Phân lập tuyển chọn các chủng Corynebacterium Glutamicum và tách dòng gen met A mã hoá Enzym Homoserine Acetyltransferase sinh tổng hợp axit amin L methionin

Phân lập tuyển chọn các chủng Corynebacterium Glutamicum và tách dòng gen met A mã hoá Enzym Homoserine Acetyltransferase sinh tổng hợp axit amin L methionin Phân lập tuyển chọn các chủng Corynebacterium Glutamicum và tách dòng gen met A mã hoá Enzym Homoserine Acetyltransferase sinh tổng hợp axit amin L methionin luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Nguyễn thị Hồng Hà

hà n ội, 2006

Luận văn thạc sĩ khoa học

“Phân lập, tuyển chọn các chủng Corynebacterium glutamicum và tách dòng gen Met A mã hoá enzym Homoserine Acetyltransferase

sinh tổng hợp axit amin L-Methionin”

Mục lục

Phần mở đầu……… 1

Chương 1 Tổng quan……… 4

1.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất methionin trên thế giới và ở Việt Nam… 4

1.1.1 Trên thế giới……… 4

1.1.2 ở Việt Nam……….………5

1.2 Đại cương về C glutamicum……….……….6

1.2.1 Đặc điểm hình thái của C glutamicum……… 6

1.2.2 Vai trò của C glutamicum trong sinh tổng hợp axit amin………….7

1.3 Công thức cấu tạo, tính chất L- methionin……… ……… 8

1.4 CƠ chế Sinh tổng hợp Axit amin……… ……… 9

1.4.1 Sản xuất axit amin bằng con đường phân nhánh……….11

1.4.2 Con đường sinh tổng hợp methionin từ nhánh homoserin……… 13

1.4.3 Thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy cho sản lượng methionin cao……….18

1.4.4 Tạo chủng đột biến để sản xuất methionin……… 20

1.4.5 Thu hồi methionin từ lên men lỏng………21

1.5 Vai trò sinh học và ứng dụng Methionin trong cuộc sống………… 22

1.6 Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để tăng sản lượng methionin……24

1.6.1 Những nghiên cứu về methionin ở mức độ phân tử và vai trò met A trong con đường sinh tổng hợp methionin……… 24

1.6.2 Vectơ sử dụng cho tách dòng……… 25

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu………… 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… ……… 28

2.2 Vật liệu……… ……… 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 30

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu………30

2.3.2 Phương pháp phân lập các chủng C glutamicum……….30

2.3.3 Phương pháp phân loại các chủng C.glutamicum……….30

2.3.3.1 Đặc điểm hình thái tế bào……….…31

2.3.3.2 Xác định hoạt tính catalaza……… 31

2.3.3.3 Khả năng sinh khí

CO2……… 31

2.3.3.4 Xác định khả năng dịch hoá gelatin……….32

2.3.3.5 Xác định khả năng khử NO -3→ NO -2……… 32

2.3.3.6 Xác định khả năng tạo H2S……… 32

2.3.4 Phương pháp lên men sinh tổng hợp L-methionin từ các chủng C glutamicum đã phân lập……… ………33

2.3.5 Phương pháp định tính và bán định lượng L-methionin………….33

2.3.5.1 Định lượng L-methionin bằng phương pháp sắc ký giấy…………33

2.3.5.2 Định lượng L-methionin ……… ……… 34

2.3.6 Tách dòng và đọc trình tự gen metA từ các chủng C.glutamicum phân lập bằng kỹ thuật PCR……… ……….36

2.3.6.1 Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn……….……… 36

2.3.6.2 Kỹ thuật PCR nhân bản gen metA ……….… 39

2.3.6.3 Phản ứng nối ghép gen (tạo dòng đoạn DNA đặc hiệu của gen metA) 39

2.3.6.4 Biến nạp sản phẩm ghép gen (plasmit tái tổ hợp) bằng sốc nhiệt vào E coli DH5α……… …40

2.3.6.5 Tách chiết DNA plasmit từ E coli DH5α ……… ……… 41

2.3.6.6 Xử lý DNA bằng enzym giới hạn EcoRI……… …….42

2.3.6.7 Tách và tinh sạch DNA plasmit lượng lớn……….……… 42

2.3.6.8 Xác định trình tự nucleotit gen metA……….………… 43

Chương 3 Kết quả và thảo luận……… 45

3.1 PHân lập và TUYỂN CHỌN các CHỦNG C Glutamicum SINH L-METHIONIN.…45 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp methionin từ đất ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam……… 45

3.1.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp L-methionin cao……….…46

3.1.3 Định loại vi khuẩn có khả năng sinh methionin dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý, sinh hóa……… 47

3.2 Tách Dòng và xác định trình tự gen met A mã hoá Homoserin Acetyltransferaza từ C glutamicum……… ………49

3.2.1 Phân lập gen metA 51

3.2.1.1 Tách chiết DNA hệ gen của C glutamicum 51

3 2.1.2 Nhân gen metA bằng kỹ thuật PCR 53

3.2.2 Tách dòng gen met A 54

3.2.2.1 Đưa gen vào vectơ tách dòng pCR 2.1 55

3.2.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp mang đoạn DNA đặc hiệu mã hoá cho homoserin acetyltransferaza vào E.coli DH5 α 55

3.2.2.3 Tách chi ết DNA plasmit từ E.coli DH5α 57

3.2.2.4 Kiểm tra sự có mặt của gen metA trong các dòng plasmit tái tổ hợp 58

3.2.3 Xác định trình tự đoạn DNA đặc hiệu của gen metA từ chủng C glutamicum 309 phân lập ở Việt Nam……… … 60

3.2.3.1 Xác định trình tự nucleotit của gen metA từ chủng C glutamicum 309…60 3.2.3.2 So sánh trình tự nucleotit đoạn DNA đặc hiệu của gen met A từ chủng phân lập ở Việt nam với trình tự của thế giới đã công bố………….61

3.2.3.3 Kết quả dịch mã đoạn DNA của gen metA……… 64

3.2.3.4 So sánh trình tự các axit amin của đoạn protein dịch mã từ đoạn DNA đặc hiệu của gen metA với trình tự của thế giới đã công bố………….66

Chương 4 kết luận……….68

Tài liệu tham khảo………69

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu, Trưởng phòng Vi sinh vật, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình hoàn thành bản luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS

Đinh Duy Kháng, Trưởng phòng Vi sinh vật phân tử, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình công tác

Cuối cùng tôi xin gửi đến gia đình và bạn bè tôi, những người đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp lời biến ơn sâu nặng

Hà Nội, tháng 09 năm 2006

Nguyễn Thị Hồng Hà

Danh mục các chữ viết tắt

Bp Base pair (cặp bazơ)

dNTP Deoxy Nucleotid Tri Phosphat

ddNTP Dideoxy Nucleotid Tri Phosphat

EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

IPTG Isopropyl -β- D-Thiogalactoeyranoside

kDa Kilo Dalton

LB Môi trường Lauria Betani

ORF Open reading frame (khung đọc mở)

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SAM S-adenosyl-methionine

TAE Tris - Acetate - EDTA

TE Tris - EDTA

Tm Temperature melting (nhiệt độ nóng chảy)

X- gal 5-bromo -4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 ảnh hưởng của các enzym đến sự ức chế sinh tổng hợp methionin

Bảng 1.2 Thành phần chính của plasmid pCRđ 2.1

Bảng 2.1 So sánh lượng 2 - ketobutyrat tính toán được bằng phương pháp quang phổ của mẫu thí nghiệm so với lượng 2 - ketobutyrat đã cho vào

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

Bảng 2.3 Chương trình chạy PCR

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCR 2.1

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt DNA bởi EcoRI

Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn cú khả năng sinh tổng hợp methionin từ các mẫu đất ở một số tỉnh của Việt Nam

L-Bảng 3.2 Khả năng sinh L-methionin của các chủng phân lập

Bảng 3.3 Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc, kích thước tế bào và bào tử của 7

chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh tổng hợp L-methionin cao

Bảng 3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh tổng hợp L-methionin cao

Bảng 3.5 Kết quả định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA hệ gen bằng quang phổ kế

Danh mục các hình và đồ thị

Sơ đồ 1.1 ức chế ngược của enzym hoạt động

Sơ đồ 1.2 Mô hình cơ chế điều hoà hoạt tính enzym sinh tổng hợp axit amin Sơ đồ 1.3 Điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp các axit amin họ aspartat ở chủng E coli

Sơ đồ 1.4 Điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp các axit amin họ aspartat ở chủng C glutamicum

Sơ đồ 1.5 Con đường sinh tổng hợp methionin ở các vi sinh vật khác nhau

Sơ đồ1.6 Các enzym điều khiển quá trình sinh tổng hợp methionin ở C glutamicum

Sơ đồ 1.7 Sơ đồ cấu trúc và các vị trí cắt của vectơ pCR 2.1

Hình 3.1 Sơ đồ miêu tả quá trình nối ghép tạo vectơ petmetA

Hình 3.2 Kết quả điện di DNA hệ gen trên gel agaroza 1%

Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm PCR của chủng C glutamicum 309 trên gel

Hình 3.9 So sánh độ tương đồng giữa trình tự nucleotit của gen metA tách

dòng từ chủng C glutamicum 309 phân lập ở Việt Nam (AJ584663) với trình

tự gen metA chủng C glutamicum được Soo Dong Park và cs công bố trong

Ngân hàng Gen quốc tế

Hình 3.10 Trình tự các axit amin được dịch mã từ đoạn DNA đặc hiệu gen

metA tách dòng từ chủng C glutamicum 309

Hình 3.11 So sánh độ tương đồng trình tự các axit amin của đoạn protein

được dịch mã từ gen metA tách dòng từ chủng C glutamicum 309 phân lập ở

Việt Nam với trình tự các axit amin của gen metA đã được Soo Dong Park và

cs công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế

Phần mở đầu

Methionin là axit amin không thay thế, cơ thể người và động vật không tự tổng hợp được nó mà phải bổ sung từ bên ngoài vào ở dạng đồng phân L-methionin mới có giá trị dinh dưỡng với người và động vật L-methionin được sản sinh khi lên men các chủng: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Escherichia coli … hoặc cũng có thể thu nhận từ dịch thuỷ phân protein

động, thực vật L- methionin được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Trong chăn nuôi, L- methionin được bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng chất lượng và sản lượng thịt của động vật nuôi Trong công nghiệp dược phẩm, methionin đã

được coi như một chất dinh dưỡng, kích thích sự ăn ngon miệng, điều hoà hoạt

động của tuyến giáp, khử các chất độc trong cơ thể… Trong công nghiệp thực phẩm, methionin là chất bổ trợ làm giàu thực phẩm, nâng cao chất lượng các loại hạt như lúa mì, ngô, gạo … vì các sản phẩm này thiếu L-methionin thì giá trị dinh dưỡng không cao

Trên thế giới việc sản xuất axit amin ở quy mô công nghiệp đã được bắt

đầu từ năm 1908 Đến năm 2005, lượng axit amin được sản xuất ra trên toàn thế giới đạt 350.000 tấn/năm [34] và dự tính sẽ tăng lên 500.000 tấn/năm vào năm 2006 [35] Mặc dù lượng methionin sản xuất ra hàng năm rất lớn, nhưng vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu sử dụng sản phẩm này Trung quốc là một trong những nước sản xuất methionin lớn nhất thế giới [23]

ở qui mô công ngiệp, L-methionin được sản xuất từ các chủng đột biến Việc tạo ra các chủng đột biến đã khắc phục được cơ chế ức chế ngược của chủng tự nhiên nên sản lượng methionin tăng cao Tuy nhiên, một hướng nghiên cứu mới được triển khai và đã thu được những kết quả tốt, đó là tách dòng và đưa các gen mã hoá enzym điều khiển quá trình sản xuất L-methionin vào hệ biểu hiện nhằm tạo ra những chủng siêu tổng hợp L-methionin Soo-Dong Park và

cộng sự [79] đã tiến hành tách dòng và xác định tính chất của gen met2 là gen

mã hoá cho homoserin 0-transacetylaza từ Ascolobus immersus, Sacharomycess cerevisiae và Preudomonas syringae, một trong những enzym của con đường

sinh tổng hợp methionin Soo-Dong Park và cs [79] đã tách dòng và đưa gen

metA mã hoá cho homoserin acetyltransferaza là enzym đầu tiên trong con

đường sinh tổng hợp methionin từ nhánh homoserin vào C glutamicum

Chủng tái tổ hợp thu được có hoạt tính enzym tăng và khả năng biểu hiện sản phẩm protein lên 10 lần so với chủng tự nhiên Hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa

có cơ sở trong nước nào sản xuất L-methionin và nước ta vẫn phải nhập khẩu hoàn toàn L-methionin với số lượng lớn

Để góp phần vào vấn đề nghiên cứu công nghệ sản xuất L-methionin ở Việt nam, chúng tôi đã nghiên cứu đề tài “Phân lập, tuyển chọn các chủng

Homoserine Acetyltransferase sinh tổng hợp axit amin L-methionin“

* Mục tiêu của luận văn

1.1 Tuyển chọn được một số chủng Corynebacterium glutamicum có khả

năng sinh tổng hợp methionin cao từ các nguồn đất ở Việt nam

1.2 Tách dòng và đọc trình tự gen met A mã hoá cho Homoserin

Acetyltransferaza từ chủng C glutamicum 309

* Nội dung nghiên cứu

2.1 Thu thập các mẫu đất ở các tỉnh miền Bắc Việt nam

2.2 Phân lập và tuyển chọn các chủng C glutamicum có khả năng sinh tổng

hợp methionin từ các mẫu đất trên

2.3 Tách DNA hệ gen và nhân bản gen met A từ chủng C glutamicum phân

lập

2.4 Gắn đoạn DNA ngoại lai vào vectơ tách dòng và biến nạp vào E coli

DH5α

2.5 Kiểm tra bằng enzym hạn chế

2.6 Tinh sạch plasmit tái tổ hợp và xác định trình tự gen met A

thí nghiệm trên gà giò khi bổ sung methionin với liều 0.44% và thấy đã làm tăng trọng lượng gà, tăng tỷ lệ chuyển hoá thức ăn và năng suất trứng

Việc sản xuất methionin cũng rất phổ biến Năm 2005 lượng methionin

được sản xuất ra trên toàn thế giới đạt 350.000 tấn/năm [34] và dự tính sẽ tăng lên 500.000 tấn/năm vào năm 2006 [35] Một số nước đã sản xuất methionin

để xuất khẩu như Trung quốc với giá thành tương đối cao [23] Methionin

được sử dụng trên nhiều lĩnh vực nhưng chủ yếu là trong ngành chăn nuôi, công nghiệp dược phẩm và công nghiệp thực phẩm Nhìn chung lượng methionin sản xuất ra hàng năm rất lớn, nhưng vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu

sử dụng sản phẩm này

1.1.2 ở Việt Nam

Trên thế giới, mặc dù methionin đã được sử dụng một cách phổ biến và rộng rãi trên nhiều lĩnh vực, nhưng ở Việt Nam methionin mới chỉ được sử dụng ở dạng thành phẩm và chủ yếu là nhập ngoại với giá thành tương đối cao Một số doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng đã sử dụng methionin nhưng với số lượng ít ở nước ta ngành sử dụng methionin nhiều nhất là ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm nhưng chúng ta vẫn phải nhập khẩu hoàn toàn L-methionin với số lượng lớn [4]

Việc nghiên cứu và sản xuất methionin ở nước ta còn rất mới mẻ, chưa

có nhiều công trình nghiên cứu về lĩnh vực này và các nghiên cứu mới chỉ tập trung về khả năng ứng dụng của methionin trong chăn nuôi Bùi Thị Oanh và

cs [4] đã nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ methionin và cystin trong thức ăn hỗn hợp đến năng suất của gà sinh sản hướng thịt và gà Broiler, kết quả cho thấy khi trong khuẩn phần thức ăn gà có bổ sung 0,25% methionin đã làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, gà có tốc độ tăng trọng nhanh, nâng cao chất lượng thịt, trứng gà và giảm chi phí tiêu tốn thức ăn Nguyễn Thị Lộc và cs [2] đã bổ sung methionin với liều 0,2-0,3% trong khẩu phần nuôi lợn thịt có sắn ủ chua

đã làm tăng tỷ lệ tiêu hoá biểu kiến hồi tràng và tỷ lệ tiêu hoá toàn phần của protein và tăng giá trị sinh vật học của protein khẩu phần lên 62-63% so với khẩu phần không bổ sung methionin

1.2. Đại cương về C glutamicum

1.2.1 Đặc điểm hình thái của C glutamicum

Trong tự nhiên cónhiều loại vi sinh vật sinh methionin [57], các vi khuẩn

có khả năng sinh methionin là: Bacillus megaterium, Brevibacterium heali, Brevibacterium liniens [30], Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lilium, E coli, Lactobacilli, Lactococcus lactis [9,22], Kluyvermyces Lactics, Methylomonassp, Micrococcus glutamicus, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Serratia marcescens var kiliensis, Vibrio fischeri [69], Torulopsis glabrata…, các nấm men có khả năng sinh methionin là: Candida boidinii, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae [60], ngoài

ra một số loại tảo lục, xạ khuẩn…cũng có khả năng sinh methionin Trong các

vi sinh vật kể trên C glutamicum, E.coli sinh tổng hợp methionin cao và được

ứng dụng phổ biến để sản xuất methionin ở qui mô công nghiệp [24]

C glutamicum thuộc họ vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, không có khả

năng di động, không bào tử Tế bào hình que hoặc hình gậy, hình dạng không

đều đặn và tạo chuỗi ngắn Kích thước tế bào thường 0,5-1,0 x 1,5-2,0 àm Khi nhuộm tế bào bắt màu không đều đặn, đôi khi chỉ những tiểu hạt trong tế bào bắt màu Khi nuôi cấy tế bào trên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp, khuẩn lạc C glutamicum có màu vàng chanh, bề mặt khuẩn lạc trơn bóng C glutamicum có khả năng sinh catalaza, lên men đường glucoza, phản ứng với

gelatin, phản ứng khử nitrat thành nitrit, không có khả năng lên men đường lactoza [21,76,83,86]

Hình thái chủng C glutamicum tự nhiên dưới kính hiển vi điện tử

1.2.2 Vai trò của C glutamicum trong sinh tổng hợp axit amin

Nhiều vi sinh vật khác nhau, trong quá trình sống có khả năng tích tụ trong tế bào hoặc tiết ra môi trường xung quanh một lượng axit amin nhất

định Tuy nhiên rất hiếm những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit amin cao Vì vậy các chủng dùng trong sản xuất axit amin đều là các chủng

đột biến (đột biến ngẫu nhiên hay đột biến nhân tạo) có nhiều thay đổi về bản chất trao đổi chất so với các chủng tự nhiên Bằng các tác nhân gây đột biến, người ta không những đã nâng cao khả năng tổng hợp axit amin mà còn thu

được nhiều chủng có thể sử dụng các nguyên liệu khác nhau như: đường tinh khiết, rỉ đường, dịch thuỷ phân gỗ, hydri và parafin để sản xuất axit amin

Đặc biệt Corynebacterium và Brevibacterium có khả năng phát triển tốt

trong môi trường giàu cacbon và nghèo nitơ ở đây sự phá vỡ cân bằng trao

đổi cacbon và đồng hoá nitơ dẫn đến sự hình thành một lượng lớn axit amin, vượt quá xa so với nhu cầu của tế bào và axit amin này được tích luỹ trong tế

bào sau đó tiết ra ngoài môi trường Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp axit amin và thường xảy ra ở các vi sinh vật đã bị đột biến

1.3 Công thức cấu tạo, tính chất L- methionin

Methionin là axit amin có nhóm (-S-) và một nhóm cacboxyl (-COOH) trong phân tử [65] Công thức của methionin như sau:

+ Đóng vai trò trong quá trình tổng hợp protein

+ Là chất tiền glutathion, một tripeptit tham gia một loại phản ứng oxy hoá khử, bảo vệ tế bào khỏi sự oxy hoá mạnh

+ Là nhân tố cần thiết trong sự hình thành polyamin, có ảnh hưởng lớn

1.4 CƠ chế Sinh tổng hợp Axit amin

Quá trình sinh tổng hợp axit amin nói chung và L-methionin nói riêng

được điều khiển bằng cơ chế ức chế ngược ức chế ngược về căn bản là sản phẩm được sinh ra ở một nồng độ quá ngưỡng sẽ quay trở lại điều chỉnh và ức chế các enzym xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp axit amin đó Quá trình này gồm nhiều bậc enzym và sản phẩm cuối là axit amin hay nucleotit

Trong ức chế ngược, axit amin hay sản phẩm cuối cùng nào đó của quá trình sinh tổng hợp thường quay lại ức chế enzym đầu tiên của nhánh sinh tổng hợp axit amin đó Như vậy, sản phẩm cuối cùng được tích luỹ trong tế bào và quá trình tổng hợp nó bị ức chế và nếu sản phẩm cuối cùng được sử dụng thì quá trình tổng hợp được phục hồi (sơ đồ 1.1)

Sơ đồ 1.1: ức chế ngược của enzym hoạt động

Các enzym hoạt động (dị lập thể) chịu trách nhiệm về sự ức chế bằng sản phẩm cuối cùng hay ức chế ngược, hoạt tính của chúng bị giảm do sản phẩm cuối cùng Ngoài vị trí phản ứng với cơ chất, chúng còn có một vị trí khác đối với sản phẩm cuối cùng gọi là trung tâm dị lập thể Hai vị trí phản ứng tách biệt nhau về không gian và khác nhau về cấu trúc, cũng như vậy cơ

Nguyên liệu sản xuất

Sản phẩm cuối cùng

chất của enzym và sản phẩm cuối cùng của chuỗi sinh tổng hợp có cấu trúc khác nhau [Sơ đồ 1.2] Ngoài ra cần lưu ý rằng các enzym dị lập thể bao gồm nhiều dưới đơn vị giống nhau Trạng thái hoạt động của enzym đặc trưng ở chỗ nó có thể phản ứng với cơ chất, nên bên cạnh cơ chất còn xuất hiện sản phẩm cuối cùng như một chất hiệu ứng dị lập thể, do vậy mà trung tâm xúc tác

bị biến đổi không gian đến mức không thể phản ứng với cơ chất được nữa Một đột biến có thể làm cho protein enzym dị lập thể bị thay đổi bằng cách mất đi khả năng phản ứng với chất hiệu ứng nhưng vẫn còn hoạt tính xúc tác Một protein bị biến đổi như vậy vẫn còn hoạt động ngay cả khi có mặt sản phẩm cuối cùng dẫn đến sự tổng hợp thừa của sản phẩm cuối cùng tương ứng [1]

Sơ đồ 1.2: Mô hình cơ chế điều hoà hoạt tính enzym sinh tổng hợp

axit amin[1]

1.4.1 Sản xuất axit amin bằng con đường phân nhánh

Methionin, lysin, threonin, isoleucin được sản xuất từ một nhánh thuộc

họ aspartat của axit amin, sự sinh tổng hợp được điều khiển bởi mỗi thành

viên trong nhóm, chẳng hạn lysin, threonin … aspartat kinaza là enzym đầu tiên của con đường sinh tổng hợp amino axit từ nhánh aspartat Enzym này

đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các axit amin trên [34,41]. Trong khi đó valin, leucin được sản xuất bởi một nhánh khác của họ

pyruvat, còn tryptophan, phenylalanin, tyrosin lại được sản xuất do nhóm thơm Việc kiểm soát những quá trình này rất phức tạp vì chúng cần tạo ra nhiều sản phẩm nhưng không được làm ngừng toàn bộ quá trình sản xuất

Cơ chế kiểm soát con đường nhánh ở E coli thật sự phức tạp (sơ đồ 1.3)

[14,59,65] Trong con đường aspartat, mỗi sản phẩm sẽ bị kìm hãm hoặc ức chế bởi aspartat kinaza đầu tiên trong quá trình sản xuất Một sản phẩm không làm kìm hãm hoạt lực kinaza do 3 isozym khác nhau (enzym khác nhau xúc tác phản ứng hoá học như nhau) của aspartat kinaza, mà mỗi loại aspartat kinaza sẽ

bị ức chế bởi một sản phẩm tạo thành: aspartat kinaza I bị ức bởi theonin và isoleucin, aspartat kinaza II bị ức bởi methionin và aspartat kinaza III bị ức bởi lysin [33,34,48] Hơn nữa, E coli có thể điều chỉnh hỗn hợp không cân bằng

trong quá trình sản xuất Nếu sản xuất quá nhiều methionin thì sẽ ảnh hưởng

đến các sản phẩm khác như: lysin, isoleucin, threonin Mỗi axit amin thường kiểm soát một enzym đầu tiên ở nhánh đặc trưng của nó

Sơ đồ 1.3: Điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp các axit amin họ aspartat ở

threonin được tạo ra sẽ ức chế homoserin dehydrogenaza, enzym tổng hợp methionin và threonin đầu tiên trong nhánh homoserin, còn sản phẩm isoleucin quá ngưỡng sẽ ức chế enzym đầu tiên của nhánh threonin [20,34]

Sơ đồ 1.4: Điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp các axit amin họ aspartat ở

chủng C glutamicum [20,33]

1.4.2 Con đường sinh tổng hợp methionin từ nhánh homoserin

Quá trình sinh tổng hợp methionin đã được nghiên cứu ở nhiều vi sinh vật Bước đầu tiên là sự acyl hoá homoserin được xúc tác bởi homoserin acetyl (hoặc succinul)-transferaza (sản phẩm metA), nhóm chuyển dịch acyl ở các vi sinh vật

khác nhau là khác nhau, trong đó cơ chất ở E coli là succinyl coenzym A

(succinyl-CoA), còn cơ chất ở một số loại vi khuẩn như: C.glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Leptospira meyeri, Brevibacterium flavum là acetyl-CoA Kết quả bước này tạo

sản phẩm O-acetylhomoserin hoặc O-succinylhomoserin, tuỳ thuộc vào mỗi loại vi sinh vật Sự hình thành homocystein từ O- acetylhomoserin (O-succinylhomoserin) có thể xảy ra theo hai con đường, con đường chuyển hoá sulfur và con đường sử dụng sulfur trực tiếp ở con đường chuyển hoá sulful, cystathionin được coi là một chất trung gian, sử dụng cystein là nguồn sulfur, còn con đường sử dụng sulfur trực tiếp không cần chất trung gian cystathionin, sử dụng sulfur vô cơ từ sulfat và cơ chất này không ảnh hưởng

đến hoạt tính của các enzym.Thông thường quá trình chuyển hoá sulfur được xúc tác bởi cystathionin γ- synthaza (sản phẩm của gen metB) và cystathionin β-lysaza (sản phẩm của gen met C), còn quá trình sử dụng surfur trực tiếp

được xúc tác bởi acylhomoserin sulfhydrylaza (sản phẩm của các gen metY

hoặc metZ) Bước cuối cùng là sự hình thành methionin từ homocystein được

xúc tác bởi homocystein methyltrasferaza được mã hoá bởi gen metE (hoặc

gen metH). Nhìn chung sự sinh tổng hợp methionin tuân theo một nguyên tắc

nghiêm ngặt và phụ thuộc vào sự biểu hiện của gen, hoạt tính enzym xúc tác

và nồng độ sulfur ở mỗi vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp methionin cũng

rất khác nhau (sơ đồ 1.5)[48,50,84]

Sơ đồ 1.5: Con đường sinh tổng hợp methionin ở các vi sinh vật khác nhau [48].

ở E.coli và các loài họ hàng, con đường sinh tổng hợp methionin được

biết sớm hơn Quá trình sinh tổng hợp theo con đường chuyển hoá sulfur Tất

cả các bước trao đổi chất diễn ra qua 13 gen met gọi là các đơn vị điều hoà

met ở E.coli gen metA mã hoá homoserin succinyl xúc tác cho việc chuyển

hoá homoserin thành O-acetyl homoserin [79]. Đây là gen mã hoá enzym

đầu tiên trong con đường sinh tổng hợp methionin từ nhánh homoserin

[85].

ở C glutamicum quá trình sinh tổng hợp methionin theo cả hai con

đường chuyển hoá sulfur và sulfur trực tiếp được xúc tác bởi các enzym khác nhau [48], quá trình sinh tổng hợp ở cả hai con đường có ý nghĩa như nhau Sự sinh tổng hợp methionin có liên quan mật thiết đến 4 gen chính là metA, metB, metC và metY mã hoá cho các enzym theo thứ tự là homoserin

acetyltranferaza, cystathionin γ-synthza, cystathionin β –lyaza và acetyhomoserin sulfhydrylaza [48,50] Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp này còn chịu ảnh hưởng của nồng độ methionin và chất đồng đẳng SAM (S-

O-adenosylmethionin) có trong môi trường sinh trưởng và phát triển [33] Trong quá trình sinh tổng hợp methionin, sự ức chế hoạt động enzym bởi methionin

và SAM ở các vi sinh vật là khác nhau (bảng 1.1) ở C glutamicum hoạt lực

homoserin acetyltransferaza bị kìm hãm bởi nồng độ methionin hoặc SAM quá ngưỡng [36,53,54] Bên cạnh đó, nhiều tác giả cho rằng homocystein và cystein cũng kìm hãm hoạt động của homoserin acetyltranferaza Cystathionin γ-synthaza bị ức chế bởi SAM, nhưng nồng độ methionin không bị ảnh hưởng Cystathionin β–lyaza bị ức chế bởi cystein nhưng không bị ảnh hưởng bởi methionin và SAM O-acetyhomoserin sulfhydrylaza không bị ức chế bởi SAM và cystein nhưng bị ức chế bởi methionin ( sơ đồ 1.6)

Sơ đồ 1.6: Các enzym điều khiển quá trình sinh tổng hợp methionin

ở C glutamicum [33]

(1) Aspartat kinaza, (2) aspartaldehit dehydrogenaza, (3) homoserin dehydrogenaza, (4) homoserin O-acetyltransferaza, (5) O-acetylhomoserin (thiol)-lyaza (cystathionin γ -synthaza), (6) cystathionin γ-lyaza, (7)

homoserin S-methyltransferaza ( mã hoá met H có hoặc không có vitamin

B12), (8) homoserin kinaza, (9) threonin synthaza, (10) O-acetylhomoserin sulfhydrylaza, (11) serin hydrooxymethyl transferaza

Bảng 1.1: ảnh hưởng của các enzym đến sự ức chế sinh tổng hợp methionin [33]

Enzym

Chất ức chế sinh tổng hợp methionin

Gen tương ứng

Methionin metL Methionin

Aspartaldehit dehydrogenaza Methionin Asd Methionin + Lysin

+ Threonin Aspartat kinaza II (Bacillus

-metA Methionin

Homoserin O- acetyl transferaza

(C glutamicum và B flavum)

Methionin + S adenosylmethionin

-metA Methionin

Cystathionin-γ-synthaza - metB Methionin

β-cystathioninsaza - metC Methionin

Cystathionin –β-lyaza - - Methionin

O-acetylhomoserin (thiol)-lyaza - - S-adenosyl

-methionin Homocystein S-methyltransferaza

(không phụ thuộc vitamin B12)

- metE S-adenosyl

-methionin Homocystein S-methyltransferaza

(phụ thuộc vitamin B12)

men

methionin

S-adenosyl Methionin

1.4.3 Thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy cho sản lượng methionin cao

Để thu được hàm lượng methionin cao, cần tìm được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy C glutamicum thích hợp Trong quá trình nuôi

cấy vi khuẩn này, hàm lượng biotin rất cần cho quá trình tạo sinh khối, ngoài

ra tỷ lệ cacbon/nitơ cũng đóng vai trò quan trọng trong con đường sinh tổng hợp methionin Nguồn cacbon được sử dụng để tạo methionin ở các chủng khác nhau cũng rất khác nhau Pham C.B.và cộng sự [66] đã sử dụng nước mía, chuối, sắn, rỉ đường và vỏ dừa làm nguồn cacbon trong sản xuất methionin Glucoza cũng được coi là nguồn cacbon phổ biến nhất [42] nhưng Banik A.K và cs [18] lại chứng minh rằng maltoza là nguồn cung cấp cacbon tốt nhất trong sản xuất methionin Một vài nghiên cứu khác lại sử dụng methanol và n-alkanes như là nguồn cacbon chính [33,81]

Nguồn Nitơ được sử dụng trong sản xuất methionin bao gồm cả nitơ hữu cơ và vô cơ như: ure, ammonium nitrat, ammonium sulfat, ammonium dihydrogen phosphat, ammonium chlorit, sodium nitrat, ammonium acetat, ammonium tartarat, ammonium citrat và ammonium oxalat Mondal S và cs [56] đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ biotin khác nhau

đến sản xuất methionin, các tác giả này nhận thấy hàm lượng methionin đạt cao nhất khi sử dụng ammonium nitrat ở nồng độ 60mM và biotin 5àg/l Có nhiều nghiên cứu đã sử dụng nước chiết nấm men làm nguồn nitơ để sản xuất methionin nhưng đều không thu được kết quả tốt, bởi trong dịch chiết nấm men có nhiều loại axit amin bao gồm cả methionin và nếu vi sinh vật được cung cấp methionin trong môi trường nuôi cấy nó sẽ kìm hãm sự sản xuất axit amin này [33,63] Một nhân tố quan trọng khác trong sản xuất axit amin là sự tiết ngoại bào Nói chung vi sinh vật không tiết axit amin là do có sự ức chế ngược hay kìm hãm trong đột biến bền không xảy ra trong tế bào Việc sản xuất và tiết ra môi trường một lượng lớn axit amin còn phụ thuộc vào tính

thấm của tế bào Sản xuất axit amin từ C glutamicum ở qui mô công nghiệp

cần bổ sung vitamin biotin, nhân tố cần thiết trong sinh tổng hợp axit béo Sự thiếu biotin đã làm tổn thương màng tế bào và tạo điều kiện cho các axit amin nội bào được tiết ra ngoài môi trường

Ngoài nguồn cacbon, nitơ và biotin ra, các nguồn khoáng, vitamin và ion kim loại cũng đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng, phát triển và sản xuất methionin Trong đó ion kim loại giúp cho sự hoạt động của enzym [12,16] sản xuất methionin cao nhất khi dùng sodium sulfat là nguồn sulfur,

Fe2+, Mn2+ là nguồn ion kim loại và cyanocobalamin là nguồn vitamin tốt nhất

Kase H và CS [43] đã đưa ra thành phần môi trường thích hợp cho sản xuất methionin gồm: 10% glucoza, 2% (NH4)2SO4, 0.05% K2HPO4, 0.05%

KH2PO4, 0.1% MgSO4.7H2O, 0.001% FeSO4 7H2O, 0.001% MnSO4.4H2O, 100àg/l biotin và 2% CaCO3 Trong khi đó Banik A.K và cs [19] cũng đã thu

được hàm lượng methionin 4,5g/l trong môi trường có: 5% maltoza, 0.8% ammonium, 0.1% K2HPO4,0.03% MnSO4.7H2O, 1mg/lNa2MoO4 2 H2O, 5mg/l FeSO4 7H2O và 1mg/l biotin ở pH=7 Ghosh B.B và CS [68] đã nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất đến sự thẩm thấu của tế bào và cho rằng hợp chất này không ảnh hưởng đến tăng hàm lượng methionin Sharma H.L và cs [77]

đã chứng minh ảnh hưởng của oxy đến sự lên men axit amin và cho rằng: nồng độ oxy hoà tan 40% là thích hợp nhất để sản xuất methionin

Đối với những chủng đột biến trợ dưỡng dùng trong sản xuất methionin, ngoài các thành phần nêu trên, quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng còn cần đến hàm lượng cystein và các axit amin như lysin, threonin…[33] Trong lên men sinh tổng hợp methionin không bổ sung cystein và dùng đột biến thể từ chủng C lilium chỉ cho sản lượng methionin là 2.34g/l, nhưng khi

bổ sung 0.75g/l cystein thì sản lượng methionin đạt 3.39g/l [26]

Nhiệt độ nuôi cấy và sinh tổng hợp methionin dao động từ 20-450C tuỳ thuộc vào từng loại vi sinh vật Thời gian nuôi cấy được kéo dài cho đến khi

đạt lượng sản phẩm cao nhất, thường từ 10-160 giờ [81] Đối với chủng B linens nhiệt độ tối thích cho sự tạo sinh khối là 250C,còn nhiệt độ tối ưu cho việc tạo methionin là 300C, với tốc độ cánh khuấy là 200v/ph, trong thời gian

70 giờ [64] Nhiệt độ tối thích cho sinh tổng hợp methionin ở C glutamicum

là 300C, sinh khối phát triển cực đại ở 24 giờ, sản lượng methionin đạt cực đại

ở 72 giờ

1.4.4 Tạo chủng đột biến để sản xuất methionin

Các cơ chế điều hoà trao đổi chất có thể bị thay đổi do những đột biến dẫn đến sự tổng hợp thừa các chất trao đổi Ngoài một trung tâm xúc tác để phản ứng với cơ chất enzym còn có một trung tâm dị lập thể dùng vào việc

điều hoà Phản ứng của sản phẩm cuối cùng (chất hiệu ứng dị lập thể) với trung tâm dị lập thể làm thay đổi cấu trúc của enzym, từ đó dẫn đến sự “đóng” trung tâm xúc tác Nhờ đột biến mà trung tâm dị lập thể có thể biến mất và do vậy sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng bị loại trừ

Để phá vỡ cơ chế ức chế ngược, cần tạo những đột biến sai hỏng về di truyền như: sai hỏng trong sự tạo thành sản phẩm cuối cùng nhờ khuyết một enzym (các thể đột biến trợ dưỡng) bằng cách bổ sung hạn chế sản phẩm cuối cùng, sinh trưởng sẽ xảy ra song sự tích luỹ nội bào của chất trao đổi gây ra sự

ức chế trở lại bị ngăn cản Sai hỏng về điều hoà: có thể sai hỏng trong trung tâm điều hoà của enzym dị lập thể hoặc sai hỏng cơ chế kiềm chế do một đột biến của gen điều hoà hay gen operator Kết quả là gây ra sự tổng hợp enzym một cách cấu trúc Một mặt, những đột biến có thể đụng chạm đến gen kiềm chế dẫn tới một sai hỏng của chất kiềm chế hoặc làm biến mất nó, hay mặt khác đụng chạm đến gen điều khiển và làm cho gen này mất khả năng tác

dụng với chất kiềm chế…Thông thường những đột biến như vậy dẫn đến sự tổng hợp thừa các enzym sinh tổng hợp nên có sự tổng hợp thừa các axit amin

Để chọn lọc các đột biến thể, có hai phương pháp thích hợp: phương pháp dùng chất chống trao đổi và phân lập các thể hồi biến từ các thể đột biến trợ dưỡng, từ đó gây tạo các chủng đột biến có năng xuất cao để sản xuất axit amin [1]

James Gomes và cs [33,47] đã tiến hành gây đột biến chủng

C.glutamicum theo các con đường sau: (1) đột biến gen điều khiển sinh tổng

hợp methionin, kết quả không ức chế ngược được những enzym sinh tổng hợpmethionin (2) Đột biến gen cấu trúc mã hoá cho enzym bị ức chế bởi sản phẩm cuối cùng, kết quả mất cơ chế ức chế ngược (3) Đột biến gen cấu trúc mã hoá enzym thẩm thấu qua màng tế bào của amino axit, kết quả làm giảm khả năng ức chế ngược … Nhờ vậy, đã tạo được những chủng đột biến C glutamicum có lượng methionin dư thừa không ức chế ngược đến homoserin

dehydrogenaza, chủng đột biến này sẽ cho năng suất methionin cao hơn chủng

tự nhiên Theo phương pháp này, đầu tiên cần có chủng bố mẹ đột biến để làm tăng tần số đột biến Do sản phẩm đột biến bằng vật lý và hoá học là không

đặc hiệu, cần phải tách những đột biến không liên quan, gây bất lợi cho sinh vật và làm chậm sự phát triển trong nuôi cấy hay làm giảm tế bào

1.4.5 Thu hồi methionin từ lên men lỏng

Tuỳ vào mục đích sử dụng mà người ta có thể thu hồi L-methionin bằng các phương pháp khác nhau Bước đầu tiên của công đoạn thu hồi là ly tâm hoặc sử dụng màng lọc để loại bỏ tế bào từ dịch lên men Dịch lên men được cho đi qua cột sắc ký trao đổi ion Quá trình này được lặp lại cho tới khi lượng methionin được hấp thụ hoàn toàn trên cột Sau đó rửa cột bằng nước khử ion

và thu hồi methionin bằng NH4OH1M Ngoài ra, còn có một số phương pháp

khác để thu hồi L-methionin là cô chân không, tủa bằng cồn kết hợp làm khô qua đêm ở 40C…[33]

1.5 Vai trò sinh học và ứng dụng Methionin trong cuộc sống

Methionin có trong tất cả các protein quan trọng của cơ thể động vật, những cơ thể không thể tự tổng hợp được và không thể thay thế nó bằng những axit amin khác Vì vậy nó được gọi là axit amin không thay thế Methionin

ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, sự hoạt động của gan, điều hoà hoạt động của tuyến giáp, khử các chất độc trong cơ thể Methionin còn có thể thay thế được lượng cystin còn thiếu trong thức ăn gia súc Methionin ở mức độ đáng kể có thể thay thế được vitamin cholin là vitamin đóng vai trò quan trọng trong vỗ béo gia cầm và lợn Các axit amin bắt buộc phải có trong thức ăn của tất cả các loài động vật, trừ động vật nhai lại đã trưởng thành ở các loài nhai lại này, các axit amin không thay thế được cung cấp bởi các vi sinh vật tổng hợp ở dạ cỏ Vì vậy, đối với lợn và gia cầm người ta đã quan tâm nhiều đến cân đối các axit amin, đặc biệt là methionin và lysin trong thức ăn nuôi dưỡng [37] Cân đối methionin trong khẩu phần thức ăn có ý nghĩa quan trọng vì methionin là một axit amin chứa lưu huỳnh là nguồn nguyên liệu cần thiết cho sự sinh trưởng Nhiễm mỡ ở gan là một trong những triệu chứng điển hình nhất do thiếu methionin trong khẩu phần thức ăn, bệnh này có thể chữa khỏi khi khẩu phần thức ăn chứa nhiều axit amin này Thiếu methionin trong thức ăn làm ảnh hưởng đến quá trình đẻ trứng và tạo sắc tố lông ở lợn, gà, vịt Methionin còn góp phần ức chế sự phát triển của khối u [12,28,80] L-methionin còn có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại sự oxy hoá gây tổn thương da [40]

Sự cân đối methionin trong khẩu phần ăn có thể bị phá huỷ không chỉ

do thiếu mà còn do dư thừa Thừa methionin có thể làm giảm khá mạnh tốc độ sinh trưởng của động vật, trong trường hợp này methionin như là chất độc trong trường hợp đó Triệu chứng của ngộ độc methionin là giảm cân, kém ăn

và kém đồng hoá thức ăn và các biến đổi bệnh lý của lá lách, tuyến tuỵ, gan, thận, ruột non Có thể giảm những ảnh hưởng do dư thừa methionin bằng cách

bổ sung vào khẩu phần thức ăn arginin hoặc xerinin hoặc glucoxiamin, đặc biệt glixin và hỗn hợp glixin-arginin rất có hiệu quả

Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã xác nhận vai trò quyết định của methionin trong hàng loạt các chức năng sinh lý khác như tham gia vào sự trao đổi selen, cholesterin và trong việc hình thành các hoocmon sinh trưởng, hoocmon adrenotropic ở phần trước của thuỳ não Methionin cũng rất cần thiết

để duy trì trạng thái bình thường của hệ thần kinh Methionin chứa nhóm chức lưu huỳnh đặc biệt quan trọng đối với súc vật non trong quá trình tăng trưởng Chính vì vậy mà ở các nước phát triển đã có cơ sở sản xuất methionin để bổ sung vào hỗn hợp thức ăn gia súc ứng dụng của methionin vào chăn nuôi đã mang lại hiệu quả kinh tế rất cao Hàng loạt các thí nghiệm ở Liên Xô (cũ) và các nước có ngành chăn nuôi phát triển khác chứng minh rằng khẩu phần thức

ăn chăn nuôi được bổ sung methionin có tác dụng sinh học rất mạnh ở một

số nước, để nuôi béo gà con và lợn người ta làm giàu hầu như tất cả các hỗn hợp thức ăn bằng methionin Methionin cung cấp hoàn thiện cấu trúc và điện sinh học cisplatin ototoxicity trong lông sóc sin sin [45] Khi không bổ sung methionin, trọng lượng gà mái 70 ngày tuổi là 1206 gam, gà trống đạt 897 gam Khi bổ sung methionin thì gà mái đạt 1310 gam, gà trống đạt 1072 gam, chi phí thức ăn cho một đơn vị tăng trọng giảm 7% đến 9% ở lứa tuổi rất sớm, gia cầm cần một lượng lớn các axit amin chứa lưu huỳnh đặc biệt là methionin để mọc lông nhanh, vì lông vũ có chứa tới 10% cistin Đối với gia cầm còn nhỏ, có lượng lông phủ tương đối lớn hơn trên một đơn vị khối lượng

đòi hỏi nhiều methionin và cistin hơn, nó chiếm 4,5% so với protein Với những lợi ích như trên, nên việc sử dụng methionin vào chăn nuôi là quan trọng và rất cần thiết

1.6 Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để tăng sản lượng methionin

Mặc dù việc tạo ra các chủng đột biến có khả năng đề kháng với chất

đồng đẳng của methionin đã khắc phục được cơ chế ức chế ngược, giúp cho sản xuất methionin tăng cao, nhưng quá trình ức chế ngược này ít nhiều vẫn

có xu hướng xảy ra, làm hạn chế sự tăng sản lượng methionin Việc tách dòng, biểu hiện gen metA bằng các promotor mạnh đã giúp khắc phục được hiện

tượng nêu trên và làm tăng đáng kể sản lượng methionin [79]

1.6.1 Những nghiên cứu về methionin ở mức độ phân tử và vai trò met A

trong con đường sinh tổng hợp methionin

Để tăng sản lượng methionin, hiện nay công nghệ gen đã tìm được yếu tố làm tăng khả năng sinh tổng hợp methionin của chủng C glutamicum Soo

Dong Park và cs [79] đã tiến hành tách dòng và xác định trình tự gen met2 là

gen mã hoá homserin O-transacetylaza, một trong những enzym của con đường sinh tổng hợp methionin Cũng trong thời gian này đã có nhiều phát hiện về con

đường aspartat để sản xuất methionin Quá trình sinh tổng hợp methionin có liên quan mật thiết đến 4 gen chính đã phân lập được từ C glutamicum là met A, met

B, met C và metY mã hoá cho các enzym xúc tác tương ứng là homoserin

acetyltranferaza, cystathionin γ-synthaza, cystathionin β–lyaza và acetyhomoserin sulfhydrylaza [48,50] Trong đó homoserin acetyltranferaza

O-được mã hoá bởi gen metA có ảnh hưởng lớn nhất đến sinh tổng hợp

methionin Trong quá trình sinh tổng hợp methionin từ chủng C.glumtamicum,

gen metA là gen đầu tiên của nhánh homoserin và là protein chịu nhiệt Khả

năng chịu nhiệt của metA có ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý tế bào

và kỹ thuật sinh học phân tử [48]

Soo Dong Park và cs [79] đã tách dòng gen metA từ chủng C glutamicum và đưa vào biểu hiện lại trong chính C glutamicum Kết quả đã

làm tăng hoạt tính enzym xúc tác và sản lượng axit amin cũng tăng lên 10 lần

so với chủng tự nhiên

Khi sản lượng axit amin thấp, việc khuyếch đại các gen sinh tổng hợp axit amin nhờ phương pháp DNA tái tổ hợp sẽ cho sản lượng cao hơn và hoàn thiện chủng giống Hơn nữa, khi khuếch đại một gen thì cũng có thể khuếch đại đồng thời hai hay nhiều gen có liên quan tới quá trình sinh tổng hợp L-methionin ở chủng C glutamicum

Số chủng vi sinh vật có khả năng sinh axit amin thì nhiều, nhưng việc xác định và sàng lọc chính xác chủng có mang gen met A mong muốn là một

vấn đề rất quan trọng, nó làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu tiếp theo đối với những gen met A này như: tách dòng, tạo những chủng C glutamicum tái tổ

hợp có khả năng sản xuất L-methionin cao, sử dụng kỹ thuật đột biến với các gen này nhằm nâng cao khả năng sing tổng hợp L-methionin và tạo được chủng siêu sản xuất

1.6.2 Vectơ sử dụng cho tách dòng

Mục đính của việc tạo dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong một thư viện gen dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm, tức là tập hợp vi khuẩn cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vectơ tái tổ hợp cần tìm Do vậy, điều quan trọng nhất của vectơ tách dòng là phải dễ biến nạp vào tế bào chủ, đồng thời dễ dàng nhận biết sự tồn tại của vectơ tái tổ hợp

Tuỳ thuộc vào kích thước các đoạn DNA muốn tạo dòng và mục đích tạo dòng mà chọn lọc vectơ thích hợp Thông thường với các đoạn DNA không quá lớn (dưới 10kb) thì plasmit là vectơ tách dòng được sử dụng thông dụng nhất, tế bào tiếp nhận là tế bào vi khuẩn Hiện nay người ta thường sử

dụng vectơ pCR 2.1 (Sơ đồ 1.7) để tách dòng, vectơ này có các đặc tính sau

đây:

+ Vectơ pCR 2.1 là một vectơ nhân tạo dạng 2, có kích thước 3,9kb đã

được mở vòng, đặc biệt ở đầu 3’ – OH có nhô ra một nucleotit loại T Đây chính là điểm thuận lợi trong việc tạo vectơ tái tổ hợp đối với những sản phẩm của phản ứng PCR sử dụng enzym tổng hợp là Taq-polimeraza Với loại enzym tổng hợp này, sản phẩm PCR sẽ có một nucleotit loại A thừa ra ở đầu tận cùng 3’, dễ dàng bắt cặp bổ sung với pCR2.1 [51]

Đây là loại vectơ có hiệu quả tách dòng sản phẩm PCR rất cao Vectơ pCRTM2.1 được thiết kế có gắn một operon chuyển hoá đường lactoza là operon-lac Tại vùng ranh giới giữa promotơ của operon này và gen cấu trúc mã hoá cho β- galactosidaza có vùng cắt gắn đa vị với các vị trí cắt cho các enzym giới hạn : Hind III, Kpn I, Sac I, Bam H I, Spe I, BstX I, EcoR I, EcoR

V, Not I, Xho I, Nsi I, Xba I, và Apa I Trong đó EcoR I và BstX I là các vị trí

cắt kép, giúp cho việc kiểm tra sản phẩm DNA mới đính thêm vào vectơ một cách dễ dàng vì chỉ cần sử dụng một trong số 2 enzym này để xử lý vectơ tái

tổ hợp thì đoạn DNA ngoại lai mới đính thêm vào vectơ sẽ tách ra khỏi vectơ

Ngoài ra, vectơ pCRTM2.1 có chứa gen kháng chất kháng sinh ampixilin

và kanamixin Nhờ đó mà tế bào vi khuẩn E coli chứa vectơ này có thể sinh

trưởng bình thường trên môi trường có chứa ampixilin hoặc kanamixin với nồng độ ức chế tối thiểu Đây là dấu chuẩn cần thiết cho việc chọn các tế bào

vi khuẩn chứa vectơ

Sơ đồ 1.7: Sơ đồ cấu trúc và các vị trí cắt của vectơ pCR 2.1

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các thí nghiệm của luận văn được tiến hành tại Bộ môn Vi sinh, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch và Viện Công nghệ sinh học, Viện hàm lâm khoa học và Công nghệ Việt nam

- 450 mẫu đất thu thập từ các tỉnh miền Bắc Việt Nam dùng làm nguồn vật liệu cho việc phân lập và chọn lọc các chủng C glutamicum có khả năng

sinh tổng hợp methionin cao.

2.2 Vật liệu

2.2.1 Sinh phẩm

- Vectơ tách dòng plasmid pCRđ 2.1 (hãng Invitrogen) [51].

- Enzym: enzym giới hạn EcoRI của hãng Bio-Labs Anh Quốc,

Taq-polymeraza của hãng Parkin Elmer, Phosphataza kiềm (Amersham), T4-DNA ligaza (Amersham), Ribonucleaza (Sigma)…

2.2.2 Hoá chất

Các hoá chất cho tách DNA, điện di DNA, điện di protein: MgCl2, HCl (pH8,8), ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), NaCl, β-mercaptoetanol, sodium dodecyl sulphate (SDS), kali axetat, natri axetat, etanol 100%, phenol, chlorofoc: isoamylalcohol (24:1), agaroza, NaOH, nitơlỏng và ethydium bromit (EtBr), 4 loại deoxiribonucleotit triphosphat (dNTP)

- Dung dịch đệm 3: Kali-axetat 5M: 60ml; axit axetic:11,5ml; Nước: 28,5ml

- Dung dịch đệm điện di TAE 5X dùng cho điện di DNA: Tris base:121g; axit

acetic glacial: 28,6ml; EDTA 0,5M (pH 8,0): 50ml; nước khử ion vừa đủ: 500ml

- Dung dịch đệm tra mẫu DNA (loading bufer) 5X: Tris HCl 1M (pH=8,0): 1ml; EDTA 0,5M (pH=8,0): 0,2ml; glycerol: 2ml; bromphenol blue 1%: 2ml

- Dung dịch Ethydium Bromid (EtBr): dung dịch mẹ 10mg/ml (Hoà tan 1g EtBr vào100ml H2O, giữ trong tối ở nhiệt độ phòng Khi dùng pha 2àl dung dịch mẹ trong 100ml đệm TAE 1 lần)

2.2.3 Môi trường

a Môi trường GM dùng làm giàu các chủng C glutamicum (g/l): Glucoza 10,

KH2PO4 2H2O 0.75, K2HPO4 0.75, MgSO4 7H2O 0.1, Dung dịch vi lượng100 àl

Thành phần dung dịch vi lượng (g/l): CaCl2: 0,368; CuSO4.5 H2O: 0,624; FeSO4 7H2O: 0,604; MnSO4.4H2O: 0,594; ZnS04.7H2O: 0,422; CoCl2.6H2O: 0,788; NaMoO4: 0,696; Thạch:15; pH 7,0, 1atm/45phút

b Môi trường chọn lọc D2 dùng để phân lập và giữ giống (g/l): Glucoza: 10,

LiCl: 5, đậu tương thuỷ phân: 4, nước chiết nấm men: 2, Tris amino- methan.HCl: 1,2, NH4Cl: 1, MgSO4:0,3, Polymicin sulfat: 10ml, NaN3:10ml, thạch: 15; pH 7,0 ±2, 1atm/45phút

c Môi trường lên men MT3 (g/l): Rỉ đường: 80, cystein: 0, 75, K2HPO4: 0.5,

KH2PO4: 2, (NH4)2SO4: 0.25, MgSO4.7H2O: 0.01, MnSO4.4H2O: 0.01, CaCO3:

20, biotin: 50àg/l, thiamin hydrochloride: 2mg/l; pH =7,2, 1atm/45phút

d Môi trường LB (Lauria Betani) (g/l): dùng để nuôi cấy E coli cho mục đích

tách chiết DNA: Cao nấm men: 10, Trypton: 10, NaCl: 10; pH 7,4, 1atm /30 phút Đối với môi trường thạch, cần bổ sung 2% agar

2.2.4 Trang thiết bị

- Máy móc: Máy li tâm lạnh (Avanti TM 30 Centifuge Beckman), bộ điện di DNA (Bio-Rad), bể ổn nhiệt (Techne, OSI), máy lắc ổn nhiệt (Metler), máy PCR Biorad, USA, tủ lạnh sâu -20 oC, -85 oC (Sanyo, Nhật bản), máy quang phổ quét hai chùm tia Phoenic 2000 PC (England), máy soi chụp ảnh gel (Pharmacia), máy xác định trình tự DNA tự động (Pharmacia), tủ hốt vô trùng

- Bình tam giác 500ml, phiễu, hộp lồng, ống nghiệm các loại, ống đong, pipet các loại …

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu

Lựa chọn các loại đất tơi, xốp có độ thoáng khí cao, có thể là đất giầu dinh dưỡng hoặc đất nghèo dinh dưỡng Dùng dao để cạo bỏ lớp đất bề mặt (chiều sâu khoảng 4 - 5 cm) lấy 20 - 30 g cho vào túi nilon, đánh dấu mẫu đất theo loại đất, vùng đất, địa điểm, ngày lấy mẫu

2.3.3 Phương pháp phân loại các chủng C.glutamicum

Tiến hành theo khóa phân loại của Bergey [21]