Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá chè Shan camellia sinensis var Shan

Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá chè Shan camellia sinensis var Shan Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá chè Shan camellia sinensis var Shan Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá chè Shan camellia sinensis var Shan luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Somedeth INTHAVONG

Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá chè Shan

Camellia sinensis var Shan

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội – 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Somedeth INTHAVONG

Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá chè Shan

Camellia sinensis var Shan

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

- BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên tác giả luận văn: Somedeth INTHAVONG

Đề tài luận văn: Nghiên cứu tách chiết Catechin từ lá chè Shan (Camellia sinensis

- Đã sửa lại toàn bộ các lỗi chính tả và sửa lại các phần văn phong chưa đạt

- Đã bổ sung thêm thảo luận trong phần kết quả nghiên cứu

- Đã viết lại phần kết luận ngắn gọn, súc tích và trọng tâm hơn

- Đã bổ sung phần phương pháp nghiên cứu ghi rõ nguồn nguyên liệu khi đánh giá chất lượng chè

Ngày tháng năm 2019

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tác giả luận văn

TS Vũ Hồng Sơn Somedeth INTHAVONG

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

( Ký và ghĩ rõ tên )

LỜI CẢM ƠN

Qua thời gian học tập tại Việt Nam, cùng với sự cố gắng nỗ lực phấn đấu tiến

hành và triển khai theo các kế hoạch thí nghiệm, cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô,

các anh chị, bạn bè và những em sinh viên các khoá đang làm nghiên cứu trên phòng

thí nghiệm C4-204 tại Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm trường ĐH

Bách Khoa Hà Nội… nay tôi đã hoàn thành luận văn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới TS Vũ Hồng Sơn đã tận

tình truyền đạt những kiến thức và trực tiếp hướng dẫn tôi

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong đại sứ quán Lào tại Việt Nam đã tạo điều kiện

cho tôi đi học thạc sỹ; các thầy cô trong Bộ môn Quản lý chất lượng đã tạo mọi điều

kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn đến bố mẹ, chồng và con trai tôi, những người

thân trong gia đình đã động viên và chia sẻ, giúp tôi có đủ nghị lực vượt qua mọi khó

khăn trong cuộc sống để tôi học tập và hoàn thành luận văn này

Học viên

Somedeth INTHAVONG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ bản luận văn này là kết quả nghiên cứu do bản thân

tôi cùng các em sinh viên hệ Đại học thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy TS Vũ

Hồng Sơn Những số liệu đưa ra là hoàn toàn trung thực, không vi phạm bản quyền

của bất kỳ tác giả nào

Học viên

Somedeth INTHAVONG

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục, các chữ hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị ………

Danh mục các ký hiệu, chữ cái viết tắt………

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Vài nét giới thiệu về chè Shan 4

1.1.1 Đặc điểm 4

1.1.2 Nguồn gốc của chè Shan 5

1.1.3 Phân loại chè Shan 5

1.1.4 Tác dụng của chè Shan 6

1.2 Thành phần hóa học của chè Shan[6] 6

1.2.1 Nước 6

1.2.2 Các sắc tố 7

1.2.3 Nhóm các hợp chất phenol 7

1.2.3.1 Các hợp chất polyphenol trong lá chè 7

1.2.3.2 Flavonoid 9

1.2.3.3 Các hợp chất Catechin 12

1.2.3.4 Các hợp chất Anthoxanthin 17

1.2.3.5 Các hợp chất Anthocyanin 19

1.2.4 Enzyme 21

1.2.5 Protein 22

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 22

1.3.1 Phương pháp trích ly thu dịch chè 22

1.3.1.1 Lựa chọn phương pháp trích ly thu dịch chè 22

1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 23

1.3.2 Công nghệ tách tinh chế polyphenol-catechin từ lá chè [13], [14] 25

1.3.2.1 Chiết tách chlorophyl, cafein và các chất khác 25

1.3.2.2 Chiết tổng hợp polyphenol-catechin 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1.Vật liệu nghiên cứu 26

2.1.1 Hóa chất 26

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 26

2.2 Sơ đồ nghiên cứu 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp phân tích 28

2.3.1.1 Xác định độ ẩm ( TCVN 5613-2015 )[5] 28

2.3.1.2 Xác định hàm lượng chất hòa tan ( TCVN 5610-1991 ) [4] 28

2.3.1.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Trong nghên liệu TCVN… 29

2.3.1.4 Xác định hàm lượng anthocyanin( TCVN 11028 - 2015) 31

2.3.1.5 Xác định hàm lượng polyphenol tổng Trong dịch chè TCVN 974532 2.3.1.6 Xác định hàm lượng cafein theo phương pháp BERTRAND [9] 35

2.3.2.1 Tiến hành thí nghiệm 36

2.3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly dịch chè 37

a Khảo sát yếu tố nhiệt độ 37

b Khảo sát yếu tố thời gian 38

c Khảo sát yếu tố pH 39

d Khảo sát yếu tố tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu 39

2.3.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách, tinh chế pp-catechin 40

a Khảo sát dung môi clorofooc và diclometan 40

c Khảo sát yếu tố tỷ lệ clorofooc/dịch chè 42

d Khảo sát yếu tố tỷ lệ etyl acetat/dịch chè 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 45

3.1 Kết quả khảo sát nguyên liệu 45

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly dịch chè 46

3.1.1 Khảo sát yếu tố nhiệt độ 46

3.1.2 Khảo sát yếu tố pH 47

3.1.3 Khảo sát yếu tố thời gian 47

3.1.4 Khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 48

3.2 Tối ưu quá trình trích ly polyphenol và anthocyanin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 49

3.2.1 Xây dựng mô hình 49

3.2.2 Tối ưu hóa 56

3.3 Khảo sát dịch chè 57

3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách, tinh chế pp-catechin .58

3.4.1 Khảo sát dung môi và số lần chiết clorofooc/diclometan 58

3.4.2 Khảo sát số lần chiết của etyl acetat 59

3.4.2 Tỷ lệ dung môi clorofooc/dịch chè 60

3.4.3 Tỷ lệ dung môi etyl acetat/dịch chè 60

3.4.4 Nồng độ dịch chè 61

3.5 Tối ưu hóa quá trình tách, tinh chế pp-catechin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 62

3.5.1 Xây dựng mô hình 62

3.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình tách chiết pp-catechin 65

3.5.3 Tối ưu hóa 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 72

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 - Các pp-catechin chính có trong chè xanh 12

Bảng 2.1 - Dung dịch chuẩn axit gallic pha loãng 33

Bảng 2.2 - Khảo sát yếu tố nhiệt độ trong quá trình trích ly 37

Bảng 2.3 - Khảo sát yếu tố thời gian trong quá trình trích ly 38

Bảng 2.4 - Khảo sát yếu tố pH trong quá trình trích ly……….39

Bảng 2.5 - Khảo sát yếu tố dung môi/nguyên liệu trong quá trình trích ly 40

Bảng 2.6 - Khảo sát yếu tố tỷ lệ clorofooc /dịch chè 42

Bảng 2.7 - Khảo sát yếu tố tỉ lệ etyl/dịch chè 43

Bảng 2.8 - Khảo sát yếu nồng độ 43

Bảng 3.1 - Kết quả khảo sát nguyên liệu chè khô 45

Bảng 3.2 - Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm quá trình trích ly 50

Bảng 3.3 - Các thí nghiệm tiến hành và kết quả 51

Bảng 3.4 - Kết quả phân tích hồi quy hiệu suất trích ly polyphenol (Y1) 52

Bảng 3.5 - Kết quả phân tích hồi quy hiệu suất trích ly anthocyanin (Y1) 53

Bảng 3.6 - Độ hấp thụ màu của axit gallic ở λ = 765nm 57

Bảng 3.7 - Khảo sát dịch chè 57

Bảng 3.8 - Khảo sát hiệu quả tách cafein của dung môi Clorofooc và Diclometan 59

Bảng 3.9 - Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm 63

Bảng 3.10 - Các thí nghiệm tiến hành và kết quả 63

Bảng 3.11 - Kết quả phân tích hồi quy hiệu suất tách, tinh chế Cafein (Y1) 64

Bảng 3.12 - Kết quả phân tích hồi quy hiệu suất tách, tinh chế pp-catechin (Y2) 64

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 - Hình ảnh lá và cây chè Shan 4

Hình 1.2 - Các pp-catechin có trong chè 15

Hình 3.1 - Hiệu suất trích ly khi khảo sát yếu tố nhiệt độ 46

Hình 3.2 - Hiệu suất trích ly khi khảo sát yếu tố pH 47

Hình 3.3 - Hiệu suất trích ly khi khảo sát yếu tố thời gian 48

Hình 3.4 - Hiệu suất trích ly khi khảo sát yếu tố tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu 49

Hình 3.5 - Ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly polyphenol 54

Hình 3.6 - Ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly anthocyanin 55

Hình 3.7 - Bề mặt đáp ứng của hiệu suất trích ly anthocyanin 55

Hình 3.8 - Bề mặt đáp ứng của hiệu suất trích ly polyphenol 55

Hình 3.9 - Mức độ đáp ứng của hàm mong đợi 56

Hình 3.10 - Đường chuẩn axit gallic 57

Hình 3.11 - Khảo sát số lần chiết của dung môi etyl acetat 59

Hình 3.12 - Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi clorofooc/dịch chè 60

Hình 3.13 - Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi etyl acetat/dịch chè 61

Hình 3.14 - Ảnh hưởng của nồng độ dịch chè 61

Hình 3.15 - Ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất tách cafein 66

Hình 3.16 - Ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất chiết pp-catechin 67

Hình 3.17 - Bề mặt đáp ứng của hiệu suất tách cafein từ dịch chè 67

Hình 3.18 - Bề mặt đáp ứng của hiệu suất chiết pp-catechin từ dịch chè 67

Hình 3.19 - Mức độ đáp ứng của hàm mong đợi - chiết dịch chè 68

LỜI MỞ ĐẦU

❖ Lý do chọn đề tài

Chè có tên khoa học là Camilia sinensis var.shan Nước chè là loại đồ uống quen

thuộc ở viết Nam và nhiều nước châu Á từ hàng ngàn năm về sau, nước chè cũng là nước uống phổ biến ở các nước khác trên khắp thế giới Ngoài tác dụng giải khát thông thường nó còn đem lại rất nhiều lợi ích Trong nước chè có chứa một lượng lớn các chất oxy hóa, như catechin trong chè xanh và theruligins trong chè đen và đây chính là nguồn sức mạnh tuyệt vời giúp con người chống lại loại bệnh tật, đặc biệt là bệnh tim Trong lá chè có chứa một lượng hợp chất catechin, ngoài chức năng trung hòa các gốc tự do, chất chống oxi hóa thì catechin còn có tác dụng ngăn ngừa một số bệnh ung thư, khối u, béo phí, giảm lượng cholestrerol trong máu Từ đó chè đã được đưa vào danh sách thực phẩm có tính năng bảo vệ sức khỏe hàng đầu để khai thác triệt

để những giá trị tuyệt vời của nó

Ở Việt Nam có khí hậu thích hợp để trồng chè, có nhiều vùng trồng chè như: Thái Nguyên, Tuyên Quang, Yên Bái, Phú Thọ, Mộc Châu, Đó là một nguồn lợi lớn, ngoài việc làm thức uống hằng ngày còn có thể từ đó tạo ra nguồn nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh, bổ dưỡng và các chất phụ gia có giá trị cao trong công nghiệp thực Phẩm Nếu khai thác được nguồn catechin trong chè làm thực phẩm chức năng hay được phẩm có thể đem lại lợi nhuận lớn hơn cho ngành công nghiệp chè

Từ thực tế cấp thiết trên tôi chọn đề tài này “Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá

chè Shan” làm đề tài nghiên cứu cho luận văn tốt nghiệp Nghiên cứu không chỉ đóng

góp những thông tin, tư liệu khoa học về chè Shan, mà còn làm cơ sở khoa học cho nghiên cứu về sau và nâng cao giá trị cho cây chè Shan

❖ Mục tiêu nghiên cứu, Đối tượng phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trích ly dịch chè có hàm lượng polyphenol và anthocyanin cao nhất

-Nghiên cứu điều kiện tách, tinh chế catechin từ dịch chè với hiệu suất cao nhất

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu trong đề tài này là mẫu chè được sấy khô (độ

ẩm < 8%) được bảo quản trong 2 lớp túi PE ở nơi khô ráo, thoáng mát

Mẫu chè Shan sau khi được sấy khô, nghiền nhỏ

❖ Ý nghĩa thực tiễn

- Dựa vào kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng trong chè có thể giúp định hướng khai thác hợp chất catechin chè xanh theo mục đích khác nhau nhằm đạt hiệu quả cao nhất

- Làm cơ sở khoa học cho nghiên cứu ứng dụng chế phẩm catechin trong công nghiệp thực phẩm và góp phần nâng cao giá trị của lá chè shan nói riêng và chè xanh nói chung

- Tài liệu tham khảo, cũng như các kết quả nghiên cứu của đề tài là một tài liệu tham khảo khoa học tốt và đầy đủ về cây chè và các sản phẩm từ chè xanh cho giảng dại, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau nay

