Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Trường Đại học bách khoa Hà nội

-

Luận văn thạc sỹ khoa học

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào

và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn

Nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

ngành: Công nghệ sinh học

Quách vũ quỳnh hương

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị ánh Hồng

MụC LụC

18TMở Đầu 18 T

18T1 Tính cấp thiết của đề tài1 8T

18T2 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài18T

18T3 Mục đích của đề tài18 T 3

18T4 nội dung nghiên cứu1 8T 3

18TChương I: 18 TTổng quan 4

18TI.1 Giới thiệu chung về cây sắn18T 4

18TI.1.1 Vị trí, phân loại và nguồn gốc18T 4

18TI.1.2 Đặc điểm sinh học18T 5

18T1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cây sắn18T 5

18T1.1.4 Độc tố trong củ và lá sắn18T 6

18T1.1.5 Sản xuất, tiêu thụ sắn trên Thế giới và Việt Nam18T 6

18TI.1.5.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới18T 6

18TI.1.5.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ở Việt Nam18T 7

18TI.2 Một số Bệnh do nấm gây hại trên sắn18T 9

18T1.2.1 Bệnh do nấm gây hại trên củ sắn ngoài đồng ruộng18T 9

18T1.2.2 Bệnh do nấm gây hại trên củ sau khi thu hoạch18T 9

18T1.2.3 Bệnh do nấm gây hại trên thân cây sắn18T 10

18T1.2.4 Bệnh do nấm gây ra trên lá sắn18T 10

18TI.3 Phương pháp nhân giống cây sắn18 T 10

18T1.3.1 Nhân giống truyền thồng18T 10

18TI.3.2 Nhân giống trong điều kiện in vitro18T 10

18TI.4 kỹ thuật chuyển gen ở thực vật18 T 12

18TI.4.1 Tái sinh cây trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật - cơ sở thành công của chuyển gen18T 12

18TI.4.1.1 Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật18T 12

18TI.4.1.2 Vai trò của hệ thống tái sinh trong kỹ thuật chuyển gen18T 14

18TI.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium18T 15

18TI.4.2.1 Cơ chế18T 15

18TI.4.2.2 Vectơ18T 17

18TI.4.2.3 Gen chỉ thị và gen chọn lọc18T 19

18TI.4.3 Giới thiệu sơ lược về enzym thủy phân kháng nấm18T 20

18TI.4.4 Một số thành tựu về cây chuyển gen18T 22

18TI.4.5 Những yếu tố tích cực và hạn chế của cây trồng biến đổi gen18T 23

18TI.4.6 Một số nghiên cứu chuyển gen vào cây sắn18T 24

18TI.4.7 Kỹ thuật PCR - ứng dụng kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển18T 26

18TChương II: 18 TVật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 18T.18 T 28

18TII.1 Vật liệu Nghiên cứu18T 28

18TII.1.1 Thực vật18T 28

18TII.1.2 Chủng vi khuẩn và vectơ biến nạp18T 29

18TII.1.3 Hoá chất và thiết bị18T 29

18TII.2 Nội dung nghiên cứu18 T 29

18TI.2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh của cây sắn18T 29

18TII.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.18T 29

18TII.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.18T 30

18TII.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.18T 30

18TII.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp giữa BAP và αNAA đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.18T 30

18TII.2.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí lấy mẫu đến khả năng phát sinh hình thái mô nuôi cấy.18T 30

18TII.2.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các môi trường đến khả năng tạo chồi của mô nuôi cấy.18T 30

18TII.2.1.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh.18T 30

18TII.2.2 Thí nghiệm trong và sau chuyển gen vào cây sắn.18T 30

18TII.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến khả năng sống và18T 30

18TII.2.2.2 Nuôi cấy tái sinh cây sắn chuyển gen18T 30

18TII.2.3 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển18T 30

18TII.3 Phương pháp nghiên cứu18 T 30

18TII.3.1 Các loại môi trường18T 30

18TII.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm18T 31

18TII.3.3 Phương pháp vào mẫu18T 31

18TII.3.4 Chuẩn bị mẫu ở nội dung xây dựng hệ thống tái sinh của cây sắn18T 31

18TII.3.5 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens18T 31

18TII.3.6 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển.18T 33

18TII.3.7 Phương pháp tách chiết DNA18T 33

18TII.3.8 Phương pháp PCR18T 34

18TChương III: 18 TKết quả và thảo luận 40

Kết quả và thảo luận 40

18TA Các thí nghiệm nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cho cây sắn18 T 40

18TIII.1 ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy18 T 41

18TIII.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy18 T 44

18TIII.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.18 T 46

18TIII.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp giữa BAP và αNAA đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.18T 48

18TIII.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí lấy mẫu đến khả năng phát sinh hình thái mô nuôi cấy.18 T 50

18TIII.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các môi trường đến khả năng tạo chồi của mô nuôi cấy.18T 52

18TIII.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của 18Tα18TNAA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh1 8T 55

18TIII.8 Những kết quả đã đạt được trong giai đoạn xây dựng hoàn thiện

hệ thống tái sinh cho cây sắn18 T 56

18TB Các nghiên cứu vào cây sắn hoàn thiện quá trình chuyển gen.18 T 18T59

18TIII.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng sống và tái sinh của mô lá cây sắn.18T 18T59

18TIII.10 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển18 T 18T65

18TIII.11 Kết quả kiểm tra PCR1 8T 618T7

18TChương IV: 18TKết luận và đề nghị 18T69

18TIV.1 Kết luận18 T 18T69

18TIV.2 Đề nghị18T 718T0

Mở Đầu

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lương thực đứng hàng thứ 6 trên

thế giới có nguồn gốc nhiệt đới ở châu Mỹ La tinh và đã được trồng cách đây khoảng 5000 năm [26] Là cây lương thực hàng đầu ở các nước có khí hậu nhiệt đới ẩm, cây sắn được trồng trên 89 nước với diện tích 14,8 triệu ha năm

2001 [28] Đến thế kỷ 19, sắn được trồng ở Việt Nam [6] và là cây lương thực

đứng thứ tư sau lúa, ngô và khoai lang

Hiện nay, sắn nhanh chóng được chuyển đổi vai trò từ cây lương thực truyền thống thành cây cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp chế biến như sản xuất tinh bột, đồ uống, nước chấm, mỳ chính, cồn Sắn còn là nguyên liệu quan trọng phục vụ chăn nuôi, lá sắn tươi là nguồn protein quan trọng phục vụ tốt cho nghề nuôi tằm, thân sắn có thể tận dụng làm nguyên liệu trồng nấm, mộc nhĩ

ở Việt Nam, sắn được trồng ở cả 7 vùng sản xuất nông nghiệp Theo thống

kê năm 2001, vùng có diện tích trồng sắn lớn nhất là Đông Nam bộ (57.800 ha), vùng Đông Bắc (48.100 ha) và ít nhất là vùng Đồng bằng sông Cửu Long (5.500 ha) Về năng suất, vùng Đông Nam bộ (16,8 tấn/ha), vùng Đồng bằng sông Hồng (10,4 tấn/ha) và thấp nhất là vùng Bắc Trung bộ (7,1 tấn/ha)[13].Sắn cũng là cây trồng bị nhiều loại nấm bệnh khác nhau gây hại, làm ảnh hưởng không nhỏ đến sinh trưởng và phát triển của cây cũng như năng suất, chất lượng của củ Có gần 250 loại bệnh nấm của sắn trong đó có khoảng 10 loại bệnh có ảnh hưởng lớn đến giá trị kinh tế của cây sắn [5] Bệnh nấm gây hại trên củ sắn khi còn ở ngoài đồng ruộng có thể gây hại nặng ở một số địa phương thậm chí có nơi không thu hoạch được Điển hình ở đây là các loài nấm Phytophthora, nấm Rosellinia necatrik Bệnh nấm gây hại trên thân cây

sắn, trên lá sắn và trên củ sắn sau khi thu hoạch cũng ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế của cây sắn Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có thể hạn chế được phần nào ảnh hưởng của nấm bệnh đến cây sắn chứ không cho tác dụng triệt để như mong muốn

Chuyển gen là một công cụ hữu ích, bổ sung hiệu quả cho phương pháp chọn tạo giống truyền thống và có thể mở rộng các nguồn gen có lợi sang các giống khác Để chuyển gen vào thực vật phương pháp thông dụng nhất là chuyển gen nhờ Agrobacterium và chuyển gen bằng súng bắn gen [3] Chuyển

gen hữu ích vào thực vật cho phép tăng cường những tính trạng mong muốn

mà vẫn giữ nguyên được những đặc tính của giống, tránh được những khó khăn mà phương pháp chọn tạo giống truyền thống gặp phải

Đối với cây sắn, chuyển gen có thể cải tiến năng suất, tăng cường chất lượng củ, kháng sâu bệnh và sản sinh ra các hợp chất mới làm tăng giá trị của sản phẩm Để có thể tạo ra những cây chuyển gen một cách ổn định, cần xây dựng một hệ thống nuôi cấy in vitro cho phép có thể tái sinh cây Các gen

được chuyển cần có biểu hiện trực tiếp ở những cây chuyển gen đầu tiên và có thể di truyền một cách ổn định cho các thế hệ sau Sắn là cây sinh sản vô tính, vì thế các cây được chuyển gen đầu tiên và đã ổn định về mặt di truyền có thể

sử dụng cho các chương trình chọn tạo giống

Tạo phôi vô tính là phương pháp chung nhất để tái sinh sắn và chỉ giới hạn

ở mô phân sinh và mô phôi của các mẫu cấy như lá mầm hoặc trụ phôi từ phôi hợp tử [70][73][50][60][44][56] Ngoài ra việc phát sinh chồi thông qua phát sinh cơ quan từ các tế bào tại mép cắt hoặc gần mép cắt của các mẫu rất thích hợp cho việc chuyển gen nhờ Agrobacterium [46][57] Xuất phát từ những cơ

sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

" Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu

chuyển gen kháng nấm và cây sắn nhờ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens"

2 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- ứng dụng tiến bộ của công nghệ sinh học hiện đại vào công tác chọn tạo giống nhằm tạo ra các dòng sắn mang gen hữu ích mong muốn (kháng nấm)

- Đề tài cung cấp thông tin, số liệu làm cơ sở khoa học đóng góp cho việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển các gen kháng nấm vào cây sắn nhờ

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nói riêng và là tài liệu tham khảo cho

học tập và các nghiên cứu chuyển gen khác nói chung

- Thành công của đề tài tạo tiền đề cho việc chọn tạo ra những dòng sắn kháng bệnh, chất lượng cao, năng suất tốt, hiệu quả kinh tế phục vụ cho nhu cầu sản xuất nông nghiệp và công nghiệp

3 Mục đích của đề tài

- Nghiên cứu quy trình chuyển gen kháng nấm chitinase-glucanase vào cây

sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm thu được cây sắn có gen

chuyển

- Xây dựng quy trình tái sinh cây sắn chuyển gen trong in vitro

4 nội dung nghiên cứu

• Chuyển được gen kháng nấm vào cây sắn thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

• Xác định được thành phần môi trường tối ưu cho khả năng tái sinh chồi cao sau chuyển gen

• Tái sinh được cây sắn chuyển gen thành cây hoàn chỉnh

• Kiểm tra sự có mặt của gen được chuyển

Chương I Tổng quan

I.1 Giới thiệu chung về cây sắn

I.1.1 Vị trí, phân loại và nguồn gốc

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc giới thực vật (Phyta), ngành

thực vật hạt kín (Angrospermae), lớp hai lá mầm (Dicotyledonece), bộ thầu

dầu (Euphorbiales), họ thầu dầu (Euphorbiacae), chi Manihot [19]

Sắn có nguồn gốc từ Đông bắc Braxin nhưng cũng có tài liệu đã chứng minh chúng còn có xuất xứ từ Bolivia và Mehico [34]

Thế kỷ 17, cây sắn du nhập vào châu á Đến thế kỷ 19, sắn được đưa vào miền nam Việt Nam [7] và trở thành cây lương thực quan trọng thứ tư của Việt nam Tới nay cây sắn đã được phân bố trên một diện rộng, chủ yếu là những nước tập trung trong khoảng từ 30° vĩ Bắc đến 30° vĩ Nam

Có nhiều giống sắn khác nhau Dựa vào màu sắc của cây, vỏ củ và hàm lượng glucozit độc thì có thể chia sắn ra làm 3 loại chính:

• Sắn đắng (sắn vỏ trắng): có hàm lượng glucozit độc cao nhất trong các loại sắn Hàm lượng HCN trung bình trong củ là 15-30 mg/100g [1] Có vỏ gỗ màu nâu nhạt, vỏ thịt trắng, cuống lá tím, thân cây thấp, đốt ngắn, không ăn tươi được

• Sắn ngọt (sắn vỏ đỏ): có hàm lượng glucozit độc thấp, hàm lượng HCN chung trong củ khoảng 4 - 5mg/100g [1] Thân cây có màu xanh nhạt, đốt dài, lá màu xanh thẫm, vỏ củ có màu nâu xẫm

• Sắn nghệ (sắn vỏ vàng): có hàm lượng glucozit độc cao hơn sắn vỏ đỏ Trung bình trong củ có 10mg/100g HCN [1] Thân cây màu vàng nhạt hơi xanh, vỏ củ màu vàng ngà, thịt sắn hơi vàng, năng suất thấp nên ít trồng

Hình 1.1 Cây sắn, hoa, quả và hạt sắn

I.1.2 Đặc điểm sinh học

Sắn là cây tiểu mộc, cao khoảng 1 - 4m, có phân nhánh hoặc không phân nhánh tuỳ giống, lá khía thành nhiều thùy, rễ ngang phát triển thành củ, tích lũy tinh bột Thời gian sinh trưởng từ 6 - 12 tháng, có nơi lên tới 18 tháng Sắn thường được trồng chủ yếu ở vùng nhiệt đới [7]

Vụ sắn thường bắt đầu vào cuối mùa khô Thời gian sinh trưởng từ 10 - 12 tháng ở miền Bắc và 7 - 9 tháng ở miền Nam Cây sắn chịu được đất chua nên trồng được ở những vùng đồi đất xấu ở miền Bắc hay vùng đất phèn ở châu thổ sông Cửu Long Đất cát ven biển, đất phù sa cũ và mới cũng trồng được sắn Vùng núi cao không trồng được sắn vì sắn không chịu được rét

I.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cây sắn

Thành phần các chất cấu tạo các bộ phận trên cây sắn rất khác nhau (xem bảng 1 - phụ lục 1) Củ sắn giàu tinh bột, nhiều nhiệt lượng và axit ascorbic nhưng có nhiều gluxit khó tiêu, nghèo protit, lipit, ít muối khoáng và ít vitamin Lá sắn có nhiều canxi, protit, vitamin A, B1, B2 và một số axit amin không thay thế như lizin, triptophan cao hơn các bộ phận khác và thay đổi tùy thuộc vào tuổi cây Có thể dùng củ và ngọn sắn để ăn Thành phần hoá học giữa sắn vàng và sắn trắng cũng rất khác nhau (xem bảng 2 - phụ lục 1)

Sắn được dùng thay ngũ cốc làm thức ăn giàu năng lượng cho gia súc, gia cầm Củ sắn được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước, lá và thân cây ít được dùng

hơn Một số nơi dùng thân lá sắn kết hợp trong cỏ khô để sử dụng hàm lượng protit và chất xơ Củ sắn thường được sử dụng dưới dạng sắn lát khô, sắn viên hoặc bột, chế biến thức ăn tổng hợp Cũng có thể sử dụng sắn tươi nhờ khả năng dễ tiêu của tinh bột sắn nhưng cần chú ý đầy đủ đến tác động của HCN Giá trị dinh dưỡng của sắn đối với các loại gia súc, gia cầm được phân tích ở châu Phi cho kết quả ở bảng 3 - phụ lục 1.

I.1.4 Độc tố trong củ và lá sắn

Bất kỳ loại sắn nào cũng đều có độc tố acid cyanic (HCN) HCN được phát hiện có trong cây sắn từ năm 1904 Tùy từng loại sắn mà hàm lượng chất độc này thay đổi và sự phân bố của nó cũng không đều trong các cơ quan trên cùng một cây (bảng 4 phụ lục 1) Theo kết quả nghiên cứu của Nastey (1973), các chất glucoside cyanogenic của sắn có thành phần chủ yếu là linamarin (93%) và lotaustralin (7%) Những chất này chuyển thành HCN khi có sự hiện diện của linamatase (một loại enzym trong sắn)

I.1.5 Sản xuất, tiêu thụ sắn trên Thế giới và Việt Nam

I.1.5.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới

Theo số liệu thống kê của FAO (1968) có tới 88 nước trên thế giới trồng sắn với năng suất bình quân năm 1968 là 8,7 tấn/ha, sản lượng trên 85 triệu tấn [2]

Đến năm 2004, toàn thế giới có 89 nước trồng sắn đạt diện tích 18,51 triệu

ha, năng suất bình quân 10,94 tấn/ha, sản lượng 202,64 triệu tấn [29] Diện tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều hướng gia tăng trong hơn 10 năm qua 1994-2004 (bảng 5 - phụ lục 1) trong đó có 22 nước đạt sản lượng sắn hàng năm trên 1 triệu tấn Châu Phi chiếm 53% sản lượng sắn thế giới, tiếp theo là châu á 29%, châu Mỹ La tinh và vùng Caribê 17% (bảng 6 - phụ lục 1)

Châu á là một trong ba vùng trồng sắn quan trọng của thế giới Diện tích trồng sắn hiện có 3,51 triệu ha, sản lượng 58,92 triệu tấn, đứng thứ hai sau châu Phi, năng suất củ bình quân 16,76 tấn/ha Nước dẫn đầu về sản lượng của châu á là Thái Lan (20,40 triệu tấn) nhưng nước dẫn đầu về năng suất lại là

ấn Độ (27,91 tấn/ha), cao nhất trên toàn thế giới [29]

Hình 1.2 Những vùng trồng sắn chính của châu á

(Mỗi chấm tương ứng 10.000ha sắn năm 2003) Nguồn: Reinhardt Howeler 2004 [63]

Tiêu thụ sắn trên thế giới năm 2002 - 2003 ước đạt 5,9 triệu tấn Thái Lan

là nước xuất khẩu sắn hàng đầu thế giới, kế đến là Việt Nam Những nước nhập khẩu chủ yếu là Trung Quốc, Cộng đồng châu Âu (EU), Nhật, Hàn Quốc, Mỹ và Philippines (bảng 7 - phụ lục 1) Năm 2003 - 2004 tiêu thụ săn tươi trên thế giới ước đạt 4,6 - 4,9 triệu tấn sản phẩm, tương đương 14,0 - 15,2 triệu tấn củ tươi Tình hình xuất khẩu sắn trên thế giới năm 2003 - 2004 được thể hiện ở bảng 8 - phụ lục 1.

Theo dự báo đến năm 2020, sản lượng sắn toàn thế giới ước đạt 275,1 triệu tấn, trong đó sản xuất sắn ở các nước đang phát triển là 247,7 triệu tấn, các nước phát triển đạt khoảng 0,4 triệu tấn Tốc độ tăng trưởng về lượng tiêu thụ sản phẩm sắn hàng năm giai đoạn 1993 - 2020 của châu Mỹ ước đạt 1,3%, châu Phi là 2,44% và châu á là 0,84 - 0,96% (bảng 9 - phụ lục 1)[20]

I.1.5.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ở Việt Nam

ở Việt Nam, sắn là cây lương thực có sản lượng đứng thứ hai sau lúa và

được coi là cây màu quan trọng thứ hai sau cây ngô Sản xuất sắn trong nước liên tục tăng trong giai đoạn 1960-1980, giảm sút trong giai đoạn 1980-1990 [6], ổn định và phát triển trong hơn 10 năm trở lại đây do chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô đồng thời vẫn coi trọng các cây màu như sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (bảng1.1)

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của Việt Nam

Chỉ tiêu 1976 1980 1985 1990 1993 1997 2001 2002 2003 2004

Diện tích

(1.000ha) 233,2 436,4 335,0 256,8 278,0 254,4 263,9 337 371,7 370,0 Năng suất

Sản lượng

(1.000tấn) 1795,6 3273,0 2948,0 2285,5 2446,4 2404,1 2807,9 4438,0 5226,1 5365,0 Nguồn: Hoàng Kim, 1995[6], Tổng cục thống kê 2001[13] và FAOSTAT 2005[29]

Sắn được trồng ở hầu hết các tỉnh nhưng tập trung nhất là ở các vùng đồi núi trung du, miền núi thấp Bắc Bộ, Đông Trường Sơn, Tây nguyên và Nam Bộ (bảng 10 - phụ lục 1)

Năm 2002, một số tỉnh miền Bắc như Yên Bái, Bắc Kạn, Phú Thọ, Sơn La, Lào Cai, đã chuyển đổi cây sắn từ cây lương thực thực phẩm sang thành cây công nghiệp [17]

Cây sắn đã bổ sung một cách đáng kể nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến như sản xuất tinh bột, làm khô để xuất khẩu hoặc tự sơ chế phục vụ cho sản xuất maltoza, cồn, các loại bún bánh Sắn sử dụng làm thức ăn chăn nuôi chiếm 60,9% tổng sản lượng sắn tiêu thụ ở Việt Nam, tinh bột sắn 16%, sắn khô phục vụ cho xuất khẩu chiếm 4,9% và sắn lát khô trong các hộ gia

đình chiếm 6,0% [27] Ngoài ra, Việt Nam còn tham gia xuất khẩu sắn và hiện

là nước xuất khẩu sắn thứ hai trên thế giới sau Thái Lan [29] Tình hình chế

biến sắn ở Việt Nam cũng phát triển mạnh, nhất là tại các tỉnh phía Nam (bảng 11 - phụ lục 1)

I.2 Một số Bệnh do nấm gây hại trên sắn

I.2.1 Bệnh do nấm gây hại trên củ sắn ngoài đồng ruộng

Khi còn ở ngoài ruộng củ sắn dễ bị nhiều loại nấm xâm nhập và gây hại, nhất là những vùng đất ẩm Bệnh có thể gây hại nặng đến không thu hoạch

được đa phần là do thối củ Trong số các loài nấm xâm nhập và gây hại trên củ sắn ngoài đồng ruộng phải kể đến:

Các loài nấm Phytophthora Thường gây ra những vết nâu và chết hoại trên

củ, trên cuống, trên rễ ở bất kỳ tuổi nào của cây sắn hoặc gây ra các vết bệnh

có hình dáng bất kỳ với màu nâu trên lá Nấm xâm nhập vào củ và phân huỷ phần bên trong của củ, từ đó tiết ra chất dịch bắt đầu từ những vết thối mềm Nấm Rosellinia necatrik Thường xuất hiện trên các chân đất ẩm, giàu chất

hữu cơ Ban đầu trên mặt củ sắn xuất hiện những đám sợi nấm màu trắng, sau chuyển sang đen Mô củ bị bệnh có màu nâu Bóp mạnh củ sắn thì vết bệnh tiết ra chất nước có mùi thối

Nấm Rogidoporus lignosus Tương đối phổ biến ở các vùng trồng sắn Nấm

gây thối củ gọi là "thối trắng" Củ sắn bị bệnh có một lớp sợi nấm phủ lên trên

bề mặt màu trắng, sau chuyển sang màu kem rồi chuyển thành màu da cam Mô củ nhiễm bệnh bị khô và tiết ra mùi thối đặc trưng, bệnh là cho cây chết dần Những ổ nhiễm bệnh lan dần ra thành từng vệt trên ruộng sắn

Nấm Corticium rolfsii là loài khá phổ biến, phân bố rộng, gây hại nhiều

loại cây trồng khác nhau Nấm này có thể quan sát thấy trên hom, trên rễ và trên củ sắn Biểu hiên của bệnh này là xuất hiện những đám sợi nấm màu trắng, chúng sẽ xâm nhập vào củ và gây thối củ

I.2.2 Bệnh do nấm gây hại trên củ sau khi thu hoạch

Sau khi củ sắn được thu hoạch, một số loài nấm đã xâm nhập vào củ từ ngoài ruộng vẫn tiếp tục phát triển và gây hại Một số loài nấm xâm nhập vào

củ thông qua các vết thương được tạo ra trên củ khi thu hoạch Sự phối hợp gây hại của 2 nhóm nấm này làm cho củ sắn bị huỷ hoại khá nhanh Điển hình

ở đây phải kể đến các loài: Mucor mucedo, Rhizopus nigricans, Choanephora cucurbitarum, Fusarium sp

I.2.3 Bệnh do nấm gây hại trên thân cây sắn

Một số loại nấm bệnh gây hại trên củ sắn nhưng có thể phát triển lên thân cây làm đen các ống mạch dẫn gây rụng lá, khô ngọn Nấm cũng có thể xuất hiện trên những hom sắn để lưu trữ khi độ ẩm không khí cao, những thân cây non gây bệnh mụn thán thư làm lá héo và rụng, ngọn bị khô đen lại

Cũng có bệnh nấm chỉ xuất hiện và phát triển nhanh vào mùa mưa làm thân lá bị vặn vẹo biến dạng, cuống và gân lá có vết lở loét, lóng thân nhỏ lại

và dài ra và nói chung đều gây ảnh hưởng đến năng suất cây bệnh

I.2.4 Bệnh do nấm gây ra trên lá sắn

Một số loài nấm phổ biến ở các vùng trồng nấm gây hại trên lá sắn như

Cercospora henningsii, Phyllosticta sp có thể gây rụng lá dẫn đến chết cây

Ngoài ra, tuỳ vào đặc điểm và khí hậu từng vùng mà xuất hiện một số bệnh nấm khác trên lá như bệnh rỉ sắt, bệnh phấn trắng, bệnh chấm đen, bệnh chấm láng có những bệnh chỉ xuất hiện ở vùng nóng, có những bệnh lại chỉ xuất hiện ở những vùng mưa và ẩm

I.3 Phương pháp nhân giống cây sắn

I.3.1 Nhân giống truyền thồng

Có thể nhân giống cây sắn bằng hom lá theo phương pháp của Kloppenburg và cộng sự (1972) [15], nhân nhanh bằng hom hai mắt theo phương pháp của CIAT hay đơn giản chỉ bằng cách gieo hạt thông thường

I.3.2 Nhân giống trong điều kiện in vitro

Sắn dễ bị nhiễm một số loại nấm bệnh, virus và sâu bọ theo con đường hom giống Vì thế phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh

đã được phát triển vào giữa những năm 1970 Cho đến nay việc tạo ra giống

mới nhanh chóng bằng cải tiến bộ gen thông qua nuôi cấy mô và chuyển gen

đang rất được quan tâm

Nuôi cấy mô phân sinh cây sắn được thực hiện đầu tiên năm 1974 Đỉnh mô phân sinh được tách ra từ những cây trồng trong nhà kính và cấy vào môi trường khoáng đa lượng và vi lượng MS, vitamin B5, 20g/l sucrose, tuy nhiên những mô phân sinh nhỏ hơn 0,2mm thì không thể sống sót, phát triển thành cây vì môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng Lui (1975) đã kết hợp thêm 0,1mg/l BA, 0,2mg/l NAA để kích thích sự hình thành rễ, mô sẹo và rễ phụ ở một số loài Cũng năm 1975, ở Costa-Rica, Moh đã sử dụng hạt phấn

