SẢN XUẤT một số sản PHẨM lên MEN KHÁC (CÔNG NGHỆ VI SINH)

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https:123doc.netusershomeuser_home.php?use_id=7046916. Slide công nghệ vi sinh dược ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn công nghệ vi sinh dược bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

SẢN XUẤT MỘT SỐ SẢN PHẨM LÊN MEN KHÁC

Mục tiêu:

Trình bày được

- Qui trình sản xuất acid hữu cơ

- Qui trình sản xuất acid amin bằng con đường lên men

- Qui trình sản xuất vitamin

SẢN XUẤT ACID HỮU CƠ

Acid lactic

Nhu cầu

- Hàng trăm triệu tấn/năm

- Nhu cầu gia tăng ~ 7%/năm

Acid lactic

Sản xuất công nghiệp

- Được sản xuất lần đầu tiên do Charles E Avery (Littleton, Massachusetts, USA), năm1881

- Có 02 phương pháp:

1 Tổng hợp hóa học

2 Lên men carbohydrate

Acid lactic

Sản xuất bằng pp hóa học

- Dựa trên lactonitril:

• Hydrogen cyanide được thêm vào acetaldehyde có sự

có mặt của kiềm

• Pư xảy ra ở dạng lỏng, áp suất cao

- Tinh chế lactonitril thô bằng pp chưng cất

- Thủy phân lactonitril thành acid lactic bằng acid HCl đậm

đặc hoặc H2SO4

- Ester hóa acid lactic bằng MeOH, tạo methyl lactate

- Tinh chế methyl acetate bằng pp chưng cất

- Thủy phân methyl lactate bằng acid, tạo acid lactic

Sản phẩm là hỗn hợp racemic (+), (-) acid lactic

Acid lactic

Sơ đồ quá trình tổng hợp acid lactic bằng pp hóa học

Acid lactic

Sản xuất bằng pp hóa học: 1 số qui trình khác

- Oxy hóa propylene glycol

- Thủy phân acid chloropropionic

- Oxy hóa propylene

- Pư giữa acetaldehyde, carbon monoxide và nước ở nhiệt độ và áp suất cao

Acid lactic

Sản xuất bằng pp lên men:

- Lên men carbohydrate

- Có thể tạo dạng L(+) hay D (-) tùy theo chủng vi khuẩn

sử dụng

- Gồm các bước chính:

• Lên men carbohydrate tạo calcium lactate

• Thủy phân calcium lactate

• Tinh chế acid lactic

Acid lactic

Gđ lên men carbohydrate và trung hòa acid

C6H12O6 + Ca (OH)2 (2CH3CHOHCOO- ) Ca2+ 2H2O

Carbohydrate Calcium lactate

Thủy phân calcium lactate

2(CH3CHOHCOO-) Ca2 + H2SO4 2 CH3CHOHCOOH + Ca SO4 Calcium lactate Lactic acid

Tinh chế acid lactic: giống pp hóa học

- Ester hóa bằng MeOH

- Thủy phân methyl lactate, thu acid lactic

Acid lactic

Tóm tắt các giai đoạn sản xuất bằng pp lên men:

- Lên men carbohydrate

- Lọc dịch nuôi cấy để loại bỏ tế bào

- Calcium sulfate không hòa tan được lọc bỏ

- Tinh chế acid lactic bằng thủy phân, ester hóa, chưng cất

Acid lactic

Quá trình lên men

sx acid lactic

Acid lactic

Cơ chế lên men: 02 cơ chế

- Lên men lactic đồng hình: acid lactic chiếm đa số

• Phân giải đường theo con đường EM, sử dụng

enzyme aldolase  acid pyruvic

• Acid pyruvic  acid lactic

- Lên men lactic dị hình: acid lactic chiếm tỉ lệ thấp, hỗn

hợp sản phẩm gồm acid acetic, acid formic, CO2

• Phân giải đường theo con đường

hexosomonophosphate (HMP), sử dụng enzyme phosphoketolase

Acid lactic

Cơ chế lên men lactic đồng hình:

- Mono hoặc disaccharide  acid pyruvic theo con

đường phân Embden - Mayerhoff (EM)

- Trong điều kiện kỵ khí, acid pyruvic  acid lactic do enzyme lactate dehydrogenase (LDH) xúc tác

- LDH qui định sản phẩm lên men là L(+) hay D(-) acid

lactic (do gen ldhL hay ldhD, tùy theo chủng vi khuẩn)

• Gen mã hóa enzyme L(+) LDH được nghiên cứu ở

L plantarum

• Gen mã hóa enzyme D(-) LDH được nghiên cứu ở

L johnsonii

Acid lactic

Nguyên liệu

Chủng vi khuẩn: nguyên tắc lựa chọn

- Lên men nhanh chóng và hoàn toàn từ các nguyên liệu rẻ tiền

- Sản xuất dạng đồng phân cần thiết với hiệu suất cao

- Hạn chế tối thiểu lượng sinh khối tạo ra

- Ít sản phẩm phụ

Acid lactic

Nguyên liệu:

Nguồn nitơ: sử dụng các nguồn nitơ khác nhau: cao

nấm men (5-15 g/l), mầm lúa mạch, peptone, thịt bò,

casein thủy phân

Vitamin: các vitamin B (vit B6)

Nguyên tố vi lượng: P, K, Mg, S: ảnh hưởng không rõ

Acid lactic

Qui trình lên men: 02 qui trình chính cho hiệu suất cao

- Lên men liên tục

- Lên men từng lô mẻ

Acid lactic

Lên men liên tục

Ưu điểm:

- Năng suất cao 117 g/l/h

- Cung cấp tế bào liên tục  gia tăng nồng độ acid lactic L(+) tinh khiết

Nhược điểm:

- Nồng độ acid lactic thấp

- Mật độ tế bào cao  khuấy trộn môi trường không đều

Acid lactic

Thu hoạch acid lactic

- Dung dịch lên men có thể chứa acid lactic tinh khiết, hay dạng muối hoặc cả hai dạng

- 1 số phương pháp tách chiết acid lactic:

• Dùng dung môi

• Sắc ký trao đổi ion

• Sắc ký hấp phụ

• Chưng cất chân không

• Trao đổi qua màng

- Giảm pH 1,6 và chạy cột sắc ký với nhựa trao đổi

cation, rửa cột bằng H2SO4 loãng

Acid lactic

Sơ đồ sản xuất acid lactic bằng phương pháp lên men liên tục

Acid gluconic

Đại cương

- Năm 1870, Hlasiwetz và Habermann phát hiện

- Năm 1880, Boutroux tìm thấy các vi khuẩn sinh acid acetic có thể sản xuất acid gluconic

- Năm 1922, Molliard tìm thấy acid gluconic từ A niger

- Hiện nay, acid gluconic có thể sản xuất từ nhiều chủng như Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter và

nhiều chủng nấm

• Dạng muối sắt: điều trị thiếu máu

• Dạng muối calci: điều trị thiếu calci

• Dạng muối kẽm: điều trị chứng lạnh run, lành vết thương

-Ngành công nghiệp giấy, vải sợi, thức ăn gia súc,

Acid gluconic

Nhu cầu

- ~ 60.000 tấn/năm

- Dạng chủ yếu là muối Na, Ca

Sản xuất: có nhiều pp sản xuất acid gluconic

- PP hóa học

- PP điện hóa

- PP sinh hóa

- PP lên men

Acid gluconic

Sản xuất acid gluconic bằng pp lên men

Chủng vi sinh vật:

- A niger được sử dụng nhiều

- Hiện nay đang nghiên cứu Gluconobacter oxydans

- Vi khuẩn Pseudomonas cũng được dùng tuy nhiên có

nhiều sản phẩm phụ như 2-ketogluconat hay

2,5-diketogluconic acid

Acid gluconic

Tùy theo sản phẩm là Na hay Ca gluconat, qui trình lên men sẽ khác nhau (nồng độ glucose, pH)

Natri gluconate Calci gluconate

hòa  muối calci kết tủa  ngăn cản vận chuyển oxy

Acid gluconic

Con đường lên men tạo acid gluconic từ glucose ở A

niger

Acid gluconic

A niger có khả năng sản xuất tất cả enzyme cần thiết

cho quá trình chuyển glucose  acid gluconic

- Glucose oxidase: glucose  glucono – lactone

- Lactonase: glucono – lactone  acid gluconic

- Mutarotase: gia tăng tốc độ phản ứng

- Catalase: H2O2 là sản phẩm phụ của pư, do vậy

catalase phân hủy H2O2 thành oxy và nước

Acid gluconic

Sản xuất acid gluconic bằng pp lên men

- Quá trình sản xuất acid gluconic ảnh hưởng trực tiếp bởi hoạt tính của enzyme glucose oxidase

Acid gluconic

Nguyên liệu lên men:

Carbon: thường sử dụng glucose, có thể sử dụng rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột,…

Ion kim loại: Zn, Cu, Mg, Ca, Fe,…

Acid gluconic

Thu hoạch acid gluconic

- Lọc để loại bỏ sinh khối

- Trung hòa bằng Ca(OH)2  Ca gluconate

- Tủa Ca gluconate bằng NaCl ở nhiệt độ lạnh

- Thêm H2SO4  tạo tủa CaSO4

- Dịch còn lại chạy qua cột trao đổi cation để hấp phụ Ca

2+ còn sót lại

- Kết tinh acid gluconic ở -10 oC, có hoặc không có cồn

Acid citric

Đại cương

- Do nhà hóa học Thụy điển Carl Wihelm Scheele phân lập lần đầu tiên năm 1874

- Năm 1893, C Wehmer phát hiện nấm mốc Penicillium

có khả năng sản xuất acid citric

- Năm 1917, James Currie phát hiện A niger có thể sản

xuất acid citric hiệu quả

Acid citric

Vai trò

- Ngành công nghiệp thực phẩm: dùng làm chất điều

chỉnh pH, chất điều vị, bảo quản; dạng muối Na, K, Ca dùng làm phẩm màu thực phẩm

- Ngành dược phẩm:

• Tác dụng chống oxy hóa khi dùng phối hợp với acid ascorbic

• Điều chỉnh pH đường tiêu hóa

• Tăng độ hòa tan của thuốc phiện

Acid citric

Nhu cầu

- Sản xuất ~ 1,6 triệu tấn/năm

• 50% dùng trong ngành nước giải khát

• 20% dùng trong ngành thực phẩm

• 20% dùng trong các chất tẩy rửa

• 10% dùng trong các ngành khác như mỹ phẩm, dược phẩm, công nghiệp hóa học

- Nhu cầu tăng 2 – 3%/năm

- 90% a citric được sản xuất bằng pp lên men

Acid citric

Sản xuất bằng phương pháp lên men: gồm 03 giai đoạn

- Nuôi cấy giống

- Lên men

- Tinh chế sản phẩmSản xuất bằng phương pháp lên men: có 03 cách chính

- Lên men chìm

- Lên men bán lỏng

- Lên men trên môi trường rắn

Acid citric

Sản xuất acid bằng phương pháp lên men

Chủng vi sinh vật:

- Aspergillus niger, A clavatus, A wentii, Penicillium

luteum, Mucor periformis, A fumaricus, A japonicus, Botrytis cinerea được sử dụng để sản xuất a citric

- Chủng A niger

• Hiệu suất cao

• Dễ bảo quản

• Có thể lên men từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền

- Khi sử dụng nấm mốc sản xuất a citric:

• Nhược điểm: sản phẩm phụ acid iso-citric

Acid citric

Nguyên liệu:

- Nguồn phospho:

• Nồng độ thấp  tăng hiệu suất

 Tác động trên hoạt tính enzyme, không ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gen

• Nồng độ cao  tạo sản phẩm phụ như a gluconic

- Nguồn nitơ:

• Muối ammonium, peptone, cao mạch nha, ,

• Acid ammonium  giảm pH  tăng hiệu suất

• Nồng độ nitơ: 0,1 – 0,4 g/l Nồng độ nitơ cao 

VSV tăng trưởng nhanh, tiêu thụ nhiều đường nhưng lượng a citric tạo ra giảm

Acid citric

Nguyên liệu:

- Ion kim loại: Cu2+ :150 mg/l, Zn2+: 0,5 mg/l, Mn2+: 3 mg/l

- Rượu: EtOH, MeOH, n-propanol, isopropanol,

• Bổ sung vào nguyên liệu tinh khiết  ức chế

• Bổ sung vào carbohydrate thô  kích thích

• Nồng độ: 1 – 5%: tùy thuộc chủng VSV và thành

phần môi trường

Acid citric

Một số yếu tố hóa học ảnh hưởng đến lên men a citric

• Tăng nồng độ oxy  tăng hiệu suất

• Nồng độ: 25%

Acid citric

Lên men chìm

- 80% a citric được sản xuất bằng pp này

- Cho môi trường vào các thùng lên men, vô trùng ở 110 – 120 oC

- Làm nguội tới 32 – 34 oC, bổ sung giống bào tử hoặc dịch nhân giống

- Nuôi ở 32 oC, khuấy và thổi khí liên tục Thời gian lên men 6 - 7 ngày

-Thêm CaCO3 vào môi trường để giảm độ acid

- Sau khi kết thúc lên men, dùng H2SO4 để chuyển calci citrat thành acid citric

Acid citric

Lên men bề mặt

- Là pp sản xuất a citric đầu tiên

- Hiện nay áp dụng để sx qui mô nhỏ

• Dụng cụ lên men là khay nhôm hoặc thép không rỉ

• Buồng lên men được cung cấp khí lọc vô trùng để đảm bảo độ ẩm, nhiệt độ, tránh ngoại nhiễm (các

nấm men, vi khuẩn lactic, Penicillium)

Acid citric

Lên men bề mặt

- Môi trường pha xong được lọc và vô trùng, cấy giống bào tử, cho lên men trên các khay có lớp môi trường

dày khoảng 2 - 8 cm và có thổi khí đã lọc trên bề mặt

khay, nhiệt độ buồng lên men giữ ở 28 – 32 oC

- Có thể thực hiện qua hai bước có bổ sung đường:

• Nuôi mốc khoảng 48 - 60 giờ trên lớp môi trường 2 -

3 cm tạo thành màng mốc

• Bổ sung vào phía dưới dịch đường 12 - 13% (không

có muối khoáng) nâng lớp môi trường dày tới 8 cm

• Tiếp tục lên men 8 ngày

Acid citric

Thu hoạch acid citric: có 03 cách

- Kết tủa: được sử dụng nhiều nhất

- Chiết tách

- Hấp phụ: dùng nhựa trao đổi ion

-Tinh sạch citric acid qua các cột tẩy màu, trao đổi

cation, trao đổi anion và tẩy màu lần cuối

- Kết tinh

SẢN XUẤT ACID AMIN

Đại cương

- Tất cả 20 acid amin đã được bán trên thị trường, nhiều

nhất là acid glutamic, methionin, lysin

• Gluctamic và lysin được sản xuất bằng pp lên men

• Methionin được sx bằng pp tổng hợp hóa học

- Vai trò của acid amin:

• Ngành chăn nuôi gia súc: dinh dưỡng bổ sung

(lysin, methionin, threonin,…)

• Ngành công nghiệp thực phẩm: điều vị

(monosodium glutamic, acid aspartic, …)

• Ngành dược phẩm: thuốc bổ

Đại cương

- Acid amin được sản xuất chủ yếu tại Nhật bản, Mỹ,

Trung quốc, châu Âu, Hàn quốc

• Có nguồn gốc từ Nhật bản

• Chiết xuất từ 1 loại tảo biển

• 1908, Kikunae Ikeda (ĐH Tokyo) đã chiết tách

Đại cương

 Vào năm 1957, Kinoshita và cs đã phân lập từ mẫu

đất vi khuẩn Corynebacterium glutamicum có khả

năng sản xuất một lượng lớn acid glutamic

Đại cương

- 03 phương pháp sản xuất acid amin:

1 Phương pháp trích ly các acid amin từ dịch thủy phân protein (L-cystein, L-cystin, L-leucin, L-

asparagin, L-tyrosin)

2 Phương pháp tổng hợp hóa học (glycin, alanin, methionin, tryptophan)

3 Phương pháp lên men vi sinh vật

 Phương pháp hóa học thường cho hỗn hợp dạng đồng phân L và D-acid amin

Sản xuất acid amin bằng phương pháp lên men

Loại acid amin Chủng sử dụng suất (g/l) Năng carbon Nguồn

Dl-alanin Microbacterium ammoniphilum 60 Glucose L-alanin Streptomyces coelicolor 3 - 19 9 Glucose L-arginin Brevibacterium flavum 35 Glucose L-phenylalanin Corynebacterium glutamicum 9 Glucose

L-glutamic acid

Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum

Arthrobacter paraffineus

>100 98 82

Glucose Acetat n-alkans L-histidin Brevibacterium flavum 10 Glucose L-leucin Brevibacterium lactofermentum 28 Glucose

L-lysin Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum FA 1 - 30

Brevibacterium flavum

39 57 75

Glucose Glucose Acetat L-methionin Corynebacterium glutamicum 2 Glucose L-ornithin Corynebacterium glutamicum 26 Glucose L-prolin Brevibacterium flavum 29 Glucose L-threonin

Brevibacterium flavum

E coli K12

E coli K12

18 27 55

Glucose Acetat Đường ăn L-tryptophan Corynebacterium glutamicum Px 115-97 12 Glucose L-tyrozin Corynebacterium glutamicum Ps 20 18 Glucose L-valin Brevibacterium lactofermentum No 487 31 Glucose

Chủng vi sinh vật sản xuất acid amin bằng con đường lên men

Acid L- glutamic

Nguyên liệu:

Chủng visinh vật: Corynebacterium glutamicum,

Brevibacterium flavum, B lactofermentum, B

thiogenitalis, và Microbacterium ammoniaphilum

- Đặc điểm chung của các chủng này:

• Rỉ đường phế thải cũng được sử dụng vì rẻ tiền

nhưng chứa một lượng lớn biotin  ngăn cản tổng hợp glutamate

Vitamin và dưỡng chất khác: dịch chiết bắp cung cấp

acid amin, khoáng chất, vitamin

Acid L- glutamic

Quá trình lên men:

- Thường áp dụng qui trình nuôi cấy liên tục

• Qui trình nuôi cấy theo lô mẻ: tất cả nguyên liệu cho vào từ đầu  nồng độ đường cao hơn ~ 20% 

oxy hóa không hoàn toàn đường  giảm hiệu suất

- Qui trình:

• Hoạt hóa giống C glutamicum

• Nhân giống: 200 – 1.000 l  10.000 – 20.000 l  lên men 50.000 – 500.000 l

• Sau 14h, nhiệt độ tăng từ 32 -33 oC lên 38 oC, thời gian lên men ~ 36h

• Cung cấp glucose với nồng độ ≥ 160 g/l

• Sản lượng 100 g/l

Acid L- glutamic

Qui trình sản xuất sodium glutamate của Ajinomoto

L- lysine

Đại cương:

- Lysine được dùng để bổ sung thức ăn gia súc

- Sản xuất ~ 400.000 tấn/năm

- Corynebacterium glutamicum đột biến tự dưỡng

homoserine có khả năng sản xuất L- lysine

Điều hòa sinh tổng hợp lysine

L- lysine

Qui trình lên men:

Tương tự quá trình lên men L- glutamate

- Nguồn carbon: mật đường, rỉ đường

- Biotin: nếu nồng độ biotin ban đầu thấp  bổ sung lượng 30 μg/l

- Được sản xuất từ chủng E coli tái tổ hợp, có khả năng

đề kháng chất tương tự L- threonin là

α-amino-β-hydroxyvaleic acid (AHV)

L- threonine

Điều hòa sinh tổng hợp threonine ở E coli

L- aspartic

- Được dùng trong dược phẩm, thực phẩm

- Từ 1973, L- aspartic đã được sản xuất bằng pp nuôi

cấy cố định tế bào E coli tái tổ hợp trên các giá mang

polyacrylamide, polyurethane

- Aspartic được sản xuất từ fumarate và amonia, do enzyme aspartase xúc tác, pH 8,5

L- alanine

- Vi khuẩn Pseudomonas dacunhae được chọn làm

chủng vi khuẩn sử dụng trong sản xuất L-alanine vì có hoạt tính aspartate β-decarboxylase cao

• L-alanine được sản xuất bằng cách cố định P

dacunhae trên K-carageenan

• Các vi khuẩn sau khi cố định được nhồi vào cột

Quá trình được tiến hành ở áp suất cao, ngăn ngừa khí carbonic thoát ra

• Cột này được nối tiếp với hệ thống sản xuất

L-aspartate  sản xuất L-alanine trực tiếp từ

fumarate

- Tuy nhiên trong hệ thống này, phản ứng phụ gây ra bởi

fumarase và alanine racemase ở cả hai vi khuẩn E coli

và P dacunhae  tạo sản phẩm phụ malate và

D-alanine  giảm hiệu suất

 Các enzym này bị bất hoạt bằng cách xử lý riêng tế bào hai vi khuẩn ở nhiệt độ cao và pH thấp

L- alanine

- L-cystein được dùng làm hóa chất, dưỡng tóc, chất phụ gia thực phẩm

- L-cystein có thể sản xuất :

• Chiết xuất lông tóc

• Bằng enzyme từ L-cysteine từ thiazoline-4-carboxylate (DL-ATC)

DL-2-amino-Δ2-• Vi khuẩn Pseudomonas thiazolinophilum