❖ Phương pháp nghiên cứu

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về việc tách chiết catechin từ chè xanh theo các phương pháp trích ly Trong bài viết này em đã có tham khảo nhiều nguồn tài liệu từ đó hoàn thiện hơn quy trình trích ly hợp chất catechin từ chè cần phân

tích catechin có thể được tinh chế từ dịch chè bằng trích ly lỏng hoặc dùng các phương pháp sắc ký Tuy nhiên đến nay các phương pháp trích ly catechin có sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện đại của Việt Nam vẫn tỏ ra chưa phù hợp do vốn đầu tư lớn Do vậy việc trích ly và tinh chế catechin bằng phương pháp trích ly đơn giản, an toàn sử dụng dung môi nước là vấn đề đang được quan tâm Việc xây dựng quy trình trích ly để thu nhận catechin từ lá chè Shan sẽ đóng góp những thông tin, tư liệu khoa học về chè Shan, làm cơ sở khoa học cho nghiên cứu về sau và nâng cao giá trị cho cây chè Shan

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Vài nét giới thiệu về chè Shan

1.1.1 Đặc điểm

Chè Shan có tên khoa học là Camellia sinensis var.Shan, thuộc ngành hạt kín (Angiospermae), lớp hai lá mầm (Dicotyledonae), bộ chè (Theales), họ chè (Theaceae), Chè Shan là thân gỗ, phân cành thưa, trong điều kiện tự nhiên có thể cao

từ 6 - 10m, lá to dài, có nhiều răng cưa sâu đều, đầu lá nhọn, búp to, có nhiều lông tơ trắng mịn, trông như tuyết cho nên chè Shan còn được gọi là chè “Tuyết” Chè Shan

có thể cho năng suất cao, chất lượng tốt, thích hợp cho cả chế biến chè xanh và chè đen Chè Shan phân bố ở địa hình núi cao, ẩm Chè Shan hiện là một trong 4 biến chủng chè trồng phổ biến ở Việt Nam

Hình 1.1 – Hình ảnh lá và cây chè Shan

1.1.2 Nguồn gốc của chè Shan

Gốc ở Bắc Ấn Độ và Nam Trung Quốc, được truyền sang Mianma, Thái Lan, Việt Nam Chè được trồng khắp nơi ở nước ta, tập trung nhiều ở Vĩnh Phú, Hà Giang, Bắc Thái, Quảng Nam, Đà Nẵng cho tới Đắc Lắc, Lâm Đồng Cây ưa khí hậu ẩm, đất chua

và cần được che bóng ở một mức độ nhất định để đảm bảo hương thơm

1.1.3 Phân loại chè Shan

a Chè Shan Tuyết ở Điện Biên

Tủa Chùa (Điện Biên) nằm ở độ cao 1400m so với mực nước biển Người Mông

còn gọi loại cây này là “cây bất tử” với tuổi đời lên đến hàng trăm năm

Hiện ở đây có khoảng 10.000 cây chè cổ thụ trên 100 năm tuổi Sống sót qua hàng trăm năm, những cây chè tự thích nghi với điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu để chống chọi lại mọi khắc nghiệt của thời tiết và các loài sâu bệnh

Thường được thu hoạch từ tháng 3 đến tháng 10 âm lịch hàng năm Ngon nhất là loại hái vào mùa xuân vì đây là lúc cây hấp thụ những tinh túy của trời đất tốt nhất (có giá cao nhất trong năm, lên đến 2 triệu đồng/kg chè khô) Chè được thu hái thủ công bằng tay sau đó sao trong lò tôn để diệt men của chè tươi và giữ hương vị thơm ngon vốn có Sau khi sao lần 1, chè được đưa vào cối vò để cánh xoăn lại, màu bóng đẹp Chè ở đây có màu đỏ và vị đắng chát hơn so với các nơi khác, rất hợp với khẩu vị của khách sành trà người Hoa

b Chè Shan tuyết ở Hà Giang

Được trồng ở nhiều nơi trên các vùng đất đồi núi của Hà Giang, đặc biệt đến vùng cao nguyên đá Đồng Văn, Lũng Phìn, Phìn Hồ - Hoàng Su Phì, Tham Vè, Bó Đướt-Vị Xuyên

Được thu hoạch 4 vụ một năm: cuối tháng 3 đầu tháng 4, tháng 5 và 6, tháng 8, tháng 10 và 11 Có 2 loại là loại chè lá nhỏ có tán hình mâm xôi hoặc dạng nến (có nhiều ở Lũng Phì, chiếm phần lớn trong tổng chè); loại chè có lá to (ở vùng chè cổ Bó Đướt, Vị Xuyên)

1.1.4 Tác dụng của chè Shan

• Chè shan tuyết có tác dụng chống lão hóa, ngăn ngừa đái tháo đường, tim mạch

Do trong chè shan tuyết có các hợp chất quý như thein, tanin Đặc biệt các chất polysaccharide có tác dụng ức chế glucos, phong bế các gốc tự do của cơ thể,

tiêu diệt tế bào gây ra nhiều bệnh nan y

• Giảm đường huyết, giữ đường huyết ở mức tối ưu của cơ thể Hạn chế sự phát sinh và phát triển của bệnh đái tháo đường, chứng đục thủy tinh thể và các biến

chứng nguy hiểm của bệnh đái tháo đường

• Giải nhiệt, giải độc thanh lọc cơ thể: điển hình là chè shan tuyết chứa rất nhiều EGCG là chất chống oxy hóa mạnh nhất có nguồn gốc tự nhiên giúp giảm mệt

mỏi, căng thẳng khi làm việc ở cường độ cao

• Uống trà mỗi ngày còn giúp cơ thể tăng khả năng kháng khuẩn, ngăn ngừa việc lão hóa đến sớm, làm tăng độ sáng của da Và quan trọng hơn nó còn có tác

dụng ngăn ngừa các loại ung thư da

• Uống chè Shan tuyết còn giúp bạn giảm cân và tiêu hóa tốt Đó là trong trà có hợp chất cafein có thể nâng cao lượng tiết ra của dịch dạ dày, giúp tiêu hóa

nhanh, tăng cường năng lực phân giải mỡ thừa

1.2 Thành phần hóa học của chè Shan[6]

1.2.1 Nước

Nước là thành phần hoá học quan trọng và chiếm hàm lượng lớn trong cây Nước

là dung môi hoà tan các chất dinh dưỡng, là môi trường cho enzyme hoạt động Thiếu nước, các hoạt động sống của cây bị suy giảm, cây không hô hấp được và có thể bị chết

Hàm lượng nước trong chè khoảng 75-80%, phụ thuộc vào giống, điều kiện canh tác và tự nhiên

Trong cùng năm, vào các thời gian khác nhau hàm lượng nước trong chè cũng thay đổi, nhưng tuân theo quy luật sau: chè đầu vụ có hàm lượng nước cao hơn chè cuối vụ, vào các tháng giữa vụ (tháng 6–tháng 9) hàm lượng nước trong chè là cao nhất

Hàm lượng nước trong lá chè giảm dần từ tôm đến các lá già (tôm 76,6%; lá một 75,6%; lá hai 75,6% và lá ba 74,26%)

Khi cây chè được bón nhiều phân đạm thì hàm lượng nước tăng lên do đó chất lượng chè thấp Khi cây chè được bón nhiều phân lân và phân kali thì hàm lượng nước giảm do vậy mà chất lượng chè cao

1.2.2 Các sắc tố

Trong lá chè chứa nhiều sắc tố khác nhau, nhưng chủ yếu là diệp lục (chlorophyl), sau đó là các sắc tố phụ bao gồm carotenoid và xanthophyl Các sắc tố quyết định màu sắc chè, có thể là xanh nhạt đến xanh lục sẫm hoặc chè màu vàng đến

Chlorophyl có 2 dạng: a và b, tỷ lệ chlorophyl a và chlorophyl b thường là 3/1 Trong chè nguyên liệu, chlorophyll chiếm từ 3–3,5%

Carotenoid là nhóm chất màu hoà tan trong chất béo, làm cho quả và rau có màu da cam, vàng, đỏ Chúng có cấu tạo theo mạch nối đôi thẳng, gồm 40 nguyên tử carbon

và 56 nguyên tử hydro Dựa vào cấu tạo hoá học chia chúng thành 2 nhóm nhỏ:

+ Caroten: C40H56 là loại hydrocarbon không no, không tan trong nước, chỉ tan trong dung môi hữu cơ Trong thực vật thường có 3 loại: α, β, γ Caroten hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 446-476nm

+ Xanthophyl: C40H56On (n=1-6) là dẫn xuất của caroten Xanthophyl có nhiều loại như: kripthoxanthin (C40H56O1), lutein (C40H56O2), violaxanthin (C40H56O4) Xanthophyl hấp thụ ở bước sóng 45-481nm

Nhóm carotenoid gồm từ 60-75% chất màu tự nhiên Nhóm carotenoid trong chè chiếm khoảng 0,1-0,12% Trong quá trình chế biến carotenoid bị phân giải để tạo thành chất thơm làm tăng chất lượng chè sản phẩm

1.2.3 Nhóm các hợp chất phenol

1.2.3.1 Các hợp chất polyphenol trong lá chè

Phenol là hợp chất thơm có nhóm hydroxyl đính trực tiếp với nhân benzene

Khi trong phân tử có nhiều nhóm hydroxyl đính trực tiếp với nhân benzene thì được gọi là polyhydroxylphenol (monome), nhiều monomer gắn với nhau gọi là polyphenol (polyme) Các hợp chất phenol tự nhiên trong chè có thể chia làm 3 nhóm chính: + Nhóm hợp chất C6–C1 (axit galic)

+ Nhóm hợp chất C6–C3 (axit cinamic: Axit para–coumaric, Axit cafeic)

+ Nhóm hợp chất C6–C3–C6 (catechin)

Gallic acid Cafeic acid Catechin

Nhóm hydroxyl là nhóm có khả năng phản ứng cao của hợp chất phenol Tuỳ theo vị trí tương hỗ và tuỳ theo số lượng của các nhóm hydroxyl có trong phân tử của các hợp chất phenol mà các tính chất lý, hoá học và hoạt tính sinh học của chúng bị thay đổi Các PP có nhóm hydroxyl ở vị trí metha (hai nhóm hydroxyl cách nhau một nguyên tử cacbon) có khả năng hình thành liên kết este với các chất khác nhưng rất trơ trong các phản ứng oxy hoá–khử Còn các polyphenol có nhóm hydroxyl ở vị trí ortho (các nhóm hydroxyl được đính vào các nguyên tử cacbon cạnh nhau) thì dễ dàng bị oxy hoá–khử

Các hợp chất PP hoà tan mạnh trong các dung môi phân cực như nước, methanol, ethanol Một số các PP liên kết với glucid tạo thành các glucosid dễ tan trong nước PP

do có chứa gốc pyrocatechin hoặc pyrogallic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hoá – khử, phản ứng cộng và phản ứng ngưng tụ

PP là một nhóm chất tự nhiên quan trọng, có nhiều ứng dụng trong mọi lĩnh vực như là chất vận chuyển điện tử trong quá trình hô hấp, là chất điều khiển, chất đặc trưng cho mỗi loài về màu sắc, mùi vị… PP đóng vai trò như những kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh Nhiều PP có hoạt tính của vitamin P (như catechin trong chè) có tác dụng làm bền thành mạch, hạn chế các hiện tượng chảy máu dưới da

PP còn là chất chống oxy hoá, chúng tiếp nhận các gốc tự do sinh ra trong quá trình bệnh lý, nói một cách khác PP có khả năng ngăn chặn các quá trình tạo gốc tự do gây bệnh [28] Nhiều PP còn được sử dụng trong công nghiệp nhẹ như công nghệ mỹ phẩm…

Trong cây chè, PP là thành phần hoá học chủ yếu chiếm khoảng 30% khối lượng chất khô Các hợp chất PP trong lá chè chủ yếu là flavonoid Hàm lượng PP trong đọt chè giảm dần từ búp xuống cuộng [6], [17]

Các nghiên cứu về cây chè trồng tại Tân Cương (Thái Nguyên) và Xuân Mai (Hoà Bình) cho thấy PP chiếm:

+ 30–32% trong búp và lá đầu

+ 25–28% trong lá thứ hai

+ 16–22% trong lá thứ ba và thứ tư

+ 10–15% trong lá già và cuộng

Hàm lượng PP trong chè thay đổi theo: Mùa trong năm; Vùng sinh thái và chế độ chăm bón

1.2.3.2 Flavonoid

Flavon và anthocyan đều là những hợp chất quy định màu sắc của hoa, quả, lá, thân và làm cho chúng có màu vàng, đỏ, xanh Các hợp chất này được gọi chung là flavonoid

Chúng có cấu tạo như sau: gồm hai vòng benzen và một vòng pyran

C C

B

Các flavonoid đều là những dẫn xuất của croman và cromon, có vòng phenol bổ xung Croman và cromon đều thuộc các phenyl–propan vì có nhóm C6 – C3

8 1 8 1

7 2 7 2

6 3 6 3

Croman Cromon

Tuỳ theo mức độ oxy hoá của mạch 3 cacbon, sự có mặt hay không có liên kết đôi giữa C2 và C3, nhóm carbonyl ở C4 trong vòng pyrol mà sẽ hình thành nên nhiều hợp chất phụ khác nhau như:

Trong đó catechin, anthocyanin và leucoanthocyanin đều thuộc các dẫn xuất của croman, còn flavon, flavanol và flavonol đều là những dẫn xuất của cromon Tất cả các chất này đều là những sản phẩm ngưng tụ của croman hoặc của cromon với phenol

Trong hợp chất flavonoid thường gặp phổ biến các nhóm sau:

+ Các dẫn xuất của cromon nghĩa là các flavonol, trong đó quan trọng là kampferol và quercetin

+ Các dẫn xuất của croman: các hợp chất gần giống catechin đều được gọi là các leucoanthocyanin Chúng vô sắc nhưng khi đun nóng với axit chúng đều biến thành anthocyanidin có màu Anthocyan là những glucozit, anthocyanidin là những aglycon của anthocyan Anthocyan hoà tan trong nước còn anthocyanidin không hoà tan trong nước Catechin là các cấu tử của chất tanin có trong lá chè, đại diện chính là catechin

+ Glucozit hoà tan trong nước nhưng không hoà tan trong dung môi hữu cơ (như este, ethyl acetate, ethanol 960) Các glucozit có hoạt tính quang học và bị thuỷ phân bởi các enzyme thuỷ phân hoặc bởi axit HCl 1N

b) Tính chất hoá học của flavonoid:

+ Tham gia vào trong các phản ứng oxy hoá, phản ứng este hoá, phản ứng shinoda, phản ứng tạo phức với kim loại

Trong chè flavonoid là nhóm hợp chất có hoạt tính sinh –y–dược cao

+ Flavonoid chè xanh có tác dụng làm bền thành mạch, chống oxy hoá, giảm sự phân huỷ tế bào, giảm lượng cholesterol trong máu và chống ung thư

+ Flavonoid chè đen có tác dụng chống sự kết tụ máu–nguyên nhân của tất cả các chứng nhồi máu và đa số trường hợp tai biến mạch máu não

1.2.3.3 Các hợp chất Catechin

Trong các loại thực vật, Catechin thường tồn tại ở trạng thái tự do hoặc ở dạng este với axit gallic Catechin trong chè thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3-ol, phân tử

có 15 cacbon bao gồm hai vòng 6 cacbon A và B được nối bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí

2, 3, 4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2, 3 và nhóm 4-oxo

Công thức tổng quát của Catechin là:

Hình 1.2 - Công thức tổng quát của catechin Hình 1.3 - Gốc galloy

Đặc điểm cấu tạo của flavan-3-ol (flavanol–3): Đó là không có nối đôi giữa C2 và

C3, không có nhóm cacbonyl ở vị trí C4, có nhóm hidroxil ở vị tri C3, có chứa hai nguyên tử cacbon bất đối(C1 và C3) nên catechin có các đồng phân quang học và có hoạt tính quan học Các chất đại diện của nhóm catechin là catechin và gallocatechin

có nhiều trong chè và lá chè

Trong phân tử catechin và gallocatechin có hai nguyên tử cacbon bất đối xứng ở vị trí C2 và C3, do đó tạo ra nhiều đồng phân quang học Thứ nhất là hai đồng phân thuận nghịch do C3 gây ra bao gồm đồng thuận và đồng phân nghịch Đồng phân thuận có nhóm OH nằm phía trên mặt phẳng phân cực,khi viết thêm kí hiệu epi Đồng phân nghịch nhóm OH nằm ở phía dưới mặt phẳng phân cực, khi viết không thêm kí hiệu Thứ hai đó là ba đồng phân dị cấu thể do C2 gây ra, có dạng L, dang D và dạng L D Nhóm OH ở vị trí C3 cũng có thể kết hợp với gallic acid để tạo catechin gallat hoặc gallocatechingallat

Các nghiên cứu về cấu trúc hóa học của catechin cho thấy nhóm catechin trong chè

có 7 đồng phân

Thành phần, hàm lượng các chất Catechin trong chèTheo lý thuyết, trong lá chè có thể có 24 loại catechin khác nhau Tuy nhiên, cho đến nay người ta mới chỉ tìm thấy 7 loại chất catechin có mặt trong lá chè tươi Các hợp chất catechin này được chia thành

2 nhóm: catechin tự do và catechin đã bị este hóa

Bảng 1.1 Các catechin chính có trong chè xanh

(viết tắt)

Catechin tự do

(+) Catechin (-) Epicatechin (+) Gallocatechin (-) Epigallocatechin

D,L-C L-EC D,L-GC L-EGC

Catechin đã bị este hóa

(-) Epicatechin gallat (-) Epigallocatechin gallat (+) Gallocatechin gallat

L-ECG L-EGCG L-GCG

Công thức các catechin chính có trong chè:

(+) – Catechin C 15 H 14 O 6 , M = 290, (-) – Epicatechin C 15 H 14 O 6 , M = 290

T nc = 176 o C, [α]D = +1 Tnc = 242 o C, [α]D = -69 o

(+) – Gallocatechin, C 15 H 14 O 7 (-) – Epigallocatechin C 15 H 14 O 7 ,

M = 306, T nc = 188 o C, [α] D = 15 o M = 306, T nc = 276 o C, [α] D = -50 o

(-) – Epigallocatechin gallat C 22 H 18 O 11 , (-) – Epicatechin gallat C 22 H 14 O 10

Hàm lượng Epigallocatechin gallate, Epicatechin gallate và Epigallo catechin chiếm chủ yếu trong tổng hàm lượng catechin (trên 80% tổng catechin) Trong quá trình phát triển của lá, dưới tác dụng của enzyme, các catechin chuyển dần thành các hợp chất tannin và giảm dần hàm lượng trong lá trưởng thành Những catechin này thể hiện các đặc tính sinh học của trà

a) Tính chất vật lý của catechin:

+ Catechin là những hợp chất không màu, dễ dàng bị oxy hoá, nhất là khi gia nhiệt trong môi trường axit, bị mất nước để chuyển thành những sản phẩm anthocyanidol có màu khác nhau

+ Trong tự nhiên catechin tồn tại ở dạng aglycon

+ Catechin có phổ tử ngoại hấp thụ cực đại ở vùng 280nm

+ Tan trong các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong nước

b) Tính chất hoá học:

mang tính chất hoá học của nhóm flavonoid.Các chất catechin có tính khử

mạnh, có thể tự oxi hoá trong không khí ẩm

1

2 O

H O 2

c) Vai trò của catechin:

+ Catechin có hoạt tính của vitamin P, tức là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và giảm tính thấm của vi ti huyết quản, củng cố tính bền thành mạch máu

+ Catechin được dùng phối hợp với vitamin E trong dự phòng điều trị chảy máu cấp và còn có tác động đến các biểu hiện lâm sáng khác của bệnh nhân như giảm bớt sốt, giảm nhiễm độc, giảm rối loạn hoạt động của hệ tim mạch

+ Catechin trong chè có tác dụng chống oxy hoá tức là chống quá trình oxy hoá dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động, do đó catechin trong chè là chất kìm hãm sự phát triển của khối u, chống phóng xạ và một số bệnh ung thư rất tốt Catechin chè làm tăng cường hoạt động của lách và gan Điều đáng quý là catechin chè là một chất không độc và chiếm tỷ lệ cao trong nhóm PP (chiếm khoảng 15–20% chất khô và trên 70% tổng lượng PP của lá chè)

+ Ngoài ta catechin còn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chế biến chè Các sản phẩm chè như chè đen, chè đỏ, chè vàng, chè xanh… với sắc nước hương thơm và vị đặc trưng rất khác nhau, phụ thuộc vào mức độ và chiều hướng của phản ứng oxy hoá bởi enzyme (và phi enzyme) các PP có trong lá chè

1.2.3.4 Các hợp chất Anthoxanthin

Các hợp chất anthoxanthin thuộc nhóm flavonol trong họ flavonoid Các hợp chất anthoxanthin có trong thực vật thường tồn tại ở cả hai trạng thái tự do và kết hợp (hợp chất glycozit)

Trong phân tử anthoxanthin, các nhóm –OH ở vị trí 3 và 7 có khả năng glycozit hoá, tức là có khả năng kết hợp với các gốc đường khác nhau (như glucoza, galactoza, ramnoza)

Các anthoxanthin trong lá chè tươi tồn tại cả hai dạng tự do và kết hợp, và các glycozit của chúng thường đính gốc đường tại các vị trí thứ 3

Công thức cấu tạo của các chất thuộc nhóm anthoxanthin:

Kampferol Quercetin

+ Anthoxanthin tồn tại trong chè chủ yếu dưới dạng glycozit có vị đắng và kích thích niêm mạc, làm se niêm mạc miệng, góp phần tạo vị chè

b) Vai trò của anthoxanthin:

+ Quercetin, myricetin, kampferol có tác dụng chống lại ung thư Năm 1995, Prof Leighton tại Uni Beckely, cho rằng quercetin còn vô hiệu hóa tác dụng các hợp chất kích thích sự phát triển ung thư, và triệt tiêu ung thư lúc mới bắt đầu, đặc biệt là ung thư ruột già Vì thế Viện nghiên Cứu Ung thư Hoa Kỳ (US National Cancer Institute) cho rằng người Trung Quốc ăn nhiều hành, tỏi nên đã giãm thiểu được 30-40% sự phát triển ung thư đường tiêu hóa của họ Trong ruột già của con người, có một lọai vi khuẩn làm chuyển hóa quercetin từ thể bất động (inactive) sang thể họat động (actice) (Leighton, 1995) Quercetin còn bảo vệ tế bào của DNA và ngăn ngừa mọi bệnh liên quan đến tim mạch (Leighton, 1995) [25]

+ Quercetine đã được chứng minh rằng nó có nhiều hiệu quả trong việc chống bệnh “gout” ( bệnh thống phong, lọai viêm khớp xương, với nhiều axit uric trong máu) [16], [17], [26]

+ Một nghiên cứu kéo dài 8 năm đã xác định rằng sự có mặt của 3 flavonol là kampferol, quercetin, và myricetin trong thành phần thức ăn hàng ngày có liên quan đến sự giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư tuyến tụy ở những người hút thuốc lá Điều này có thể là một căn cứ để giải thích cho “nghịch lý châu Á”, là hiện tượng châu Á có

tỉ lệ người hút thuốc lá rất cao, nhưng tỉ lệ ung thư lại thấp [23], [24]

1.2.3.5 Các hợp chất Anthocyanin

Hợp chất anthocyanin đều thuộc nhóm flavonoid dẫn xuất croman Trong thực vật, hầu như các hợp chất anthocyanin đều tồn tại ở trạng thái kết hợp với các gốc đường (glycozit)

Tất cả các anthocyanin đều có chứa trong vòng pyran oxy hoá trị tự do Ở trạng thái tự do, anthocyanin gồm 3 chất chủ yếu là pelargonidin, cyanidin và delphinidin

a) Công thức cấu tạo:

Pelargonidin Cyanidin Delphinidin

Các glycozit của anthocyanin được tạo thành do gốc đường glucoza, galactoza hoặc ramnoza kết hợp với gốc aglycon có màu gọi là anthocyanindin

b) Tính chất của các anthocyanin:

+ Hoà tan tốt trong nước và luôn có trong nước ép thực vật

+ Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào:

• Số lượng nhóm –OH trong vòng benzene

• Tạo phức muối với các ion kim loại để cho màu khác nhau Muối kali sẽ cho với anthocyanin màu đỏ máu, muối canxi và magie sẽ cho với anthocyanin phức có màu xanh

• pH môi trường pH >7 các anthocyanin cho màu xanh, pH <7 các anthocyanin

Ngoài trạng thái tự do, leucoanthocyanin còn có ở dạng glucozit Hàm lượng của

chúng trong lá chè rất ít so với hàm lượng của catechin

Qua nghiên cứu đã chứng minh các chất leucoanthocyanin là hợp chất trung gian

giữa catechin và anthoxanthin

1.2.3.7 Các axit phenol cacboxylic

Axit phenol cacboxylic là nhóm chất tự nhiên có trong thực vật Đặc điểm của

nhóm chất này là trong phân tử chúng có chứa nhóm phenol và nhóm cacbonyl

Hàm lượng của các axit phenol cacboxylic trong lá chè không cao, tuy nhiên

chúng cũng góp phần tạo nên vị của chè

Trong lá chè tươi có chứa các chất thuộc nhóm axit phenol cacboxylic như:

+ Axit gallic và ellagic

Axit gallic Axit ellagic

+ Axit metadigallic:

+ Axit chlorogenic (cafeil – 3 – quinic) và axit cafeic:

Axit chlorogenic Axit cafeic

+ Axit para – coumaric và axit galloylquinic (teogallin):

Dưới tác dụng của enzyme polyphenoloxydaza trong môi trường oxy thì các hợp chất tanin – catechin bị oxy hoá biến thành màu sắc hương vị đặc trưng của chè đen Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào đặc tính giống, thành phần búp chè, thời vụ thu hoạch, lá chè càng non hoạt tính enzyme càng cao Hoạt tính enzyme tăng dần từ đầu

vụ đến cực đại vào giữa vụ, sau đó giảm dần vào cuối vụ Người ta lợi dụng hoạt tính của enzyme khi chế biến để tạo ra các loại sản phẩm khác nhau như chè xanh, chè đen, chè vàng, chè đỏ…

Trong chè còn chứa các axit amin tự do chiếm 1,5–2%, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 17 loại axit amin, trong đó có 7 axit amin tự do không thay thế đối với cơ thể con người

Trong lá chè có các tiểu phần protein khác nhau, nhưng chủ yếu vẫn là glutelin hoà tan trong môi trường kiềm Albumin hoà tan trong nước thì có ít hơn, nhưng sau khi chế biến tỉ lệ albumin có thể tăng lên tới 10%

Trong quá trình chế biến axit amin tác dụng với đường tạo thành hợp chấtaldehyl thơm

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Phương pháp trích ly thu dịch chè

1.3.1.1 Lựa chọn phương pháp trích ly thu dịch chè

Trích ly là quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất

lỏng khác nhưng vẫn giữ đầy đủ thành phần và tính chất của nó Trích ly rắn lỏng là phương pháp tách một hay một số chất màu ra khỏi nguyên liệu dựa vào đặc tính của chất tan cần thiết và dung môi, là sự phân bố giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng một pha rắn tạo sự cân bằng lỏng rắn Dung môi phân cực sẽ tách được chất phân cực còn dung môi không phân cực sẽ tách được chât không phân cực Khi nguyên liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, lúc đầu dung môi thấm vào nguyên liệu,

sau đó hòa tan nhưng chất tan có trong tế bào nguyên liệu rồi được khuếch tán ra ngoài

tế bào Trong quá trình trích ly sẽ xảy ra quá trình khuếch tan, thẩm thấu, hòa tan …và chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, độ mịn của nguyên liệu Quá trình tích ly được ứng dụng rộng rãi

trong công nghiệp hóa học, thực phẩm cũng như trong nghành dược phẩm

Có rất nhiều phương pháp trích ly khác nhau như: Phương pháp trích ly ngâm (ngâm chiết) có khuấy trộn, phương pháp shoxlet, trích ly siêu âm (Ultrasound-assisted extraction), trích ly sử dụng dung môi siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction), trích ly lỏng cao áp (PFE: Pressurized Liquid Extraction) hay chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent) Nhưng dựa vào điều kiện thực tế nghiên cứu thì phương pháp khả quan nhất đó là phương pháp trích ly ngâm (ngâm chiết) có khuấy trộn: là phương pháp dùng để trích ly thu dịch chè

Phương pháp trích ly ngâm chiết hay còn gọi là đun cách thủy được tiến hành ở nhiệt độ dưới 100oC, ở áp suất 1 atm (hay 101.325 Pa, là phương pháp tương đối đơn giản và dễ lắp đặt, gia nhiệt gián tiếp qua nước, tránh hiện tượng quá nhiệt khi đun nóng, hạn chế được hiện tượng cháy chất cần đun Bên cạnh đó, sử dụng nhiệt gián tiếp từ nước sẽ góp phần kiểm soát được nhiệt độ và giảm nhiệt nhanh nếu tăng cao hơn so với nhiệt độ khảo sát Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong công nghệ tách chất màu tự nhiên từ thực vật [2]

Để tăng hiệu suất quá trình trích ly kết hợp thêm quá tình khuấy trộn để tăng quá trình tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu

thấp

Nhược điểm: Trong quá trình trích ly thu được cả các chất khác (tạp chất)

1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

a Chênh lệch nồng độ chất cần thiết ở trong nguyên liệu và dung môi

Nguyên liệu phải có lực hút nhỏ nhất đối với dung môi để tạo ra nồng độ chất cần chiết trong dung môi phía trong nguyên liệu càng lớn thì quá trình khuếch tán các phân

tử chất cần chiết đi ra càng mạnh

Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu phải lớn Tuy nhiên phải ở mức độ hợp lý, nếu tỷ

lệ qúa lớn làm cho nồng độ chất cần chiết trong dung môi chiết rút thấp gây khó khăn, cồng kềnh trong sản xuất

Có thể lợi dụng nguyên lý ngược dòng hoặc thay đổi dung môi chiết nhiều lần để tạo được sự chênh lệch nồng độ lớn

b Hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu

Mức độ phá vỡ cấu trúc tế bào càng nhiều thì sự tiếp xúc giữa chất cần chiết và dung môi càng tăng nên rút ngắn thời gian chiết và chiết triệt để hơn

Kích thước càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng tăng, hiệu suất chiết tăng Tuy nhiên cũng chỉ nên nhỏ tới mức nhất định vì quá nhỏ nguyên liệu dễ bị vón lại các hạt mịn lắng đọng trên các lớp nguyên liệu Mặt khác, nguyên liệu quá nhỏ sẽ bị cuốn vào dịch chiết gây khó khăn cho quá trình xử lý dịch chiết sau khi chiết

Tính chất của nguyên liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết Khi chiết bằng dung môi hữu cơ, độ ẩm nguyên liệu giảm thì tốc độ chiết tăng lên

c Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ

Thời gian càng dài thì lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn Khi đạt được mức độ trích ly cao nhất nếu kéo dài thời gian thì sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, do đó phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi Tuy nhiên, nhiệt độ tăng có giới hạn, vì nhiệt độ quá cao sẽ có thể phân hủy phân tử cần chiết và gây khó khăn cho quá trình công nghệ

d Dung môi chiết

Dung môi trích ly là các dung môi hòa tan được hợp chất cần trích ly Anthocyanin là hợp chất phân cực, dễ tan trong nước nóng và các dung môi có độ

phân cực cao như ethanol, methaonol…

Dung môi chiết cần thỏa mãn các điều kiện như: hòa tan chất cần chiết ở bất kì tỷ

lệ nào mà có nhiệt độ sôi thấp để dễ dàng tách dung môi ra khỏi dịch chiết, có thành phầnhóa học ổn định, không phản ứng phụ với nguyên liệu, không độc hại, không ảnh hưởng sức khỏe và chất lượng sản phẩm, khó cháy nổ, an toàn cho quá trình sản xuất,không ăn mòn thiết bị, rẻ tiền, dễ kiếm, có khả năng sử dụng trong sản xuất

Tuy nhiên hiện nay chưa có loại dung môi nào đáp ứng đầy đủ tất cả những điều kiện trên Dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm, tính an toàn không độc hại thì dung môi sử dụng là nước và phương pháp ngâm chiết là phương pháp phù hợp dùng để tách chiết catechin, đồng thời áp dụng một số kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu suất chiết catechin

1.3.2 Công nghệ tách tinh chế polyphenol-catechin từ lá chè [13], [14]

Sau quá trình trích ly thu được dịch chè gồm hỗn hợp polyphenol-catechin và các

chất màu, chất sáp như chlorophyl, cafein, pectin, protein và các chất khác Để quá trình tách, tinh chế pp-catechin cho hiệu suất cao và chất lượng tốt cần tiến hành phân lập từng phần các chất dựa vào đặc tính hòa tan chọn lọc của chúng trong các dung môi khác nhau Nguyên tắc chủ yếu là loại trừ dần các chất không mong muốn có trong sản phẩm pp-catechin thu được Thường tiến hành loại bỏ chlorophyl, cafein và các chất khác trước Sau đó mới chiết tách polyphenol-catechin sẽ làm tăng hiệu quả tinh chế bởi các chất sáp sẽ không còn để cản trở quá trình chiết catechin

1.3.2.1 Chiết tách chlorophyl, cafein và các chất khác

Các chất béo, chất sáp, chất màu có đặc điểm chung là hòa tan tốt trong nhau và tan tốt trong các dung môi chứa gốc clo Các loại dung môi này thường là dung môi độc và có nhiệt độ bay hơi thấp như diclometan, clorofooc Các dung môi hydrocacbon khác như benzen, hexan lại hòa tan rất ít chất màu Ngoài ra nhóm chất chứa nhóm clorofooc còn hòa tan rất tốt cafein là chất cần được loại bỏ trong quá trình tách tinh chế pp-catechin

1.3.2.2 Chiết tổng hợp polyphenol-catechin

Dựa trên cơ sở nhóm chất polyphenolin-catech có tính hòa tan tốt trong etyl axetat Sau khi loại bỏ cafein, chlorophyl, các chất màu và dung môi ra khỏi dịch chiết chè thì trong dịch chiết chè chủ yếu còn lại catechin Đem xử lý dịch chiết bằng dung môi hữu

cơ như etyl axetat thì polyphenol-catechin chuyển vào pha etyl axetat Tách lấy dịch chiết và đem loại bỏ dung môi etyl axetat ta thu được chế phẩm polyphenol-catechin

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguên liệu chè lấy từ Điện biên và Hà Giang, chất lượng nguên liệu khi thu hái

Thực tế cho thấy, tổ chức thu hái chè đúng kỳ, đúng kỹ thuật là yếu tố quan trọng đảm bảo chất lượng chè nguyên liệu Nếu thu hái chè không đúng kỳ, búp chè sẽ phát triển

và già đi, nếu hái không đúng kỹ thuật thì khả năng nẩy búp tiếp theo của cây chè sẽ giảm Ở các nước phát triển, có những máy chuyên dùng phục vụ cho việc hái chè, trên các nông trường ở nước ta, việc hái chè vẫn còn thực hiện thủ công

1.1.2 Thiết bị nghiên cứu

- Thiết bị cân phân tích độ chính xác 0,0001g và 0,01g - Thiết bị lọc chân không

- Bình hút ẩm - Bình ổn nhiệt

- Thiết bị cô quay chân không - Tủ sấy

- Máy đo quang phổ - Dụng cụ đo BX

- Máy lắc vortex

- Máy đo pH

2.2 Sơ đồ nghiên cứu

Khảo sát nguên liệu

- Xác định độ ẩm (TCVN 5613:2013)

- Xác định hàm lượng chất hòa tan(TCVN 5610-1991)

-Xác định hàm lượng polyphenol tổng

(TCVN 9745-1:2013, ISO 1:2005)

14502 Xác định hàm lượng Anthocyanin (TCVN 11028-2015)

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

đến quá trình trích ly thu dịch

chè

Xây dựng phương án tối ưu

cho quá trình trích ly

Khảo sát dịch chè sau khi

chiết ở điều kiện tối ưu

- Khảo sát yếu tố nhiệt độ

- Khảo sát yếu tố thời gian

- Khảo sát yếu tố pH

- Khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

- Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TCVN 9754-1:2013)

- Xác định hàm lượng cafein tổng (Bertrand)

- Khảo sát dung môi diclometan/clorofooc

ưu cho quá trình Tách và

tinh chế catechin

Thu chế phẩm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân tích

2.3.1.1 Xác định độ ẩm ( TCVN 5613-2015 )[5]

Dùng máy nghiền một lượng chè có kích thước phù hợp để tiến hành thí nghiệm

Mở nắp chén cân, sấy cả chén và nắp trong 1h ở tủ sấy với nhiệt độ kiểm soát là 103±2

oC Làm nguội trong bình hút ẩm Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng thì đậy nắp và cân chính xác tới 0,001g Cân khoảng 4g mẫu thử chính xác tới 0,001g cho vào trong chén Cho vào trong tủ sấy để nắp bên cạnh trong tủ với nhiệt độ 103±2oC trong 4h (đến khối lượng không đổi) Cửa tủ không được mở trong quá trình sấy Mở tủ sấy và đậy ngay nắp chén Lấy chén cho vào bình hút ẩm, mở nắp, để nắp trong bình hút ẩm,

để khoảng 30 phút Lấy chén ra ngoài và đậy nắp, cân chính xác tới 0,001g Đặt chén cân vào trong tủ sấy và để nắp bên cạnh Sấy trong 1h sau đó cho vào bình hút ẩm để nguội Cân chính xác tới 0,001g Lặp lại thao tác trên tới khi khối lượng không đổi (giữa 2 lần cân chênh lệch không vượt quá 0,005g)

Độ ẩm của mẫu tính theo công thức:

Trong đó: m0 là khối lượng mẫu thử ban đầu, tính bằng gam (g);

m1 là khối lượng phần mẫu thử đã sấy khô, tính bằng gam (g)

2.3.1.2 Xác định hàm lượng chất hòa tan ( TCVN 5610-1991 ) [4]

Cân 2g chè với độ chính xác 0,01g, cho vào bình cầu có dung tích 500 cm3 và hòa chúng bằng nước cất sôi, lắp sinh hàn ngược và đun trên bếp cách thủy trong

60 phút, khuấy đều nước trong bình để chè không dính vào thành bình, sau khi chiết làm nguội nhanh bình dưới vòi nước Dịch chiết được chuyển định lượng vào bình định mức có dung tích 500 cm3 đổ thêm nước cất đến vạch mức và lắc đều sau đó lọc qua phễu lọc khô Lấy 50 cm3 dung dịch vào bát sứ khô đã biết trọng lượng, cho bay hơi trên nồi cách thủy, sau đó đặt chén có phần cặn vào tủ sấy ở nhiệt độ 103 ± 2℃, sấy trong 2 giờ và làm nguội trong bình hút ẩm rồi

cân, sau đó sấy 1h, làm nguội và cân Nếu cần thiết lặp lại những động tác trên cho đến khi hiệu của 2 kết quả cân liên tiếp không lớn hơn 0,01g

2.3.1.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Trong nguyên liệu (TCVN

9745-2013)[3]

Nguyên tắc của phương pháp xác định polyphenol đó là: polyphenol từ phần mẫu thử của lá chè đã nghiền mịn được chiết bằng metanol 70 % ở 70 °C Các polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng đo màu, dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu Thuốc thử này chứa chất oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại

ở bước sóng 765 nm Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden Các thuốc thử Folin-Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và mặc dù có thể có đáp ứng khác nhau với các hợp chất đơn lẻ, thì việc lựa chọn axit gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu polyphenol tổng số

Ta sử dụng hỗn hợp chiết metanol/nước, 70 % và thuốc thử Folin-Ciocalteu loãng,

10 % (thể tích, dung dịch natri cacbonat, 7,5 % (khối lượng), dung dịch chuẩn gốc axit gallic, tương đương với axit gallic khan nồng độ khoảng 1 000 µg/ml

Dung dịch chuẩn axit gallic: từ A đến E

Bảng 2 1: Dung dịch chuẩn axit gallic pha loãng

Dung dịch chuẩn axit gallic

Thể tích của dung dịch gốc axit gallic

ml

Nồng độ danh định của chất chuẩn pha loãng