đơn bội làm vật liệu nuôi cấy mô

Nuôi cấy phôi soma xuất hiện muộn hơn và lần đầu tiên được mô tả bởi Stamp và Henshaw (1982) Ban đầu tác giả sử dụng phôi hợp tử làm nguyên liệu khởi đầu để tạo phôi, sau đó thuỳ lá (leaf lobe) của cây cũng được sử dụng và cho kết quả tương tự như phôi hợp tử [69]

Việc nhân giống thông qua phôi soma chủ yếu được ứng dụng trong công tác chuyển gen cây sắn Theo các báo cáo, các loại mô được sử dụng trong quá trình phát sinh phôi (mảnh mô sẹo phát sinh phôi hoặc lá mầm từ phôi soma trưởng thành) để làm nguyên liệu cho việc chuyển gen, sau đó cũng dùng chính chu trình tái sinh phôi này để tái sinh mô chuyển gen

Tình hình nuôi cấy mô sắn ở Việt nam

Nghiên cứu về cây sắn ở nước ta được chú trọng từ khi Việt Nam hợp tác với các tổ chức và mạng lưới nghiên cứu sắn châu á Tuy nhiên những nghiên cứu trong điều kiện in vitro còn ít, chủ yếu chỉ về kỹ thuật trồng trọt

Trường đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã có những nghiên cứu bước đầu về nuôi cấy in vitro cây sắn: Đoàn Thị Phương và Bùi

Trang Việt đã sử dụng mẫu lá 4 tuần tuổi in vitro nuôi cấy trên môi trường

MS + 1,2mg/l NAA, 0,15mg/l BA và 0,3mg/l GAR 3 R, sau 7-10 ngày đã thu được mô sẹo Tiếp tục nuôi cấy các mô sẹo để tạo chồi [4] Phan Tường Lộc và

Nguyễn Hữu Hổ (Viện Sinh học Nhiệt đới) đã sử dụng thuỳ lá non từ cây khử trùng mẫu và chuyển vào môi trường MS + Vitamin B5 + 2àM/l casein + 0,5 mg/L CuSO4, tạo cụm phôi với môi trường MS + 6 - 8 mg/l 2,4D, thu được 85% tạo phôi sau 25 ngày nuôi cấy Môi trường tái sinh được sử dụng là MS + (0,5- 2mg/l) BAP và (0,1-1mg/l) IBA, thu được 6 chồi/mẫu cấy [14] Các nghiên cứu khác cũng cho thấy loại mô sử dụng và kiểu gen của giống ảnh hưởng đến khả năng tạo callus, sinh phôi và tái sinh cây

I.4 kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

Rosen và cs 2003; Veluthambi và cs 2003 đã nhận định: "Chuyển gen là một phương pháp gây biến dị di truyền có định hướng ở cây" Về mặt nông học, chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một trong những bước tiến khá dài của công nghệ sinh học Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc rất lớn vào bản chất cây trồng, đặc tính di truyền, phương pháp biến nạp cũng như tái sinh cây chuyển gen Mục đích chính của kỹ thuật chuyển gen là phải đạt hiệu quả cao, áp dụng được với nhiều với đối tượng cây trồng mà theo đó các nhà nghiên cứu công nghệ đã phát triển, xây dựng nhiều giải pháp cũng như kỹ thuật chuyển gen khác nhau

I.4.1 Tái sinh cây trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật - cơ sở thành công của chuyển gen

I.4.1.1 Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật

UTính toàn năng của tế bàoU

Haberlandt (1902) ngay từ xa xưa đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm của sinh học hiện đại: mỗi tế bào riêng rẽ

đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp

nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [31]

Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [12], [31]

Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:

Khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết,

ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào sinh phôi và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một

số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thì thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bàp thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô

tế bào xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào

thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào [12] Tuỳ theo mục đích đặt ra như tạo mô sẹo, tạo chồi phụ, tạo rễ, tạo phôi vô tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy mà điều chỉnh môi trường thích hợp là rất cần thiết

I.4.1.2 Vai trò của hệ thống tái sinh trong kỹ thuật chuyển gen

Đối tượng thường được sử dụng để chuyển gen ở thực vật là: mô lá, mô cấy

là lát cắt đoạn thân, mẩu callus, hay những tế bào tách rời Những vật liệu này sau khi đã được biến nạp thành công, các tế bào đã dung nạp những gen ngoại lai, phải tìm cách làm cho những tế bào này tái sinh được thành một cơ thể hoàn chỉnh bằng cách đặt nó vào một môi trường tái sinh thích hợp Nếu tái sinh không thành công thì quá trình biến nạp trước đó sẽ trở nên vô nghĩa Chính vì vậy, việc lựa chọn và điều chỉnh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đóng vai trò hết sức quan trọng, quyết định thành công hay thất bại của thí nghiệm biến nạp Bên cạnh đó, sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục tiêu nghiên cứu không kém phần quan trọng [55]

Để tạo được giống mới nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả, phải đảm bảo 4 yêu cầu: Hệ thống tái sinh thích hợp; Hệ thống vectơ thích hợp; Có các gen thích hợp đã được nhân dòng và đã xác định được các đặc tính; Các phương pháp để đánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm, nhà kính và

đoạn tế bào nhưng việc tái sinh các tế bào này gặp rất nhiều khó khăn để nhận

được một cây mang gen ngoại lai

I.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Mặc dù có nhiều phương pháp để tạo ra cây chuyển gen nhưng chuyển gen gián tiếp là phương pháp đơn giản nhất để sử dụng chuyển gen cho nhiều loại cây trồng

Agrobacterium tumefaciens và A rhizogenes là hai vi khuẩn gây bệnh khối

u và rễ tơ cho thực vật đã được biết và nghiên cứu từ lâu Tuy nhiên, người ta lại chú ý nghiên cứu và khai thác sử dụng khả năng của chúng ở một khía cạnh khác đó là sử dụng như một vectơ mang các gen ngoại lai để chuyển vào mô tế bào thực vật trong đó A tumefaciens được sử dụng phổ biến hơn cả.

Dựa vào cơ chế chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens, người ta đã dùng

chúng để chuyển các gen mong muốn trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmid của vi khuẩn sao cho vẫn đảm bảo được chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây độc cho cây cũng như tạo ra các dạng vectơ mới để chuyển gen là những vectơ liên hợp và vectơ nhị thể Các hệ thống vectơ mới được tạo thành này

đều được dựa trên cơ sở cải tiến Ti-plasmid Phần T-DNA của Ti-plasmid sẽ bị cắt

bỏ những gen gây u và gen tổng hợp opine, thay thế vào đấy là các gen mong muốn kèm theo gen chỉ thị và gen khởi động

I.4.2.1 Cơ chế

A tumefaciens mang một plasmid sao chép độc lập với bộ gen vi khuẩn đó

là plasmid Ti có kích thước khoảng 200kb Trên plasmid này có các vùng:

+ Vùng T-DNA: được giới hạn bằng các trình tự lặp và bảo tồn ở hai đầu gọi

là hai bờ trái và phải, có chứa các gen mã hóa cho auxin, cytokinin và opine Vùng này được đưa và gắn vào bộ gen của tế bào thực vật khi vi khuẩn xâm nhiễm, trong đó bờ phải là nơi cần thiết cho quá trình chuyển T-DNA vào genome thực vật

+ Vùng gen vir: các gen vir giữ vai trò chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế

bào thực vật Vùng vir có tới 25 gen được định vị trên Ti-plasmid bao gồm 6 operon A, B, C, D, E và G trong đó vir A, B, D và G liên quan đến quá trình tạo ra độc tính còn vir C và E liên quan đến quá trình tạo thành khối u Các

operon B, C, D, E đều là cistron Vir A luôn luôn biểu hiện còn vir C thể hiện mạnh ở môi trường dịch chiết từ các mô bị tổn thương Hoạt động của các operon này nhìn chung liên quan đến sự có mặt của các hợp chất chứa phenol như acetosyringone và α-hydroxy acetosyringone được tiết ra từ các tổn thương trên cơ thể thực vật Một số chủng Agrobacterium còn có thêm vùng

vir F và phần lớn các chủng nopaline có thêm một gen tổng hợp zeatin tzs

định vị gần đó Các gen vir hoạt động giúp T-DNA tách khỏi Ti-plasmid và tạo điều kiện để đưa T-DNA xâm nhập sang tế vào thực vật

+ Vùng ori giúp cho sự sao chép của plasmid

+ Vùng gen dị hóa opine

Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật: là một quá trình khá phức

tạp với nhiều yếu tố tham gia hoạt động, xảy ra khi Agrobacterium tiếp xúc

với tế bào thực vật bị tổn thương Khi đó tế bào thực vật bị tổn thương sẽ tiết

ra các hợp chất phenolic như acetosyringone, α-hydroxy acetosyringone Các hợp chất phenolic dẫn dụ với vi khuẩn, giúp cho các Agrobacterium nhận ra tế

bào chủ thích hợp và gắn vào thành tế bào Vi khuẩn sẽ bám vào những vị trí

đặc trưng trên bề mặt tế bào nhờ sự giúp đỡ của các gen vir nằm trên nhiễm sắc thể gọi là gen chv (chromosome virulence) Bên cạnh đó, các hợp chất

phenolic còn là chất cảm ứng cho các gen vir hoạt động Quá trình này diễn ra trong điều kiện pH thấp và được tăng cường nhờ các opine và monosacaride

Đầu tiên gen vir A được hoạt hóa, sản phẩm protein của nó hoạt động như một chất thụ cảm hóa học, nhận biết sự có mặt của các phân tử như acetosyringone

và truyền thông tin này cho protein gen vir G thông qua cơ chế phosphoril hóa Vir G điều khiển quá trình dịch mã các gen vir B, C, D và E Các phân tử

đường cũng tham gia hỗ trợ các phức hợp phenolic làm tăng cường biểu hiện của các gen vir Ti-plasmid (gọi là mạch T) chuyển từ vi khuẩn sang tế bào thực vật (đầu 5’ đi trước) Đoạn DNA mạch đơn còn lại trên Ti-plasmid sẽ làm khuôn để tổng hợp nên mach DNA bổ trợ mới Quá trình này diễn ra sau 12

giờ kể từ khi vi khuẩn nhận biết được acetosyringone Gen vir D mã hóa một loại endonuclease cắt ở vị trí đặc biệt Sự phân tích bắt đầu khi enzym này hoạt động và cắt một đoạn ranh giới bên phải tại base thứ 3 hoặc thứ 4 tính từ trái sang Đầu 5’ của mạch T được protein vir D2 gắn vào Các prtein này bảo

vệ T-DNA khỏi sự tấn công của các enzym trong suốt quá trình vận chuyển Ngoài ra, protein vir D2 còn có chức năng nhận biết tế bào thực vật Cuối cùng, một vài sản phẩm của gen vir B kết hợp với màng và định vị tại đó Cấu trúc màng tế bào thực vật bị thay đổi trong suốt quá trình phức hợp T-DNA/protein chui qua

Sau khi đã qua màng tế bào, đoạn mạch T đi vào nhân và kết hợp với DNA trong nhân của tế bào vật chủ ở những vị trí ngẫu nhiên, tại đó các gen trên T-DNA bắt đầu hoạt động nhờ sự điều khiển của các gen trong nhân tế bào chủ Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật có nhiều nét tương đồng với quá trình tiếp hợp của vi khuẩn Quá trình chuyển T-DNA cần cấu trúc phức protein - DNA sản sinh từ Agrobacterium dưới sự tác động của các phức hợp

chứa phenol tiết ra từ các tổn thương của tế bào thực vật

I.4.2.2 Vectơ

Plasmid trong Agrobacterium là công cụ tham gia trực tiếp và có vai trò

cực kỳ quan trọng trong việc đưa gen lạ vào tế bào thực vật Do đó từ plasmid

Ti hoang dại, người ta đã cố gắng cải tiến sao cho plasmid này hoạt động hiệu quả nhất [8] Có 2 loại vectơ chính Agrobacterium sử dụng trong chuyển gen

gián tiếp

+ Vectơ liên hợp (cointegrating):

Đầu tiên các gen giữ chức năng tạo khối u trên thực vật trong plasmid bị loại bỏ đi, sau đó gắn thêm vào các gen chọn lọc, gen chỉ thị, các promoter cần thiết cho gen mục tiêu và các promoter giúp cho plasmid nhân lên được trong tế bào E.coli và Agrobacterium Cụ thể như sau:

Vùng polylinker có nhiều vị trí cắt giới hạn cho phép chèn vào các gen

đích mong muốn đưa vào thực vật và vùng bờ trái, bờ phải của plasmid được bao bọc bởi 24 cặp bazơ lặp lại Gen chọn lọc chứa các gen kháng kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ dùng dể chọn lọc các cá thể đã được chuyển gen Gen kháng kháng sinh nằm ngoài vùng T-DNA giúp chọn lọc các tế bào vi khuẩn

có mang plasmid

+ Vectơ nhị nguyên (đồng nhập):

Vectơ này nhỏ hơn vectơ liên hợp, có ưu điểm cho plasmid tồn tại lâu hơn trong tế bào E.coli và Agrobacterium Hệ thống này gồm 1 cặp plasmid có khả

năng tự sao chép trong E.coli và Agrobacterium vì trên plasmid có điểm khởi

đầu sao chép ori

Đầu tiên là một plasmid Ti hoang dại có mang gen vir nhưng không có

vùng T-DNA - helper plasmid Plasmid thứ 2 là plasmid Ti, trên đó các gen

auxA, auxB và cyt trong vùng T-DNA của plasmid hoang dại đã bị lấy đi, sau

đó chèn thêm vùng để gắn gen mục tiêu với nhiều vi trí cắt giới hạn Các gen chọn lọc thực vật chuyển gen như gen kháng kanamycin, hygromycin cũng

được đưa vào vùng T-DNA Những gen kháng này có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó được biến thành các gen kháng của thực vật bằng cách gắn thêm

đoạn gen tín hiệu của thực vật như các promoter hay những đoạn được polyadenin hóa để các gen này được biểu hiện Vectơ này còn được chèn thêm những gen cần thiết cho mục tiêu của thí nghiệm biến nạp trong đoạn T-DNA như các gen chỉ thị GFP, GUS Các gen nằm trong vùng T-DNA được sắp xếp hợp lý nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển và biểu hiện trong cây Gen mục tiêu thường nằm ở gần bờ phải, nơi quá trình chèn vào gen genome thực vật là trung thực nhất Ngược lại các gen đánh dấu (marker) lại

được sắp xếp gần bờ trái Vùng trung tâm của T-DNA là một promoter kép

được tạo dòng theo hướng ngược nhau giúp giảm ảnh hưởng của các DNA xung quanh trong bộ gen thực vật lên sự biểu hiện của gen mục tiêu

I.4.2.3 Gen chỉ thị và gen chọn lọc

Tất cả các vectơ đều phải có ít nhất một gen chỉ thị hoặc chọn lọc để giúp

ta quan sát và chọn lọc những cây chuyển gen thành công Các gen chon lọc này thường mã hóa cho một enzym có khả năng khử độc tính của chất chọn lọc như kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ trong quá trình chuyển hóa Các gen này còn dùng để phân tích bộ gen cây chuyển gen nhằm xác định việc đoạn DNA đưa vào có hiệu quả hay không Các gen này thường được kiểm soát bởi các yếu tố điều hòa lấy từ virus như promoter 35S của cauliflower mosaic virus (CaMV) hay promoter và terminator của gen tổng hợp nopaline (nos)

Gen đánh dấu có thể thiếu mất đi phần promoter, mục đích là để nhận ra các

đoạn DNA đã được chèn vào trong

NptII là gen chọn lọc được sử dụng phổ biến nhất, sản phẩm của gen là

enzym neomycin phosphotransferase (NPT), nó tự động phosphoryl hoá và bất hoạt các kháng sinh kanamycin, neomycine trong tế bào thực vật [23][35] Ngoài ra còn có các gen khác của vi khuẩn như CAT (Chloramphenicol

acetytransferase) kháng chloramphenicol [35], HPT (hygromycin

phosphatransferase) kháng hygromycin (Vanden Elzen và cs, 1985) và PAT

(phosphophinothricine acetyltransferase) kháng thuốc trừ cỏ phosphinotricine cũng được sử dụng rất phổ biến hiện nay

Gen chỉ thị giúp nhận biết tế bào hoặc thể chuyển gen vì nó tạo ra các sản phẩm có thể nhận biết dễ dạng Các gen CAT và β-glucuronide của E.coli

(GUS) được dùng làm gen chỉ thị những tế bào đã biến đổi chứa gen ngoại lai

ổn định [43] Tương tự, gen LUX của đom đóm và gen vibrio harveyi cũng

được sử dụng làm gen chỉ thị vì gen này mã hoá enzyme luciferase phát tia sáng cũng rất dễ phát hiện

Thông thường, khi thiết kế các gen chuyển vào thực vật, để cho quá trình nhận biết hay thanh lọc sau này được thuận lợi người ta thường thiết kế các vectơ mang một số gen bao gồm: gen mong muốn (gen kháng sâu, gen kháng

thuốc trừ cỏ, gen kháng etylen, gen sinh tổng hợp protein ), gen chỉ thị (gen GUS, gen phát huỳnh quang ), gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh )

Có thể nêu ra đây một số ví dụ như chuyển gen CryIAc kháng sâu vào một

số giống cải bắp (Brassica oleracea var capitata) nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium - GV 2260 mang vectơ nhị hợp pART27 chứa gen chọn lọc NPT II (neomycin phosphat transferasa) kháng kanamycin và gen CryIAc mã

hoá protein tinh thể kháng sâu tại Viện Di truyền Nông nghiệp [2], trong chuyển gen kháng hygromycin, gen GUS và gen kháng bệnh bạc lá Xa-21 vào lúa bằng phương pháp bắn gen, Viện Sinh học Nhiệt đới TPHCM đã lấy DNA của 2 plasmid p35H chứa gen marker (hph) và 1 plasmid chứa gen quan tâm

(gen GUS hoặc Xa-21) [18] hay chủng A.tumefaciens EHA 105 chứa plasmid

ITB mang gen cryIA(c), gen bar và gen GUS A

I.4.3 Giới thiệu sơ lược về enzym thủy phân kháng nấm

Chitin và β-1,3-glucan là các polysaccaride cấu thành chủ yếu của thành tế

bào nhiều loại nấm Sự vững chắc về mặt cơ học của thành tế bào nấm phụ thuộc vào chitin (một loại β-1,4-polyme của N-acetylglucosamine) Việc xử lý

hệ sợi của nấm với chitinase dẫn đến các tế bào bị phá vỡ tại đỉnh sinh trưởng

của sợi nấm [51] Những enzym hay dùng nhất là endochitinase và β endoglucanase đều thuộc nhóm các protein liên quan đến sự phát sinh bệnh

-1,3-xuất hiện tự nhiên của cây, được cho là ức chế sinh trưởng của nấm, khi chúng tích tụ lại thì có những phản ứng bảo vệ của cây trồng liên quan đến khả năng hủy hoại thành tế bào nấm Những gen này có nguồn gốc từ đậu đỗ, đại mạch,

cỏ ba lá hay từ lúa và đã được chuyển vào cây thuốc lá

Bốn loại (I-IV) endochitinase trong đó có ba loại chính (I-III) và β endoglucanase đã được mô tả Các loại hydrolase I đã được định khu trong

-1,3-các không bào của cây và đã chứng tỏ là có ảnh hưởng ức chế mạnh lên sự

sinh trưởng của nấm in vitro Sự ức chế sẽ rõ ràng hơn nhiều khi ứng dụng hỗn

hợp hai kiểu hydrolase, cho thấy các protein hoạt động hợp lực [8]

Chitinase (enzym tổng hợp chitin) nói chung được tìm thấy ở mức thấp

hoặc mức cơ bản trong cây khỏe mạnh Sự biểu hiện của nó tăng lên khi nguồn bệnh tấn công Do kết quả của sự tương tác giữa vật chủ và nguồn bệnh phụ thuộc nhiều vào tính nhanh chóng và cường độ của sự hoạt hóa phản ứng bảo vệ Broglie và cộng sự đã kết hợp gen CH 5B endochitinase ở cây họ đậu,

mã hóa một protein loại I với đoạn promoter của gen CaMV 35S dẫn đến sự

biểu hiện về cấu trúc cao trong sự đa dạng của các kiểu tế bào

Nhóm J.Ryals tại CIBA, Research Triangle Park (USA) đã thông báo về sự bảo vệ của các cây thuốc lá chuyển gen chống lại các nguồn bệnh nấm đủ loại như là kết quả của sự biểu hiện ở mức cao các protein kết hợp với tính kháng

được nội hấp (synsetic acquired resistance-SAR) trong các cây này Đa số các

protein SAR này thuộc nhóm các protein PR Sự tích luỹ mRNA của chúng không chỉ trong các lá sơ cấp bị nhiễm bệnh mà còn trong các lá thứ cấp không bị nhiễm Mục đích của nghiên cứu này là bảo vệ trên một phạm vi rộng chống lại các nguồn bệnh bằng việc kết hợp sản xuất quá mức các protein SAR trong các cây chuyển gen

Các protein bất hoạt riboxom từ thực vật (RIPs) đã cho các khả năng khác

tiến gần đến thử nghiệm để hạn chế một cách đặc hiệu quá trình trao đổi chất của nấm Các enzym này hạn chế việc tổng hợp protein trong các tế bào đích nhờ sự phân tách N-glycosidic của RNA 28 S Có hai dạng RIP: một dạng là

protein chuỗi đơn, một dạng protein bao gồm hai chuỗi, một chuỗi tạo ra

galactose - một dạng lectin đặc trưng có thể gắn với bề mặt tế bào RIPs nằm

trong số các độc tố tự nhiên hiệu lực mạnh, được biết đến nhiều nhất trong số này là ricin RIPs không cản trở chức năng của “bản thân” các ribosome

nhưng lại gây ra các hoạt động ức chế khác nhau về phía các ribosome của các

loài có họ hàng xa, kể cả các riboxom nấm Kiểu RIP I được tinh chế từ lúa

đại mạch ức chế sự sinh trưởng của nấm in vitro Tác dụng của nó càng được

tăng cường nhờ các enzym tổng hợp chitin và β-1,3-glucanase loại I Đặc tính

này của RIPs đã được Logemann và cộng sự sử dụng để tăng cường tính kháng

với nấm Rhizoctonia solani ở cây thuốc lá được chuyển gen Gen RIP I ở đại

mạch đã được đưa vào dưới sự kiểm soát của promoter wun 1 tách từ khoai tây

làm trung gian điều hoà giữa vết thương và tác nhân cảm ứng bệnh Nó giải mã trong biểu bì của lá, thân và rễ của thuốc lá biến nạp Broglie và cộng sự phát hiện thấy các thế hệ được biến nạp ban đầu RR 0 R và thế hệ con RR 1 R cây con thuốc lá biểu hiện mức độ hoạt động của chitinase mạnh hơn, cho các tỉ lệ

sống sót cao hơn và phát triển tốt hơn trong đất bị nhiễm nặng với Rhizoctonia solani so với các cây đối chứng [8] Ngược lại, các cây chuyển gen không

được bảo vệ kháng lại Pythium aphnidermatum - một tác nhân gây bệnh mà

thành tế bào của nó không chứa chitin

Một số lượng lớn các protein có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của các nấm in vitro cũng đã được nhận biết từ thực vật Trong số này có osmotin, một

protein không bào được tạo ra từ cây thuốc lá để phản ứng lại stress mặn và

các protein giàu cystein, cơ bản, trọng lượng phân tử thấp từ các nguồn gốc khác nhau Hơn nữa, các vi sinh vật như nấm Aspergillus ginanteus cũng tạo

ra các peptid kháng nấm như thế Chức năng của các protein này trong cây chuyển gen vẫn đang được kiểm tra

I.4.4 Một số thành tựu về cây chuyển gen

Những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên đã sử dụng vi khuẩn A tumefaciens

để đưa gen ADH của nấm men và gen kháng kanamycin vào cây thuốc lá [36]

Đến nay, rất nhiều loại cây trồng đã được chuyển thành công như khoai tây,

cà chua, cải bắp, hướng dương, dưa hấu, khoai lang [37][68] sử dụng những phương pháp phổ biến như thông qua A tumefaciens, xung điện, sử dụng hoá

chất (PEG) và bắn gen Các nhà nghiên cứu không dừng lại ở việc hoàn thiện

phương pháp và thực hiện chuyển thành công trên nhiều đối tượng cây trồng

mà còn đi sâu nghiên cứu tăng cường hiệu quả chuyển gen cũng như hiệu quả biểu hiện gen trong cây trồng chuyển gen

Trong lĩnh vực tạo giống cây trồng, chuyển gen đã và đang phát triển vượt bậc, được ứng dụng rất rộng rãi [37], diện tích đất canh tác trồng cây chuyển gen trên toàn cầu tập trung ở 5 quốc gia là Mỹ (55,33%), Achentina (19%), Brazil (10,44%), Canada (6,44%), và Trung Quốc (3,67%) [James C, 2005] Trong số các loại cây trồng chuyển gen được trồng phổ biến, đậu tương chuyển gen là cây chiếm tỷ lệ cao nhất (46%) trên tổng diện tích 72 triệu hecta gieo trồng của loại cây trồng này, 14% trên tổng số 140 triệu hecta diện tích đất trồng ngô, 20% trên tổng số 34 triệu hecta ở bông và 11% trên tổng số

25 triệu hecta ở cây cải dầu [38] Đến năm 2005, đậu tương là cây trồng chuyển gen có diện tích lớn nhất chiếm 60,44% diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu Ngô đứng thứ 2 với 23,56% và bông chiếm 10,89% [33] (bảng

12, 13 - phụ lục 1)

I.4.5 Những yếu tố tích cực và hạn chế của cây trồng biến đổi gen

Những đóng góp của cây trồng biến đổi gen cho thế giới là rất đáng kể: (1) cung cấp nguồn lương thực cần thiết trong tương lai; (2) tăng cường chất lượng thực phẩm; (3) loại trừ các thực phẩm có mang tính độc hoặc chất gây

dị ứng; (4) tạo cây trồng sinh năng lượng, sau đó nuôi cấy thu sinh khối để chuyển thành năng lượng sinh học (biodiesel và bioethanol) có thể thay thế

được các nhiên liệu hoá thạch và dầu khoáng; (5) sản xuất nhiều loại hoá chất, trong đó chủ yếu là các loại dầu chiết từ hạt lanh, cải dầu và hướng dương; (6) tạo ra các chất hoá học đặc biệt như các dược phẩm, mỹ phẩm, thuốc nhuộm; (7) sản xuất các hợp chất sinh học như sợi sinh học tổng hợp; (8) tăng khả năng chăm sóc sức khoẻ; (9) sản xuất dược phẩm chống các căn bệnh đặc biệt; (10) tạo ra các chất hoá học ít gây ô nhiễm môi trường và dễ kiểm soát; (11) giảm ô nhiễm môi trường do thuốc trừ sâu; (12) đem lại những lợi ích to lớn cho môi trường, trong đó tạo ra các khả năng mới trong việc giám sát và quản ly ảnh hưởng môi trường [59][36][58].

Bên cạnh những tiềm năng to lớn mà cây trồng biến đổi gen mang lai, sản phẩm công nghệ này cũng tạo ra một số mối lo ngại về nguy cơ rủi ro đến sức khỏe con người và môi trường cũng như các vấn đề kinh tế xã hội khác [9] Các tranh luận về cây trồng chuyển gen và sản phẩm của chúng thường xoay quanh các nguy cơ rủi ro cho sức khỏe con người và môi trường

I.4.6 Một số nghiên cứu chuyển gen vào cây sắn

Đóng vai trò quan trọng trong nên nông nghiệp và công nghiệp nên việc cải tạo và đưa ra những giống sắn mới là việc làm cấp thiết Tuy nhiên ở sắn, cả mô sơ cấp và thứ cấp phát triển từ một nhóm tế bào thường nằm gần hoặc ở tại các mô có mạch [71][62] nên nguồn gốc đa tế bào của phôi vô tính sắn làm cho chúng ít thích hợp cho chuyển gen

Các gen chỉ thị có sự biểu hiện cao khi chuyển chúng vào các cụm phôi sắn bằng súng bắn gen Tuy nhiên chỉ những phôi ở khu vực chuyển gen mới có thể tái sinh và thu được các callus mang gen chuyển Chúng sẽ bị mất khả năng tạo phôi khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh [24].Phôi thứ cấp từ mẫu lá mầm của giống sắn M Peru 183, sau khi đồng nuôi cấy với chủng Agrobacterium CIAT 1182 có mang gen GUS và gen kháng

phosphinotricin, chọn lọc trên môi trường có chứa 8 -32 mg/l Basta, các phôi thứ cấp giả định được chuyển gen có thể được tái sinh và phát triển thành cây

M Peru 1182 hoàn chỉnh Bằng các phân tích về sinh học phân tử đã phát hiện

sự có mặt của các gen chuyển trong 1 dòng từ 15 dòng kháng Basta được tái sinh [65][66] Các vectơ đã được cắt, sửa chữa có tiềm năng to lớn tiếp tục bổ xung cho phương pháp chuyển gen qua Agroacterium Việc sử dụng các lá

non sắn để tái sinh cây sau khi đã đồng nuôi cấy với Agrobacterium đã được

thông báo [22], nhưng cần kiểm tra lại ở mức độ phân tử

Một lựa chọn nhiều hứa hẹn nữa là sử dụng mô sẹo phôi xốp (FEC) Nó là

1 phần của quá trình tạo phôi vô tính được duy trì ở môi trường GD (Gres Shoff and Doy, 1974) có bổ sung picloram sẽ sản xuất một lượng lớn FEC [74] Những FEC mới phát triển từ những tế bào của cụm phôi hình cầu và là nguồn gốc của những tế bào đơn thích hợp cho chuyển gen

Gonzalez và cs 1998; Raemarkers và cs 2000 đã nghiên cứu sau khi biến nạp, đồng nuôi cấy mẫu sắn 3-4 ngày với chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA

4404 có chứa gen kháng hygromycin (hpt) và gen uidA, mô được cấy trên môi

trường không chọn lọc 3 ngày và sau đó 75 ngày trên môi trường chọn lọc lỏng có chứa 12mg/l picloram và 50 mg/l hygromcin Các tế bào huyền phù

được chuyển sang môi trường cứng có chứa 1mg/l NAA và 25 mg/l hygromycin (4 -8 tuần) và chồi tạo thành trên môi trường có chứa 0,4 mg/l BAP không có hygromycin sau 4 tuần nuôi cấy Qua kết quả phân tích ở mức

độ phân tử đã thu được 12 dòng tái sinh mang gen chuyển [32]

So sánh với việc tái sinh qua nảy mầm của phôi từ các tế bào huyền phù, việc tái sinh thông qua sự phát sinh cơ quan nhanh hơn, đòi ít thời gian nuôi cấy Việc phát sinh chồi thông qua phát sinh cơ quan từ các tế bào ở hoặc gần mép cắt của các mẫu cây lá mầm lá rất thích hợp cho việc chuyển gen thông qua Agrobacterium [45][47][56]

Việc chọn các chủng vi khuẩn, tiền kích hoạt chúng bằng acetosyringone, thời gian đồng nuôi cấy, giai đoạn phát triển của mẫu có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển và hệ số tái sinh

Các nhà khoa học đã chuyển thành công một số gen vào cây sắn bằng nhiều phương pháp trực tiếp và gián tiếp, tạo ra những giống sắn có năng suất, chất lượng cao Có thể kể ra ở đây một số nghiên cứu như: Luong và cộng sự (1995) dùng phương pháp xung điện để chuyển plasmid UidA gen mang pDE

vào phôi tế bào soma [48], Li và cộng sự đã sử dựng Agrobacterium chứa

plasmid pTOK233 mang gen uidAint, gen kháng hygromycine hpt và gen

chọn lọc nptII và plasmid pBinGusInt mang gen uidAint và gen chọn lọc nptII

chuyển thành công vào cây sắn năm 1996 [45] Cũng trong năm 1996, Schopke và cộng sự đã chuyển thành công plasmid pILTAB313 mang gen

uidA và gen chọn lọc nptII kháng poramomycin bằng súng bắn gen [53] Các

nghiên cứu chuyển gen vào cây sắn bằng súng bắn gen tiếp tục thành công với Raemakers và cộng sự năm1996, Schopke và cộng sự năm 1997, Munykiwa

và cộng sự năm 1998 Arias-Garzon (1997), White và cs (1998) đã chuyển thành công gen mã hóa cho hydroxynitrile lyase (HNL) giúp giảm hàm lượng

cyanogenic glycosides trong sắn [21][75]; Uzoma Enyinnaya Ihemere B.S, M.S (2003), đã chuyển thành công hai gen glgC của vi khuẩn và gen SPS của

ngô vào sắn; Sarria và cs (2000, 2004) đã chuyển gen nptII làm mất độc tính

kháng sinh của kanamycine, gen bar kháng thuốc diệt cỏ [65][66]

I.4.7 Kỹ thuật PCR - ứng dụng kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR-Polymerase Chain Reaction)) do Karl

Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Thực chất đây là phương pháp tạo dòng DNA in vitro không cần sự hiện diện của tế bào, cho phép nhân nhanh 1

vùng DNA đặc trưng nằm giữa 2 vùng trình tự DNA đã biết Trong phản ứng PCR cần có: đoạn khuôn, đoạn mồi, enzym polymerase chịu nhiệt, các

nucleotide và dung dịch đệm

PC Đoạn mồi gắn vào khuôn DNA sợi đơn theo nguyên tắc bổ trợ giữa các bazơ (3) ở 72P

0 P

C - 75P

0

PC, enzym Taq polymerase hoạt động, quá trình tổng hợp DNA diễn ra trên những đoạn có gán mồi vào ở nhiệt độ này,Taq polymerase hoạt động chính xác với vận tốc cao Thời gian của giai

đoạn này phụ thuộc vào độ dài của đoạn DNA cần tổng hợp

Đó là một chu kỳ của phản ứng PCR thông thường được lặp lại từ 20-30 lần Sau môi chu kỳ, giai đoạn 72P

0

PC được tăng thêm từ 1-2 phút vì lượng primer giảm dần khi số chu kỳ tăng lên Hơn nữa enzym polymerase hoạt

động kém dần do tác động của nhiệt độ Và ở vòng cuối cùng, giai đoạn này

được tăng thêm vài phút để tất cả các mạch DNA nếu bị tổng hợp thiếu hụt sẽ

được tổng hợp hoàn toàn

Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần thời gian ngắn (khoảng vài giờ)

đã cho một số lượng lớn DNA mong muốn Phương pháp này được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau trong đó được dùng để xác định sự có mặt của gen trong tế bào với độ chính xác cao

Chương II

Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

II.1 Vật liệu Nghiên cứu

II.1.1 Thực vật

Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu là các mảnh lá và

đoạn thân từ 4 giống sắn KM60 KM94, KM140

1 KM60: giống sắn nhập nội từ Rayong 60 của Thái Lan vào Việt Nam từ

những năm 1990 thông qua hợp tác với CIAT (trung tâm giống nông nghiệp nhiệt đới quốc tế tại Thái Lan), được công nhận là giống sắn tiến bộ năm

1994, đặt tên là KM60 - tức khoai mỳ 60 và đang phát triển ở Việt Nam

2 KM94: giống sắn nhâp nội từ Thái Lan có tên Kasetsart 50 (ku 50), là con

lai chọn lọc từ tổ hợp lai rayong1 x rayong3 (RR 1 R x RR 3 R) được tiến sĩ Kazuo Kaoano chuyên gia CIAT trực tiếp mang vào Việt Nam năm 1995, được bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận là giống tiến bộ mang tên KM94 Năm 1994

được công nhận là giống khu vực hóa (tạm thời) KM94 là giống sắn đắng, có năng suất củ tươi và tỷ lệ tinh bột cao

3 KM140: là giống sắn đắng nhập nội từ thời chiến tranh, chủ yếu ở miền

Nam, thân lá đều xanh, củ nhiều bột nhưng đắng vì tỷ lệ HCN cao Vỏ củ màu vàng nhạt, ruột dễ bị hoá nâu khi chế biến chậm, nhân dân không thể sử dụng tươi được, chỉ chế biến khô và ủ cho chăn nuôi Hiện nay giống đang trồng phổ biến ở nhiều vùng trong cả nước

Tất cả các giống này đều được kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA để chọn

ra những cây mẹ sạch bệnh, đưa vào nuôi cấy trong điều kiện in vitro Các

giống sắn được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên thực vật - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

II.1.2 Chủng vi khuẩn và vectơ biến nạp

Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 có chứa plasmid pCAMBIA

1300 mang gen kháng nấm Chitinase-Glucanase được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nông nghiệp quốc gia Pháp (INRA)

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA 1300

có chứa gen chitinase-glucanase

II.1.3 Hoá chất và thiết bị

Hóa chất

Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm nuôi cấy mô gồm các chất khoáng đa lượng,

vi lượng, các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin của Đức, Trung Quốc và Việt Nam

Thiết bị

Máy lắc định ôn của Daiki Sciences Co., Lmt.; kính hiển vi soi nổi (Leica CLS

150 XE); máy li tâm; máy quang phổ; máy PCR (Mastercycerlar 5330); thiết

bị điện di; tủ nuôi cấy vi sinh vật; tủ ổn nhiệt; tủ lạnh sâu; buồng cấy vô trùng

và một số thiết bị khác thuộc phòng thí nghiệm Viện Di truyền Nông nghiệp

II.2 Nội dung nghiên cứu

I.2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh của cây sắn

II.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh hình thái

của mô nuôi cấy

II.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh hình thái của

mô nuôi cấy

II.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến khả năng phát sinh hình thái

của mô nuôi cấy

phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

hình thái mô nuôi cấy

chồi của mô nuôi cấy

II.2.2 Thí nghiệm trong và sau chuyển gen vào cây sắn

II.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến khả năng sống và

tái sinh của mô lá cây sắn

II.2.2.2 Nuôi cấy tái sinh cây sắn chuyển gen

II.2.3 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển

II.3 Phương pháp nghiên cứu

II.3.1 Các loại môi trường

• Môi trường nuôi cấy in vitro

+ Môi trường cơ bản Murashige and Skoog (MS) 1962

+ Các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin

+ Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là 5,7

+ Khối lượng môi trường: 5ml/ống nghiệm, 15ml/đĩa petri, 40ml/bình trụ

+ Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121P

0

PC trong 20 phút

Điều kiện nuôi cấy:

- Chế độ chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối

- Cường độ chiếu sáng: 2.000 lux

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy 24 ± 2P

0

PC

• Môi trường nuôi khuẩn

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB:10g/l tryptone + 5g/l yeast extract + 10g/l NaCl + 15g/l Bactor agar, pH 7

- Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: sử dụng môi trường tạo mô sẹo (không agar) bổ sung 250mg/l acetosyringone

II.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được bố trí

3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 10 bình hoặc 30 cây

II.3.3 Phương pháp vào mẫu

Hom thân sắn được trồng trong vườn ươm để phát triển thành các chồi con Các đoạn chồi con được khử trùng bằng cồn 70P

0

P trong 1 phút và natri hypocloride 10% trong 15 phút hoặc hydrogen peroxide (HR 2 ROR 2 R) 15% trong

10 phút Rửa lại 3 lần bằng nước cất khử trùng Cắt các đoạn thân có nách lá cấy lên môi trường MS (1962) không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng

II.3.4 Chuẩn bị mẫu ở nội dung xây dựng hệ thống tái sinh của cây sắn

+ Cây sắn in vitro được lấy ra khỏi bình nuôi cấy, cắt phần cuống lá để

tách riêng lá

+ Mẫu lá được cắt theo kích thước 0,5 x 0,5cm

+ Đoạn thân có mắt ngủ được cắt thành từng đốt, dài từ 0,5 - 0,7cm Cắt lát mỏng đoạn thân theo chiều dọc

+ Các thao tác được thực hiện nhẹ nhàng, nhanh, tránh dập nát

II.3.5 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

UNuôi cấy Agrobacterium tumefaciens

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 pCAMBIA

1300 được bảo quản trong glyxerol 15% hay trong đĩa thạch được

nuôi cấy phục hồi trên đĩa môi trường LB thạch có bổ sung 50mg/l rifamycine và 50mg/l hygromycine, nuôi ở 25P

0

PC, thời gian 2 ngày Sau đó cấy chuyển mẫu vi khuẩn sang 50ml môi trường LB lỏng có thành phần như trên Nuôi lắc 180vòng/phút ở 28P

0 P

C trong 2 ngày để tạo dịch huyển phù vi khuẩn

- Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600nm: 0,5

UChuyển gen kháng nấm vào sắnU (theo quy trình của Datta, 1997) [70]

- Ly tâm dung dịch vi khuẩn ở tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 10 phút Bỏ lớp dịch bên trên, rửa cặn bằng 20ml dung dịch MgSOR 4 R(10mM) Rửa lại một lần nữa bằng chính dung dịch MgSOR 4-

o P

C, 3- 4 ngày trong điều kiện tối

UTái sinh cây sắn chuyển genU

- Rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng rồi đặt mẫu 10 phút trong dung dịch chứa 250ml kháng sinh cefotaxime

- Chuyển mẫu sang môi trường chọn lọc tạo mô sẹo có bổ sung 250mg/l cefotaxime và 50mg/l hyromycine

- Cấy chuyển các mô sống sót có khả năng phát sinh phôi từ môi trường chọn lọc sang tổ hợp môi trường tạo phôi và tái sinh chồi bổ sung 250mg/l cefotaxime và 50mg/l hygromycin

- Cấy chuyển chồi sang môi trường tạo rễ để tạo cây hoàn chỉnh

II.3.6 Kiểm tra sự có mặt tạm thời của gen chuyển

Theo dõi khả năng tái sinh của các mẫu sau chuyển gen trên môi trường chọn lọc có các kháng sinh tương ứng

II.3.7 Phương pháp tách chiết DNA

Hóa chất: + Đệm chiết: 100mM Tris-HCl (pH=8)

Dựa theo phương pháp của Huygo và cộng sự, 1995 (có cải tiến)

1 Cắt phần non của mẫu lá sắn cho vào ống eppendorf, đóng nắp, thả vào bình nitơ lỏng để trong 1 phút lấy ra nghiền thành dạng bột mịn

2 Cho 800àl dung dịch đệm chiết và 30àl SDS

3 Trộn đều và ủ ở 65P

0

PC trong 30 phút

4 Lắc ngược ống và làm nguội hỗn dịch xuống nhiệt độ phòng

5 Bổ sung 800àl dung dịch Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), ly tâm hỗn dịch với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4P

0

PC

6 Lấy dịch trong nằm ở pha trên cho vào ống mới

7 Bổ sung 800àl dung dịch phenol : Chloroform : Isolamyl alcohol

(25:24:1)

8 Trộn đều và ly tâm hỗn dịch ở 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4P

0

PC

9 Hút dịch nổi nằm ở phía trên cho sang ống eppendorf mới

10 Cho 3àl Rnase (10mg/l) và để vào tủ 37P

0 P

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho cặp mồi CHIf/CHIr như sau:

• Điện di sản phẩm PCR

Các phản ứng sau khi kết thúc được lấy ra kiểm tra và phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% và được nhuộm bằng Ethidium bromide, tiến hành như sau:

Bước 1: Chuẩn bị đổ gel agarose 0,8% theo công thức:

- Agarose: 0,8g; - TAE1X: 100ml

Dung dịch này được đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến 50P

0

PC, bổ sung 7àl Ethidium bromide (10mg/ml) lắc đều và đổ vào khay gel đã cài lược sẵn

Bước 2: Sản phẩm PCR sau khi lấy ra khỏi máy và được tra vào trong giếng theo công thức sau: - Sản phẩm PCR: 9àl

trên bảng gel để lại một giếng để nạp Marker

Bước 3: Sau khi tra xong mẫu, bản gel được điện di trong dung dịch đệm TAE1X, ở thông số: - Điện thế: 130V

Bước 4: Điện di xong, soi bản gel trên máy soi gel bằng tia UV

A Các thí nghiệm xây dựng hệ thống tái sinh cây sắn in vitro

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh hình

thái của mô nuôi cấy (mảnh lá và lát cắt đoạn thân) Nuôi trong tối 2 tuần rồi

đưa ra nuôi trong điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh hình

thái của mô nuôi cấy (mảnh lá và lát cắt đoạn thân)

Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến khả năng phát sinh

hình thái của mô nuôi cấy (mảnh lá và lát cắt đoạn thân)

Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau: