Nghiên cứu quá trình thuỷ phân cá cơm bằng chế phẩm Proteaza từ nấm mốc Aspergillus orizae trong sản xuất nước mắm ngắn ngày

Nghiên cứu quá trình thuỷ phân cá cơm bằng chế phẩm Proteaza từ nấm mốc Aspergillus orizae trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Nghiên cứu quá trình thuỷ phân cá cơm bằng chế phẩm Proteaza từ nấm mốc Aspergillus orizae trong sản xuất nước mắm ngắn ngày luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

-

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CÁ CƠM BẰNG

Tập thể các thầy, cô giáo Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội

Các bạn đồng nghiệp trong Khoa Thủy Sản Trường Cao Đẳng Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.Hồ Chí Minh

Đặc biệt ghi ơn Giáo sư Tiến sĩ : Hoàng Đình Hòa đã định hướng và tận tình chỉ dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cám ơn sự cộng tác giúp đỡ của các em sinh viên Khoa Thủy Sản Trường Cao Đẳng Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.Hồ Chí Minh

LỜI CAM ĐOAN 2

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 3

LỜI MỞ ĐẦU 4

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEAZA VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 6

1.1 Những nghiên cứu về proteaza 7

1.2 Những nghiên cứu về thu nhận proteaza từ mấm mốc Aspergillus oryzae 12

1.3 Đặc điểm và những nghiên cứu về nước mắm 15

1.3.1 Tình hình tiêu thụ và sản xuất nước mắm trong trong và ngoài nước 15

1.3.1.1 Trong nước 15

1.3.1.2 Ngoài nước 15

1.3.2.Những nghiên cứu về nước mắm 18

1.3.3.Mục tiêu, nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài 28

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.1 Chọn đối tượng cá để thủy phân là cá cơm 29

2.1.2 Muối ăn 30

2.1.3 Chế phẩm enzym dùng để thủy phân là proteaza 30

2.2 Ph ương pháp nghiên cứu 31

2.2.1.Sơ đồ nội dung nghiên cứu 31 2.2.2 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu theo tiêu

2.2.5.Xử lý số liệu thức nghiệm theo phương pháp

thống kê toán học 36

2.2.6.Xác lập công thức và vẽ đồ thị quy luật biến đổi của các thông số bằng phần mềm Microsoft for Windows 36

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm proteaza kỹ thuật của A.oryzae A 4 vào sản xuất nước mắm 37

3.1.1 Xác định chế độ thủy phân thích hợp trong trường hợp tiếp nhiệt tự nhiên 38

3.1.2 Tối ưu quá trình thủy phân chượp bằng chế phẩm proteaza kỹ thuật trong điều kiện tiếp nhiệt nhân tạo 55

3.2 Nghiên c ứu ứng dụng chế phẩm proteaza tinh khi ết của A.oryzae của hãng Merck 60

3.3 Ứng dụng chế phẩm proteaza kỹ thuật của A.oryzae A 4 để thử nghiệm sản xuất nước mắm 66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69

PHỤ LỤC

TÓM TẮT

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

E – Pr.Kt Chế phẩm Proteaza kỹ thuật

GTNC Giá trị ngưỡng cảm

Hđp Hoạt độ phân giải Protein của 1 lượng chế phẩm

Proteaza ( số gam đạm axit amin được tạo thành sau 1 giờ ở điều kiện nhiệt độ 38 - 400C, pH thích hợp )

Naa Đạm axit amin

NXB Nhà xuất bản

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Đố thị 3.1 Biến đổi hàm lượng N aa của dịch chượp ở các mẫu

có tỷ lệ muối ban đầu khác nhau theo thời gian 39

Đồ thị 3.2 Biến đổi hàm lượng N NH3 của dịch chượp ở các

mẫu có tỷ lệ muối ban đầu khác nhau theo thời gian 40

Đồ thị 3.3 Biến đổi hàm lượng N aa của dịch chượp ở các mẫu

có tỷ lệ muối bổ sung khác nhau theo thời gian 46

Đồ thị 3.4 Biến đổi hàm lượng N NH3 của dịch chượp ở các

mẫu có tỷ lệ muối bổ sung khác nhau theo thời gian 47

Đồ thị 3.5 Biến đổi hàm lượng N aa của dịch chượp ở các mẫu

theo tỷ lệ proteaza và thời gian thủy phân 50

Đồ thị 3.6 Biến đổi hàm lượng N NH3 của dịch chượp ở các mẫu

theo t ỷ lệ proteaza và thời gian thủy phân 51

Đồ thị 3.7 Biến đổi hàm lượng N aa theo thời gian khi thủy

phân bằng enzym proteaza tinh khiết từ A.oryzae 65

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định chế độ thủy

phân cá bằng chế phẩm enzym kỹ thuật ( E-Pr.Kt)

trong sản xuất nước mắm 32

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy

phân cá bằng chế phẩm enzym proteaza tinh khiết từ

A.oryzae trong sản xuất nước mắm 33

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

B ảng 2.1 Thành phần hóa học của cá cơm 30

B ảng 3.1 Biến đổi trạng thái cảm quan của chượp ở các

mẫu có tỷ lệ muối khác nhau 40

B ảng 3.2 Biến đổi trạng thái cảm quan của chượp theo các

chế dđộ bổ sung muối 47

B ảng 3.3 Biến đổi trạng thái cảm quan của chượp theo tỷ lệ

proteaza kỹ thuật bổ sung vào 53

B ảng 3.4 Mức thí nghiệm các yếu tố 56

B ảng 3.5 Bố trí và kết quả thí nghiệm theo phương pháp quy

hoạch thực nghiệm 56

B ảng 3.6 Bố trí và kết quả thí nghiệm xác định nhiệt độ

và thời gian thủy phân tối ưu theo phương pháp của

Box – Willson 57

B ảng 3.7 Biến đổi hàm lượng N NH3 của dịch chượp ở các mẫu

thí nghiệm theo phương pháp Box – Willson 58

B ảng 3.8 Biến đổi cảm quan chượp ở các mẫu thí nghiệm

theo phương pháp Box – Willson 58

B ảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch

thực nghiệm như sau 61

B ảng 3.10 Bảng số liệu về đạm axít amin 62

B ảng 3.11 Bảng kết quả thí nghiệm để tìm được điều kiện tối ưu

của đạm tổng quá sau khi có phương trình hồi quy (2) 63

B ảng 3.12 Bảng số liệu về đạm thối 64

phân bằng enzym proteaza tinh khiết từ A.oryzae 65

B ảng 3.14 So sánh mẫu chượp thử nghiệm và mẫu chượp

đối chứng 67

LỜI MỞ ĐẦU

Nước mắm là một loại gia vị nhưng cũng là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Đặc biệt nó là một loại gia vị không thể thiếu trong một số món ăn truyền thống của người Việt Nam Nó tạo nên hương vị độc đáo đặc trưng từng món ăn Lịch sử làm nước mắm của nhân dân ta đã có từ rất lâu Nước mắm là chế phẩm của quá trình thủy phâm thịt cá, thực hiện theo nguyên lý cá đem trộn với muối theo tỉ lệ nhất định và lên men tự nhiên Trong quá trình đó, protein của cá được thủy phân dưới tác động của enzym proteaza tạo thành peptít và axít amin Cùng với quá trình đó màu sắc, mùi vị của nước mắm dần dần được hình thành do các quá trình sinh hóa học, vi sinh vật phức tạp diễn ra không ngừng Sự tổ hợp các vật chất hình thành trong quá trình lên men đã tạo tính độc đáo của sản phẩm

Ở nước ta nổi tiếng với phương pháp làm nước mắm cổ truyền là Cát Hải Hải Phòng, Phan Thiết và Phú Quốc với hai phương pháp chế biến chủ yếu là đánh khuấy và gài nén Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng nhưng nhìn chung các phương pháp này thời gian thường rất dài từ 6 tháng đến 1 năm dẫn đến thu hồi vốn chậm làm giảm hiệu quả kinh tế Do vậy, ở trong và ngoài nước đã có rất nhiều công trình nghiên cứu để rút ngắn thời gian chế biến mà vẫn đạt được nước mắm có chất lượng tốt, hương vị thơm ngon Để nghiên cứu vấn đề này người ta thường tạo điều kiện thuận lợi và phù hợp nhất cho các enzym có sẵn trong cá hoạt động tốt thực hiện quá trình thủy phân để kéo rút đạm được hoàn toàn và tạo điều kiện cho vi sinh vật gây hương hoạt động tốt nhất bằng cách tiếp nhiệt, điều khiển quá trình cho muối, giữ pH….một phương pháp nghiên cứu khác là bổ sung enzym vào làm tăng hoạt độ của enzym làm quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về vấn dề này nhưng nhìn chung

do bổ sung chế phẩm proteaza thô để thủy phân nên còn tạp chất gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị của nước mắm Do vậy cần bổ sung enzym được tách chiết sẵn vào chượp đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho enzym hoạt động tốt Và đưa ra các thông số kỹ thuật phù hợp nhất để rút ngắn quá trình thủy phân làm nâng cao hiệu quả kinh tế cho các nhà sản xuất nước mắm

Và đề tài của chúng tôi với mục tiêu đó Chúng tôi đã nghiên cứu

“Quá trình thủy phân cá cơm bằng chế phẩm proteaza từ nấm mốc Aspergilllus oryzae trong sản xuất nước mắm ngắn ngày”

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ EMZYM PROTEAZA VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

NƯỚC MẮM

Công nghệ sinh học nói chung và công nghệ enzym nói riêng đang được ứng dụng ngày càng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống kinh tế, xã hội Có thể nói đó là một trong những ngành mũi nhọn phát triển nhất của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây

Sản xuất và ứng dụng enzym nói chung và proteaza trong thực phẩm nói riêng là một trong những lĩnh vực quan trọng của công nghệ sinh học

Proteaza là loại enzym xúc tác cho quá trình thủy phân protein đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất công nghiệp từ khá lâu trên thế giới Chúng được sử dụng trong nhiều ngành khác nhau: y học, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, …

Proteaza có thể thu nhận từ các nguồn nguyên liệu khác nhau như : động vật, thực vật và vi sinh vật Trong vài thập kỷ gần đây, việc sản xuất proteaza từ nguồn vi sinh vật được chú ý hơn cả, do có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn khác như:

Chủ động về nguồn nguyên liệu, chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn do vậy có thể thu hoạch hàng chục lần trong một năm

Có thể dễ dàng nhanh chóng điều hòa định hướng tổng hợp enzym cần thiết trên cơ sở thay đổi môi trường, chọn lọc hoặc gây đột biến ở chủng vi sinh vật

Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật rẻ tiền và dễ kiếm

Phổ phân bố enzym rộng, điều đó cho phép có thể sử dụng một chủng

vi sinh vật để sản xuất nhiều chế phẩm enzym

Sự tích lũy số lượng lớn enzym trong môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu nhận chúng

Tuy nhiên, không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh tổng hợp proteaza như nhau, mà ngay cả khi cùng một giống cũng khác nhau Trong số vi sinh vật dùng làm nguồn nguyên liệu sản xuất proteaza thì nấm mốc trở thành đối tượng quan trọng

Để đạt được hiệu quả cao trong sản xuất proteaza từ nấm mốc, ta phải tiến hành phân lập, tuyển chọn những chủng có khả năng sinh tổng hợp proteaza cao Trong số đó có chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

1.1 Những nghiên cứu về proteaza

Các proteaza (Peptít – hydrolaza 3.4) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptít ( - CO – NH - ) trong phân tử protein

Proteaza được nghiên cứu từ lâu trên thế giới, trong đó proteaza của hệ tiêu hoá được nghiên cứu sớm hơn cả Ngay từ cuối thế kỷ 18 đầu thế kỷ 19

đã tách được chế phẩm pepsin từ dịch vị dạ dày, tripsin từ tuy tạng của động vật ăn thịt

Những dẫn liệu khoa học gần đây đã cho biết trong động vật thủy sản

có đủ các loại proteaza như pepsin, tripsin, chathepsin, erepsin v.v… chúng

có tính đặc hiệu rộng rãi và đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến và bảo quản các sản phẩm từ thủy sản, như sản xuất nước mắm, bột cá…

Các proteaza của thực vật được phát hiện muộn hơi Cuối thế kỷ 19,

đầu thế kỷ 20, các nhà khoa học mới tách được papain từ nhựa đu đủ ( carica

papaya) bromelain trong các phần khác nhau của cây dứa, ureaza từ đậu tương…

Proteaza từ vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ năm 1950 Tuy vậy, số công trình nghiên cứu proteaza của vi sinh vật tăng lên rất nhiều so với các công trình nghiên cứu proteaza của động vật và thực vật

Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu proteaza vi sinh vật

đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng enzym trong nhiều lĩnh vực của đời sống kinh tế – xã hội Phần lớn proteaza được sản xuất nhờ quá trình nghiên cứu vi sinh vật ở quy mô công nghiệp Hiện nay hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 600 tấn proteaza tinh khiết

từ vi sinh vật, trong đó khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc

Nhịp độ sản xuất enzym ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển tăng trung bình hàng năm từ 5% - 15% và doanh thu từ sản xuất enzym hàng năm ở các nước này khoảng 1,5 tỷ USD

Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng proteaza tiên tiến nhất hiện nay trên thế giới là: Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đan Mạch, Đức, Áo Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các chế phẩm proteaza của vi sinh vật – nguồn nguyên liệu rất dồi dào để sản xuất enzym nói chung và proteaza nói riêng

Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được những thành tựu to lớn trong lĩnh vực nghiên cứu về proteaza của vi sinh vật

Một nhóm các nhà khoa học của trường đại học nông nghiệp Tokyo, Nhật Bản đã tách được enzym X-prolyl dipeptidyl-aminopeptitdaza từ môi

trường rắn nuôi cấy A.oryzae Enzym này được tinh khiết bằng phương pháp

điện di trên gel polyacrylamit (PAGE- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

ở pH = 9,4 và ở điểm đẳng điện Bằng phương pháp lọc gel đã xác định được

phân tử lượng của enzym này là 280.000 đơn vị Kết quả nghiên cứu càng cho thấy, enzym này do 2 tiểu phần đồng nhất tạo thành, điểm đẳng điện pI = 4,2

và bị ức chế bởi hợp chất diisopropylphosphorofluorit

Một loại proteaza trung tính của A.oryzae cũng được nghiên cứu bởi

các nhà khoa học Nhật Bản, cho thấy đó là một proteaza – kẽm có 3 liên kết disulfua nỗi phân tử Enzym này hầu như không bền sau 10 phút ở nhiệt độ

750C, nhưng độ bền được phục hồi trở lại ở nhiệt độ trên 750C cho đến 1000C Các nghiên cứu tiếp theo đã giải thích rằng enzym này có tính thuận nghịch trong khoảng nhiệt độ từ 750C ÷1000C Tính thuận nghịch này là do các liên kết disulfua trong phân tử enzym quyết định

Amyloprotooryzin được sản xuất từ chủng A.oryzae 387 là một phức hệ

của các enzym và có hoạt tính thủy phân protein Amyloprotooryzin làm tăng hàm lượng các axít amin lên khoảng 108% ÷227% tuỳ thuộc vào cơ chất sử dụng Phức hợp enzym này đã được xác định gồm : proteaza, Amylaza, exo - gluconaza, và xylanaza, chúng có hoạt tính thủy phân protein mạnh nhất ở môi trường pH = 4÷5,5

Để làm tăng độ bền nhiệt của proteaza kiềm từ A oryzae, các nhà khoa

học Nhật Bản đã nghiên cứu đưa vào cấu trúc enzym này một liên kết disulfua bằng phương pháp đột biến gel Kết quả cho thấy, đối với enzym ban đầu có hoạt tính mạnh nhất ở 510C, khi làm đột biến đoạn Cys-169/Cys -200 thì hoạt tính mạnh nhất của ezym này ở nhiệt độ 560C

Klaus Prommer cho biết các loại proteaza kiềm được ứng dụng nhiều trong sản xuất bột giặt vì có tính chất sau: Bền vững ở nhiệt độ cao; Bền vững trong môi trường kiềm ( pH = 9 ÷11); Và bền vững khi kết hợp với các yếu tố tạo phức Tuy nhiên các proteaza kiềm không bền với các chất hoạt động bề mặt Các chủng vi sinh vật thường dùng để sản xuất proteaza kiềm là vi khuẩn

Bacillus như b.licheniformis, b.amiloliquefaciens, B.fermus, B.megatetericum, các chủng nấm mốc A.oryzae, A.niger, Asojae Chế phẩm subtilisn BPN và subtilisin NOVO sản xuất từ vi khuẩn B.amyloliquefaciens có chứa serin ở

trung tâm hoạt động của phân tử và bị ức chế bởi EDTA ( Ethyl – Diamin – Ttraaxetic – axít), nhưng không bị ức chế bởi DFP (Diisopropyl –Fluoro – Phosphat) Các proteaza trung tính được sản xuất từ chủng vi khuẩn

B.subtilic, B.cereus, B.megaterium, Pseudomonas aerugenas, các chủng mấm

mốc A.oryzae, A.sojae và Percularia oryzae Các proteaza trung tính kém bền

hơn, cần Ca++ để ổn định hoạt tính và cần Zn++ để hoạt hoá Mất hoạt tính nhanh khi tăng nhiệt độ và tác động của proteaza kiềm, vì vậy chúng được sử dụng hạn chế, chủ yếu trong công nghiệp thuộc da và sản xuất bánh mì Các

proteaza axít được sản xuất từ các chủng nấm mốc Aspergillus, có pH tối ưu

từ 2 ÷3 Hầu hết được sử dụng để thủy phân gluten trong bánh mì và sản xuất pho-mát

Trong thời gian gần đây, người ta đã nghiên cứu được các phương pháp thích hợp để thu nhận các chế phẩm proteaza không tan proteaza được cố định trên các chất mang như xenlluloza, polyacrylamit, agaroza, axit alginic, DAEA- Xenlluloza, DAEA – Sephadex Nhờ những kết quả này mà có thể tái

sử dụng chế phẩm enzym nhiều lần để sản xuất các sản phẩm một cách liên tục và tự động hoá quá trình sản xuất sản phẩm, do vậy giảm được giá thành sản phẩm

Ở nước ta, những nghiên cứu về enzym nói chung và proteaza nói riêng

đã thu hút sự quan tâm của đông đảo các nhà khoa học thuộc lĩnh vực hoá sinh học và vi sinh vật học Các nghiên cứu tập trung theo các hướng: Tách, tinh khiết enzym từ các cơ quan nội tạng động vật và các mô thực vật, tạo các sản phẩm có d0ộ sạch khác nhau Nghiên cứu cấu trúc, tính chất của proteaza,

sự liên quan giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của chúng và khả năng ứng

dụng proteaza vào các lĩnh vực khác nhau Có thể thấy rõ qua một số công trình nghiên cứu đã được công bố

Phạm Thị Trân Châu, và cộng sự (1987), đã nghiên cứu thành phần và một số tính chất của chế phẩm Bromelain tách từ chồi ngọn dứa tây Kết quả nghiên cứu cho thấy Bromelain thuộc nhóm proteaza-xystein, có nghĩa là trung tâm hoạt động của nó có chứa nhóm thiol (-SH) Các số liệu thí nghiệm còn cho thấy hoạt tính thuỷ phân của chế phẩm Bromelain được gia tăng rõ rệt khi có mặt xystein 1.10-2M và EDTA 4.10-3M ngược lại các hoá chất chứa kim loại nặng như HgCl2 lại có tác dụng ức chế hoạt tính của chế phẩm này Chế phẩm bromelain có hoạt tính cực đại trong khoảng nhiệt độ từ 500C

÷600C, pH thích hợp của chế phẩm khi sử dụng cơ chất cazein là 8,0 ÷8,5, còn đối với azocazein thì dao động trong khoảng 6,0 ÷9,0 Như vậy khả năng thủy phân các loại protein của chế phẩm này cũng khác nhau

Năm 1992, Nguyễn Thị Vĩnh và các cộng sự đã nghiên cứu một số tính chất của proteinaza của dịch chiết từ thịt rắn hổ mang ( Naja – Naja) Kết quả cho thấy proteinnaza P-I có pH tối ưu bằng 7.0, bị kìm hãm dưới tác dụng của EDTA nhưng có thể phục hồi đến 71%(so với lúc chưa xử lý EDTA) dưới tác dụng của Zn++ hoặc hỗn hợp Zn++ và Ca++ Ca++ cũng có khả năng hoạt hoá enzym nhưng ở mức độ thấp hơn

Phạm Thị Trân Châu và các cộng sự (1993), đã nghiên cứu proteaza từ đầu tôm biển, cho biết đầu tôm biển có chứa 2 loại proteaza khác nhau ký hiệu là P-I và P-II Hoạt độ của enzym trong dịch chiết đầu tôm đạt cực đại khi pH = 7,5 và ở nhiệt độ bằng 650C

Nguồn enzym proteaza của động vật thủy sản nói chung và cá nói riêng mới được nghiên cứu trong 40 năm trở lại đây và còn rất ít

Năm 1996, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thị Kim đã nghiên cứu và ứng dụng proteaza từ hạt đậu nẩy mầm, kết quả cho thấy: hoạt lực của proteaza và hàm lượng đạm hoà tan của hạt đậu đen nẩy mầm cao hơn hạt đậu xanh

Theo đánh giá của các nhà khoa học, ở Việt Nam tuy đã có một số công trình nghiên cứu thu nhận proteaza từ vi sinh vật nhưng chưa đủ khả năng sản xuất các chế phẩm proteaza từ nguồn này Do đó chủ yếu nguồn proteaza thu được từ các cơ quan nội tạng và mô thực vật

Qua các dẫn liệu đã nêu ở trên ta thấy rằng proteaza được chú ý nghiên cứu từ rất lâu, tuy nhiên các công trình nghiên cứu chỉ tập trung vào các proteaza của động vật và thực vật còn proteaza từ vi sinh vật thì được nghiên cứu gần đây Điều này chỉ ra rằng cần chú ý nghiên cứu hơn nữa về proteaza

từ vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng, góp phần thúc đẩy ngành công nghệ sinh học nói chung và công nghệ enzym nói riêng phát triển để phục vụ tốt hơn cho đời sống kinh tế xã hội của đất nước

1.2 Những nghiên cứu về thu nhận proteaza từ nấm mốc

Aspergillus oryzae

Như chúng ta đã khẳng định trên đây việc thu nhận enzym nói chung và proteaza nói riêng từ vi sinh vật là kinh tế nhất, trong đó nấm mốc là nguồn quan trọng Nói chung, các chủng vi sinh vật được chọn làm nguồn để sản xuất enzym phải thoả mãn các yêu cầu

Có thể sinh trưởng trên môi trường đơn giản rẻ tiền, dễ kiếm

Có khả năng sinh tổng hợp enzym mạnh trong thời gian ngắn

Dễ cơ giới hoá và tự động hoá quá trình nuôi cấy

Dễ tách chiết enzym và không sinh độc tố

Đã có nhiều công trình nghiên cứu mốc Aspergillus oryzae để sản xuất

enzym nói chung và proteaza nói riêng, được công bố trong thời gian gần đây

Một nhóm các nhà khoa học Mỹ (1996) đã dùng A.oryzae để kích thích

sự tăng sinh khối và sinh tổng hợp proteaza

Một nhóm nhà khoa học cộng hào Czeck (1996) đã nghiên cứu ứng

dụng A.oryzae để làm tăng hoạt tính của enzym N – axetyl-hexozaminidaza

Trương Thị Hòa và các cộng sư (1991) đã nghiên cứu phát triển khả năng sinh tổng hợp proteaza của chủng nấm mốc A.oryzae 938/2 và nâng cao hoạt lực của nó, đã chọn được môi trường nuôi cấy tối ưu cho chủng này là :70% bã bia, 20% bột ngô ,10% đậu tương và hoạt lực proteaza tăng 21% so với mẫuđối chứng, thời gian nuôi cấy là 40 giờ

Các nhà khoa học thuộc Viện Công nghiệp thực phẩm Hà Nội đã tuyển chọn được chủng nấm mốc A.oryzae29B có đặc điểm nuôi cấy được mô tả như sau: khuẩn lạc dạng nhung khi còn non đầu bào tử màu vàng, sau 1 tuần chuyển sang màu xanh lá mạ, không mùi, mặt trái khuẩn lạc không màu, có nếp nhăn phóng xạ Chủng này có hoạt tính sinh tổng hợp proteaza ổn định trên môi trường cám gạo bổ sung bột ngô, bột đậu tương và bã bia

Các chế phẩm proteaza của nấm mốc được sử dụng trong thực tế dưới nhiều dạng khác nhau Trong một số trường hợp, khi tạp chất không gây tác hại đáng kể cho sản phẩm và kỹ thuật sản xuất như trong thuộc da, người ta

sử dụng trực tiếp môi trường nuôi cấy có chứa proteaza (gọi là chế phẩm thô)

mà không cần tách tạp chất Cũng có nhiều trường hợp, cần sử dụng chế phẩm tinh khiết với mức độ khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng Khi đó ta phải chiết suất và tinh khiết enzym

Việc tinh khiết proteaza có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và qua nhiều giai đoạn, nhằm loại bỏ các tạp chất và các enzym khác Có thể

dùng phương pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu

cơ, bằng muối trung tính, hấp phụ chọn lọc, trao đổi ion để thu được chế phẩm proteaza có hoạt lực cao nhất

Từ năm 1950 đến nay, nhờ sử dụng một số phương pháp mới để tinh khiết enzym nên người ta đã tách được các loại khác nhau của nhiều loại proteaza

Ryle và Porter (1959) sử dung phương pháp sắc ký trao đổi ion trên DEAE- xelluloza đã tách được pepsin B và pepsin C trong chế phẩm pepsin của lợn

Kielova và Keil (1969) đã hoàn thiện phương pháp sắc ký trao đổi ion trên CM và DEAE – sephadex, lọc qua gen sephadex

Một trong các phương pháp đơn giản rẻ tiền để tách và tinh khiết các proteaza của vi sinh vật và thực vật, là sử dụng cột sắc ký với vật liệu là thủy tinh – keratin Đây là phương pháp có nhiều triển vọng để tách phân đoạn các serin-proteaza từ nhiều nguồn khác nhau Keratin của lông, tóc là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sau khi được sử lí sơ bộ bằng hóa học có thể dùng để làm vật liệu hấp phụ trong kỹ thuật sắc ký Kết quả nghiên cứu cho thấy : cột sắc

ký được tái sử dụng nhiều lần (khoảng 25 lần nếu tái tạo tốt)mà không làm giảm hoạt độ và tính đặc hiệu của enzym thu được Hoạt độ riêng của proteaza sau khi sắc ký thậm chí còn cao hon so với vật liệu và phương pháp sắc ký khác Do tính chất hóa học, cơ học, tính kết dính mà vật liệu thủy tinh – keratin phù hợp để tinh khiết proteaza trong phòng thí nghiệm và trong sản xuất công nghiệp ở quy mô nhỏ

Từ những dẫn liệu trên ta nhận thấy, để nấm mốc phát triển tốt và nâng cao khả năng sinh tổng hợp proteaza, cần lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp, chú ý đến việc sử dụng các chất cảm úng để định hướng sự tổng hợp

proteaza của chúng Đồng thời cần tìm các điều kiện nuôi cấy thích hợp (nhiệt

độ, độ ẩm ,pH môi trường, độ thoáng khí…) nhằm thu được proteaza có hoạt tính cao nhất Để nâng cao khả năng sử dụng chế phẩm proteaza trong nhiều lĩnh vực khác nhau cần tách chiết và tinh khiết chúng từ môi trường nuôi cấy

1.3 Đặc điểm và những nghiên cứu về nước mắm

1.3.1 Tình hình tiêu thụ và sản xuất nước mắm trong và ngoài nước

Trong nước:

Với người dân Việt Nam nước mắm là loại nước chấm hầu như được xuất hiện trong các bữa ăn hàng ngày Vì nó là một loại gia vị cũng là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao được người dân chế biến và sử dụng

Nước mắm được phân bố rộng rãi trong các cửa hàng, siêu thị…người tiêu dùng dễ dàng mua được mà không phải tìm kiếm nhiều

Tình hình sản xuất hiện nay :

Nhìn chung các phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền ở nước ta còn thô sơ, thời gian còn quá dài (từ 6-12 tháng) hiệu quả kinh tế còn thấp, chính vì vậy đã có rất nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trong

nước và nước ngoài nhằm tăng cường quá trình thủy phân, rút ngắn thời gian sản xuất, các công trình nghiên cứu được chia thành hai hướng:

Hướng thứ nhất: Tạo điều kiện thích hợp để các enzym có sẵn trong cá hoạt động phân giải thịt cá mạnh nhất bằng cách tiếp nhiệt, điều khiển quá trình cho muối, náo đảo…

Hướng thứ hai: Bổ sung proteaza hoặc các vi sinh vật sinh tổng hợp proteaza từ bên ngoài để rút ngắn thời gian thủy phân thịt cá, nâng cao hiệu suất thu hồi đạm trong nguyên liệu sản xuất Một số loại proteaza được sử dụng trong chế biến nước mắm như: papain (đu đủ), bromelain (dứa), proteazatừ nấm mốc…sự tác động của nấm mốc có tác dụng thủy phân thịt cá tương đối rõ Khi cấy nấm mốc với tỉ lệ cao thì cá rã nát và loãng ra nhanh Ngoài ra, trong dân gian nhân dân ta đã biết sử dụng nấm mốc để sản xuất tương từ đậu nành Việc sử dụng nấm mốc tạo nên vị ngọt cho tương

Hàng năm nước ta sản xuất 150 triệu lít nước mắm, chủ yếu theo phương pháp cổ truyền, sử dụng quá trình thủy phân cá với sự có mặt của muối biển, hàm lượng của muối là 25-28% và được bổ sung ngay từ đầu Thời gian sản xuất nước mắm theo phương pháp cổ truyền từ 6-12 tháng Do thời gian quá dài nên đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm rút ngắn quá trình sản xuất nước mắm bằng cách sử dụng enzym proteaza trên cơ sở các đề tài nghiên cứu cấp viện, cấp bộ và dự án cấp nhà nước:

Nghiên cứu sản xuất nước mắm bằng enzym proteaza, thực hiện năm 1988-1990 với kinh phí 5,0 triệu đồng

Hoàn thiện quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, thực hiện

1991-1992 với kinh phí 15,0 triệu đồng

Sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng enzym proteaza, thuc hiện năm 1992-1995 với kinh phí 450 triệu đồng (thu hồi vốn 80 triệu)

Kết quả nổi bật:

Ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot:1000kg cá/1 mẻ

Rút ngắn quá trình chế biến chượp cá từ 6-12 tháng theo phương pháp

cổ truyền xuống 10-15 ngày trong điều kiện nhiệt độ ổn định và 30-35 ngày trong điều kiện nhiệt độ tự nhiên mùa hè (Nghệ An)

Lượng nước cốt rút ra ban đầu tăng 10-15% so với đối chứng (phương pháp cổ truyền 30 -35%; phương pháp mới 40-45% so với nguyên liệu cá)

Hàm lượng đạm thu hồi so với phương pháp cổ truyền tăng từ 8-10%

Tỷ lệ enzym 0.3- 0.5% so với nguyên liệu cá

Ở quy mô sản xuất:1.000.000lít/năm

Địa điểm sản xuất : xí nghiệp thủy sản Cửa Hội-Công Ty Thủy Sản Nghệ An:

Sản xuất thành công với quy mô: 5 tấn cá /bể

Thời gian chế biến chượp: 2-2.5 tháng ở nhiệt độ tự nhiên muà hè Enzym có thể hoạt động tốt với cá ướp muối ban đầu có nồng độ 10-15%

Chất lượng sản phẩm được chi cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng tỉnh Nghệ An theo dõi và xác nhận đã đạt tiêu chuẩn Việt Nam

Sản phẩm bảo quản trên 6 tháng

Hàm lượng đạm thu hồi tăng 12% so với phương pháp cổ truyền

Định mức tiêu hao nguyên liệu giảm 13% so với tiêu chuẩn ngành

Nước ngoài:

Nước mắm được sản xuất từ cá và muối, không chỉ sử dụng ở Việt Nam mà còn được ưa chuộng tại nhiều nước trên thế giới

Tuy nhiên, do phương pháp chế biến có phần khác nhau nên sản phẩm

có màu sắc và mùi vị khác nhau Ở mỗi quốc gia nó được gọi với mỗi tên gọi khác nhau: ở Nhật Bản có Mampla, Miến Điện có Ngapi, Indonexia có Ketjapiken, Philipin có Patic, Hy Lạp có Garum, Châu Âu có Anchovie…

1.3.2 Những nghiên cứu về nước mắm

Cá trộn với (muối theo tỉ lệ nhất định, thích hợp rồi đem ủ ở điều kiện tối ưu, sau một thời gian sẽ hình thành nên nước mắm )

Đó là quá trình thủy phân protein trong thịt cá qua các dạng, polypeptid, dipeptid và cuối cùng là axít amin dựa vào enzym proteaza có trong nguyên liệu (cá) hoặc enzym từ thực vật (dứa, đu đủ) nhưng gần đây thì người ta thì người ta sử dụng nguồn enzym phong phú nhất là vi sinh vật

Ezim Enzym Enzym Enzym

Protein pepton polypeptid dipeptid acid amin Cùng với quá trình đó, màu sắc mùi vị của nước mắm dần dần được hình thành do các quá trình sinh hóa học, vi sinh vật phức tạp diễn ra không ngừng Sự tổ hợp các vật chất hình thành trong quá trình lên men đã tạo tính chất độc đáo của sản phẩm

Quá trình phân giải thịt cá chuyển từ protein đến axit amin là một quá trình phức tạp chủ yếu do enzym proteaza có sẵn trong cá tác dụng, nhưng cũng có sự tham gia của vi sinh vật Riêng đối với sự xúc tác của enzym trong quá trình đó củng đã phức tạp do tính đặc hiệu của enzym khác nhau Mỗi

proteaza chỉ tác dụng lên một vài loại protein và một vị trí liên kết nhất định Quá trình hình thành nước mắm trong điềuv kiện tự nhiên có thể được tóm tắt như sau:

Trong 24 giờ đầu thịt cá (protein ) dưới tác dụng của các hệ enzym proteaza trong cá như metalo-proteaza, serin-proteaza và axit-proteaza tạo thành các hợp chất đạm hòa tan trong nước bổi (như pepton, polypeptit) Lúc này nước bổi có pH xấp xỉ 5,4 Từ 24 giờ đến tháng thứ 3 thịt cá tiếp tục bị thủy phân dưới tác dụng chủ yếu của hệ metalo-proteaza tạo thành các axit amin alanin, izoloxin, arinin… và peptit Dịch chượp có pH xấp xỉ 5,2 lúc này cũng đã hình thành mùi nước mắm nhẹ từ tháng thứ 3 đến tháng thứ 6 dưới tác dụng xúc tác chủ yếu của hệ serin- proteaza thì pepton, polypeptit tiếp tục bị thủy phân để tạo thành các peptit bậc thấp (dipeptit, tripeptit) và axit amin prolin, valin, tirozinn phenylalanin… nước cốt có pH xấp xỉ 6,0; và

có mùi đặc trưng lúc này chượp đã chín, đem lọc – rút sẽ được nước mắm

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước mắm như: nguyên liệu cá đem vào chế biến, nhiệt độ, pH môi trường, tỉ lệ muối và phương pháp chế biến v v trong sản xuất nếu chúng ta biết sử dụng kết hợp những nhân tố này thì sẽ rút ngắn được thời gian chế biến và tạo ra sản phẩm

có chất lượng cao, giá thành hạ

Nguyên liệu chính để chế biến nước mắm là cá, đặc điểm chung của

cá là hàm lượng nước cao( 48%-85,1%), giàu đạm (hàm lượng protein từ 10,3%-24,4%)và các chất dinh dưỡng khác ( lipit : 0,1%-54%; muối vô cơ : 0,5%-5,6%) Mặt khác cấu trúc mô cơ thịt lại lỏng lẻo, có pH gần trung tính, nên khi cá chết quá trình tự phân giải của enzym diễn ra nhanh chóng Tuy nhiên tùy từng loại cá khác nhau, do có thành phần hóa học và cấu trúc cơ thịt khác nhau nhất là hệ enzym tồn tại trong cá khác nhau nên khi đưa vào chế

biến sẽ cho những loại nước mắm có chất lượng khác nhau Nước mắm được coi là tốt khii có hàm lượng đạm axit amin (Naa) cao, màu sắc đẹp Mùi vị đặc trưng thơm ngon mà axit amin là sản phẩm của sự phân giải axit amin thịt

cá, vì vậy những loại cá nào có hàm lượng protein cao sống ở tầng nổi xa bờ bơi lội di chuyển thành đàn như cá cơm, cá thu, cá trích, cá mòi, cá lục…đem chế biến sẽ cho chất lượng cao

Về phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền ở nước ta thì có 2 phương pháp chủ yếu là: phhương pháp đánh khuấy được sử dụng nhiều ở các tỉnh miền bắc, đặc điểm của phương pháp này là cho muối nhiều lần, thêm nước lã kết hợp với đánh khuấy và tiếp nhiệt tự nhiên bằng cách phơi nắng cho đến khi chượp chín.ở các tỉnh miền trung, miền nam thì dùng phương pháp gài nén, với đặc điểm là cho muối một lần ngay từ đầu, gài nén, tiếp nhiệt tự nhiên và kéo rút náo đảo nước bổi cho đến khi chượp chín Do đặc điểm chế biến khác nhau nên chất lương nước mắm tạo thành cũng khác nhau Nhìn chung thì nước mắm được sản xuât trong phương pháp gài nén có hương vị thơm ngon hơn so vơi nước mắm sản xuất theo phương pháp đánh khuấy, điều này có thể do trong chượp gài nén thì quá trình lên men tạo hương bởi vi sinh vật tốt hơn

Nhìn chung các phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền ở nước ta còn thô sơ, thời gian còn quá dài (từ 6-12 tháng) hiệu quả kinh tế còn thấp Chính vì vậy đã có nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước và ngoài nước, nhằm tăng cường quá trình thủy phân, rút ngắn thời gian sản xuất và các công trình nghiên cứu được chia thành hai hướng

Hướng thứ nhất : tạo điều kiện thích hợp để các enzym có sẵn trong

cá hoạt động phân giải thịt cá mạnh nhất bằng cách tiếp nhiệt, điều khiển quá trình cho muối náo đảo…Theo hướng này đã có các công trình nghiên cứu

của các tác giả Lê Hải Lưu (1973), Hồ Văn Thành và Đoàn Nguyệt Huy (1975), Hồ Văn Hoành(1979), Hồ Thạch(1987) Từ kết quả nghiên cứu, các nhà khoa học đã đưa ra kết luận : nhiệt độ tốt nhất để thủy phân cá là 450C

Áp dụng phương pháp cho muối nhiều lần kết hợp với đánh khuấy sẽ tăng cường quá trình phân giải thịt cá tuy nhiên cần theo dõi để khống chế kịp thời quá trình phân hủy Nguyên liệu được băm đập dập có tác dụng rút ngắn thời gian chế biến chượp hơn so với để nguyên con Trong điều kiện ướp muối tự nhiên pH chượp xấp xỉ bằng 6 tuy ở phạm vi pH này không ưu tiên cho hoạt động của loại enzym nào trong cá, nhưng cả hai loại chính là pepsin và tripsin đều hoạt động được, mặt khác lại có tác dụng ức chế hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa Kết quả tổng hợp của những nghiên cứu này đã rút ngắn thời gian chế biến một cách đáng kể, từ 9 đến 12 tháng xuống còn 60 tới 70 ngày Tuy nhiên, theo hướng này vì chỉ sử dụng en zym có sẵn trong cá nên thời gian chế biến vẫn còn dài, hiệu suất thu hồi đạm từ cá vẫn chưa cao, vì thế đã

có một số công trình nghiên cứu theo hướng sau

Hướng thứ hai : bổ sung proteaza hoặc các vi sinh vât tổng hợp proteaza từ bên ngoài để rút ngắn thời gian thủy phân thịt cá, nâng cao hiệu suất thu hồi đạm trong nguyên liệu sản xuất

Đã có nhiều loại proteaza được sử dụng trong chế biến nước mắm như papain, bromelain, proteaza từ nấm mốc, từ vi khuẩn Theo hướng này, cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước

Năm 1961, Cục cung tiêu- chế biến thuộc Tổng cục Thủy sản (nay là

Bộ Thủy Sản) và các nhà máy rượu Hà Nội đã nghiên cứu sự tác động của

nấm mốc A.flavus, A oryzae trong quá trình thủy phân thịt cá đã cho thấy,

A.oryzae có tác dụng thủy phân tương đối rõ Khi cấy nấm mốc với tỉ lệ cao thì cá rã nát và loãng ra nhanh

Nguyễn Lân Dũng, Đào Trọng Hùng và Ngô Khắc Truy (1964) đã

nghiên cứu sử dụng proteaza từ nấm mốc A.oryzae để rút ngắn thời gian sản

xuất nước mắm

Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty(1967), đã phân lập và tuyển chọn

một số chủng nấm mốc thuộc giống Aspergillus có năng lực phân giải protein

cá và nghiên cứu các điều kiện tốt nhất để sản xuất lớn các loại nấm mốc này trên môi trường đơn giản Trộn mốc với cá để từ 1-3 ngày ở nhiệt độ 550C, kết quả cho thấy bã và xương lắng xuống, nước cốt ở trên trong, nhưng hương vị không bằng nước mắm cổ truyền

Năm 1975 một nhóm cán bộ nghiên cứu của Viện nghiên cứu Hải sản Hải Phòng đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm proteaza của vi khuẩn

B.pumillus vào quá trình thủy phân cá, kết quả cho thấykhi cho thêm proteaza

ngoại bào của B.pumillus với tỉ lệ 1%(so với cá)thì tăng nhanh quá trình thủy

phân cá rõ rệt ở 24 giờ đầu, dịch thủy phân thu dược có màu cánh gián, vị ngọt, mùi thơm nước mắm, không có mùi lạ và có hàm lượng đạm cao hơn mẫu đối chứng

Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Ngô Thi Mại, Nguyễn Thị

Dự (1991) dùng proteaza của vi khuẩn Bacillus subtilis để thủy phân cá Kết quả nghiên cứu cho thấy : bổ sung 0,3% chế phẩm proteaza của B.subtilis vào

chượp, trong điều kiện nhiệt độ ổn định ở 500C, thời gian chế biến rút ngắn còn 10 ngày và 30-35 ngày trong điều kiện tiếp nhiệt tự nhiên mùa hè Dịch lọc sau khi thủy phân được đánh giá tốt về thành phần hóa học và cảm quan.Tăng hiệu suất thu hồi đạm từ 7-10% so với phương pháp cổ truyền

Nguyễn Trọng Cẩn và các cộng sự (1993)đã nghiên cứu ứng dụng

môi trường nuôi cấy nấm mốc A.oryzae 29A để rút ngắn thời gian chế biến

nước mắm Kết quả cho biết, dùng 2,5%-3% môi trường nuôi cấy nấm mốc

A.oryzae 29A (chế phẩm proteaza thô) bổ sung vào chượp ở điều kiện pH=6,5-6,8 nhiệt độ từ 350C-400C, tỉ lệ muối ban đầu là 6% cứ 3 ngày cho muối một lần với lượng 3% cho tới khi đủ muối, kết hợp với đánh khuấy thì sau 12-15 ngày chượp đã ổn định có thể đem lọc rút được nước mắm Tuy nhiên nước mắm chưa có mùi vị đặc trưng khâu lọc rút nước mắm còn gặp nhiều khó khăn vì chượp đã tạo thành hỗn hợp đặc nhuyễn có độ nhớt cao

Trần Thị Luyến (1992) đã có nghiên cứu bổ sung rỉ đường kết hợp với sục khí và cho muối nhiều lần để rút ngắn thời gian chế biến chượp nâng cao hiệu suất thu hồi đạm trong sản xuất nước mắm

Theo thông báo của tác giả Nguyễn Ngọc Lân (1995), đã sử dụng proteaza để sản xuất nước mắm tại Công Ty thủy sản Nghệ An cho thấy rút ngắn thời gian chế biến từ 6-8 tháng xuống còn 2 tháng chất lương nước mắm vẫn đảm bão các yêu cầu về kỹ thuật Hiệu suất thu hồi đạm tăng từ 8-12%

Ngoài những công trình do các nhà khoa học trong nước công bố, còn

có nhiều tác giả nước ngoài đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm proteaza và vi sinh vật trong sản xuất nước mắm và nước chấm

Ravipim-Chaveesuk và các cộng sự (1993) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng khi thêm chế phẩm hỗn hợp Tripsin và chimotripsin vói lượng 0,3% theo khối lượng

Tuy nhiên trong quá trình thủy phân protein thành axít amin còn có quá trình thối rữa do vi sinh vật gây thối có sẵn trong nguyên liệu hoặc trong quá chế biến nhiễm vào Trong lúc biến đổi vi sinh vật có 2 loại : loại có lợi

và loại có hại

Có hại : vi sinh vật gây thối

Có lợi: vi sinh vật gây hương, tạo ra enzym thúc đẩy quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn

Tốc độ thủy phân phụ thuộc vào hoạt độ của enzym proteaza Mà enzym chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố sau:

Ảnh hưởng bởi pH : trong khoảng pH từ 6.0-7.0 khi pH tăng thì hoạt tính hoạt tính xúc tác của enzym proteaza cũng tăng và hoạt độ đạt cực đại ở giá trị pH = 6.5 Khi giá trị pH lớn hơn 6.5 thì hoạt độ của enzym giảm dần Trong khoảng pH thích hợp enzym proteaza bền vững và ở trạng thái ion hóa thích hợp để tạo phức với cơ chất, nhiệt độ, loại dung dịch đệm thì pH thích hợp của enzym cũng thay đổi Đồng thời khoảng pH = 6-7 không ảnh hưởng đến hoạt độ của các enzym proteaza chủ yếu có sẵn trong chượp Như vậy phát huy được hoạt độ xúc tác của tất cả các enzym ở mức độ cao để thủy phân cá

Các tài liệu công bố mới đây cho thấy các proteaza của nấm mốc có

khoảng pH hoạt động rộng hơn so với proteaza của động vật và vi khuẩn Proteaza của vi khuẩn hoạt động ở vùng pH =7-8, còn proteaza của nấm mốc A.oryzae hoạt động trong khoảng pH =3.5-9, nhờ vậy mà proteaza của nấm mốc nói chung và của A.oryzae nói riêng có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như trong việc ổn định bia (pH =4-5), trong việc làm mềm da (pH =8-9), trong sản xuất nước chấm (pH = 6 - 7.5)

Ảnh hưởng của nhiệt độ:khoảng nhiệt độ thích hợp cho enzym proteaza là 370C - 500C, trong đó nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt độ của enzym này là 430C Vận tốc phản ứng do enzym xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn nhất định mà ở đó phân tử enzym còn bền chưa bị biến tính Cũng như các phản ứng hóa học nói chung, trong phản ứng do enzym xúc tác khi nào enzym chưa bị biến tính, cứ nhiệt độ tăng lên 100C thì tốc độ

phản ứng sẽ tăng lên khoảng hai lần Ở nhiệt độ dưới 370C và trên 500C thì hoạt độ của enzym giảm

Tuy nhiên nhiệt độ thích hợp của mỗi enzym không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố, thời gian tàc dụng dài thì nhiệt độ tác dụng giảm dần Ngoài ra, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym cũng có thể làm thay đổi tác dụng của nhiệt độ đối với enzym

Ảnh hưởng của nồng độ muối : nồng độ muối càng cao thì hoạt độ của enzym càng giảm Do bản chất của enzym là protein nên khi nồng độ muối càng cao khả năng cạnh tranh nước với enzym càng lớn sẽ làm cho enzym giảm tính xúc tác

Quá trình thủy phân thịt cá chuyển từ protein đến axít amin là một quá trình rất phức tạp, hiện nay cònn có nhều ý kiến khác nhau về vai trò của enzym và vi sinh vật trong quá trình thủy phân Tuy nhiên ở đây chúng ta chỉ

đi sâu vào vai trò của enzym

Đối với sự xúc tác của enzym vào trong quá trình thủy phân thịt cá thì rất phức tạp do tính đặc hiệu của enzym Mỗi proteaza chỉ tác dụng lên một vài loại protein và một vị trí liên kết nhất định Như enzym peptidaza chỉ tác động lên liên kết peptit để thủy phân liên kết này

H2O

-CO-NH- -COOH + H2N Ngay cả trong cùng loại proteaza đều thủy phân liên kết peptit song

có loại lại tương đối ưu tiên hơn với liên kết peptit này, có loại ưu tiên hơn với mối liên kết peptit kia Ví dụ như ưu thế của pepsin là cắt đứt liên kết peptit ở vị trí giữa nhân thơm và diaxit

Pepsin

-CO-NH-CH-CO-NH- CH- CO-NH-

NH2 CH2 COOH Nói tóm lại thì sự tham gia của enzym trong quá trình thủy phân này

là theo cơ chế xúc tác theo sơ đồ:

E + S ES E + P Trong đó E là enzym, S là cơ chất, trong quá trình này thì S là protein thịt cá, ES là phức hợp trung gian giữa enzym và cơ chất Và P là sản phẩm cuối của quá trình thủy phân, là các axít amin và peptit cấp thấp Đây chính

là nước mắm

Enzym có bản chất là protein do đó nó chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt

độ Khi nhiệt độ giảm enzym sẽ giảm hoặc ngừng hoạt tính xúc tác thì vận tốc thủy phân sẽ giảm xuống Khi nhiệt độ cao protein bị biến tính do đó nó sẽ bị mất hoạt tính xúc tác khi nhiệt độ lớn hơn 700C thì enzym bi mất hoạt tính xúc tác

Enzym proteaza có khoảng nhiệt độ thích hợp là từ 370C đên 500C trong phạm vi nhiệt độ này khi tăng nhiệt độ thì tốc phản ứng tăng Và đến một giá trị nhiệt độ nào đó thì vận tốc phản ứng là tối đa nhưng nếu tiếp tục tăng vận tốc phản ứng sẽ giảm

Ảnh hưởng của pH: pH thì ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym Nếu

pH thích hợp sẽ thúc đẩy enzym hoạt động mạnh làm vận tốc thủy phân tăng

Và ngược lại khoảng pH không thích hợp thì quá trình thủy phân diễn ra chậm Khoảng pH thích hợp để enzymproteaza thủy phân là từ 3.5-9

Ảnh hưởng của muối : muối là thành phần quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân Nếu nồng độ muối ban đầu quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzym làm quá trình thủy phân diễn ra chậm Nồng độ muối ban đầu thấp thì quá trình thủy phân diễn ra nhanh nhưng thường kèm theo quá trình thối Nồng độ muối ban đầu thích hợp cho quá trình thủy phân là từ 5-15%

Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: vận tốc thủy phân còn chịu ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và enzym Bề mặt tiếp xúc càng lớn thì quá trình thủy phân càng nhanh Nếu bề mặt tiếp xúc giữa enzym nhỏ thì quá trình thủy phân diễn ra chậm Do vậy quá trình làm nước mắm người ta thường chọn những loại nguyên liệu có kích thước nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc như cá nục, cá trích, cá cơm… nhưng trong đó nguyên liệu cá cơm được sử dụng nhiều nhất do sản lượng khai thác lớn và kích thước bé

Ảnh hưởng cả nồng độ enzym : trong phản ứng thủy phân do enzym xúc tác, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau, trong đó nồng độ enzym có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ enzym

Trong chế biến chượp nếu nồng độ proteaza thấp thì quá trình thủy phân protein cá sẽ kéo dài Ngược lại, nếu nồng độ proteaza quá cao tuy đạt được tốc độ thủy phân lớn nhưng gây lãng phí

Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu : nguyên liệu cá tươi có giá trị kinh tế thì sản phẩm nước mắm có chất lượng tốt Về mặt cấu trúc tổ chức cơ thịt cá thì những loại cá nào có kết cấu tổ chúc lỏng lẽo, cơ thịt mềm mại, mỏng mình ít vẩy thì quá trình thủy phân sẽ nhanh hơn Do đó người ta

thường chọn những loại cá như cá cơm, cá nục, cá trích…để chế biến nước mắm

Tóm lại quá trình thủy phân của enzym chịu ảnh hưởng của nhiều yếu

tố Chính vì vậy để quá trình thủy phân xảy ra nhanh, triệt để chúng ta cần đưa ra các thông số tối ưu nhất Để xác định được các thông số tối ưu đó cần tiến hành nghiên cứu và có các phương pháp xác định cho phù hợp

1.3.2 Mục tiêu, nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài

Từ những phân tích ở trên chúng tôi nhận thấy có nhiều ứng dụng enzym proteaza trong sản xuất nước mắm ngắn ngày đã thu được nhiều kết

quả tốt nhưng ẫn còn mộpt số tồn tại là màu sắc nước mắm chưa tốt vị của

nước mắm còn đắng và có vị chat, nước mắm còn bị đục do đó đã thôi thúc tôi chọn đề tài : “ Nghiên cứu quá trình thủy phân cá cơm bằng chế phẩm proteaza từ nấm mốc Aspergillus oryzae trong sản xuất nước mắm ngắn ngày

”

Mục tiêu cần đạt được :

1 Thời gian thủy phân ngắn nhất

2 Hàm lượng axít amin cao nhất

3 Hàm lượng đạm thối thấp nhất

4 Hàm lượng đạm tổng quát cao nhất

5 Chất lượng cảm quan nước mắm tốt nhất

Để đạt được các mục tiêu trên chúng tôi đi nghiên cứu các thong số trong quá trình thủy phân như : Nồng độ enzym bổ sung, nhiệt độ thủy phân, hàm lượng muối ăn, pH thủy phân, tỷ lệ muối bổ sung

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chọn đối tượng cá để thủy phân là cá cơm

Quá trình sản xuất nước mắm bị tác động bới nhiều nhân tố như nguyên liệu, nhiệt độ, pH, môi trường, tỉ lệ muối và phương pháp chế

biến…nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm là cá, tuy nhiên từng loại cá khác nhau có thành phần hóa học và cấu trúc cơ thịt khác nhau, nhất là hệ enzym tồn tại trong cá nên khi đưa vào chế biến sẽ cho những loại nước mắm

có chất lượng khác nhau Nước mắm được coi là tốt khi có hàm lượng đạm axít amin cao, màu sắc đẹp, mùi vị đặc trưng, thơm ngon, mà axít amin là sản phẩm của sự phân giải protein thịt cá, vì vậy những loại cá nào có hàm lượng protein cao, sống ở tầng nổi xa bờ, bơi lội di chuyển thành đàn như cá cơm, cá thu, cá nục… đem chế biến sẽ cho nước mắm có chất lượng cao

Giống cá cơm-Stolephrus lacepede-thuộc họ cá Trỏng (Engraulidae) thường sống thành đàn tương đối lớn ở các vùng ven bờ, độ sâu dưới 100m của biển nhiệt đới và cận nhiệt đới Có một số loài phân bố rộng ở các vùng sông: cá cơm sọc tiêu (Stophephorus trybleeker)

Ở vùng biển thuộc các nước Đông Nam Á cá cơm là đối tượng đánh bắt quan trọng, chủ yếu là: cá cơm than, cá cơm sọc phấn, cá cơm trỏng (cơm

An Độ), cá cơm đỏ và cá cơm sọc tiêu…vùng nước ven biển nước ta cá cơm phân bố từ Bắc đến Nam, các nơi có sản lượng cá cơm cao là: Quảng Ninh, Cửa Lò (Hà Tĩnh), Bình Định, Quảng Nam,Nha Trang, Phan Rang, Phan Thiết, Phú Quốc Và đa số chỉ tồn tại các loại cá đặc hữu:

Cá cơm đỏ và cá cơm than ở Phú Quốc

Cá cơm sọc phấn ở Nha Trang

Cá cơm là loài cá sống ở tầng nổi Có tuổi thọ tối đa là 3 năm Trong năm đầu đời cá cơm lớn nhanh chiều dài từ 57-76 mm, trọng lượng từ1,8 -> 4,5 g từ năm thứ 2 trở đi cá sinh trưởng chậm dần Tỉ lệ cá một tuổi chiếm ưu thế trong sản lượng đánh bắt

Mùa vụ chính của cá cơm là từ tháng 2 đến tháng 5 và từ thàng 7 đến tháng 10 hàng năm Phần lớn thứa ăn là thực vật nổi cá cơm thường tập trung với mật độ cao ở những vùng nước vên biển có sự xáo trộn mạnh theo phương thẳng đứng hay vùng nước trồi ven bờ

Cá cơm thường ( Stolephorus commersonii )[9] : được sử dụng

nghiên cứu điều kiện thủy phân Đây là loài cá nổi, mùa vụ từ tháng 2 đến tháng 5 và từ tháng 7 đến tháng 10 hàng năm [4]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của cá cơm:

Tỉ lệ(%) 77,4 ± 0,2 19,3 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,3 ± 0,1

2.1.2 M uối ăn ( NaCl ) : Dùng loại muối sạch, ít tạp chất, đã bảo

quản ít nhất là một tháng

2.1.3 Chế phẩm enzym dùng để thủy phân là proteaza

Sử dụng enzym bổ sung vào cá để rút ngắn thời gian thủy phân theo hai cách:

Sử dụng ở dạng enzym proteaza kỹ thuật (E-Pr.Kt) : Enzym kỹ thuật

từ chủng A oryzae A4, có hoạt độ 310± 0,5 HđP/g để thủy phân cá cơm ( Viện sinh học Tp.HCM )

Sử dụng enzym proteaza từ A.oryzae ở dạng tinh: Enzym proteaza tinh khiết từ A.oryzae,có hoạt độ 50.000 đơn vị hoạt độ/mg, của hãng MERCK để thủy phân cá cơm

Proteaza là loại enzym xúc tác cho quá trình thủy phân protein đã được nghiên cứu và được sử dụng trong sản xuất công nghiệp từ khá lâu trên thế giới Chúng được sử dụng trong nhiều ngành khác nhau: y học, công nghệ thực phẩm, công nghiệp nhẹ

Proteaza có thể được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu khác nhau: động vật, thực vật và vi sinh vật Trong vài thập kỷ gần đây, việc sản xuất proteaza từ các nguồn vi sinh vật được chú ý hơn cả, do có nhiều ưu điểm hơn các nguồn khác như;

Chủ động về nguồn nguyên liệu, chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn do vậy có thể thu hoặch hàng trăm lần trong một năm

Có thể dễ dàng nhanh chóng điều hòa định hướng sự tổng hợp enzym cần thiết trên cơ sở thay đổi môi trường, chọn lọc hoặc gây đột biến ở chủng

vi sinh vật

Giá thành thấp vì trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền

Có thể thu được với số lượng nhiều

Chính vì vậy mà enzym proteaza từ nấm mốc A.oryae được ứng dụng trong sản xuất nước mắm cho phép rút ngắn thời gian chế biến, nâng cao hiệu suất thu hồi đạm từ cá và tận dụng nguồn nguyên liệu cá tạp để chế biến, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế trong sản xuất

2.2 Phương pháp ngiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

+ Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy phân cá cơm bằng chế phẩm enzym kỹ thuật từ chủng A.oryzae A4 ( E-Pr.Kt) trong sản xuất nước mắm theo sơ đồ 1.2:

Xác định tỷ lệ Proteaza thêm vào

Xác định nhiệt

độ và thời gian thuỷ phân

Khẳng định chế độ thủy phân

thích hợp

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy phân cá bằng chế phẩm enzym proteaza tinh khiết từ A.oryzae trong sản xuất nước mắm

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5276 – 90.[16, tr 247-250]

2.2.3 Các phương pháp phân tích hoá học

- Nitơ tổng số được xác định theo phương pháp Kjeldahl [10, tr 128]

123 Nitơ formon được xác định theo phương pháp Sorensen.[10,tr 141]

138-Nguyên liệu

Thuỷ phân

Nhiệt độ Nồng độ Enzym proteaza

từ nấm A.oryzae ( chế phẩm tinh khiết )

kiện tối ưu chung

- Nitơ amoniac được xác định theo phương pháp chưng cất [10,tr 176-180]

- Nitơ axít amin bằng hiệu số giữa Nitơ formol và Nitơamoniac [7]

- Xác định hoạt độ proteaza theo phương pháp formol.[6,tr145 – 147]xem phu lục 1

2.2.4 Các phương pháp phân tích cảm quan

2.2.4.1 Phương pháp xác định giá trị ngưỡng cảm (GTNC) phát hiện mùi nước mắm ( điểm đầu mùi) [11],[14]

Ngưỡng cảm phát hiện là giá trị của một kích thích cảm giác cần thiết

để gây ra được một cảm giác Đối với mùi, vị ngưỡng cảm phát hiện được đo bằng nồng độ chất kích thích trên một chất mang nào đó.[14]

Vậy giá trị ngưỡng cảm phát hiện mùi nước mắm ( điểm đầu mùi) là nồng độ tối thiểu cần thiết của nước mắm để gây ra cảm giác về mùi nước mắm

+ chuẩn bị mẫu: Để xác định ngưỡng cảm mùi nước mắm ,dùng phương pháp pha loãng như sau:

Trước tiên pha dung dịch mẫu có nồng độ cơ bản 10-4 ( tức là pha loãng 10.000 lần so với ban đầu): Lấy 10ml nước mắm pha với 90ml nước cất, được nồng độ 10-1, sau đó lấy 10ml dung dịch này pha tiếp với 90ml nước cất, rồi lần lượt tiến hành tương tự ta sẽ pha được dung dịch có nồng độ cơ bản 10-4 Từ dung dịch có nồng độ cơ bản trên, pha tiếp nồng độ 1.10-6, 2.10-6, 3.10-6 , v.v…

+ Tiến hành xác định ngưỡng cảm mùi: với quy định, người chuẩn bị mẫu thử không tham gia vào nhóm cảm quan Quá trình xác định gồm các bước sau