Nghiên cứu môt vài giải pháp kỹ thuật để sản xuất nước bưởi chất lượng cao Nghiên cứu môt vài giải pháp kỹ thuật để sản xuất nước bưởi chất lượng cao

Nghiên cứu môt vài giải pháp kỹ thuật để sản xuất nước bưởi chất lượng cao Nghiên cứu môt vài giải pháp kỹ thuật để sản xuất nước bưởi chất lượng cao Nghiên cứu môt vài giải pháp kỹ thuật để sản xuất nước bưởi chất lượng cao luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Việt Nam là nước nông nghiệp, tuy nền kinh tế chưa phát triển nhưng có rất nhiều tiềm năng Để xóa đói giảm nghèo, thay đổi cơ cấu cây trồng, vật nuôi đưa nền kinh tế quốc dân phát triển, nhiệm vụ cấp bách hàng đầu mà Đảng và Nhà nước đặt ra hiện nay là tăng diện tích và năng suất trồng trọt, biến các sản phẩm nông nghiệp thành hàng hóa phục vụ cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu

Ở Việt Nam cây bưởi được trồng từ đồng bằng, trung du, đến đồi núi trên khắp các tỉnh từ Bắc chí Nam Hiện nay cả nước có hơn 25.000ha trồng bưởi với rất nhiều giống quý trở thành các giống bưởi đặc sản, bản địa Tuy nhiên, quả bưởi

ở nước ta chủ yếu tiêu thụ ở dạng ăn tươi là chính Ở Việt Nam các sản phẩm nước quả ép nguyên chất chưa được sản xuất phổ biến bởi kỹ thuật chế biến còn đơn giản, sản phẩm chủ yếu ở dạng pha từ pure quả, chưa hấp dẫn người tiêu dùng

Trước kia nếu các đồ uống có ga chiếm ưu thế thì ngày nay đã dịch chuyển dần sang các sản phẩm đồ uống thiên về tự nhiên và có lợi cho sức khỏe như các sản phẩm nước ép trái cây Nhu cầu về các dạng đồ uống này ngày càng tăng lên

rõ rệt, nhóm người tiêu dùng được mở rộng từ nhóm người trẻ tuổi đến nhóm người có tuổi Các sản phẩm nước ép quả có hàm lượng đường thấp, calori thấp và chứa 100% nguyên liệu tự nhiên ngày càng được các nhà sản xuất quan tâm

Những năm gần đây, các nhà khoa học và các nhà sản xuất trên thế giới đã nghiên cứu về việc bao bọc các hợp chất gây đắng trong nước bưởi bằng cyclodextrin để đưa ra thị trường các sản phẩm 100% dịch bưởi đóng hộp không

bổ xung chất ngọt Để hòa đồng cùng xu thế phát triển khoa học của thế giới, để

đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng đề tài: “Nghiên cứu một vài giải pháp kỹ

thuật để sản xuất nước bưởi chất lượng cao ” cho luận án thạc sỹ kỹ thuật

2.Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nước bưởi giảm vị đắng

3.Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung sau:

- Nghiên cứu công nghệ sử dụng hệ enzim trích ly dịch quả Utral SP-L thủy phân tế bào tép bưởi để nâng cao hiệu suất trích ly dịch bưởi

4.Ý nghĩa khoa học

công nghệ sản xuất nước bưởi

5.Ý nghĩa thực tiễn

góp phần thúc đẩy công nghệ trồng trọt, phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững, hiện đại hóa nông thôn như Nghị quyết của đại hội Đảng đề ra

thể ứng dụng vào thực tế sản xuất

6.Đối tượng, thời gian và phạm vi nghiên cứu

Thực phẩm Hà Nội, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm –Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 Bưởi và ứng dụng trong đời sống

1.1.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây bưởi

Theo nhiều tài liệu bưởi có nguồn gốc từ Đông Nam Á, quần đảo Mã Lai

trị thực phẩm nhưng có thể trước hết là vì hương thơm của hoa bưởi

đi khắp các nước Đông Nam Á và các nhóm cây có múi khác đã được mang đến vùng Đông Nam Á bởi những người Trung Quốc đi lập nghiệp và được trồng rộng rãi ở các vùng này

Tên khoa học của bưởi là Citrus Grandis(L) Osb var Grand Người Pháp

gọi bưởi là Pamplemousse, người Anh và người Mỹ gọi là Pomelo, Grapefruit, shaddock

Ở Việt Nam các tỉnh trồng nhiều bưởi nhất là: Hà Nội, Phú Thọ, Nghệ Tĩnh, Huế, Đồng Nai, Bến Tre, Vĩnh Long với nhiều giống bưởi nổi tiếng như: Diễn, Đoan Hùng, Thanh Trà, Năm Roi, Da xanh…

1.1.2 Đặc tính sinh học của cây bưởi

Là giống cây trồng quan trọng ở Đông Nam Á Cây cao khoảng 5-15 mét thường có gai lớn (nhất là khi trồng hột), nhánh to có lông tơ Lá lớn, có cánh lá

to, phiến lá hình xoan tới bầu dục dạng quả tim, dài 5-20 cm, rộng 2-12 cm, mặt dưới gân chính thường có lông.[7]

Hình 1 1 Hoa và quả bưởi Năm Roi

Hoa lớn mọc đơn hay thành chùm, cánh hoa màu trắng kem 20-25 nhị đực, bầu noãn có 11-16 ngăn, mọc từ lách, thường là hoa lưỡng tính Cây thường tự thụ phấn và cho năng suất cao nhưng quả thường có nhiều hạt

Nhu cầu sinh thái: Cây bưởi có thể sống và phát triển trong khoảng nhiệt

cây sẽ bị chết; Về ánh sáng: cây không thích hợp với ánh sáng trực tiếp Cường độ ánh sáng thích hợp nhất là 10.000-15.000 lux (tương đương với ánh sáng lúc 8 giờ

nhiều về nước, nhất là thời kỳ cây ra hoa và phát triển quả; Về nhu cầu về đất: đất thịt pha, màu mỡ, thoát nước tốt, thoáng khí, pH từ 5-7 [5]

1.1.3 Đặc tính thực vật học của một số giống bưởi đang trồng ở Việt Nam

Bưởi Diễn:

Được trồng nhiều ở Phú Diễn, Phú Minh (Từ Liên, Hà Nội).Hiện nay được trồng nhiều ở Hoài Đức, Đan Phượng, Thanh Oai Bưởi Diễn có thể là một biến

dị của bưởi Đoan Hùng.Trái tròn, vỏ quả khi chín có màu vàng cam, trọng lượng

xanh, ăn ngọt, độ Brix từ 12 ÷ 14%.Thời gian thu hoạch thường muộn hơn bưởi Đoan Hùng, trước tết nguyên đán khoảng nửa tháng.[5]

Bưởi Phúc Trạch:

Có nguồn gốc ở xã Phúc Trạch, huyện Hương Khê, tỉnh Hà Tĩnh Hiện tại được trồng ở 28 xã trong huyện và các vùng lân cận.Bưởi Phúc Trạch được nhiều người đánh giá là một trong những giống bưởi ngon nhất cả nước.Quả hình cầu, hơi dẹt, vỏ quả có màu vàng, xanh Trọng lượng trung bình từ 1÷1,2 kg/quả.Màu sắc thịt quả và tép múi phớt hồng, vách múi giòn, dễ tách, thịt quả mịn, đồng nhất,

vị ngọt hơi chua Độ Brix từ 12 ÷ 14% Thời gian thu hoạch khoảng tháng 9 hàng năm.[7]

Hình 1.2 Hình ảnh bưởi Phúc Trạch

Bưởi Đoan Hùng:

ven sông Lô và sông Chảy Có hai giống được coi là tốt nhất: đó là bưởi Tộc Sửu (xã Chí Đám) và bưởi Bằng Luân (xã Bằng Luân) Bưởi Bằng Luân quả hình cầu, hơi dẹt, trọng lượng trung bình 0,7 ÷0,8 kg/quả, vỏ quả màu vàng hơi xám nâu, tép

Bưởi Tộc Sửu quả lớn hơn, trọng lượng trung bình từ 1÷1,2 kg/quả Thịt quả ít nhão hơn giống bưởi Bằng Luân, vị ngọt lạt và có màu trắng xanh Thu hoạch sớm hơn bưởi Bằng Luân khoảng nửa tháng

Hình 1.3 Hình ảnh quả bưởi Bằng Luân Hình 1.4 Hình ảnh quả bưởi Tộc Sửu

Bưởi Da Xanh:

tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long Quả có hình cầu, vỏ quả có màu xanh đến khi chín, tép múi có màu hồng đỏ,nước quả nhiều, vị ngọt, không the đắng, nhược điểm của quả là có nhiều hạt

Hình 1.5 Hình ảnh bưởi Da Xanh

Bưởi Năm Roi:

Được trồng khá tập trung ở huyện Bình Minh (Vĩnh Long) và khá nhiều ở các tỉnh Cần Thơ, Tiền Giang, Bến Tre…Trong quá trình chọn lọc giống Viện Nghiên cứu cây ăn quả miền Nam đã lựa chọn được một số cá thể bưởi Năm Roi

Bưởi đường lá cam:

Được trồng nhiều ở huyện Vĩnh Long (Đồng Nai) và Tân Uyên (Bình Dương), Dạng quả khá đẹp, phẩm chất ngon được thị trường trong và ngoài nước

ưu chuộng Quả có trọng lượng trung bình từ 0,8÷1,2 kg/quả Dạng quả có hình lê thấp,vỏ quả khi chín có màu vàng xanh, láng nhẵn và tróc rất tốt, các con tép bó chặt, vị ngọt, ngon Nhưng lại có nhược điểm là khá nhiều hạt.[5]

Bưởi Quế Dương

Được trồng nhiều ở xã Cát Quế -Hoài Đức Cây bưởi Quế Dương có bộ lá

to, xanh đậm che cho quả ít bị xém nắng và đặc biệt có hệ thân cành phát triển mạnh, có thể trồng để lấy bóng mát Cây bưởi khỏe, có khả năng chịu úng cao, chống chịu sâu bệnh tốt Quả có dáng tròn hơi dẹt, cùi mỏng Lúc chín có màu vàng đẹp, khá thơm Quả khá to trung bình 1,2-1,5 kg

Hình 1.6.Hình ảnh cây bưởi Quế Dương

1.1.4 Thành phần hóa học của quả bưởi

Thành phần hóa học của quả bưởi rất phong phú, bao gồm các chất vô cơ

và các chất hữu cơ.[5], [6], [7]

Các chất vô cơ:

Nước: Hàm lượng nước trong quả bưởi khá cao, các giống bưởi khác nhau thì có hàm lượng nước khác nhau, thường giao động trong khoảng từ 25-40%

khoáng trong quả bưởi được chia làm các loại: đa lượng,vi lượng và siêu vi lượng

*Các nguyên tố đa lượng phải kế đến là: Canxi (20÷24 mg%), Natri (2

Gluxit:trong bưởi chứa từ 10,0 ÷15,5% gồm:

thông thường từ 9÷14%, trong số đó saccaroza chứa đến 60÷70% phần còn lại là glucoza và fructoza với tỷ lệ tương đương nhau Ngoài ra còn một lượng nhỏ

và vỏ hạt

pectin từ 0,5-2%, còn vỏ hạt bưởi có hàm lượng pectin khoảng 5-20% Bên trong thịt quả bưởi hàm lượng pectin thường chiếm khoảng 0,32 ÷0,35%

Các axit hữu cơ: Lượng axit hữu cơ có trong thịt quả bưởi thường chiếm khoảng 2,5÷5,0%, chủ yếu là axit citric chiếm 70%, axit malic…

Các vitamin: Thành phần thịt quả bưởi có chứa một lượng vitamin cần thiết cho cơ thể con người:

dần.Hàm lượng vitamin C đạt giá trị cao nhất khi quả bưởi đạt đến độ chín tuyệt đối.Hàm lượng này thường giao động trong khoảng: 30÷ 97mg/100g

đặc biệt là Caroten Hàm lượng giao động từ 10-17mg/100g Đối với những loại bưởi có dịch quả màu trắng thì hàm lượng này thấp hơn, thường từ 8÷14mg/100g

Ngoài ra trong thịt quả bưởi còn chứa các vitamin B1 (0,02

÷0,05mg/100g),B2 (0,01 ÷0,02mg/100g), PP (0,1 ÷0,4mg/100g)…

1.1.5 Giá trị dinh dưỡng của bưởi

Nước bưởi giúp ngăn ngừa nguy cơ loãng xương

Thường xuyên uống nước cam và nước bưởi sẽ giúp ngăn ngừa nguy cơ loãng xương, đó là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Đại học A&M Texas

nước cam và nước bưởi thì tỷ lệ đậm đặc trong xương cao hơn nhiều so với những con chuột không được dùng những loại nước quả này Các chuyên gia khẳng định nước bưởi và nước cam giúp gia tăng lượng chất chống oxy hóa, vốn có tác dụng làm cho độ đậm đặc của xương cao hơn.[9]

Ăn bưởi giúp trách được bệnh tim mạch, giảm cholesterol

Theo một nghiên cứu mới của các nhà nghiên cứu Israel, ăn một quả bưởi mỗi ngày có thể tránh được bệnh tim mạch Trong một nhóm các bệnh nhân tim mạch được theo dõi ở thí nghiệm này Các nhà khoa học phát hiện ra rằng những người bệnh ăn một quả bưởi mỗi ngày giảm đáng kể lượng cholesterol so với những người không ăn.Cholestrol trong máu cao là nhân tố gây ra bệnh tim mạch

Theo các nhà nghiên cứu, những bệnh nhân sử dụng bưởi thường xuyên sẽ

có dấu hiệu giảm đáng kể lượng Lipit trong máu Bưởi đào có dấu hiệu giảm lipit đáng kể nhiều hơn bưởi trắng, đặc biệt là đối với triglyxeride máu, một loại cholesterol khi tăng cao thường gây ra các bệnh về tim mạch.[17]

Ăn bưởi đều đặn sẽ giúp giảm cân và phòng chống bệnh tiểu đường

Nếu ăn mỗi ngày ½ quả bưởi và uống 150g nước ép bưởi, sau 2 tuần có thể sụt đươc 2kg.[53] Bưởi có khả năng giảm nồng độ isulin trong máu Để bưởi phát huy tác dụng nên ăn vào khoảng thời gian giữa các bữa chính Theo các nhà khoa học bưởi the hay chua chỉ làm giảm bớt sự ngon miệng thực ra thành phần vitamin của chúng cũng không thay đổi nhiều so với bưởi ngọt Nếu nước bưởi ép the khó dùng nên hòa trộn cùng với nước cam ngọt và chanh Hỗn hợp này có tác dụng hỗ trợ khả năng miễn dịch và thải độc tố ra khỏi cơ thể.[5]

Ăn bưởi giúp phòng chống và giảm bệnh viêm lợi

Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Đại học Phidrich silơ

khoa học hàm lượng vitaminC cao trong bưởi là yếu tố giúp phòng chống bệnh viêm lợi, nó có tác dụng thúc đẩy quá trình làm lành vết thương và giảm sự phân hủy các phân tử gốc tự do bất ổn định gây ra

Hút thuốc lá là yếu tố làm tăng nguy cơ của bệnh viêm lợi Nghiên cứu các các nhà khoa học cho thấy bưởi có tác dụng phòng chống viêm lợi đối với những người hút thuốc lá Theo lời khuyên của các chuyên gia những người hút nước lá nên ăn bưởi nhiều gấp đôi những người không hút thuốc lá [32]

Nước bưởi giúp ngăn ngừa nguy cơ nhiễm bệnh đường tiết niệu

Thường xuyên uống nước cam, bưởi, chanh mỗi ngày sẽ ngăn ngừa được nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến đường tiêt liệu.[19], [48]

Bên cạnh đó lá, rễ vỏ bưởi còn có rất nhiều tác dụng

Lá bưởi:có vị cay, tính ấm, chữa đau đầu, do phong đau khớp, viêm khớp dạng

thấp, viêm khớp cấp, thể hàn thấp, đau bụng do thực trệ, cảm mạo, chữa đau bụng, đầy bụng do lạnh

Cùi bưởi:vị ngọt đắng, tính ấm, tác động vào tỳ, thận và bàng quang, công dụng

hóa đàm, tiêu thực, hạ khí và làm khoan khoái lồng ngực.Cùi bưởi được dùng để chữa các bệnh sau: chứng ho hen ở người già, đau bụng do lạnh, phụ nữ mang thai nôn nhiều viên loét ngoài ra, ăn không tiêu, đau bụng sau khi sinh

Hoa bưởi:Có tác dụng hành khí, tiêu đờm, giảm đau,dùng để chữa các chứng đau

dạ dày, đau tức ngực với liều dùng 2-4g sắc uống

Hạt bưởi:chứa 40-74% dầu béo, có tác dụng chữa thuốc chốc đầu cho trẻ em, chữa

đau dạ dày,kinh nguyệt không đều sau khi, bạch hầu

Tinh dầu:Có tác dụng giải rượu, trị phong thấp,kích thích tuần hoàn máu dưới da

Rễ bưởi: rửa sạch, thái nhỏ sắc thuốc chữa bệnh Tầm cây bưởi dùng để chữa các

bệnh khớp,ăn uống khó tiêu.[50]

1.2.Một số sản phẩm được chế biến từ quả bưởi

1.2.1.Chế biến dạng mứt

Trên thế giới nhu cầu sử dụng mứt của người dân là hàng ngày và khá phổ biến Sản phẩm mứt dùng trực tiếp hoặc mứt nhuyễn phết kẹp với bánh mỳ hay sản phẩm mứt miếng mứt nguyên quả được trang trí trên những chiếc bánh gato,

phổ biến vào những dịp lễ tết Mứt được chế biến ở nhiều dạng: Mứt đông, mứt nhuyễn, mứt miếng đông, mứt khô…

Sản xuất mứt đông từ cùi bưởi

Khi làm mứt đông, cùi bưởi được xay nhỏ rồi nấu với nước theo tỷ lệ 1:1,

có bổ sung 0,3% axit xitric, thời gian nấu 30 phút Gạn lấy chất lỏng và tiếp tục nấu trong 15 phút nữa với 50% nước và 0,15% axit xitric rồi bỏ bã Chất lỏng thu được qua hai lần thủy phân pectin được trộn chung với nhau rồi hòa với đường axits theo tỷ lệ: Dung dịch pectin 100l + đường kính 10kg + axit 0,6 kg Cô đặc hỗn hợp đến khi nhiệt độ sôi đạt 105,5C (độ khô 68-70%) thu được mứt đông Rót vào đồ đựng khô sạch, làm nguội bảo quản nơi khô mát.[6]

Sản xuất mứt khô từ cùi bưởi

Cùi bưởi ngâm kỹ trong nước muối 5-10% cho tới khi trong Sau đó ngâm

mứt.Trước khi nấu mứt, cùi đã ngâm phải được rửa kỹ, sau đó ngâm trong xirô

rót xirô ra và cô đặc lên 30-35% độ khô rồi cho cùi vào nấu trong 5-7 phút Cho axit citric tỷ lệ 0,12-0,15% so với cùi Sau đó để nguội và tiếp tục cho khuếch tán

tự nhiên Cô đặc từng bậc để nâng nồng độ xirô lên hàng ngày là 5% cho đến khi đạt 75%.Lấy cùi thấm đường ra khỏi xirô và để khô tự nhiên hoặc sấy ở nhiệt độ

1.2.2.Chế biến dạng đồ uống

Sản xuất nước bưởi

Tùy theo trạng thái sản phẩm nước quả mà người ta phân biệt như sau: Nước quả ép dạng trong: Chế biến bằng cách tách dịch bào khỏi mô quả bằng phương pháp ép Sau đó được lắng, lọc để loại bỏ hết phần thịt quả

Nước quả ép dạng đục: cách chế biến tương tự như nước quả ép dạng trong chỉ khác là không lọc triệt để như nước quả trong Sản phẩm vẫn có chứa một lượng thịt quả nhất định

Nước quả nghiền (nectar): chế biến bằng cách nghiền mịn mô quả cùng với dịch bào rồi pha thêm đường, axit thực phẩm cùng các phụ gia khác

Nước bưởi chủ yếu chỉ sản xuất ở dạng trong và dạng đục Dù sản phẩm là trong hay đục thì quy trình công nghệ tổng quát công nghệ sản xuất nước bưởi theo một sơ đồ chung sau đây:[6]

Nguyên liệu quả Lựa chọn, phân loại, rửa

Dịch quả Lọc thô Phối chế

Vào hộp Ghép kín

Thanh trùng, làm nguội Nước quả dạng trong Nước quả dạng đục

Sản xuất rượu bưởi

Do đặc tính quả bưởi không chứa nhiều đường lên men như quả nho do vậy sản xuất rượu bưởi chủ yếu bằng cách cho dịch bưởi ép lên men rượu sử dụng

nấm men Saccharomyces ceverisae tương tự như sản xuất rượu vang nhưng nước

tồn trữ dài ngày Dạng sản phẩm này còn có tên là Cider.[6]

1.2.3.Các dạng sản phẩm khác được chế biến từ quả bưởi

Trong chế biến bưởi, lượng phế thải (lớp vỏ bưởi và lớp cùi bưởi) chiếm tới 50% khối lượng nguyên liệu đưa vào chế biến Các phế thải này vẫn còn chứa lượng đáng kể các chất dinh dưỡng như: tinh bột, pectin, tinh dầu Để tận dụng nguồn phế thải, nâng cao giá trị kinh tế và giảm ô nhiễm môi trường, từ các phế thải đã sản xuất ra tinh dầu vỏ quả bưởi, pectin từ cùi bưởi…

Thu hồi tinh dầu từ vỏ quả bưởi

Thường sử dụng phương pháp chưng cất bằng hơi nước: Vỏ bưởi được xay

khử tecpen và tách làm ba loại tinh dầu: Tinh dầu hòa tan trong cồn ở lớp trên cùng dùng để gia hương nước ngọt, rượu mùi; tinh dầu ở lớp giữa dùng để chế biến bánh kẹo còn tinh dầu cuối cùng để phối chế xà phòng thơm, kem đánh răng.100 kg vỏ bưởi tươi thu được 2 kg tinh dầu thô.[6]

Sản xuất pectin từ cùi quả bưởi

Pectin là chất tạo đông, còn có tác dụng chữa bệnh đường ruột và giúp cơ thể bài tiết kim loại nặng nên được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và y

tế Pectin được sản xuất ở dạng dung dịch hay dạng bột

Cùi quả bã ép sau khi khử đắng và tách hạt bằng cách rửa trong nước luân lưu, đem xay nhỏ.Thủy phân pectin có chứa hỗn hợp bằng dung dịch HCl loãng ở

phẩm pectin với hàm lượng 3,5-5,0%, đem bảo quản để nấu mứt Trung bình 1000kg cùi quả cho 500-700l dung dịch pectin độ khô 10% Để thu pectin dạng

sấy chân không tang trống ở 60-700C đến khi độ ẩm còn lại 3-4%, nghiền nhỏ và đóng bao Cồn được thu hồi đem dùng lại.[6]

1.3 Các chất gây đắng trong nước bưởi

Flavonoids và Limonoids.[35]

Flavonoids hiện diện khắp nơi trong tế bào thực vật và hiện diện nồng độ cao trong tất cả trái cây có múi Chúng phân bố khắp quả nhưng chiếm nồng độ cao trong lớp vỏ Trong dịch quả chúng chỉ thể hiện ở nồng độ thấp Trong quá trình chuẩn bị chế biến, dịch quả thường bị lẫn một vài mảnh nhỏ của vỏ màng múi, nếu những phần này được loại nhanh chóng thì vị đắng được giảm đáng kể Flavonoids bao gồm naringin, hesperindin, các aglycone với 2 disaccharide điển hình là neohesperidose và rutinose, cả hai đều chứa glucose và rhamnose nhưng khác nhau ở loại glucocidic Các aglycone không tạo vị đắng, chỉ có naringin là

Hợp chất limonoids: bao gồm limonin, nomilin, limonoate A–ring lactone, nomilinoate A-ring lactone, limonin glucoside, nomilin glucoside…Limonoate A–ring lactone có nhiều trong hạt của quả họ citrus, đối với quả không hạt thì chúng chiếm ưu thế ở cấu trúc màng Limonoate A–ring lactone không đắng nhưng trong

Hình 1.7 Quá trình tạo limonin gây vị đắng

lượng các chất thuộc nhóm hợp chất limonoids trong nước quả họ citrus là phương pháp đo màu [49], sắc ký khí [16,21], sắc ký bản mỏng [35,49], radioimmuoassay

Tìm hiểu về limonin và các hợp chất limonoids

Limonin

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của limonin

Tên gọi quốc tế 7,16-Dioxo-7,16-dideoxylimondiol

Các tên gọi khác limonoate D-ring-lactone, limonoic acid di-delta-lactone

Các tính chất

limonoid, màu trắng được tìm thấy nhiều ở hạt của các quả họ citrus.Bản thân limonin không đắng, nhưng khi kết hợp với các axit citric thì có vị đắng Phản ứng này xảy ra khi cấu trúc tế bào bị phá hủy như khi chà, ép, đông lạnh, hay khi quả

bị hư, thối rữa Đây là lý do tại sao cam, bưởi không đắng khi ăn nhưng lại gây ra

vị đắng khi ép và đun nóng Limonin gây vị đắng ở nồng độ 3,7ppm và đắng khủng khiếp ở nồng độ 16-20ppm [20,32]

Limonin là hợp chất thứ cấp trong quá trình chuyển hóa các chất có nồng

độ cao giống như là aglycones và glucosides trong hạt cam, bưởi và trong mô quả Những hợp chất triterpenoids này là biểu lộ ý nghĩa quan trọng hoạt động sinh học

và đã được nghiên cứu đến chức năng của chúng đối với sức khỏe con người.Trong quả họ citrus phải kể đến kết quả nghiên cứu điều chỉnh limonin trong mối quan hệ đến sự phát triển “sự cản trợ của vị đắng”[12,22] Sự cản trở của vị đắng là khởi đầu trong citrus tuỳ thuộc vào sự tổn tương không suy tính hoặc ngăn cản tình trạng enzymmatically dưới điều kiện acid Limonin (1) và nomilin (2) là những chất gây đắng chủ yếu, các hợp chất limonoids được sinh ra trong các phản ứng hóa sinh và ảnh hưởng đến sự cản trở của vị đắng Bình

thường trong thời gian chín của các quả citrus, limonoate A–ring lactone (3) và

các quả citrus chưa chín thì ít chất 3 và 4 dẫn đến giảm sự hình thành chất 5 và 6

Hình 1.9 Con đường sinh tổng hợp của các hợp chất limonoid

Các kết quả nghiên cứu của Hasegawa và các cộng sự đã thừa nhận rằng (3)

axetat, mevalonate và farnesyl furphosphate là nguyên liệu bắt đầu cho sự tổng hợp của các hợp chất limonoids khác.[22,26]

Từ 1990, các nhà khoa học ở Mỹ và Canađa đã phát hiện trong các loại quả này có một loại hợp chất có khả năng chống ung thư, đó là hợp chất limonoid và

những hợp chất đó có hoạt tính đối với ung thư vùng miệng, vòm họng, phổi, dạ dầy, đường ruột, da, gan và vú Hợp chất limonoid là những hợp chất tritecpenoid phức giầu oxy Trong phân tử các glucosit còn có nhóm cacboxylic nên chúng có phản ứng axit Những hợp chất được biết rõ hơn là limonin, nomlilin, obacunon và các glucosit của chúng Bằng các phương pháp sắc ký, người ta đã tách riêng được

hợp chất đó đều có một vòng furan gắn với vòng no ngưng tụ có chứa các nhóm thế khác nhau[8].

Hiện nay, trên thế giới đã có khá nhiều kết quả nghiên cứu về công dụng

tăng sự tạo thành enzim glutathione –S-tranferase và detofying enzim Các enzim này tác động vào các chất độc trong gan làm tăng độ hòa tan của chúng vào nước giúp chúng giải độc Limonin giúp chống lại ung thư miệng, da phổi, dạ dày…[14] Limonin glucoside kết hợp với glucozan làm giảm lượng đường trong máu.Tác dụng sinh học của limonin được thể hiện rõ ở các nghiên cứu về khả năng chống lại các quá trình sinh ra chất gây ung thư, ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư [18] Limonin còn có tác dụng làm giảm colesterol trong thành mạch máu rất

rõ rệt Khi có mặt limonin trong tế bào gan apo B được sản xuất ít hơn (Apo B là protein tham gia vào cấu trúc của LDL colesterol [14]

Sự phân bố của limonin trong quả bưởi

Vỏ: 130,16 – 294,14 ppm Cùi: 133,58 – 352,72 ppm

Màng múi: 85,81 – 295,14 ppm Hạt: 1375,31 – 2615,30 ppm Nước: 4,27 – 19,62 ppm

Hình 1.10 Sự phân bố limonin trong quả bưởi

Hàm lượng limonin giảm nhanh từ hạt đến cùi, vỏ tinh dầu, màng múi và nước quả So sánh các quả họ citrus thì sự phân bố này là giống nhau, tuy nhiên khác nhau về hàm lượng [21]

Tìm hiểu về naringin

citrus Naringin là chất gây ra vị đắng trong bưởi và dịch nước bưởi ép Trong cơ

Naringin có ứng dụng nhiều trong thực phẩm và dược phẩm, là chất có tác dụng như một chất chống oxy hóa trong cơ thể con người, là chất có tác dụng giảm mỡ máu, chống lại những tác động của căn bệnh ung thư, là chất có khả năng ngăn cản sự hoạt động của cytochrome P450 isoform CYP3A4 trong ruột, làm

Naringin có nhiều trong cùi trắng và cả trong dịch quả họ citrus Khi quả còn xanh naringin gây ra vị đắng Khi quả chín do tác dụng của enzim peroxidaza, naringin phân hủy thành glucoza, ramnoza, agluconnaringinen không có vị đắng[6]

1.4 Giới thiệu về cyclodextrin (CD) và các ứng dụng của chúng

1.4.1 Giới thiệu về cyclodextrin

Cyclodextrins (cycloamyloses) thuộc nhóm hợp chất được tạo thành từ các phẩn tử đường liên kết với nhau tạo thành vòng (vòng oligosaccharides)

Tên gọi khác Naringin Naringoside 4',5,7-Trihydroxyflavanone-7-rhamnoglucoside

Cyclodextrins được sản xuất từ tinh bột nhờ sự đảo ngược bằng enzym Chúng được sử dụng trong thực phẩm, dược và công nghiệp hóa học cũng như công nghệ môi trường và nông nghiệp Cyclodextrin là hợp chất hoạt động chính được tìm thấy trong các sản phẩm khử mùi của Procter và Gamble được biết đến với tên phụ là “Clenzaire”[41]

Cyclodextrins là hợp chất chứa từ 5 hoặc nhiều hơn các đơn vị đường glucopyranoside theo liên kết 1-4, như trong amylose (một đoạn của tinh bột) Vòng có chứa 5 phân tử là không tự nhiên Gần đây phân tử cyclodextrin lớn nhất

α-D-đã được phát hiện có chứa 32 đơn vị 1,4-anhydroglucopyranoside trong khi như một hỗn hợp ít thuộc tính nhất, thậm chí có ít nhất oligosaccharides vòng có chứa

150 đơn vị đã biết đến Cyclodextrins điển hình có chứa một số lượng các monomer glucose nằm trong khoảng từ 6 -8 , tạo nên một hình nón, do vậy dễ cho electron [47]

• α -cyclodextrin: có chứa 6 phân từ đường trong vòng

• β -cyclodextrin: chứa 7 phân tử đường trong vòng

• γ -cyclodextrin: chứa 8 phân tử đường trong vòng

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của α-CDs, β-CDs, γ-CDs

Hình 1.13 Kích thước hình học gần chính xác của α-CDs, β-CDs, γ-CDs

Cấu trúc

Cyclodextrins điển hình được tạo thành bởi từ 6-8 đơn vị đường glucopyranoside, dễ hòa tan trong dung môi lần lượt là các nhóm hydroxyl thứ cấp

và sơ cấp Do sự sắp xếp này, bên trong không ưa nước, nhưng có thể cân nhắc đến khả năng ưa nước kém trong môi trường nước và do vậy có thể làm vật chủ cho các phân tử ưa nước khác Trái lại, bên ngoài hoàn toàn ưa nước cho phép cyclodextrinh có thể hòa tan trong nước dễ dàng

Tổng hợp

Sản xuất cyclodextrin tương đối đơn giản và bao gồm việc xử lý tinh bột

bằng nhiệt độ hoặc sử dụng α-amylase, sau đó bổ sung CGTase cho chuyển hóa CGTases có thể tổng hợp nên tất cả các dạng cyclodextrin, do vậy sản phẩm là hỗn hợp của 3 loại phân tử vòng chính với tỷ lệ phụ thuộc vào enzym sử dụng: mỗi CGTase có đặc tính riêng của nó về tỷ lệ α:β:γ Tách chiết 3 loại phân tử cyclodextrins cần dựa vào khả năng tan trong nước khác nhau của mỗi phân tử: β-

145 và 232 g/l) thường được tách chiết bằng kỹ thuật sắc phổ và mất nhiều thời gian Như vậy một cách khác được sử dụng là bổ sung tác nhân phức hợp trong bước chuyển đổi của enzym: tác nhân (các dung môi hữu cơ như toluene, acetone hoặc ethanol) để hình thành nên phức hợp với cyclodextrin sau đó kết tủa, dẫn đến việc tổng hợp các cyclodextrin kết tủa, do vậy làm giàu hàm lượng của nó trong hỗn hợp sản phẩm cuối cùng [47]

1135

7

11 6,0 - 6,6

1297

8

17 7,5 - 8,3

255 - 260 12,33

79

262 0,14 0,262 1,85

255 - 265 12,2

79

472 0,2 0,472 23,2

240 - 245 12,08

Tính chất hóa học:

- Độ bền hóa học: So với các oligosacarit mạch thẳng thì các CD là những

phân tử rất bền Các axit mạnh như axit clohydric có thể phân hủy CD tạo ta hỗn hợp các oligosacarit khác nhau (từ mạch thẳng do phân tử CD bị mở vòng cho đến tận glucoza) Tốc độ thủy phân tăng khi nhiệt độ thủy phân tăng nhưng chậm hơn

axit yếu như axit hữu cơ sự thủy phân hầu như không xảy ra.Cũng như các

có sự thủy phân CD

oxy hóa làm mở vòng glucoza nhưng không tạo ra focmadehyt hay axit focmic vốn là các chất độc do CD không có tính khử.α và β-CD khá bền dưới tác dụng của enzim thủy phân amololytic trong khi đó γ –CD bị thủy phân dễ dàng bởi α- amillaza.Nói chung các α- amillaza từ nấm mốc thủy phân CD tốt hơn các α- amillaza từ vi khuẩn β amilaza và glucoamilaza không thủy phân CD nhưng cyclodextrin glucosyltransfenaza có thể thủy phân dễ dàng.Các phức CD nhìn chung bền hơn CD trước sự thủy phân bởi enzim Điều này có thể do một số chất khách thể ức chế enzim hoặc cản trở không gian khiến enzim khó tiếp xúc với cơ chất CD.Ngoài ra các CD biến đổi cũng bền hơn do nhóm thay thế không

thậm chí ở nhiệt độ cao và trong môi trường đậm đặc.[27]

Khả năng biến đổi hóa học

Bằng phương pháp hóa học hoặc bằng enzim có thể thay thế các nhóm

kính của CD không bị thay đổi nhưng chiều sâu các lỗ hang giảm xuống [16] Mục đích biến đổi này là nhằn thay đổi độ hòa tan, thay đổi khả năng tạo phức (độ bền

tác

1.4.3 Tìm hiểu về cơ chế tạo phức của cyclodextrin

Các CDs (cyclodextrins) được xem giống như là các nồi nhỏ trống rỗng có các kích thước phân tử khác bên trong có chứa các lỗ hang Trong trường hợp này phức chất được gọi là “inclusion complex” Ở dạng này inclusion complex là sự kết hợp thực thể Các phức chất này tồn tại bao gồm hai hoặc nhiều hơn phân tử Một phân tử là “chủ thể”, bao gồm toàn bộ phân tử hay một phần phân tử, một phân tử là “khách thể” bằng các ảnh hưởng của tính chất vật lý.Do vậy các CDs là loại phân tử “chủ thể” [16]

Hình 1.14 Khả năng hòa tan CD (mgCD/gH 2 O) cuả ()-αCD, (●)-βCD,(○) -

γCD trong nước và ảnh hưởng của nhiệt độ (K)

Hiện nay, loại kết hợp giữa chủ thể và khách thể vẫn chưa được thống kê đầy đủ Hình 1.15 là hình ảnh minh họa gần chính xác các lỗ hang của từng α,β,γ,CDs

Hình 1.15 Hình ảnh minh họa thể tích lỗ hang và bảng số liệu khả năng hòa tan của từng α,β,γ,CDs

Phân tử khách thể càng rộng lớn thì sự tạo phức càng chậm Sự ion hóa được diễn tả bởi tỷ lệ tạo phức và sự phân ly Khả năng kết hợp và phân ly đạt trạng thái cân bằng là một trong những tính chất quan trọng của mối liên quan này.[13]

Khả năng và cơ chế tạo phức

Sự tạo phức của các khách thể trong một lỗ hổng của một cyclodextrin bao gồm sự thay thế cơ bản của các phân tử nước bằng các khách thể ít cực nhất Hình ảnh 1.19 minh họa cơ chế tạo phức của cyclodextrin và p-xylene.[33]

Hình 1.16 Hình ảnh minh họa cơ chế tạo phức giữa p-xylene và cyclodextrin

Quá trình tạo phức xảy ra mạnh mẽ bởi các động lẫn nhau giữa phân tử khách thể với các lỗ hang không ưa nước của chủ thể Trong quá trình này sự thay đổi entropy và enthalpy giữ vai trò quan trọng.Mặc dù thực tế “cơ chế tác động” của các hợp chất là vẫn chưa hoàn toàn được hiểu đủ nhưng dường như đây là một vài kết quả của các tác động sau:

không cực diễn ra mạnh mẽ và có chiều hướng ưu tiên (giữa nước và các lỗ hang CD trên phần tham gia và giữa nước với các khách thể khác) bằng cách có nhiều quyền ưu đãi hơn của các ảnh hưởng qua lại giữa các tác động của phân tử có cực và không cực (giữa khách thể và các lỗ hang) và các ảnh hưởng qua lại giữa các phân tử không cực với phân tử có cực (giữa

số lượng nước và các lỗ hang được giải phóng với phân tử nước)

hydrogen giữa chủ thể và khách thể.[33]

Cyclodextrin là các phân tử không ưa nước, do vậy cần phải tận dụng tính hòa tan của chúng, khi một số lượng nhỏ của ethanol được thêm vào nước Các phân tử nước trong lỗ hang CD không thể làm bão hòa khả năng gắn kết hydrogen của chúng, giống như là sự tìm thấy chúng rời nhau trong dung môi Các phân tử nước đã làm tăng sự hoạt động hoặc các entanpi Sự giảm sút trong năng lượng hệ thống là nguyên nhân bởi sự biến đổi là nguyên nhân về khả năng hòa tan phân tử khách thể và các ảnh hưởng tác động lỗ hang với yếu tố hòa tan

Năng lượng gắn kết hóa học là 400kj/mol Năng lượng gắn kết của hydrogen là khoảng 40kj/mol và các tác động của lực Val der Waals chỉ khoảng 4kj/mol của năng lượng gắn kết Trong trường hợp tạo phức, các hình thái có thể đạt được trạng thái ổn định khi tương ứng về số lượng gắn kết đúng trong không gian xắp xếp

Ảnh hưởng Val der Waals, sự ảnh hưởng tác động nhẫn nhau của tính không ưa nước và sự gắn kết hydrogen của chủ thể CD với các khách thể

Sự hoạt động tích cực của ảnh hưởng Val der Waals là có tỷ lệ đúng đến phân tử phân cực và phân tử bị khúc xạ Cấu trúc tượng tự của các phức, một đường thẳng tương quan tồn tại giữa phân tử bị khúc xạ và hằng số phân ly của phức chất CD của chúng [21]

Các ảnh hưởng đảm bảo tính ổn định của các chi phối khác là tính không ưa nước và tính phân ly trong dung môi Sự hydrat hóa của phức CD là rất mạnh mẽ, khi so sánh sự hydrat hóa riêng lẻ của các thành phần Vai trò gắn kết hydro là không phổ biến bởi tính ổn định của các thành phần đã được xác định ví dụ benzen không thể gắn kết với hydro

Tác động của cấu trúc cyclodextrin trong sự bao chất

Theo dõi hầu hết các chủ thể, CDs cùng với các đường kính lỗ hang khác nhau và sự thay đổi tính hóa học của CDs Dạng α CDs không hòa tan trong axit

thể là nguyên nhân về sự thiếu cân bằng của các axit béo.[30]

Sử dụng các CDs đã chuyển hóa có khả năng hòa tan cao hơn, độ hòa tan cao cũng tác động đến kết quả đạt được Trong cách này, sự thay thế của nhóm

phân cực/tính không phân cực của chúng cũng đã được xác định Để bảo tồn, một

dẫn xuất CD, cùng với khả năng hòa tan cao của chúng là dạng hỗn hợp đưa ra các khách thể, tính chất này cũng ổn định trong suốt quá trình cất giữ.[30]

Tác động của các tính chất khách thể

So sánh hình học tương hợp giữa chủ thể và khách thể, cấu trúc, sự thay đổi

và chiều phân cực của khách thể, tác động của các phản ứng môi trường (khả năng hòa tan), nhiệt độ và quan trong nhất là sự tạo thành phức

Quan trọng nhất là kích thước hình học của các phân tử khách thể là sự khít hơn của các vòng benzen và sự cô đặc chất đồng đẳng của chúng Các phân tử chủ thể β-CDs cung cấp lỗ hang linh hoạt chủ yếu cho các bẫy phân tử tổng số trong gia đình CDs Ví dụ, dạng β-CDs ổn định tạo phức cùng với mạch đơn.[30]

Sự thay đổi và phân cực của các khách thể cũng đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc CD, chủ thể và khách thể ảnh hưởng qua lại với nhau Tuy nhiên, nó cũng là ít quyết định hơn cho sự khớp hình học Các phân tử có thể tạo phức bởi CDs khi chúng ít hút nước hoặc ít phân cực hơn nước

1.4.4 Các ứng dụng của cyclodextrin trong đời sống

Cyclodextrins, như chúng ta đã biết đến ngày nay, được gọi là “cellulosine”

đã xác định được 3 chất có trong tự nhiên là cyclodextrins -α, -β, và –γ Những hợp chất này vì vậy sau đó thường được nhắc đến là đường Schardinger Trong 25 năm, từ năm 1911 đến 1935, Pringsheim người Đức đã dẫn đầu về các nghiên cứu trong lĩnh vực này, chứng minh được rằng cyclodextrins được hình thành từ các phức hợp bền với nước với nhiều chất hóa học khác Cho đến giữa những năm

1970, mỗi một cyclodextrins tự nhiên đã được xác định cấu trúc và tính chất hóa học và nhiều phức hợp hơn cũng đã được nghiên cứu Từ những năm 1970, các nghiên cứu mở rộng đã được dẫn dắt bởi Szejtli và các khám phá gói gọn trong ứng dụng của cyclodextrins và các dẫn xuất của chúng trong công nghiệp và dược phẩm Trong tất cả các quy trình sử dụng phức hợp, qui trình phối trộn dường như

Ứng dụng của cyclodextrin tăng hàng năm 20-30%, trong đó ngành thực phẩm chiếm 80-90%, còn lại là trong dược, hóa học và một số ngành công nghiệp khác Trong công nghiệp dược, CDs và các chất dẫn xuất của nó đã được sử dụng trong ngành thuốc được thêm vào bổ trợ khả năng làm tan, làm pha loãng hoặc

làm thành phần trong các viên nén để phát huy tính chất hóa học và lý học hay để làm tăng tính xúc tác sinh học của các thuốc có sự hòa tan kém [30]

Tuy nhiên, tình hình sử dụng CDs trong thực phẩm khác nhau giữa các nước Ở Mỹ, α,β và γ CDs được đưa vào danh sách GRAS và FDA đã công nhận

là sử dụng CD trong thực phẩm là an toàn Ở Nhật, α,β và γ CDs được giới thiệu như là các sản phẩm tự nhiên và chất tinh khiết được thương mại hóa Ở Australia

và New Zealand α,β và γ CDs được đưa vào các dạng thực phẩm mới từ năm

2003, 2004 [15,48]

Trong công nghiệp thực phẩm, cyclodextrin được dùng làm chất đặc biệt cho sản phẩm cholesterol tự do: phân tử cholesterol lớn và ưa nước dễ dàng chui vào bên trong vòng cyclodextrin để sau đó bị thải ra ngoài Alpha-, beta-, and

Trong những năm gần đây, một vài miêu tả ứng dụng cyclodextrin trong công nghiệp sản xuất thực phẩm và hương liệu đã được công bố.[15,27]

được thêm vào như chất phụ gia thực phẩm cùng với một vài tính chất được đề cập đến:

i).Để chống quá trình oxy hóa chất mỡ trong thành phần thực phẩm dễ bị hỏng bởi oxy không khí, ánh sáng và nhiệt độ

ii) Để hòa tan màu thực phẩm và vitamin

iii) Để làm ổn định hương thơm, phẩm màu, vitamin và các dầu tinh khiết, chống lại sự thay đổi về hương, màu, vitamin

iv) Để ngăn cản mùi và vị khó chịu

v).Điều khiển tự động bay hơi của các cấu tử chính trong thực phẩm

1.5.Tìm hiểu về một vài chế phẩm enzim dùng trong sản xuất nước quả

1.5.1 Chế phẩm Pectinex Ultra SP – L

Chế phẩm Pectinex Utral SP-L là chế phẩm enzim pectinaza hoạt tính cao

được dùng chủ yếu để xử lý quả nghiền

Chế phẩm Pectinex Utral SP-L được sản xuất từ một chủng nấm mốc chọn lọc của nhóm Aspegiluss niger Enzim này bao gồm một loạt hoạt tính của

pectonitic và một loạt hoạt tính của Hemixenlulytic Nó có khả năng phân hủy

màng tế bào thực vật nên chủ yếu dùng để xử lý quả nghiền và ngâm mô tế bào.Các pectin hòa tan hay pectin không hòa tan và các polosacarit làm đục dịch quả đều bị phân hủy.Enzim này được đưa vào hỗn hợp quả nghiền dẫn đến sự tăng mạnh hiệu suất trích ly và thu được lượng dịch cao hơn Chế phẩm là một chất lỏng màu nâu với mùi nhẹ tiêu biểu của sản phẩm lên men Khoảng pH tối thích là 4,5 và hoạt độ của sản phẩm là 26000 PG/ml (pH=3,5) Hoạt độ chuẩn được xác định bằng cách đo của sự giảm nhớt của pectin bằng 3,5.[2]

tháng Nếu kéo dài thời gian hơn hoạt độ sẽ giảm 1-2%

khoảng 1 năm

1.5.2 Chế phẩm Pectinex 3XL

phụ azabanaza Nó phân hủy nhanh và hoàn toàn polysacarit, có hiệu quả trong việc làm trong nước và và tiết kiệm chất trợ lọc Một hoạt tính quan trọng của chế

phẩm Pectinex 3XL là vùng hoạt động azabanaza trái ngược với những enzim pectolitinaza bình thường Với phổ hoạt động của azabanaza Pectinex 3XL có thể

phân cắt phân tử lớn azaban thành các phân tử nhỏ arabinoza gần như hoàn toàn

và những phân tử này không thể trùng hợp thành cao phân tử araba Nguy cơ của đục nước quả do araban gây ra sẽ được giảm đáng kể

Tuy nhiên khi công nghệ ép quả cao được ứng dụng thì araban trong quả cũng sẽ được giải phóng ra và dẫn tới việc vẩn đục araban

Chế phẩm Pectinex 3XL là một sản phẩm có màu nâu sẫm, mùi dịu đặc trưng của sản phẩm lên men Pectinex 3XL có tiêu chuẩn hoạt độ của 3000 FDV

Hiện nay trên thế giới, sản xuất nước quả chiếm tỷ trọng lớn trong ngành công nghiệp nước giải khát Công nghệ enzim được ứng dụng trong sản xuất nước quả đã làm tăng hiệu suất ép dịch quả và làm trong nước quả Hiện nay,ở nước ta

đã có khá nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng enzim trong sản xuất nước dứa, cam, dâu cho thấy hiệu xuất ép tăng rõ rệt tuy nhiên thực tế chưa có cơ sở sản xuất nào ứng dụng cả Một phần nguyên nhân này là do các loại quả ở nước ta chủ yếu được tiêu thụ ở dạng ăn tươi và xuất khẩu, chưa được chế biến nhiều Do vậy

nội tiêu và hướng tới xuất khẩu nhằm đáp ứng nhu cầu ăn nhanh của người tiêu dùng

1.6.Tình hì nh trồng, sản xuất và tiêu thụ bưởi trên thế giới và tại Việt Nam

1.6.1 Tình hình trồng, sản xuất và tiêu thụ bưởi trên thế giới

Trên thế giới có 62 nước trồng bưởi cho sản lượng 5,5 triệu tấn Nhiều bưởi nhất thuộc về khu vực Bắc Mỹ với sản lượng chiếm 63%, Châu Á chiếm 20,5% và Châu Phi chiếm 8% Mỹ là quốc gia có lượng bưởi khá, với sản lượng hàng năm 2,65 triệu tấn, các tiểu bang Florida và Texas là nơi trồng nhiều bưởi nhất với nhiều giống bưởi khác nhau như: Bưởi Duncan hình tròn, đường kính khoảng 12cm, vỏ vàng nhạt, cùi mềm, nhiều nước, vị thơm; Bưởi không hột Marsh hình tròn hơi dẹt, đường kính quả từ 9-12 cm, vỏ quả màu vàng nhạt, hương vị thơm đặc biệt; Bưởi Paradise Navel hình cầu dẹt, trái nhỏ; Bưởi Star Rubby vỏ màu vàng, tép màu đỏ, có hoặc không có hạt… Khu vực Châu Á, bưởi trồng nhiều nhất

là Ixraen, xếp sau là Trung Quốc, Ấn Độ, Iran, Sip và Thổ Nhĩ Kỳ.[8,18]

Bưởi tiêu thụ ở Mỹ và một số nước phương Tây chủ yếu là giống bưởi

Pomelo có ruột màu đỏ tươi, vỏ mỏng và kích thước nhỏ, khác với giống bưởi ở

nước ta là giống Grandis Các sản phẩm từ bưởi ở nước ngoài khá phổ biến một

phần do thói quen tiêu dùng của người phương Tây sử dụng đồ chế biến sẵn Các

sản phẩm từ bưởi phổ biến là nước bưởi gồm nước bưởi có tép, nước bưởi đục

(với mức độ đục khác nhau tùy thuộc loại sản phẩm của mỗi nhà sản xuất) Ngoài

ra còn có các loại sản phẩm sử dụng tép bưởi như sữa chua đóng hộp (yoghurt), mứt sệt (jam) và các loại bánh có nhân bưởi khác.[11]

Trên thị trường thế giới, nước bưởi có rất nhiều loại như 100% dịch bưởi đóng hộp không bổ xung chất ngọt của Ocean Spray trong một cốc nước bưởi chứa: 177ml chứa 70 calo, chất béo 1g, 16g cacbonhydrat trong đó chất xơ 0,5g, đường 13 g, vitamin C đủ cung cấp cho cơ thể 90% lượng cần thiết mỗi ngày, sắt

nước bưởi ngọt, nước bưởi đỏ ruby, nước bưởi vàng được sử dụng như một đồ uống cho sức khỏe và là nguồn cung cấp vitamin C cần thiết cho cơ thể.[8,9]

Hình 1.17 Một số hình ảnh sản phẩm nước bưởi hiện có trên thế giới

Tổ chức FAO công bố hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 98.6 triệu tấn nước quả họ citrus [17] Trong công nghiệp sản xuất nước quả họ citrus, công nghệ xử lý vị đắng là một trong những khâu then chốt.Vị đắng là một trong những nguyên nhân gây cản trở trong sản xuất nước quả

và nước bưởi không chỉ được nghiên cứu tại các Viện Khoa học hay các trường Đại học (nghiên cứu cơ bản) mà còn được nghiên cứu ngay tại phòng thí nghiệm của các Công ty sản xuất nước quả ép Ngoài việc sử dụng enzim nagarinase trong khử đắng dịch bưởi và cam thì hiện nay các Công ty đang sử dụng cyclodextrin và các dẫn suất của chúng để làm giảm vị đắng của dịch quả ép họ citrus.[8,11,22] Bang Florida là bang có sản lượng quả họ citrus đứng thứ 2 nước Mỹ [18] Công

năm 1933 và hiện nay các sản phẩm của Công ty đã xuất khẩu hơn 40 quốc gia trên toàn thế giới Từ năm 1987 Công ty này đã sản xuất nước bưởi đỏ ép 100% tự nhiên không bổ sung đường, nước với công nghệ khử đắng bằng cyclodextrin, sản phẩm có tên là Tropicana Do công nghệ sản xuất nước quả luôn đi kèm với các công nghệ mới như công nghệ enzim, công nghệ siêu lọc hay hệ thống bao gói khép kín tự động để tạo ra các sản phẩm nước quả ép ngày càng có chất lượng cao Năm 1990 Công ty Ocean Spray đã nghiên cứu và đưa ra thị trường sản phẩm nước bưởi đỏ ép 100% tự nhiên đóng lon và hộp giấy, năm 1993 Công ty sản xuất thêm sản phẩm nước quýt đỏ ép tự nhiên.[8,11] Không chỉ dừng lại ở việc sản xuất nước quả mà hiện nay các công ty này còn sản xuất các loại nước cốt quả như sản phẩm cốt cam, cốt bưởi nhằm xuất khẩu

1.6.2 Thực trạng trồng, sản xuất và tiêu thụ bưởi tại Việt Nam

Những loại cây ăn quả có diện tích lớn ở Việt Nam là chuối, cam, bưởi, nhãn, vải…Diện tích cây ăn quả của Việt Nam đã tăng từ 346 nghìn ha (1995) đến

2007 xuất khẩu rau quả của Việt Nam ước đạt 300 triệu đô la

Việt Nam hiện có khoảng 25.000 ha trồng bưởi, trong đó có 15.000 ha đang

rệt khi các phương tiện thông tin đại chúng đồng loạt đăng tải thương hiệu bưởi Năm Roi -Vĩnh Long, bưởi Tân Triều - Đồng Nai, bưởi Phúc Trạch - Hà Tỉnh, bưởi Diển-Hà Nội, bưởi Đoan Hùng -Phú Thọ…Tình hình trồng bưởi được thể hiện ở bảng 1.2

2 Hµ tÜnh 3.000 5.000 Phóc tr¹ch

3 Phó thä 1.071 1.500 §oan hïng

4 Đồng Nai 685 1000 Bưởi đường lá cam

5 Bình Dương 380 - Bưởi đường lá cam

6 Tiền Giang 1000 - Bưởi đường lá cam

8 Vĩnh Long 9.275 12.000 Bưởi Năm Roi

9 Cả nước 25.000

)Nguồn báo điện tử tỉnh Vĩnh Long- Đồng Nai

Trong 5 năm qua, bưởi Việt Nam là trái cây Việt Nam được Châu Âu đặt hàng nhiều nhất nhưng không thể thực hiện được các hợp đồng vì nguồn cung không đều đặn, quy chuẩn theo hợp đồng Thị trường Hồng Kông, Đức có nhu cầu

có nhu cầu cao về bưởi Năm Roi, ngay cả với loại hàng chất lượng thấp, thậm chí một số siêu thị Châu Âu vẫn chấp nhận cả bưởi có hạt miễn sao đồng đều về chất lượng và kích cỡ, bưởi lông Cổ Cò rất có ưu thế nhờ vỏ dày và cứng.Theo thống

kê Đồng bằng sông Cửu Long hiện có tới 10.000 ha bưởi Năm Roi với sản lượng lên tới 95.000 tấn Tuy nhiên các nước có bưởi nhập khẩu đều ở xa Việt Nam, vận chuyển bằng máy bay cước phí bình quân 3,5 USD/kg, còn vận chuyển bằng đường biển tuy có rẻ nhưng thời gian dài khó bảo quản, hao hụt do hư hỏng tăng cao

Ở Việt Nam bưởi được dùng để ăn tươi là chính Vỏ bưởi dày cứng có nhiều tinh dầu nên bảo quản được lâu để dùng dần (có thể bảo quản được 3-4 tháng) Ngoài ăn tươi còn có thể chế biến nước bưởi, mứt bưởi.Tuy nhiên, các sản phẩm

về đồ uống từ nước bưởi của nước ta chưa phổ biến bởi kỹ thuật chế biến còn đơn giản và chưa hấp dẫn người tiêu dùng.Các cơ sở sản xuất nước trái cây của nước ta hầu hết sử dụng công nghệ bán cơ giới Các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ là các đơn

vị thích hợp với việc chế biến các sản phẩm từ trái cây vì ít chịu tác động của tính thời vụ do có thể chuyển đổi sang sản xuất loại hàng hóa khác Cũng chính vì lý

do đó, các cơ sở vừa và nhỏ cũng hạn chế đầu tư hệ thống thiết bị lớn, đồng nghĩa với việc họ phải sử dụng công nghệ truyền thống là bán cơ giới

Một số cơ sở tư nhân như Doanh nghiệp tư nhân Long Thuận tại xã Song Thuận huyện Châu Thành -Tiền Giang đã sản xuất thử sản phẩm nước bưởi nhưng sản phẩm tiêu thụ ở mức rất hạn chế và đang trong thời gian thăm dò thị trường Hiện nay Công ty BIDRICO đang triển khai dự án sản xuất thử nghiệm 150 lít nước bưởi đóng lon 330ml của Bộ Công Thương là kết quả nghiên cứu của đề

Vấn đề nghiên cứu khử đắng đối với các quả thuộc họ citrus cũng đã được nghiên cứu tại Việt Nam Tiến sĩ Hoàng Thị Lệ Hằng và các cộng sự - Viện Rau quả Việt Nam (2007) đã thực hiện đề tài “Sử dụng chế phẩm enzim β-glucosidaza

từ nhân hạt mơ nhằm khử đắng dịch quả cam” Tiến sĩ Nguyễn Văn Chung – Trung tâm nghiên cứu Thực phẩm- Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu ứng dụng hợp chất cyclodextrin để khử vị đắng trong chế

biến nước bưởi Sản phẩm nước bưởi này được sản xuất có bổ sung đường

1.6 3 Tiềm năng cho công nghiệp sản xuất nước bưởi tại Việt Nam

Hiện nay bưởi quả được tiêu thụ mạnh ở trong nước và có tiềm năng xuất khẩu Nông dân được lợi nhuận cao gấp 2-3 lần (100 triệu đồng/ha) so với trồng cây ăn trái khác như xoài, chôm chôm, nhãn Ngoài lợi ích kinh tế, trồng bưởi còn góp phần cải thiện môi trường sinh thái, thu hút du lịch sinh thái cho địa

Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ bưởi và ưu tiên phát triển cây bưởi Việt Nam

đã đưa ra chiến lược phát triển năm 2015 và định hướng đến năm 2020 về chiến lược phát triển cây bưởi hiện nay: Chiến lược phát triển bưởi Đoan Hùng- dự án xây dựng mô hình trồng mới và thâm canh 167 ha bưởi Chí Đám và 904 ha bưởi Bằng Luân;Chiến lược quy hoạch phát triển bưởi Tân Triều ở Vĩnh cửu đến năm

2010 là 1000 ha; Chiến lược phát triển bưởi Năm Roi ở huyện Bình Minh tỉnh Vĩnh Long phấn đấu đến năm 2015 diện tích trồng bưởi năm roi đạt 3800

nguyên liệu dồi dào phục vụ công nghệ sản xuất nước bưởi

Hiện nay, tại Hà nội có giống bưởi Quế Dương là một trong các giống bưởi quý đang được bảo tồn và nhân giống.Giống bưởi này chủ yếu trồng tại xã Cát Quế- Huyện Hoài Đức- Hà Nội Do cây bưởi Quế Dương có khả năng chống chịu sâu bệnh cao nên năng suất cây trồng của giống bưởi này khá cao, khoảng 58 tấn/ha Đồng thời giống bưởi này cho năng suất thu hái sớm, chỉ sau 5-6 năm trồng mới Hiện nay đang có dự án duy trì và bảo tồn bưởi Quế Dương do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam [44].Hy vọng sự thành công của dự án cùng với

sự phối hợp của chính quyền địa phương về việc trồng tập trung và nhân rộng cây bưởi Quế Dương thì đây sẽ là nguồn nguyên liệu dồi dào cho công nghệ sản xuất nước bưởi, góp phần tạo thêm sản phẩm mới đặc trưng của Hà Nội

Những tồn tại chưa giải quyết:

Trong công nghệ sản xuất nước bưởi, công nghệ xử lý vị đắng là một trong những khâu then chốt Vị đắng là một trong những nguyên nhân gây cản trở trong sản xuất vì chúng thường gây cảm giác khó chịu cho người tiêu dùng Nếu sử dụng chất ngọt để át vị đắng gây hậu quả là tăng tỷ lệ trẻ em mắc bệnh béo phì, bất lợi cho người ăn kiêng vì lý do sức khỏe Do vậy, việc khử đắng bằng các tác nhân

không đường sẽ làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm nước bưởi mà không ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của chúng Hiện nay trên thế giới cyclodextrin được ứng dụng khá phổ biến trong thực phẩm đặc biệt là công nghệ sản xuất đồ uống Trong công nghiệp sản xuất sữa cyclodextrin được sử dụng như một chất mang bao bọc các hợp chất quý bổ sung vào sữa như Taurin, DHA…Trong công nghiệp sản xuất nước quả cyclodextrin được sử dụng để bao bọc các hợp chất gây đắng trong nước bưởi Một trong những hướng nghiên cứu làm giảm vị đắng của nước bưởi là sử dụng cyclodextrin để bao bọc các hợp chất limonoid tránh tiếp xúc trực tiếp với cơ quan vị giác nhưng không làm ảnh hưởng đến chất lượng nước bưởi

CHƯƠNG 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ:

+ Bưởi Năm Roi canh tác tại xã Mỹ Hòa- Bình Minh-Vĩnh Long

+Bưởi Đường lá cam canh tác tại xã Tân Bình- Vĩnh Cửu- Bình Dương +Bưởi Quế Dương trồng tại thôn Cát nổi- Cát Quế - Hoài Đức

+Bưởi Đông Lao trồng tại xã Trung Châu- Đan Phượng

Thời gian thu thập tháng 1,2,3,7,8,9,10,11,12 năm 2010 và 2011 khi bưởi ra quả được 2 tháng và khi mùa thu hoạch bưởi Sau khi thu hái bưởi được bảo quản

+Hệ enzim Utral SP-L là một chế phẩm hỗn hợp của hai enzim pectinase và hemixenlulase có hoạt lực 26.000 PG/ml của hãng Novo –Đan mạch

* Kính hiển vi điện tử Nikon (Nhật Bản)

* Chiết quang kế (Trung Quốc)

* Cân điện tử (Mỹ)

* Máy đo pH (Nhật)

* Máy ép hoa quả (Trung Quốc)

* Hệ thống phân tích HPLC (Nhật)

* Nhiệt kế (Nhật)

* Thiết bị Thanh trùng (Trung Quốc)

* Máy đo tốc độ khuấy (Nhật)

* Thiết bị lọc hút chân không

parafin, ống đong, đồng hồ bấm giây…

2 2 Phương pháp nghiên cứu:

2 2.1 Phương pháp hóa lý:

2 2.1.1.Xác định hàm lượng chất khô tổng số bằng chiết quang kế

Lọc trong dịch quả và tiến hành đo bằng chiết quang kế: dùng đũa thủy tinh

hai lăng kính vào với nhau giá trị đọc được là tỷ lệ % chất khô hòa tan có trong

2 2.1.2.Xác định hàm lượng axit tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N

Bản chất: Trong quả bưởi có nhiều axit citric Độ axit này có thể định

hay kết hợp đều không được tính trong độ chua của dịch quả bưởi, do đó trước khi

Tiến hành: Lấy 1ml dịch cần phân tích cho vào bình tam giác 100ml, thêm

NaOH 0,1 N tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt

Cách tính kết quả:

A = V x K x 1000(g/l) Trong đó:

V: thể tích NaOH 0,1 N tiêu hao (ml) K: lượng axit tương ứng với 1ml NaOH 0,1N (K=0,0064)

2 2.1.3.Xác định hàm lượng đường tổng số theo phương pháp Granxinop

Để xác định hàm lượng đường trong dịch nước bưởi cần phân tích theo phương pháp hóa học thì có rất nhiều phương pháp, nhưng tất cả các phương pháp

hóa học đều dựa trên tính dễ bị oxy hóa của đường đơn

Tiến hành:

Chuẩn bị các dung dịch hóa chất sau:

Dung dịch Methylen xanh 0,5%: Cân 0,5g, hòa tan vào trong cồn 70%, định mức đến 100ml ; Dung dịch KOH 2,5 N: Cân 140g KOH, hòa tan định mức đến 1000ml Để 24 h trước khi sử dụng ; Dung dịch NaOH 10%: Cân 10g NaOH hòa tan, định mức đến 100ml ; Dung dịch phenolphthalein 1%: cân 1g hóa chất hòa tan trong cồn 70% định mức đến 100ml

Dùng pipet lấy 20ml dung dịch ferixyanua kali cho vào bình tam giác 250ml, sau đó thêm 5ml KOH 2,5 N và 3,4 giọt metylen xanh 1% Lắc đều và đặt lên bếp, rồi đun sao cho sau 1-2 phút thì sôi.Sử dụng pipet hút dịch đường cần phân tích nhỏ từ từ sao cho dịch luôn sôi cho tới khi mất màu xanh metylen Khi chuẩn màu của hỗn hợp phản ứng sẽ thay đổi từ xanh sang tím hồng và cuối cùng

là màu vàng rơm thì kết thúc

Hàm lượng đương trong dung dịch pha loãng tính theo công thức:

D = (a/m) x F x 100 Trong đó:

a: là lượng glucoza ứng với 20ml dung dịch ferixyanua kali 1% khối lượng

dùng để chuẩn với 20ml ferixyanua kali 1% Từ số n ml của dịch đường tiêu tốn,

ta tính được 20 ferixyanua kali 1% tương ứng với bao nhiêu gam đường theo công

thức a = (n x 5)/1000 Trong đó 1000 là hệ số quy đổi về gam

2 2.1.4.Phương pháp xác định vitaminC bằng 2,6diclophenoldophenol (2,6D) Nguyên tắc: Vitamin C có nhiều ở các loại quả bưởi.Nó tham gia vào nhiều phản

ứng oxy hóa khử Trong phân tử axit ascorbic chưa nhóm dielnol (-HOC=COH-)

có tính khử mạnh Nó dễ bị oxy hóa để biến thành axit dehydro ascorbic dựa trên tính khử mạnh của axit ascorbic người ta dụng nó để khử muối natri của 2,6D Màu xanh đen của chỉ thị 2,6D (ở dạng oxy hóa) khi gặp axit ascorbic sẽ chuyển

Tiến hành:

Chuẩn bị dung dịch hóa chất:

Dung dịch 2,6D ( indolphenol): Hòa tan 0,05 g 2,6D trong nước cất, sau đó

bổ xung nước đến 100ml và đem lọc;Dung dịch ascorbic chuẩn: Hòa tan 0,05g axit ascorbic tinh khiết vào 60ml axit metaphotphoric 20% Sau đó định mức tới 250ml bằng nước cất.; Axit metaphotphorics 20%; Axeton

*Chuẩn dung dịch indolphenol như sau: Lấy pipet hút 10ml dung dịch axit ascorbic chuẩn vào bình nhỏ, sau đó chuẩn bằng dung dịch indophenol tới khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong khoảng 15 phút Nồng độ của dung dịch chuẩn được thể hiện bằng số mg đương lượng axit ascorbic mà 1ml tác dụng hết.Nếu khi chuẩn 0,02 axit ascorbic tiêu tốn hết V ml dung dịch chuẩn thì:

1ml dung dịch chuẩn = 0,002/V (g) axit ascorbic

* Cho 50ml nước quả vào bình tam giác 100ml sau đó bổ xung 25 ml axit metaphotphoric 20% và định mức tới 100ml bằng nước cất Lấy 10ml hỗn hợp này cho vào bình và thêm 2,5ml axeton, sau đó chuẩn bằng 2,6D tới màu hồng nhạt bền

Tính kết quả: Hàm lượng vitaminC = 20 x V x C (mg/100ml)

2 2.1.5 Phương pháp xác định tỷ lệ phần bỏ đi của quả bưởi:

Phần bỏ đi của quả bưởi bao gồm có: vỏ bưởi, cùi bưởi, màng múi bưởi và hạt

Chọn ngẫu nhiên 3 loại quả có khối lượng: lớn nhất, nhỏ nhất và trung bình mỗi loại 3 quả

Cân để xác định trọng lượng quả

Xác định tỷ lệ phần bỏ đi bằng cách dùng dao gọt vỏ, bóc bỏ cùi, bóc bỏ màng múi bưởi, bỏ hạt rồi cân xác định khối lượng quả còn lại sau khi đã loại bỏ phần bỏ đi

Tỷ lệ phần bỏ đi của quả bưởi được xác định theo công thức :

Trong đó:

V: tỷ lệ phần bỏ đi của quả bưởi

2.2.1 6 Xác định hàm lượng Limonin trong dịch bưởi bằng phương pháp HPLC

Máy HPLC loại có bơm 6000,kim tiêm U6K và chiết quang kế R40 Bộ ghi

Dung môi cloroform-acetonitril(95:5)

Tiến hành

Ly tâm và tách Hỗn hợp chloroform chiết cho bốc hơi đến 1,0ml dưới nitrogen ở

định limonin bằng HPLC

2.2.1.7 Định tính limonin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Sắc lý bản mỏng được làm theo phương pháp của Clifford Scott Cách làm được tiến hành như sau:

hydroxytoluene.Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút sau đó bổ xung 1ml acetonnitribe

- Chất hiện màu: Dung dịch diphenylamin, benzoamin, axit phosphoric và

aceton

nghiệm được chấm lên giấy với lượng khoảng 1μl, đem sấy khô rồi để mẫu chạy trong 2 giờ Sau khi kết thúc quá trình chạy bản sắc ký được phun chất hiện màu rồi sấy khô

2.2.2.Ph ương pháp vi sinh

2.2.2.1.Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí(TCVN 4884-2005)

Môi trường nuôi cấy :Plate Count Agar (PCA)

Môi trường được pha chế, phân phối vào trong các bình thủy tinh hay trong

nghiệm chứa môi trường chưa sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ

bể điều nhiệt

Chuẩn bị dung dịch muối pepton (SPW) để pha loãng.Dung dịch này được chứa trong các bình 1lít, hấp khử trùng và được phân phối thành các thể tích chính xác 9ml vào trong các ống nghiệm vô trùng

Quy trình phân tích:

Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích:

Hút 10ml mẫu cần phân tích cho vào bình tam giác chứa 90ml nước SPW

đã được hấp khử trùng, lắc đều trong 2 phút Dung dịch mẫu thu được có độ pha

Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách

pha loãng Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex)

chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9 ml dung dịch pha loãng

tương tự để có các độ pha loãng thập phân tiếp theo cho đến độ pha loãng cần thiết

Cấy mẫu: