2004), số lượng vi khuẩn

cố định đạm trong mẫu đất phân lập (trong đó có Azospirillum) đạt từ 414,0 -

428,3 CFU/g đất khô tuyệt đối và khi xử lý hạt của giống lúa Khang Dân với nồng độ vi khuẩn 105, 106, 107 tế bào/ml, các chỉ tiêu nảy mầm, chiều dài rễ và thân mầm đều tăng so với đối chứng, ngoại trừ chỉ tiêu của rễ mầm ở nồng độ 107

tế bào/ml

Nguyễn Khắc Minh Loan và Đào Thanh Hoàng (2005) đã phân lập

được một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum trên cây lúa Riêng Đào

Thanh Hoàng (2005) đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn cố định đạm từ lúa trồng, lúa hoang hay cỏ dại và đã xác định 3 dòng A16, A28 và A31 là

Azospirillum lipoferum có nguồn gốc từ thân, rễ lúa trồng (lúa cao sản) và lúa

hoang Tác giả cho rằng nồng độ acid malic, nguồn carbon chính cho

Azospirillum trong môi trường NFb, thích hợp nhất là 4g/lít

Các kết quả thí nghiệm trên cho thấy loài Azospirillum lipoferum phân

bố rộng và chúng có những đóng góp lớn trong việc tăng năng suất cây trồng, thay thế phần nào lượng phân hóa học bón cho cây, cải tạo đất đai và giảm thiểu

ô nhiễm môi trường

V Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử

1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng tác viên phát minh năm 1985 Kỹ thuật này dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase đều cần mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung vào mạch khuôn Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước:

- Bước 1: Biến tính (denaturation) Phân tử ADN được tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt độ 94 - 950C trong vòng 1 phút

- Bước 2: Bắt cặp (anealing) Nhiệt độ được hạ thấp 490C cho phép mồi bắt cặp với khuôn, giai đoạn này kéo dài 1 phút

- Bước 3: Kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho ADN polymerase tổng hợp ADN, giai đoạn này kéo dài 1 phút

Các ADN mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n (với n là số chu kỳ nhiệt) Sản phẩm PCR sau đó sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di (Nguyễn Viết Khuê, 2006)

2 Điện di agarose gel

Điện di là một quá trình mà các phân tử mang điện tích được tách ra trong một điện trường do khả năng di chuyển khác nhau của các phân tử Đây là phương pháp thông dụng dùng để tách rời các đoạn acid nucleic có kích thước từ 200bp đến 50kb (Võ Công Thành, 2004; Trần Thị Xuân Mai, 2005)

Trong điện di, người ta thường sử dụng thang ADN chuẩn (ADN ladder) Đó là hỗn hợp nhiều đoạn ADN có kích thước đã biết khi cho điện di cùng lúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn ADN của mẫu

Kỹ thuật điện di trên gel sẽ tách các phân tử ADN tùy theo kích thước của chúng (http://www.semvn.net/sem/modules.php?name=Forums&file=view topic&p=7)

Vận tốc và sự phân ly ADN phụ thuộc vào một số yếu tố sau: kích thước phân tử ADN, nồng độ gel agarose, kiến trúc ADN, cường độ điện trường, chiều của điện trường, … (Trần Thị Xuân Mai, 2005)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN III - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

I Địa điểm và thời gian

1 Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ

2 Thời gian

Từ tháng 02/2008 đến 06/2008

II Vật liệu thí nghiệm

- Lúa hoang (hình 1): mẫu được thu tại 2 địa điểm: Khoa Nông Nghiệp Trường Đại Học Cần Thơ, đường Huỳnh Thúc Kháng - Thành Phố Cần Thơ

Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.)

III Phương tiện

1 Phương tiện để phân lập vi khuẩn

- Cối chày, chai khử trùng mẫu, eppendorf 1,5 ml

- Bình tam giác, đĩa Petri đường kính 10 cm

- Máy khuấy (vortex), máy sấy, cốc

- Kính hiển vi Olympus, tủ ủ Incucell

Lông gai Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Tủ cấy vô trùng, que cấy, tủ lạnh, cân điện tử

- Ống nghiệm nắp đen 15 ml

- Nồi khử trùng nhiệt ướt, máy đo pH -Xẻng (dùng để đào lúa), kéo, bọc nilon, đèn cồn

- Lò vi sóng Panasonic, đũa thủy tinh

2 Phương tiện trích ADN, thực hiện phản ứng PCR, điện di

- Micropipet Bio - Rad,

- Eppendorf 1,5 ml và 2,0 ml

- Bộ chạy điện di Embi - Tec

- Máy PCR Bio - Rad

- Máy chụp hình gel Bio - Rad UV 2000

- Môi trường NFb (môi trường bán đặc và đặc)

• Công thức môi trường NFb đặc (g/l) (Kirchhof và ctv, 1997)

- pH 6,8

- Agar 18g (môi trường đặc )

- Agar 1,9g (môi trường bán đặc )

• Dung dịch vitamine Biotin 10mg Pyridoxyl - HCl 20mg Thêm nước cất cho đủ 100ml

- Trường hợp trữ ống thêm vào công thức môi trường trên

Dịch trích nấm men 5g/l

2 Hóa chất nhuộm Gram

- Crystal violet, iod

- Tăm tre đầu nhọn

- Môi trường LB (Lauria Betan)

• Công thức môi trường LB (Lauria Betan) (g/l)

Dịch trích nấm men 5g Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Mồi dùng nhận diện Azospirillum lipoferum:

+ Mồi xuôi: 5’- GTA AAT CCA CCA CCT CCC - 3’

+ Mồi ngược: 5’- TGT AGA TTT CCT GGG CCT - 3’

(Cặp mồi chuyên biệt để nhận diện Azospirillum lipoferum được

Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ

thiết kế dựa theo trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công bố trên

- Ethidium bromide (EtBr)

- Thang chuẩn λ/pstI

- Loading buffer Fer

- Nước cất 2 lần đã khử trùng

V Phương pháp

1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum

a) Thu mẫu

- Các mẫu lúa được thu lấy từ bờ ruộng hay ven kênh và rạch

- Dùng xẻng đào đất xung quanh bụi lúa để có thể thu được toàn bộ cây lúa Sau đó cho vào bao nylon và được mang về phòng thí nghiệm vi sinh vật

để tiến hành xử lý mẫu và phân lập vi khuẩn Azospirillum

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu