Nghiên cứu tính chất bề mặt và tính chất kết lắng của nấm men saccharomyces

Nghiên cứu tính chất bề mặt và tính chất kết lắng của nấm men saccharomyces Nghiên cứu tính chất bề mặt và tính chất kết lắng của nấm men saccharomyces Nghiên cứu tính chất bề mặt và tính chất kết lắng của nấm men saccharomyces luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

Hµ néi 2006

Hµ Néi

2006

Lời cám ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục bảng biểu, sơ đồ

Danh mục hình vẽ và đồ thị

Mở đầu……… 1

Chương 1: Tổng quan…….……… 3

1.1 Giới thiệu chung về nấm men và nấm men Saccharomyces 3

1.1.1 Sơ lược về nấm men ……… 3

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của nấm men……… 4

1.1.1.2 Sinh sản và chu kỳ sống của nấm men……… 7

1.1.2 Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces……… 10

1.1.2.1 Sơ qua về đặc điểm sinh lý, sinh hoá ……… 10

1.1.2.2 Nhìn lại cấu tạo tế bào……… 11

1.1.2.3 Cấu tạo thành tế bào nấm men Saccharomyces……… 12

1.2 Tính chất bề mặt của nấm men……… 13

1.2.1 Sự kết dính của nấm men.……… 13

1.2.1.1 Tương tác hoá lý……… 14

1.2.1.2 Tương tác cơ học……… 14

1.2.1.3 Tương tác đặc hiệu……… 15

1.2.2 Khái quát về tính chất bề mặt của nấm men……… 15

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất bề mặt của nấm men… 16

1.2.3.1 Thành phấn hoá học của bề mặt tế bào…… ……… 16

1.3 Tính chất kết lắng của nấm men Saccharomyces………… 18

1.3.1 Khái niệm……… 18

1.3.2 Cơ chế của quá trình kết lắng……… 20

1.3.2.1 Các lực liên quan đến tương tác tế bào……… 21

1.3.2.2 Các giả thuyết về quá trình kết lắng của nấm men………… … 22

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất kết lắng của nấm men… 25 1.3.3.1 Thành phần và cấu trúc của thành tế bào ……… 25

1.3.3.2 Tính chất di truyền……… ……… 26

1.3.3.3 Khả năng tạo keo……… 27

1.3.3.4 Điều kiện và thành phần môi trường ……… … 29

1.3.3.5 Đặc điểm sinh lý của tế bào nấm men……… 34

1.3.3.6 Tính chất bề mặt……… 36

1.4 Nhũ tương thực phẩm và tính chất nhũ hoá của nấm men Saccharomyces……… 37

1.4.1 Nhũ tương thực phẩm……… 37

1.4.1.1 Sự hình thành nhũ tương……… 38

1.4.1.2 Độ bền nhũ tương……… 38

1.4.1.3 Tác nhân phá vỡ độ bền nhũ tương……… 41

1.4.2 Tính chất nhũ hoá của nấm men……… 42

1.4.2.1 Tương tác giữa hạt nhũ tương và tế bào vi sinh vật……… 42

1.4.2.2 Tác động của thành phần bề mặt tế bào nấm men đối với dung dịch nhũ tương……… 43

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu…… 45

2.1.1.2 Hóa chất……… 45

2.1.2 Các thiết bị sử dụng……… 46

2.2 Môi trường……… 46

2.2.1 Môi trường Hansen……… 46

2.2.2 Môi trường hoạt hóa……… 47

2.2.3 Môi trường cấp 2……… 47

2.2.4 Môi trường cấp 3……… 47

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 47

2.3.1 Phương pháp vi sinh……… 47

2.3.1.1 Phân lập vi sinh vật……… 47

2.3.1.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men ……… 48

2.3.1.3 Nuôi cấy nấm men……… 49

2.3.1.4 Đếm số lượng tế bào sử dụng buồng đếm Thomas……… 50

2.3.1.5 Nhuộm màu xanh metylen……… 51

2.3.1.6 Xác định độ kết lắng của nấm men……… 52

2.3.2 Phương pháp hóa lý……… 53

2.3.2.1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp quang phổ hấp thụ 53

2.3.2.2 Test MATS……… 54

2.3.2.3 Phương pháp xác định độ bền nhũ tương……… 55

Chương 3: Kết quả và thảo luận……… 57

3.1 Tính chất bề mặt của một số chủng nấm men……… 57

3.1.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của một số chủng nấm men Saccharomyces nghiên cứu……….……… 57 3.1.2 Tính chất bề mặt của một số chủng nấm men Saccharomyces 59

3.1.3.3 ảnh hưởng của quá trình khuấy trộn……… 65

3.2 Xác định tính chất kết lắng và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết lắng của nấm men ……… 66

3.2.1 Tính chất kết lắng của các chủng nấm men nghiên cứu…… 66

3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất kết lắng của nấm men… 69 3.2.2.1 ảnh hưởng của trạng thái sinh lý tế bào nấm men……… 69

3.2.2.2 ảnh hưởng của nhiệt độ……… 71

3.2.2.3 ảnh hưởng của pH……… 72

3.2.2.4 ảnh hưởng của các loại đường……… 73

3.2.2.5 ảnh hưởng của nồng độ etylic……… 75

3.2.2.6 ảnh hưởng của quá trình khuấy trộn.……… 76

3.3 ứng dụng tính chất bề mặt vào công nghệ thực phẩm …… 77

3.3.1 Mối quan hệ giữa tính chất bề mặt và tính chất kết lắng…… 77

3.3.1.1 ảnh hưởng của trạng thái sinh lý tế bào……… 79

3.3.1.2 ảnh hưởng của pH……… 80

3.3.1.3 ảnh hưởng của quá trình khuấy trộn……… 81

3.4 Tác dụng của nấm men đến độ bền nhũ tương ……… 82

Kết luận……….……… 86

Triển vọng và đề nghị……… 87

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

được sử dụng rộng rãi trong rất nhiều các công nghệ sản xuất thực phẩm bao gồm các sản phẩm đồ uống lên men, các sản phẩm sữa, các sản phẩm bánh

mỳ, thức ăn gia súc Nhất là trong các các quá trình sản xuất đồ uống lên men nấm men đóng vai trò là tác nhân lên men chuyển hóa từ đường glucoza

Tuy nhiên sự có mặt của nấm men trong nhiều sản phẩm thực phẩm cuối cùng

là điều không mong muốn đặc biệt đối với các sản phẩm đồ uống lên men như rượu, bia cider … vì vậy cần phải tách chúng ra khỏi sản phẩm một cách hiệu quả là một yêu cầu công nghệ được rất nhiều các nhà khoa học và các nhà sản xuất quan tâm nghiên cứu [11, 15] Trước tình hình đó, việc nghiên cứu tính chất kết lắng của nấm men đóng một vai trò hết sức quan trọng

Do đó với mục đích tìm hiểu vai trò và tác động của nấm men

Saccharomyces đến các sản phẩm thực phẩm chúng tôi đã tiến hành: “Nghiên

cứu tính chất bề mặt và tính chất kết lắng của nấm men Saccharomyces

và ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm“

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất bề mặt của nấm men

3 Xác định tính chất kết lắng của nấm men

4 Nghiên cứu các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến tính chất kết lắng của nấm men

5 Tìm hiểu sự liên quan quan giữa tính chất bề mặt và tính chất kết lắng của nấm men

6 Nghiên cứu ảnh hưởng của tính chất bề mặt nấm men đến sự ổn định của nhũ tương thực phẩm

Chương 1: Tổng quan

.1 Giới thiệu chung về nấm men và nấm men Saccharomyces

.1.1 Sơ lược về nấm men

Nấm men (Yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có

vị trí phân loại không thống nhất nhưng có chung các đặc điểm [1] sau đây:

- Nói chung, tồn tại ở trạng thái đơn bào

- Đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi hình thức phân cắt

tế bào

- Nhiều loại có khả năng lên men đường

- Thành tế bào có chứa mannan

- Thích nghi với môi trường chứa đường cao, có tính axit cao

Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên nhất là trong các môi trường

có chứa đường, có pH thấp chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa mật mía, rỉ

đường, mật ong, trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ

Rất nhiều loại nấm men được ứng dụng rộng rãi trong nhiều trong công nghiệp thực phẩm rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, gây hương nước chấm, sản xuất chất béo, lipit nấm men, sản xuất các enzym như amilaza, invectaza, lactaza, uricaza, polygalacturonaza, sản xuất ergosterol, axit

Tuy nhiên bên cạnh các loại nấm men có lợi cũng có những nấm men có hại cho sản xuất làm nhiễm các quá trình công nghệ và gây hư hỏng sản phẩm thực phẩm tươi sống cũng như đã chễ biến Có khoảng 13 – 15 loài nấm men

có khả năng gây bệnh cho người và các động vật chăn nuôi, đáng chú ý nhất là

các loài Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Tripchosporon cutaneun, Trichosporon capitatun …

.1.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của nấm men

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật (eucaryot) [1] Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn

Hình 1.1: Hình dạng tế bào sinh dưỡng của một số loại nấm men [9]

(a) Saccharomyces cerevisiae (b) Schizosaccharomyces pombe

(c) Nadsonia sp (d) Sterigmatomyces halophilus

(e) Trigonopsis variablis (f) Oosporidium margaritiferum

Tuỳ loại nấm men mà tế bào có dạng hình cầu hay hình trứng, hình ôvan (Saccharomyces cerevisiae) (Hình 1.1-a), hình chanh tây (Nadsonia sp.)

(Hình 1.1-c), hình elíp, hình mũ phớt, hình mụn cơm, hình sao thổ, hình cái

cung nhọn, hình tam giác (Trigonopsis variablis) (Hình 1.1-e), hình thoi, hình

lưỡi liềm, hình thấu kính, hình elíp dài, hình quả lê, hình kim không có phần

Có loại nấm men có khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả [1] Khuẩn ty giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài Có loại có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể Thành tế bào nấm men dày khoảng 25 nm (chiếm 25% khối lượng khô của tế bào) Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan Một số nấm men có thành

tế bào chứa kitin và mannan Trong thành tế bào nấm men còn có chứa khoảng 10% protein (tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần là các enzim Trên thành tế bào còn thấy cả một lượng nhỏ lipit

Hình 1.2: Cấu tạo thành tế bào nấm men [24]

Thành tế bào có cấu tạo hai lớp với tỷ lệ glucan và mannan khác nhau, trong đó glucan (chiếm 70 % lượng chất khô có trong tế bào) là một hợp chất cao phân tử có chứa D-glucoza đây là một polysacarit phân nhánh có liên kết

β 1,6 và β 1,3 còn mannan là một hợp chất cao phân tử của D-manoza ở đó

mỗi phân tử thường chứa từ 200 - 400 gốc manoza, mannan cũng là một

β-glucan, protein

Mannoprotein, protein

polysacarit phân nhánh chứa các liên kết (-1,6 ; -1,2 ; -1,3) và có phân tử lượng là 5,9.104Da

Ngoài tác dụng tạo hình dạng và độ bền cho tế bào nấm men thì thành tế bào nấm men còn thể hiện các tính chất đặc biệt khác như tính chất bề mặt do thành phần hóa học của thành tế bào Thành tế bào nấm men chứa 15 - 20% chất khô trong đó có hàm lượng protein chiếm (6 - 14%) và thường thường protein của nó liên kết với các phần hydrat cacbon và tạo thành các phức chất giàu lưu huỳnh tồn tại dưới dạng disunfit (-S-S-) hoặc silfidrin (-SH-) Ngoài protein màng tế bào còn chứa lipit (4 - 8%), chất tro (4 - 7%), kitin (0,5 - 1%),

đường khử, axít amin, nitơ và các chất khoáng [26] Thành phần hoá học của thành tế bào nấm men có thể thay đổi tuỳ thuộc vào nhiều nguyên nhân khác nhau mà trước hết là do tốc độ của sự phân cắt tế bào Khi rút ngắn thời gian phân cắt nói chung hàm lượng của các chất đều giảm xuống Thành phần hoá học của màng các nấm men khác nhau thì khác nhau, mặc dù có nhiều nấm men luôn chứa nhiều glucan nhưng không phải bao giờ cũng liên kết với mannan, thường những loại nấm men không chứa mannan (trừ giống

Schizosaccharomyces) lại chứa khá nhiều kitin Trên thành tế bào nấm men

chứa nhiều lỗ nhỏ (đường kính khoảng 3,6 nm), qua các lỗ này chất dinh dưỡng được đưa vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất được thải ra môi trường xung quanh

Nhiệm vụ của thành tế bào nấm men là bảo vệ hình thái tế bào duy trì áp suất thẩm thấu bên trong và góp phần điều hoà các quá trình trao đổi chất Các chất dinh dưỡng được hấp thụ chọn lọc qua thành tế bào Tốc độ hấp thụ và

đồng hoá các chất dinh dưỡng phụ thuộc một phần vào hoạt tính của các enzim chứa trong thành tế bào Ví dụ enzym phosphataza đẩy mạnh sự hấp thụ glucoza và photphat còn enzim invectaza xúc tác quá trình thuỷ phân sacaroza thành đường đơn Nhìn chung tốc độ hấp thụ chất dinh dưỡng bên ngoài tuỳ

thuộc từng loài nấm men, lứa tuổi tế bào, trạng thái sinh lý của tế bào và điều kiện môi trường nuôi cấy cũng như điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào Dưới lớp thành tế bào nấm men là lớp màng tế bào chất [1] Sinh khối nấm men khi đưa vào trong dung dịch có áp suất thẩm thấu, li tâm để tấch ra màng tế bào chất, rửa và li tâm lại để thuần khiết màng Quan sát dưới kính hiển vi thấy nó có 3 tầng kết cấu khác nhau Cấu tạo chủ yếu là protein (chiếm

50 % khối lượng khô) phần còn lại là lipit (40 % trong đó bao gồm lipit glixero-monoeste, lipit glixero-dieste, lipit glixero-trieste, glixero-photpho lipit và sterol) và một ít polysacarit Phần sterol trong màng tế bào nấm men khi được chiếu tia tử ngoại có thể chuyển thành vitamin D2 Lượng sterol

% khối lượng khô của tế bào

Nhân của tế bào nấm men được bao bọc bởi màng nhân như các sinh vật

có nhân thật Màng nhân của nấm men có cấu trúc 2 lớp và có nhiều lỗ thủng

Ti thể của nấm men cũng giống với các nấm sợi và các sinh vật có nhân khác ADN ti thể nấm men là phân tử dạng vòng có khối lượng phân tử là 50 x

men chiếm 15 – 23 % tổng lượng ADN của toàn tế bào nấm men

Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào Trong không bào

có chứa các enzim thuỷ phân, poliphotphat, lipoit, iôn kim loại và các sản phẩm trao đổi chất trung gian Ngoài tac dụng một kho dự trữ không bào còn

có chức năng điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào

màng dày khoảng 7 nm Vi thể có vai trò nhất định trong quá trình oxi hoá metanol

.1.1.2 Sinh sản và chu kỳ sống của nấm men

Nấm men có nhiều phương thức sinh sôi nảy nở khác nhau [1]:

a Sinh sản vô tính

- Phương thức nảy chồi: Nảy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất

ở nấm men ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở nhanh, quan sát dưới kính hiển vi thấy hầu như tế bào nấm men nào cũng có chồi Khi một chồi xuất hiện các enzim thuỷ phân sẽ làm phân giải phần polysacarit của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi làm chồi phình to dần lên, khi đó sẽ làm xuất hiện một vách ngăn giũa chồi và tế bào mẹ Thành phần của vách ngăn cũng tương tự như thành tế bào Khi tế bào chồi tách khỏi tế bào mẹ ở chỗ tách ra còn giữ lại một vết sẹo của chồi, trên tế bào con cũng mang một vết sẹo

- Phương thức phân cắt: Phân cắt là hình thức sinh sản chỉ thấy ở chi nấm men Schizosaccharomyces Lối phân cắt tương tự như ở vi khuẩn Tế

đương nhau, mỗi tế bào con có một nhân

- Phương thức sinh sản bằng bảo tử:

Sporidiobolus, Bullera và Aessosporon Loại bào tử này hình thận sinh

ra trên một cuống nhỏ mọc ở các tế bào dinh dưỡng hình trứng Sau khi các bào tử chín nhờ một cơ chế đặc biệt bào tử sẽ được bắn ra phía đối diện

+ Bào tử áo: hay còn gọi là bào tử màng dày: thường gặp ở chi nấm men

Candida albicans Bào tử này mọc ở đỉnh các ty khuẩn giả

(pseudomycelium)

b Sinh sản hữu tính

nấm men khác thuộc bộ Endomycetales Bào tử túi được sinh ra trong các túi (hai tế bào khác nhau mang dấu + và -) đứng gần nhau sẽ mọc ra hai mấu lồi Chúng tiến lại gần nhau và tiếp nối với nhau Chỗ tiếp nối sẽ tạo ra một lỗ thông và qua đó chất nguyên sinh có thể đi qua để tiến hành phối chất, nhân cùng đi qua đế tiến hành phối nhân Sau đó nhân phân cách thành 2, thành 4, thành 8 Mỗi nhân được bao bọc bởi một chất nguyên sinh rồi được tạo màng dày xung quanh và hình thành các bào tử túi Tế bào dinh dưỡng biến thành túi

c Chu kỳ sống của nấm men

Có thể chia thành 3 loại chính:

- Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) có thể tiếp hợp với nhau để tạo ra tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) Sau quá trình giảm phân các bào tử túi (thường là 4 bào tử túi) Bình thường khi không có sinh sản hữu tính chúng vẫn liên tục nảy chồi sinh sôi nảy nở Chu kỳ sống này thấy ở

- Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) sinh sản theo lối phân cắt Hai tế bào khác dấu ở gần nhau sẽ tiếp hợp và sau quá trình phân cắt 3 lần, lần đầu giảm nhiễn sẽ tạo ra 8 túi bào tử Tế bào mang 8 bào tử này sẽ trở thành túi Khi túi vỡ các bào tử túi sẽ thoát ra ngoài và khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển trở lại thành các tế bào dinh dưỡng Chu ký sống này

- Thể dinh dưỡng chỉ có thể tồn tại ở dạng lưỡng bội (2n) sinh sản theo lối nảy chồi khá lâu Bào tử túi đơn bội tiếp hợp từng đôi với nhau ngay

cả từ khi còn nằm trong túi và không thể sống một cách độc lập Có thể

.1.2 Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces

.1.2.1 Sơ qua về đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Loại nấm men nhà máy rượu và nhà máy bia thường dùng là

Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces carlsbergensis có kích thước

dưới kính hiển vi

Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình trai như Saccharomyces ludwigii

Nói chung hình dáng tế bào nấm men ở các loài khác nhau thì khác nhau, trong cùng một loài hình dáng tế bào cũng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào [26]

của chúng rất giàu protein, vitamin và lipit Nấm men có khả năng lên men

đường thành rượu trong các điều kiện yếm khí còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tạo sinh khối tế bào Có nhiều đặc điểm sinh lý, sinh hóa

trong quá trình nuôi cấy, nhiệt độ tối ưu, nhiệt độ tối thiểu, nhiệt độ cực đại cho sinh trưởng và phát triển của các chủng, khả năng chịu oxy và chịu muối, khả năng tạo khí và các chất bay hơi, độ nhạy cảm với các chất kháng sinh, các chất ức chế …

Ví dụ nấm men có nhiều cách biểu hiện khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện có hay không có không khí (Phụ lục 1) [25]

Nếu không có mặt không khí thì nấm men xúc tác quá trình lên men rượu, chuyển hoá một phân tử đường (glucoza hoặc fructoza) thành hai phân

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 34ATP + Q

Như vậy trường hợp này tạo ra 34 ATP (gấp 17 lần so với trường hợp trước) đây là quá trình nấm men tập trung phát triển để thúc đẩy sự tăng trưởng của chúng vì vậy lượng sinh khối tăng nhanh còn rượu etylic thì có thể không được tạo ra nữa hoặc tạo ra rất ít

.1.2.2 Nhìn lại cấu tạo tế bào

Tế bào nấm men được bao bọc bởi thành tế bào có tác dụng tạo hình dạng

và độ bền cho nó Bên trong thành tế bào là một lớp thứ hai mỏng hơn, đó là màng nguyên sinh chất Màng nguyên sinh chất bao xung quanh nguyên sinh chất là nơi thực hiện mọi quá trình tổng hợp, phân giải các chất của tế bào trên cơ sở đó tế bào luôn đổi mới và phát triển Thành phần hóa học chủ yếu của nguyên sinh chất là các hạt axit ribonucleic, các riboxom cũng như các chất

dự trữ Thành tế bào, màng, bộ máy di truyền là những thành phần chủ yếu của tế bào nấm men Ngoài ra còn có thể có các thành phần khác đó là các polyme bề mặt ngoài hoặc có bản chất polysaccarit như mannan, glucan hoặc

có bản chất protein như phức chất giữa protein và hydrocacbon (mannoprotein) là lớp protein trên bề mặt hay các phức chất giàu lưu huỳnh có liên kết dạng disunfit (-S-S-) hoặc silfidrin (-SH-)

Hình 1.3: Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces [9]

Do dễ dàng tạo sinh khối và là tác nhân quan trọng trong công nghiệp lên

và cấu trúc thành tế bào của loại nấm men này [15] Thành tế bào nấm men

Saccharomyces bao quanh không gian chứa nguyên sinh chất dày khoảng 100

- 200 nm và chiếm 15 – 25 % trọng lượng khô của tế bào Trong đó, thành phần của thành tế bào có khoảng 60 – 85 % hydratcacbon, mà ở đó có một

α-mannan cùng là thành phần chủ yếu trong số hydrocacbon có trong thành tế

bào

Vựng mọc chồi tiếp Màng tế bào chất

Theo nghiên cứu của Freimund, Sauter, Kappeli và Dutler [11] thì thành phần

- 39 – 56% là polysacarit (chủ yếu là glucan và mannan)

- 20 – 29% là protein (gồm protein tự do và mannoprotein)

- 11 – 13% là lipit

Hình 1.4: Cấu tạo thành tế bào nấm men Saccharomyces [9]

.2 Tính chất bề mặt của nấm men

1.2.1 Sự kết dính của nấm men

Một trong những vấn đề chính của công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học và y tế là vấn đề vệ sinh, đây là vấn đề liên quan đến đặc tính gắn kết trên bề mặt của vi sinh vật [27] Sự kết dính của vi sinh vật là do các bề mặt của vi sinh vật kết dính với nhau theo 3 dạng tương tác sau:

- Tương tác hóa lý

Bờn ngoài

Màng tế bào chất

β-1,3 glucan Glycogen

Bờn trong

Khụng gian giữa màng

và th ành tế bào

Mannoprotein cố định trờn màng tế bào

β-1,3 và β-1,6 glucan

Mannoprotein liờn kết cộng húa trị với glucan

Kitin liờn lết vắt chộo với glucan

Thành enzym tạo ra

Với hầu hết các điều kiện sinh lý thì bề mặt tế bào nấm men

Saccharomyces tích điện âm Hầu hết các bề mặt tự nhiên cũng tích điện âm,

vì thế khi nấm men tiếp xúc các bề mặt này sẽ phải chịu lực đẩy của lớp điện tích kép Những nghiên cứu đã chỉ ra tầm quan trọng của các tương tác của lớp

điện kép đến sự kết dính của nấm men

Bề mặt tế bào nấm men là một bề mặt động, nó tác động mạnh mẽ đến sự thay đổi của môi trường qua sự hấp thụ các ion và các cấu tử có khối lượng phân tử lớn Các nhóm tích điện sẽ kết hợp hoặc phân ly dưới sự thay đổi của

pH hoặc mật độ ion trong dung dịch huyền phù hoặc khi tiếp xúc với một bề mặt tích điện hoặc bề mặt tế bào nấm men khác Thêm vào đó, nó sẽ dẫn theo

sự thay đổi trong quá trình hình thành các phần tử phụ khác có trên bề mặt tế bào Ngoài ra, bề mặt tế bào nấm men có khả năng hấp thụ các dung môi, các chất tan do có sự xuất hiện của các lớp mannoprotein, glucan, glycogen trên

bề mặt tế bào nấm men Trong thành tế bào nấm men có các nhóm tích điện tồn tại, sự phân bố của các nhóm tích điện này chịu ảnh hưởng của lớp điện tích kép Sự kết dính này khác với sự kết dính của các chất keo tổng hợp đối với các bề mặt khác

Theo thuyết DLVO (Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek) sự tương tác của lớp điện tích kép trong sự kết dính của nấm men bao gồm các tương tác Van der Waals, tương tác tĩnh điện và tương tác axit/bazơ Lewis

1.2.1.2 Tương tác cơ học

Các vi sinh vật có thể kết dính với bề mặt tùy theo tính chất vật lý của bề mặt như độ nhám hay độ mấp mô của bề mặt

1.2.1.3 Tương tác đặc hiệu

Kết dính là một hiện tượng gắn kết mà chất kết dính được sử dụng là một phân tử đặc biệt có khả năng gắn với một phân tử của tế bào cố định trên chất

mà ta gọi là chất gắn

1.2.2 Khái quát về tính chất bề mặt của nấm men

Theo nghiên cứu của Tiina Nakari-Setọlọ và cộng sự [17] về tính chất bề

Tính chất kỵ nước của cả hai loại nấm men lên men nổi và lên men chìm

đã được nghiên cứu từ rất nhiều năm trước trên thế giới Đây là những loại nấm men quan trọng được sử dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất bia, rượu vang, rượu cồn … Qua nghiên cứu cho thấy 3 chủng nấm men tuy đều có

khác nhau khá rõ rệt Tuy nhiên, với các thành phần môi trường khác nhau chúng lại thể hiện tính chất bề mặt khác nhau Trong môi trường phân cực thì chủng VTTC-99315 có góc tiếp xúc lớn hơn 2 chủng H2155 và H2749, tuy nhiên trong môi trường không phân cực thì VTTC-99315 lại thể hiện góc tiếp xúc nhỏ hơn 2 chủng kia Và từ đó có kết quả về độ kỵ nước của các chủng nghiên cứu như sau: H2749 (23,7) > H2155 (17,3) > VTTC-99315 (7,2) Hơn nữa, nghiên cứu trên cũng góp phần khẳng định thêm kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Amory D E., Rouxhet P G [7] là các chủng nấm men

Saccharomyces đều có đặc tính kị nước và cho điện tử (bề mặt tích điện âm)

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất bề mặt của nấm men

1.2.3.1 Thành phần hóa học của bề mặt tế bào

Như đã trình bày ở phần 1.1.2.3 thì rõ ràng sự kết dính của vi sinh vật phụ thuộc vào thành phần hóa học của bề mặt tế bào Các nhóm chất hóa học thường là protein, polysacarit, glucan, mannoprotein, axit teichoic và kitin có trên bề mặt tế bào là nguyên nhân gây ra những tính chất hóa lí, bề mặt tích

điện, đặc tính axit/bazơ Lewis và tương tác Van der Waals

Tính ưa nước được xác định bằng góc tiếp xúc tỷ lệ nghịch với O/C và tỷ

lệ thuận với chỉ số N/C Nói cách khác, tính ưa nước sẽ tương ứng với nồng độ polysacarit cao và nồng độ các hợp chất hydrocacbon thấp Phân tích vĩ mô thành phần thành tế bào bằng quang phổ điện tử đã chỉ ra rằng lớp ngoài cùng dày 5 – 10nm của tế bào lạnh khô giàu nhóm cacboxyl và photphat, là những

bề mặt ưa nước và tích điện âm ở pH thấp Trong khi đó, bề mặt tế bào kị nước

Điện tích bề mặt đóng vai trò chủ yếu đối với các tương tác tĩnh điện ảnh hưởng đến sự phân cực của bề mặt tế bào Bề mặt tích điện âm có thể là do số lượng nhóm cacboxyl (pKa = 3,95) và nhóm photphat (pKa = 2,15) nhiều hơn

số lượng nhóm amin (pKa = 9,67) Các nhóm này định vị trên bề mặt đại phân

tử và hướng về phía môi trường xung quanh Điện tích của chúng phụ thuộc vào pH môi trường

Trên bề mặt của nấm men có chứa nhiều mannoprotein, glucan nên dẽ dàng tạo ra các liên kết giữa mannan của bề mặt tế bào nấm men này với các protein của bề mặt tế bào nấm men khác vì vậy tế bào nấm men kết dính vói nhau thuận lợi hơn

1.2.3.2 Trạng thái sinh lý của tế bào

Sự kết dính của tế bào nấm men có thể thay đổi trong quá trình sinh trưởng tùy theo hợp chất bề mặt được tạo ra khác nhau trong pha phát triển logarit hay pha phát triển cân bằng

1.2.3.3 Thành phần môi trường

Trong từng môi trường cụ thể, nấm men có khả năng kết dính tốt hay kém Các nghiên cứu về tính chất kị nước, tính chất axit/bazơ Lewis của tế bào nấm men được các nhà nghiên cứu tiến hành thông qua các phương pháp MATS và nhận thấy các chủng nấm men đều ái lực kết dính mạnh nhất trong dung môi kỵ nước và mạnh trong dung môi bazơ và rất yếu trong dung môi axit

1.2.3.4 Điều kiện nuôi cấy

a Thành phần môi trường nuôi cấy

Các nguyên liệu có những đặc tính riêng biệt cho phép nấm men kết dính tốt hơn hoặc kém hơn Các tác nhân sinh học, hóa học cũng làm ảnh hưởng

đến khả năng kết dính của nấm men

Các chất dinh dưỡng có ảnh hưởng rất nhiều đến tính chất bề mặt của nấm men do nó làm thay tính chất kị nước của bề mặt tế bào nấm men Cụ thể theo nghiên cứu của Gerrit Smit và cộng sự [21] thì khi thiếu dinh dưỡng tính

kị nước của bề mặt các tế bào nấm men tăng lên

b Nhiệt độ

Nhiệt độ tăng trưởng có thể có ảnh hưởng đến tính chất bề mặt của vi sinh vật cũng như các chất dinh dưỡng Theo nghiên cứu của tác giả Giovanaci

và cộng sự thì sự giảm nhiệt độ tăng trưởng kéo theo sự giảm độ tích điện âm

và tính kỵ nước cũng như đặc tính bazơ của chủng nấm men Còn theo tác giả Gallardo-Moreno A M và cộng sự [14] khẳng định nhiệt độ đóng vai trò là một tác nhân quan trọng liên quan đến tính chất hóa lý và tính kết dính của các tế bào nấm men

c pH và lực ion

pH và lực ion của môi trường có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự kết dính của các vi sinh vật bằng cách thay đổi tính chất tích điện của các phần tử khác nhau trong môi trường và từ đó làm thay đổi tương tác tĩnh điện Kết quả dẫn

đến khả năng kết dính của các tế bào nấm men cũng thay đổi theo

d Quá trình nuôi cấy lắc

Tốc độ và thời gian lắc cũng có ảnh hưởng nhất định đến khả năng kết dính của vi sinh vật Dưới tác động cơ học khác nhau cũng làm thay đổi mức

độ va chạm của các tế bào trong môi trường và có khả năng ảnh hưởng đến độ mấp mô của bề mặt tế bào nấm men

1.3 Tính chất kết lắng của nấm men Saccharomyces

1.3.1 Khái niệm

Kết lắng là quá trình thuận nghịch mà các tế bào nấm men gắn kết với nhau dưới dạng kết tụ (aggregation) Quá trình kết tụ vi sinh vật chính là quá

trình tập hợp các tế bào dựa trên mối liên hệ mật thiết hoặc là sự kết hợp (gathering) của các đơn vị nhỏ tạo thành đơn vị lớn hơn Vì vậy, quá trình kết

tụ có thể bao gồm cả quá trình kết dính (agglutination hay mating) (Hình 1.5 – a) Và quá trình kết lắng (flocculation) (Hình 1.5 – c) đây là quá trình các

tế bào kết dính với nhau có thể do sự hình thành cầu canxi hoặc theo thuyết lectin đó là liên kết protein-hydrocacbon

Hình 1.5: Các hình thức kết dính của nấm men Saccharomyces [15]

a) Sự kết dính theo giới tính

c) Sự kết lắng b) Sự tạo chuỗi

Tế bào cảm ứng α

Yếu tố a

Tế bào cảm ứng a

Tế bào cảm ứng α

Tế bào cảm ứng a

Tuy nhiên đó không phải quá trình tạo thành chuỗi (chain formation) (Hình 1.5 – b) đó là trường hợp các tế bào nấm men mọc chồi nhưng tế bào con không tách dời khỏi tế bào mẹ trong quá trình phân bào

Theo định nghĩa của Yu-Lai Jin và R Alex Speers [15] trong bài báo viết

Saccharomyces cerevisiae” thì hiện tượng kết lắng của nấm men là ‘hiện

tượng tại đó các tế bào nấm men gắn kết với nhau thành đám, cụm và nhanh chóng tạo cặn và lắng xuống đáy của thiết bị mà bên trong có chứa canh trường nấm men’

Trải qua nhiều năm nghiên cứu về tính chất kết lắng của vi sinh vật và

đặc biệt là nấm men thì Gilliland và Helm [15] cho rằng nếu phân loại theo khả năng kết lắng thì nấm men bao gồm 4 loại sau:

• Loại 1: loại nấm men không kết lắng hay còn gọi là nấm men dạng bụi

• Loại 2: loại có khả năng kết lắng thành các đám nhỏ và có xu hướng kết

lắng ở cuối giai đoạn cuối quá trình lên men Ngoài ra, đây là loại có mức

độ kết lắng vừa phải và phân ly rất tốt trong môi trường lên men

Kết lắng về phương diện di truyền thì được kiểm soát bởi các đặc tính của

men không thể kết lắng và việc đưa gen FLO có thể khơi mào cho quá trình

kết lắng đối với chủng không kết lắng Liên kết của các zymolectin có trên thành tế bào kết lắng với các gốc đường hoặc với các thành tế bào xung quanh

bào ảnh hưởng đến mức độ kết lắng

Các đám kết lắng có thể có từ hàng nghìn tế bào trở lên và tính chất kết lắng của tế bào dựa trên các tương tác giữa thành tế bào - thành tế bào Vì các

tế bào không bị tác động bởi chuyển động Brown nên việc khuấy trộn là yếu

tố cần thiết cho quá trình kết lắng

Khả năng kết lắng của các tế bào nấm men lên men đồ uống được thể hiện ở giai đoạn cuối pha phát triển logarit hoặc đầu pha phát triển cân bằng Nói cách khác, các tế bào của chủng nấm men không kết lắng thì luôn luôn không có khả năng kết lắng nhưng không phải các tế bào của chủng nấm men kết lắng luôn luôn có khả năng kết lắng Tuy nhiên, đáng chú ý là người ta quan sát thấy quá trình kết lắng là không đổi đối với chủng nấm men có cấu tạo theo kiểu gen đơn bội Hiện tượng kết lắng của nấm men phụ thuộc vào các ion canxi và các phân tử đường đặc hiệu Người ta cũng biết rằng các protein trên bề mặt tế bào có liên quan đến quá trình kết lắng Cầu hydro và các tương tác kỵ nước cũng có liên quan đến tính chất kết lắng giữa tế bào - tế bào [13] Cũng như vậy, có một tế bào thuộc chủng không kết lắng có thể kết lắng cùng nhau hoặc cùng kết lắng với các tế bào thuộc chủng kết lắng khác 1.3.2.1 Các lực liên quan đến tương tác tế bào

a Lực đẩy tĩnh điện:

Sự xuất hiện các điện tích âm trên bề mặt tế bào nấm men tại giá trị pH sinh lý đã được biết đến từ 5 thế kỷ trở lại đây Cả hai nhóm cacboxyl và este diphotpho có khả năng tham gia vào sự tạo ra bề mặt tích điện âm của tế bào mặc dù chỉ có các nhóm cacboxyl được biết đến là có tham gia vào sự hình

thành nên cầu canxi trong quá trình kết lắng Lực đẩy tĩnh điện có thể giúp các tế bào cách nhau một khoảng là 10 nm Lực đẩy như vậy sẽ giúp cho các phân tán trong môi trường trước khi chúng kết lắng và tác động giống như rào cản quá trình kết lắng

b Lực hút tĩnh điện:

Người ta thấy rằng nấm men kết tụ với nhau là do lực Van der Waals [9,

11, 15] Nếu không có các dạng lực hút khác thì đúng là Van der Waals là lực quan trọng hơn cả lực hút tĩnh điện gây ra hiện tượng kết lắng của các tế bào Cầu hydro cũng tham gia vào tương tác của tế bào - tế bào và được chứng minh bằng quá trình kết lắng thuận nghịch bởi nhiệt, sự có mặt của ure, guanidin cloride và SDS Một số nhà khoa học nhấn mạnh tầm quan trọng của tính chất kỵ nước trong quá trình nấm men kết lắng [15] Tác dụng kị nước thể hiện rõ rệt chỉ ra rằng lực hút của các tế bào đối với các phân tử nước nhỏ hơn rất nhiều lực hút giữa các tế bào Cũng có giả thuyết cho rằng tương tác kị nước bao gồm cả lực hút tầm xa Van der Waals và tương tác tầm ngắn, đặc biệt là các cầu hydro

1.3.2.2 Các giả thuyết về quá trình kết lắng của nấm men

Các nghiên cứu về tính chất bề mặt của nấm men của Amory D.E và

chủ yếu dựa trên thuyết lectin do có bề mặt tích điện âm ít hơn và tính kị nước

lắng tuân theo thuyết tạo cầu canxi do bề mặt tích điện âm của các chủng này

a Thuyết tạo cầu hydro

Giả thuyết về cầu nối canxi là giả thuyết rất được ưa thích từ những năm

đầu thập kỷ 80 để giải thích các tương tác tế bào - tế bào trong quá trình hình

thành các đám kết lắng Thuyết này dựa trên ý tưởng của Harris năm 1959 và Mill công bố năm 1964 [15] Theo thuyết này thì các ion canxi hình thành nên các cầu giữa các tế bào kết lắng bằng cách liên kết các điện tích âm trên bề mặt tế bào Những cầu như vậy có thể trở nên ổn định nhờ các cầu hydro giữa các nguyên tử hydro của cacbon hydrat và các nhóm hydroxyl vì vậy mà nhiệt

có mặt của cầu hydro trong việc duy trì cấu trúc của đám kêt bông

Tuy nhiên cũng có một vài cơ sở lập luận cho giả thuyết này Quá trình kết lắng có thể bị kìm hãm bất thuận nghịch bởi 1,2-epoxypropan giống như gốc cacboxyl bị este hóa Mật độ của các gốc cacboxyl trên bề mặt tế bào có mối tương quan đến hiện tượng kết lắng Hiện tượng không kết lắng do quá trình thủy phân protein hoặc biến tính protein cũng gợi ý rằng các nhóm cacboxyl liên kết với mannoprotein có trên thành tế bào có thể tham gia vào cơ chế này Các nhóm phosphoeste cũng được giả thuyết lần lượt là các tâm nối cho các ion canxi, và người ta nhận thấy hiện tượng kết lắng tăng lên sau khi loại bỏ các cầu phosphodieste trên thành tế bào

Người ta không tìm thấy có mối tương quan nào giữa hàm lượng phosphat và giai đoạn đầu của quá trình kết lắng Tuy nhiên, khi ảnh hưởng khi hàm lượng phosphat giảm thì được nghiên cứu sau này Với thuyết này thì không dễ dàng tìm ra được tác dụng kìm hãm của đường đối với quá trình kết lắng Thuyết này cũng không làm rõ được hiện tượng kết lắng cùng nhau hoặc kết lắng cùng với các tế bào có khả năng kết lắng của các tế bào không có khả năng kết lắng và sự có mặt của các nhóm mannoprotein cacboxyl trên bề mặt của các tế bào không kết lắng Thuyết này đã và đang phải nhận rất nhiều lời chỉ trích từ khi nó không thể giải thích được tính đăch hiệu của tương tác tế bào - tế bào Cũng không chắc chắn là lượng nhỏ ion canxi cần cho quá trình kết lắng sẽ tạo ra cầu hai hóa trị trong dung dịch

b Thuyết lectin

Từ những năm đầu thập kỷ 80, lý thuyết về lectin đã trở thành học thuyết

có tính thuyết phục và đãng xem xét hơn trong việc giải thích tính chất kết lắng của nấm men [19] Theo thuyết này thì các protein đặc hiệu có trên bề mặt được biết đến như zymolectin có trên bề mặt tế bào kết lắng gắn với gốc

đường mannoza của phân tử mannan của tế bào nấm men bên cạnh Các ion canxi có tác dụng như là yếu tố duy trì cấu hình đúng của tâm nối zymolectin

Sự xuất hiện của thành phần như tương tác protein-cacbonhydrat chỉ ra là hiện tượng kết lắng bị kìm hãm đặc hiệu bởi đường mannoza [11, 15] Giả thuyết lectin được hỗ trợ bởi sự liên quan giữa các protein có trên bề mặt với hiện tượng kết lắng của nấm men Giả thuyết này được ủng hộ vì nó giải thích được tính chất kết lắng cùng nhau và cùng kết lắng với các tế bào kết lắng của các

tế bào không kết lắng là hai phần phân biệt đều có liên quan đến tương tác tế bào - tế bào

Theo kết quả thảo luận trước đây thì các chủng nấm men kết lắng được phân loại thành 2 loại là chủng có kiểu hình Flo1 và NewFlo hoặc tương ứng

là các chủng nhạy với đường mannoza (MS), nhạy với cả đường glucoza và mannoza (GMS) và không nhạy với đường mannoza (MI) [15] Sự tồn tại các chủng có kiểu hình Flo1 và NewFlo được giải thích bằng các đặc trưng khác nhau của đường tương ứng với hai cơ chế zymolectin phân biệt Các chủng MI

có thể là do tính đặc hiệu thấp đối với các monosacarit trong khi các lectin có thể là có ái lực lớn hơn rất nhiều đối với các tri và polysacarit ái lực của zymolectin được đường manoza có thể là MS > GMS > MI trong khi đối với các đường khác lại là MI > GMS > MS

Liên kết lectin - cacbon hydrat đòi hỏi hai thành phần tham gia đều có

với mạch bên của phân tử mannan

Hình 1.6: Cơ chế kết lắng của nấm men theo thuyết lectin [15]

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính kết lắng của nấm men

Tuy nhiên theo các nghiên cứu trước đây của Dengis B P và cộng sự [11] thì do các tính chất nhất là tính chất tích điện trên bề mặt và tính kỵ nước

hưởng đến quá trình kết lắng của chúng cũng có điểm khác nhau Nói chung, hiện tượng kết lắng tế bào nấm men bị kiểm soát bới các yếu tố đặc hiệu liên quan đến mức độ phân tử và các yếu tố không đặc hiệu là tương tác của lớp tích điện kép, lực Van der Waals, tương tác kỵ nước, cầu muối và hiệu ứng không gian Các tương tác đặc hiệu thì diễn ra trong cự ly gần (nhỏ hơn 1,5nm) còn các tương tác không đặc hiệu thì có thể xáy ra ở khoảng cách xa hơn Do đó khi xét ảnh hưởng của các yếu tố không đặc hiệu người ta quan tâm nhiều hơn đến tính chất hóa lý của nấm men

1.3.3.1 Thành phần và cấu trúc của thành tế bào

Thành tế bào nấm men đóng vai trò quan trọng nhất đối với tốc độ và phạm vi khả năng kết lắng của nấm men

Tuy nhiên thành tế bào cũng can thiệp đến sự kết dính theo giới tính và tính chất kết lắng của nấm men trong sản xuất đồ uống lên men Chắc rằng zymolectin có trên bề mặt tế bào liên kết với nhau thành các chất tiếp nhận có bản chất cacbon hydrat đối với thành các tế bào nấm men lân cận trong suốt

quá trình kết lắng của tế bào nấm men Hai loại zymolectin tham gia vào quá

có kiểu hình Flo1 thì có zymolectin chứa manoza đặc hiệu (MS) trong khi nấm men có kiểu hình NewFlo lại có zymolectin nhạy cảm với đường manoza

và đường glucoza (GMS) Các zymolectin kết hợp ở tâm với các protein có mặt trên bề mặt của thành tế bào có thể tiến hành xác định bằng phương pháp

sử dụng protein liên hợp Chính vì vậy, người ta khẳng định rằng chính các zymolectin kết tụ trung gian là nhân tố chủ yếu gây ra quá trình kết lắng nấm men Các phần hydrocacbon liên kết không cần xúc tác được gọi là zymolectin có cấu trúc protein hoặc glycoprotein gắn với thành tế bào nấm men đặc hiệu với hydrocacbon liên kết không cần xúc tác và chính chúng là nguyên nhân gây ra hay làm tăng tính chất kết lắng của nấm men

Saccharomyces

1.3.3.2 Tính chất di truyền

Dựa trên các nghiên cứu về di truyền để phân biệt các chủng nấm men thông qua các phương pháp như kìm hãm bằng đường, muối và axit, thử hoạt tính proteaza và các biểu hiện chọn lọc của quá trình kết lắng, Stratford và Assinder (1991) đưa ra hai kiểu hình đối với các chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae là Flo1 và NewFlo tương ứng chứa đường mannoza

đặc hiệu và glucoza hay mannoza đặc hiệu Kiểu hình ban đầu là dành cho tất cả các chủng với các kiểu gen xác định có tác động đến quá trình kết lắng trong khi kiểu hình thứ hai lại là kiểu hình chủ yếu của các chủng nấm men sử dụng trong quá trình lên men Từ giữa những năm 70 đến nay, kỹ thuật di truyền đã giúp chúng ta hiểu biết hơn về tính chất kết lắng của nấm men ở mức độ phân tử

1.3.3.3 Khả năng tạo keo

Khả năng kết lắng của nấm men đang được nghiên cứu mở rộng từ trước theo hướng của hóa sinh trong khi quá trình tạo keo thì mới chỉ gần đây mới thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Calleja (1984) đã phác họa những nét chính của lý thuyết chất keo cơ bản và chỉ ra tầm quan trọng của quá trình khuấy trộn đến tốc độ kết lắng của nấm men ảnh hưởng của việc khuấy trộn đã được nghiên cứu và báo cáo trước đây Thuyết tạo keo có thể giúp chúng ta làm sáng tỏ những hiểu biết nấm men kết hợp với nhau thế nào Trong khi nếu ở quá khứ hầu hết chỉ là những hiểu biết mù mờ về sự kết hợp của các tế bào nấm men thì các thuyết về khoa học tạo keo sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn tính chất kết lắng của nấm men

Trong đó thuyết DLVO (Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek) đưa ra một dự đoán về tương tác năng lượng của hai tế bào nấm men gần nhau, thuyết động học và thuyết lưu biến đối với huyền phù tế bào nấm men kết lắng

có thể cung cấp cho chúng ta những hiểu biết sâu sắc về cơ chế kết lắng của tế bào nấm men

a Thuyết DLVO

Theo thuyết cổ điển về tính ổn định chất keo được Derjaguin và Landau phát triển một cách độc lập cũng như Verwey và Overbeek vì vậy ngày nay người ta gọi là thuyết DLVO – thuyết này mô tả các tương tác giữa các phần tích điện nhúng chìm trong môi trường chất béo và kết luận rằng các lực đẩy bắt nguồn từ sự chồng chéo các lớp lưỡng cực liên kết với các phần tử Có nhiều thực nghiệm tiến hành dựa trên sự phân tán của môi trường nước xác nhận giá trị thực chất của phương pháp này, mặc dù người ta quan sát thấy có nhiều chi tiết trong thực nghiệm không hoàn toàn thống nhất với thuyết này Một số người cố gắng liên hệ giữa tính ổn định của huyền phù nấm men với sự tích địên của các phần tử (tế bào) được tạo ra khi tiến hành phân tán các tế bào

nấm men Nói chung, chứng tỏ thuyết DLVO có khả năng đưa ra một lời giải thích hợp lý toàn diện hơn so với giá trị trung bình khoảng cách giữa các phần

tử cho dữ liệu kết tụ cho hệ thống phi sinh học bao gồm các phần tử có nồng

độ thấp từ bề dày của lớp kép trong môi trường có hằng số điện môi thấp.Thuyết DLVO rất hữu ích cho việc xác định tầm quan trọng và định lượng lực Van der Waals và lực đẩy tĩnh điện trong quá trình kết lắng của nấm men Trong khi thuyết các lực kiểu DLVO có thể giải thích hiện tượng kết lắng trên bề mặt tích điện cao, người ta tin rằng các quá trình tương tác như việc gắn zymolectin vào và các tương tác kị nước quan trọng hơn tương tác giữa các tế bào

b Lý thuyết động học

Nhánh thứ hai của khoa học nghiên cứu chất keo có thể được tiến hành trong nghiên cứu về tính chất kết lắng của nấm men lên men đồ uống và điều

đó có liên quan đến tỷ lệ giữa các phần tử keo hóa và các phần tử liên kết Có

3 cơ chế chủ yếu để các phần tử có thể kết hợp với nhau:

(1) kết tụ động học vòng (perikinetic) dựa vào chuyển động Brown

(2) kết tụ động học thẳng (orthokinetic) dựa vào dòng chảy của chất lỏng (3) kết tụ theo đường đạn tăng lên do va chạm trong quá trình kết lắng hoặc kết lắng

Do kích thước tế bào nấm men tương đối lớn nên kiểu kết lắng động học vòng không chiếm đa số trong điều kiện sản xuất đồ uống Người ta tin rằng theo tương tác tế bào - tế bào của nấm men thì quá trình kết lắng diễn ra theo

động học thẳng còn quá trình kết tụ diễn ra theo động học vòng đường đạn là chủ yếu

c Thuyết lưu biến học

Một vài năm trước những tính chất lưu biến của huyền phù nấm men đã

được nghiên cứu và tỏ ra là rất có ảnh hưởng đối với cấu trúc của đám kết lắng

mà trên thực tế thì cấu trúc này lại chịu ảnh hưởng của các lực hút tĩnh điện giữa các phần tử bên trong của đám Hơn nữa, cấu trúc của đám nấm men kết lắng còn phụ thuộc vào nhiều các yếu tố hóa lý và vi sinh khác

1.3.3.4 Điều kiện và thành phần môi trường

Theo nghiên cứu của các tác giả Amory D.E., J.-P Dufour, P.G.Rouxhet (1988) và Pascale B Dengis, L.R Nélissen, Paul G Rouxhet (1994) chỉ ra

ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến xu hướng kết lắng của các chủng nấm men là rất rõ do các điều kiện này làm thay đổi tính chất bề mặt của nấm men

Và họ cũng chỉ ra rằng các chủng nấm men khác nhau có tính chất bề mặt khác nhau cũng sẽ chịu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ khác nhau So

S.carlsbergensis ta thấy trong quá trình kết lắng các chủng S.cerevisiae không

bị ức chế bởi sự có mặt của các loại đường, không cần đòi hỏi sự có mặt của ion canxi nhưng lại chịu ảnh hưởng sâu sắc của etylic trong khi đó thì đối với

của ion canxi, bị ức chế bởi sự có mặt của đường nhất là mannoza và ít chịu

ảnh hưởng của etylic

a Sự có mặt của muối vô cơ

Người ta chứng minh được ion canxi có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình kết lắng của nấm men Công trình nghiên cứu của Seyffert (1896) cho rằng việc nấm men mất khả năng kết lắng là do chúng ta sử dụng nước mềm trong khi đó thì tính chất kết lắng lại xuất hiện khi chúng ta bổ sung thêm vôi Đấy

là bằng chứng hùng hồn để chứng tỏ ion canxi có tác dụng thúc đẩy tính chất kết lắng của các tế bào nấm men phân tán trong môi trường Canxi đặc hiệu

giúp cho việc giải thích tương tác tế bào - tế bào trong suốt quá trình kết lắng của nấm men Giả thuyết về cầu nối canxi đưa ra là các ion canxi kết nối với các tế bào nấm men bởi các nhóm hydrocacbon trên bề mặt liên kết Stronti và Bari cũng giống canxi về tính chất nên chúng được xem như là có khả năng kìm hãm cạnh tranh quá trình kết lắng Tuy nhiên theo kết quả nghiên cứu thì magiê có khả năng gây ra quá trình kết lắng một cách gián tiếp thông qua khả năng kích thích giái phóng ra các ion canxi nội tế bào.Cũng nằm trong những nghiên cứu về tính chất kết lắng của nấm men thì việc bổ sung thêm các loại muối natri hoặc kali và việc trung hòa các ion canxi gây ra hiện tượng kết lắng bằng cách bổ sung vào các ion natri và sự ức chế các ion magiê gây ra hiện tượng kết lắng bằng các ion natri hoặc kali Theo những ghi chép của Stratford thì các ion natri hoặc kali có thể là nguyên nhân giải phóng ra canxi từ tế bào nấm men và dẫn đến hiện tượng kết lắng Tuy nhiên với nồng độ ion natri và kali cao thì hiện tượng kết lắng sẽ bị kìm hãm cạnh tranh trong khi magiê gây

ra hiện tượng kết lắng lại không bị kìm hãm cạnh tranh

ra mối quan hệ giữa hoạt động kết lắng và hằng số điện môi của huyền phù có chứa các dung môi hữu cơ ở nồng độ cao và mối quan hệ này được giải thích bằng sự gia tăng hiện tượng ion hóa của cầu muối và sự gia tăng sức bền của các cầu hydro là yếu tố có liên quan đến sự tăng tính kỵ nước Nếu xem xét tế bào nấm men giống như chất keo kỵ nước, tác động của etanol có thể là kết quả của quá trình hấp thụ trên bề mặt tế bào Đó là nguyên nhân gây ra hiện

tượng giảm hằng số điện môi cục bộ và hiện tượng giảm lực đẩy tính điện giữa

tế bào-tế bào hoặc hiện tượng làm giảm tính ổn định về không gian bằng cách thông qua sự nhô ra của các mannoprtein trong các liên kết đặc hiệu hoặc không đặc hiệu Các dung môi hữu cơ sau đó sẽ thúc đẩy tương tác tế bào - tế bào

đó chứng tỏ rằng bề mặt tích điện ít sẽ tạo điều kiện cho các tiếp xúc tế bào-tế bào và làm tăng tốc độ kết lắng

d Nhiệt độ

Những nghiên cứu gần đây cho thấy các chủng có khả năng kết lắng bị

nấm men đó là quá trình thuận nghịch khi làm mát Hiện tượng không kết

lactis, người ta nhận thấy loại nấm men bền và ổn định ở nhiệt độ dưới 500C

và cấu trúc không ổn định do nhiệt cũng có ảnh hưởng đến hiện tượng kết lắng

có liên quan chặt chẽ đến bề mặt tế bào hơn là bị phân hủy trong môi trường Phạm vi nhiệt độ như vậy cũng làm ảnh hưởng đến cầu hydro Thực tế cho thấy các nguyên nhân gây ra hiện tượng không kết lắng tế bào của ure củng cố lòng tin đối với lý thuyết của cầu hydro Cần chú ý rằng khi tế bào nấm men

được lấy mẫu trước khi bắt đầu hiện tượng kết lắng rồi đem đi đun nóng hoặc làm lạnh nhanh sẽ làm cho hiện tượng kết lắng bị kìm hãm hoặc thúc đẩy mặc

dù cơ chế vẫn chưa được biết rõ

Các nghiên cứu về chuyển động của huyền phù nấm men lên men nổi chỉ

ra ứng suất đàn hồi tăng khi nhiệt độ tăng Điều này cho thấy bản chất kỵ nước của chủng nấm men và do đó thấy được sự tăng lên của lực hấp dẫn tế bào - tế bào Với thiết bị phân tích hiện tượng phân tán bằng phương pháp đo quang cho chúng ta thấy kích thước và tốc độ lắng xuống tăng khi nhiệt độ

với nhau thấp chính là kết quả ảnh hưởng của thành phần môi trường và tính biến thiên (đa dạng) của chủng giống Trên thực tế, có nhiều nghiên cứu về tính chất kết lắng cho rằng các chủng nhạy cảm với nhiệt độ bị kìm hãm ở

được xem như là nhân tố không kết lắng ở nhiệt độ 200C Tuy nhiên, nói chung, nhiệt độ cũng có chút ảnh hưởng đến quá trình kết lắng của nấm men

e Sự có mặt của đường

Sự kìm hãm hiện tượng kết lắng của nấm men bởi đường được phát hiện

đầu tiên bởi Lindner (1901) sau đó Burns (1937), Lindquist (1953), Eddy

mannoza là những chất kìm hãm hiệu quả nhất trong khi sucroza và glucoza lại ít hiệu quả hơn còn các loại đường như galactoza và fructoza thì hoàn toàn vô tác dụng

Hiện tượng kết lắng có thể bị kìm hãm đặc biệt là khi có mannoza và các

25mM Khi sử dụng đường và các dẫn xuất có nhóm thế kị nước thì quá trình kết lắng của các tế bào nấm men lên men chìm ở pha cân bằng bị kìm hãm bởi nông độ 500mM đối với glucoza và mannoza, nồng độ 10mM đối với phenyl-

α-D-mannozit và p-nitrophenyl-α-D-mannozit mặc dù không tìm thấy có sự ức

chế nào đối với chủng nấm men lên men nổi Tính đặc hiệu cao hơn của liên

p-nitrophenyl-α-D-mannozit chỉ ra rằng đường có nhóm kị nước gắn trên bề mặt tế bào mặc dù

nó không được tác giả nhắc đến trong nghiên cứu này

Hai nhóm riêng biệt của các chủng nghiên cứu được phân loại theo tính

đặc hiệu của đường: Nhóm có kiểu hình Flo1 thì chỉ nhạy cảm với đường mannoza và nhóm kiểu hình Flo2 thì nhạy cảm với glucoza và maltoza có bổ sung mannoza Tuy nhiên một số nhà nghiên cứu lại phân loại các chủng nấm men có khả năng kết lắng thành 3 nhóm là nhóm MS (mannose sensitive – nhạy với đường mannoza), GMS (glucose-mannose sensitive – nhạy với

đường glucoza và mannoza) và nhóm MI (mannose insensitive – không nhạy với đường mannoza)

Mặc dù ba loại đường đề cập trên có thể được nấm men chuyển hóa nhưng chúng cũng thể hiện những tác dụng trực tiếp đối với hiện tượng kết lắng Huyền phù nấm men kiểm soát quá trình trao đổi chất ở nhiệt độ thấp

của đường đối với hiện tượng kết lắng Sự kìm hãm hiện tượng kết lắng bởi

đường nếu không được biết đến trong thuyết cầu canxi thì lại được giải thích

rõ ràng trong thuyết lectin Thực vậy, sự kìm hãm do đường là mấu chốt chứng minh cho thuyết lectin - like của hiện tượng kết lắng

f Ôxy hoà tan

Hiện tượng tiêu thụ oxy xảy ra ở giai đoạn rất sớm trong quá trình lên men bia Các phân tử oxy tiêu thụ được sử dụng để tạo ra các axit béo không

no và sterol chính là các thành phần chủ yếu của màng tế bào nấm men Khi oxy đã hấp thụ đủ cho sự hình thành màng tế bào thì cũng là lúc tế bào nấm men ngừng phát triển Nó cũng cho thấy sự thiếu hụt sterol và axit béo không

no xảy ra trước hiện tượng kết lắng đối với điều kiện lên men bia Có những nghiên cứu của Calleja về cả hai tác dụng thúc đẩy và kìm hãm của điều kiện hiếu khí đối với quá trình kết lắng Nếu điều kiện hiếu khí chưa đủ có thể đẩy nhanh giai đoạn bắt đầu của quá trình kết lắng Trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí thì người ta nhận thấy quá trình kết lắng là không đổi Khả năng kết lắng của tế bào nấm men được thể hiện trong suốt quá trình lên men dịch đường sau khi kết thúc giai đoạn tăng trưởng do sự thiếu hụt oxy và đồng nhất với sự

ra tăng mạnh mẽ trong CSH của tế bào Sự có mặt của oxy trong toàn bộ dịch hèm có ảnh hưởng đến số lượng tế bào nấm men cuối cùng tính chất kết lắng

và CSH Đối với quá trình lên men rượu, có nghiên cứu cho thấy tính chất kết lắng trong thiết bị lên men sinh học có sử dụng cầu hàng không, kích thước tế bào nấm men thay đổi tùy theo tốc độ thông khí

1.3.3.5 Đặc điểm sinh lý của tế bào nấm men

Cần chú ý rằng các nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình kết lắng của nấm men có xu hướng phát triển vào giai đoạn pha phát triển cân bằng gần giai đoạn hết quá trình lên men chính Tế bào nấm men ở giai đoạn phát triển cân bằng kết lắng tốt trong môi trường đặc hiệu với giai đoạn phát triển logarit

và phát triển cân bằng những không phải trong môi trường mới (khác) ở pha cân bằng của nấm men nổi kết lắng trong điều kiện môi trường mới được bổ sung thêm etanol (hơn 3% thể tích) và không bị ức chế bởi đường (đối với chủng đã nghiên cứu) Tế bào ở giai đoạn phát triển logarit lại không kết lắng trong môi trường mới kể cả môi trường đặc hiệu cho giai đoạn phát triển logarit và phát triển cân bằng mặc dù đã được bổ sung thêm hơn 10% tính theo thể tích etanol So với tính chất bề mặt của tế bào thì tại các giai đoạn

sinh lý khác nhau thì các đường cong chuyển động đạt được ở môi trường có

phát triển cân bằng Trong các báo cáo gần đây, tính chất kết lắng của chủng

có kiểu hình Flo 1 không bị tác động bởi giai đoạn sinh lý sinh hóa của tế bào trong suốt quá trình tăng trưởng trong khi chủng có kiểu hình NewFlo lại có khả năng kết lắng tuần hoàn Các tế bào có kiểu NewFlo mất dần khả năng kết lắng trong giai đoạn đầu sinh trưởng và lại thể hiện được khả năng kết lắng ở giai đoạn cuối của pha phát triển logarit Nghiên cứu về hình thái học đã chứng tỏ rằng sự hình thành dần dần các lỗ và nếp nhăn trên thành tế bào nấm men trong quá trình phản ứng có thể làm tăng khả năng tiếp xúc của bề mặt tế bào so với bề mặt nhẵn trơn của tế bào mới và vì thế làm tăng sự kết dính tế bào-tế bào Cũng trong nghiên cứu này người ta nhận thấy các tế bào con mới thể hiện khả năng kết lắng kém hơn so với các tế bào mẹ Tuy nhiên, xu hướng tăng tính kết lắng ở cuối giai đoạn lên men hầu như không thể giải thích bằng sự tăng lên của các tế bào mẹ khi mà các tế bào con chưa từng phân chia có trong lượng sinh khối tạo ra chiếm khoảng 50% tổng lượng tế bào Với các chủng NewFlo thì lượng zymolectin được xúc tiến tạo thành liên tục ngay từ đầu của giai đoạn sinh trưởng và nhanh chóng được đưa vào thành

tế bào vẫn đang ở trạng thái vô hoạt và trước khi được hoạt hóa ở giai đoạn

đầu của quá trình kết lắng với có chế vẫn chưa được biết rõ

Hiện tượng dinh dưỡng bị giới hạn hay thiếu dinh dưỡng dẫn đến hiện tượng làm giảm khả năng kết lắng của cả chủng nấm men lên men bia và rượu Hiện tượng thiếu dinh dưỡng có ảnh hưởng đến tính chất lý học của thành tế bào nấm men Thành tế bào không còn dày và nồng độ các chất trên

bề mặt tế bào bị giảm đi Đối với các chủng lên men bia, hàm lượng phosphat trên bề mặt tế bào giảm do hiện tượng thiếu dinh dưỡng gây ra và bề mặt tích

điện của tế bào cũng giảm Tuy nhiên, tính CSH lại không bị tác động cũng