Nghiên cứu công nghệ sản xuất Phytaza từ nấm mốc A Niger

Nghiên cứu công nghệ sản xuất Phytaza từ nấm mốc A Niger Nghiên cứu công nghệ sản xuất Phytaza từ nấm mốc A Niger Nghiên cứu công nghệ sản xuất Phytaza từ nấm mốc A Niger luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

Lª thiªn minh

hµ néi, 2006

Luận văn thạc sĩ khoa học

Ngành: Công nghệ sinh học Mã Số:

Lê thiên minh

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu

hà nội, 2006

1.1 Những nghiên cứu về axit phytic 4

1.1.1 Chức năng sinh lý của axit phytic 6

1.1.2 Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic 7

1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên 9

1.2 Những nghiên cứu về phytaza 10

1.2.1.Khái niệm về phytaza 10

1.2.2 Phân loại phytaza 11

1.2.3 Đặc điểm cấu tạo và tính chất của phytaza 11

1.2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của phytaza 11

1.2.3.2 Tính chất của phytaza 13

1.2.4 Nguồn nguyên liệu để thu phytaza 17

1.2.4.1 Phytaza từ nguồn thực vật 17

1.2.4.2 Phytaza từ nguồn động vật 17

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp phytaza 21

1.2.5.1 Các nhân tố vật lý 21

1.2.5.2 ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng 23

1.2.5.3 ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 25

1.2.6 Thu hồi và tạo chế phẩm phytaza 26

1.2.7 ứng dụng của phytaza 28

1.2.7.1 ứng dụng trong nông nghiệp 29

1.2.7.2 ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy 30

1.2.7.3 Điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate ứng dụng trong y học 30

1.3 Gen phyA và một số gen khác mã hóa cho phytaza từ vi sinh vật 31

1.3.1 Gen phyA mã hóa cho phytaza của Aspergillus 31

1.3.2 Một số gen khác mã hóa cho phytaza trong tự nhiên 32

1.3.2.1 Gen phyC mã hóa phytaza của Bacillus 32

2.1 Vật liệu 34

2.1.1 Địa điểm và đối tượng nghiên cứu 34

2.1.2 Hoá chất 34

2.1.3 Môi trường 36

2.1.3.1 Môi trường tuyển chọn các chủng A niger sinh phytaza cao 36

2.1.3.2 Môi trường lên men sinh tổng hợp phytaza 36

2.1.3.3 Môi trường dùng cho các kỹ thuật sinh học phân tử 37

2.1.4 Thiết bị 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ phytaza 37

2.2.1.1 Hoá chất và dung dịch enzym 38

2.2.1.2 Cách tiến hành 40

2.2.2 Phương pháp lên men chìm sục khí qui mô 100 lít/mẻ cho sản xuất phytaza 41

2.2.2.1 Quá trình khử trùng toàn bộ hệ thống lên men 41

2.2.2.2 Quá trình điều chế môi trường ở quy mô 100 lít/mẻ 41

2.2.2.3 Quá trình tiếp giống 42

2.2.2.4 Điều khiển oxy hòa tan, nhiệt độ và pH trong quá trình lên men 42

2.2.3 Nghiên cứu thu hồi enzym bằng muối trung tính ((NHR4R)R2RSOR4R ) 42

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 43

2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng pH lên đặc tính của enzym 43

2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên đặc tính enzym 44

2.3.7 Tách dòng và đọc trình tự gen PhyA từ các chủng A niger bằng kỹ thuật PCR 44

2 3.7.1 Tách chiết DNA hệ gen của nấm mốc 44

2.2.7.2 Định lượng DNA bằng quang phổ kế 45

2.2.7.3 Điện di kiểm tra DNA hệ gen trên gel agaroza 1% 46

2.2.7.4 Kỹ thuật PCR nhân bản gen phyA 47

vào E coli IVNαF’ 49

2.2.7.7 Tách chiết DNA plasmid từ E coli IVNαF’ 50

2.2.7.8 Xử lý DNA bằng enzym giới hạn EcoRI 51

2.2.7.9 Tách và tinh sạch DNA plasmid lượng lớn 51

2.2.7.10 Xác định trình tự nucleotit của gen phyA 51

Chương 3 Kết quả và thảo luận 52

3.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao 52

3.1.1 Tuyển chọn sơ bộ bằng vòng phân giải natri-phytat 53

3.1.2 Hoạt độ phytaza sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc A niger 54

3.2 Nghiên cứu công nghệ lên men chủng A niger cho sinh tổng hợp phytaza 55

3.2.1 Lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao 55

Ký hiệu chủng 55

3.2.2 ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính phytaza của chủng A niger MP2 57

3.3.3 ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính phytaza của chủng A niger MP2 58

3.2.4 ảnh hưởng của độ oxy hoà tan đến hoạt độ phytaza của chủng A niger MP2 60

3.2.5 Nghiên cứu thu hồi phytaza từ A niger MP2 62

3.2.5.1 Khảo sát nồng độ (NHR4R)R2RSOR4R kết tủa phytaza từ A niger MP2 62

3.2.5.2 Kiểm tra độ tinh sạch phytaza sau kết tủa 63

3.3 Xác định tính chất của phytaza từ chủng A niger MP2 64

3.3.1 Xác định pH tối ưu của phytaza sinh tổng hợp từ chủng A niger MP2 64

3.3.2 Khả năng chịu nhiệt của phytaza từ chủng A.niger MP2 65

3.3.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm phytaza 66

3.4.2 Nhân bản gen phyA bằng kỹ thuật PCR 70

3.4.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRP  P 2.1 71

3.4.4 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli IVNαF’ 72

3.4.5 Tách chiết DNA plasmid từ E.coli IVNαF’ 73

3.4.6 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI 74

3.4.7 Xác định trình tự đoạn DNA đặc hiệu của gen phyA từ chủng A niger MP2 75

Chương 4 kết luận 79

Tài liệu tham khảo 80

Đặt vấn đề

Ngũ cốc và cây họ đậu chiếm hơn 90% diện tích trồng trọt trên thế giới Vì vậy nó đóng vai trò là nguồn cung cấp dinh dưỡng chính cho người và vật nuôi Ngoài ra nó còn cung cấp các chất khoáng đa lượng, vi lượng Một trong số những chất khoáng đa lượng rất cần cho sự phát triển của người và vật nuôi là photpho, đặc biệt là sự phát triển của xương và các quá trình trao đổi chất Tuy nhiên, photpho có chứa trong các nguyên liệu hạt này có tới 50- 80% nằm dưới dạng phân tử phytat hoặc axit phytic Photpho tồn tại dưới dạng này rất khó tiêu hoá đối với các loài động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn.Hơn nữa, phytat và axit phytic trong cơ thể ngoài điểm bất lợi là rất khó hấp thụ, chúng còn ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại và các protein với các axit không

no, dẫn tới làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng Ngoài ra, axit phytic không phân huỷ được thải ra ngoài môi trường theo phân của động vật còn làm nghèo đất và gây ô nhiễm môi trường

Chính vì vậy, để tận dụng nguồn photpho có sẵn trong thành phần của các nguyên liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải ra ngoài môi trường thì việc chuyển các hợp chất photpho ở dạng khó phân giải này thành các chất đơn giản và dễ phân giải hơn là rất quan trọng Để đạt được điều đó, người ta đã sử dụng phytaza để thuỷ phân axit phytic Phytaza (myo - inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) là

một enzym có khả năng xúc tác phản ứng thuỷ phân axit phytic (và các muối của axit này), giải phóng ra một hoặc nhiều gốc phosphat vô cơ tự do và myo -

inositol phân tử thấp, là các dạng chất dễ tiêu hoá hơn các hợp chất ban đầu Phytaza cũng như tất cả các enzym khác, đều có sẵn trong mô, cơ quan của

động, thực vật và tế bào vi sinh vật Tuy nhiên, khi nghiên cứu để tách và sản xuất phytaza, đặc biệt là sản xuất với quy mô công nghiệp thì nguồn vi sinh

vật là nguồn để sản xuất enzym có ưu thế hơn cả Có nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp phytaza như Aspergillus niger, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis nato, Escherrichia coli

Phytaza được phát hiện đầu tiên vào năm 1907, đến năm 1994 thì những ứng dụng của phytaza bắt đầu được đẩy mạnh Người ta đã sản xuất enzym phytaza dưới dạng các chế phẩm dạng bột, hoặc dạng nước dùng bổ sung vào thức ăn gia súc và gia cầm, nhằm tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi và giảm chi phí giá thành trong chăn nuôi Cuối thế kỷ XX, phytazađược coi như chất phụ gia bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Lợi nhuận thu được hàng năm vào khoảng 500 triệu USD và còn có xu hướng tăng hơn nữa Vì những tính chất rất ưu việt của phytaza, nên số công trình nghiên cứu về enzym này hàng năm tăng lên rõ rệt Trong những năm gần đây, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao cũng như việc nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp cho năng suất cao và hoàn thiện công nghệ sản xuất đã được các nhà khoa học của rất nhiều nước trên thế giới như

Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Pháp, Đức đặc biệt quan tâm

ở nước ta, việc nghiên cứu về phytaza còn rất mới mẻ Trong những năm qua, Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã phân lập được một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng sinh phytaza cao từ Aspergillus niger, aspergillus ficuum và một số loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus Tác giả bước

đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm phytaza từ các chủng tự nhiên

đã phân lập Các tác giả Dương Duy Đồng, Nguyễn Thị Hoài Trâm và cộng

sự đã thông báo về khả năng ứng dụng chế phẩm phytaza Ronozyme P do Thuỵ sĩ sản xuất vào thức ăn chăn nuôi Kết quả cho thấy phytaza làm tăng khả năng tiêu thụ thức ăn của lợn và làm tăng tỷ lệ đẻ trứng lên 2%, tăng năng suất trứng sau 12 tuần là 1,86-1,99 quả/gà mái [1,4] Bên cạnh đó còn có một

số đơn vị nghiên cứu về phytaza như là Bộ môn Công nghệ sinh học trường

Đại học Sư phạm đang tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh phytaza từ vùng ngập mặt Các tác giả Trần thị Tuyết và CS đã sử dụng A niger NRRI 365 để sản xuất phytaza bằng phương pháp lên men bề mặt

Để góp phần vào việc ứng dụng phytaza trong thức ăn chăn nuôi, việc tuyển chọn chủng giống cho năng suất cao và nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza ở quy mô lớn là rất quan trọng Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza từ nấm mốc A

niger

Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm được các yếu tố công nghệ thích hợp cho lên men và thu hồi phytaza từ nấm mốc A.niger MP2

- Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa phytaza A từ chủng A.nigerMP2,

làm cơ sở cho việc tạo chủng tái tổ hợp cho sản lượng phytaza cao

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thành phần môi trường, thời gian lên men cho sinh tổng hợp phytaza cao nhất

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp phytaza

- Nghiên cứu quy trình thu hồi phytaza

- Xác định tính chất phytaza sinh ra từ nấm mốc A.nigerMP2

- Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa phytaza A từ nấm mốc A niger

có hoạt tính phytaza cao

Chương 1 Tổng quan về phytaza 1.1 Những nghiên cứu về axit phytic

Axit phytic là một axit hữu cơ trong phân tử có chứa các gốc phosphat

Nó có mặt chủ yếu trong hạt của các loại ngũ cốc, đậu đỗ và hạt có dầu Người ta

đã xác định được rằng axit phytic giữ vai trò nhất định và có những tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng của các loại hạt trên

Axit phytic có công thức phân tử CR 6 RHR 18 ROR 24 RPR 6 R và phân tử lượng là 660,04 Danh pháp quốc tế của axit phytic được gọi là myo-inositol 1,2,3,4,5,6

– hexakisdihydrogen phosphate Thực tế, axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại hoá trị I, II (thường là Kali- Magiê- Canxi) Các muối này được gọi là phytat và chúng được xem như là kho dự trữ photpho lớn trong các hạt thực vật

Hình 1.1: Cấu trúc axit phytic - dưới dạng muối phytate

Có nhiều nghiên cứu về mô hình cấu trúc phân tử của axit phytic nhưng các nghiên cứu này lại đưa đến những kết luận rất khác nhau Trong số các nghiên cứu đó có hai nghiên cứu tiêu biểu của hai nhóm chuyên gia khác nhau

được biết đến nhiều hơn cả Đó là nghiên cứu của Johnson bằng phương pháp cộng hưởng điện từ hạt nhân P

bằng phương pháp nhiễu xạ tia X [7] Tuy nhiên hai nhóm nghiên cứu này lại

đưa ra hai kết luận trái ngược nhau

Theo Johnson và Tate thì trong cấu trúc của phân tử axit phytic có một gốc phosphat ở vị trí số 2 (gốc phosphat gắn với nguyên tử C số 2) nằm theo hướng trục thẳng đứng còn các gốc phosphat ở vị trí khác thì có hướng nghiêng một góc so với phương thẳng đứng Ngược lại, kết luận của Blank lại cho rằng các gốc phosphat 1,3,4,5 và 6 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn gốc phosphat nằm ở vị trí số 2 lại nghiêng theo góc 1/4

Tuy nhiên, kết luận về cấu trúc phân tử của axit phytic theo phương pháp Johnson và Tate được nhiều sự tán đồng hơn Mô hình theo kết luận này

được giá trị của hằng số axit pKa khi các gốc phosphat của phân tử axit phytic

được tách ra như sau: trong môi trường axit mạnh mà pKa = 1,1- 2,1 toàn bộ 6 gốc phosphat của phân tử axit phytic đều bị tách ra; trong môi trường axit yếu hơn mà pKa = 5,7 thì chỉ có một gốc phosphat bị tách ra; trong môi trường axit yếu mà pKa = 6,8- 7,6 thì có 2 gốc phosphat bị tách ra; còn khi trong môi trường axit rất yếu, pKa = 10- 12 sẽ có 3 gốc phosphat bị tách ra Điều này cho thấy, axit phytic có nhiều khả năng hình thành hợp chất với các ion dương

đa hoá trị và các protein trong cơ thể vì chúng có rất nhiều khả năng tồn tại ở các dạng phân tử mang điện tích âm trong một dải pH rộng

1.1.1 Chức năng sinh lý của axit phytic

Axit phytic được tìm thấy nhiều trong các hạt thực vật, đặc biệt là hạt các loại ngũ cốc và hạt các loại đậu đỗ Vì trong thành phần cấu tạo nên phân

tử axit phytic có chứa một lượng phospho tương đối lớn nên axit phytic và các muối của chúng trong các hạt thực vật là một nguồn dự trữ phospho khá dồi dào có thể tận dụng nhằm cung cấp khoáng chất cho cơ thể

Axit phytic còn là một nguồn dự trữ năng lượng, nguồn myo-inositol (thành phần cấu tạo nền vỏ ngoài của thành tế bào) tương đối lớn

Axit phytic trong các hạt thực vật có những ảnh hưởng nhất định đến

đặc tính sinh lý của hạt Nó tác động đến trạng thái ngủ nghỉ của hạt do nó chống lại sự oxy hoá tự nhiên trong quá trình ngủ nghỉ (chống lại sự hô hấp) của các hạt thực vật, vì vậy làm chậm sự phát triển và có thể làm mất khả năng nảy mầm của các hạt này

Đối với động vật, axit phytic cũng có những vai trò tích cực nhất định Trong những vai trò đã được biết đến như là nguồn cung cấp phospho và myo- inositol thì nó còn được coi như là một tác nhân chống ung thư đường ruột và ung thư vú ở động vật Sự có mặt của axit phytic không tiêu hoá trong đường ruột có thể bảo vệ cơ thể nhờ khả năng chống lại sự phát triển của các khối u ở trong ruột

Vào cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90 người ta đã chứng minh được vai trò gián tiếp của inositol phosphat trong quá trình vận chuyển vật chất trong tế bào, đặc biệt là vai trò của inositol - triphosphate Chúng là dấu hiệu của sự di truyền tính trạng và có liên quan rất lớn đến sự biến đổi chức năng của tế bào

đối với cả tế bào động vật và thực vật

Axit phytic còn có thể có một số chức năng khác như: kìm hãm sự ăn mòn kim loại, loại bỏ rỉ sắt, thêm vào thành phần mỡ bôi trơn Ngoài ra nó còn sử dụng trong thực phẩm và y học, làm tăng tác nhân tương phản tia X, làm giảm sự bài tiết của dạ dày để xử lý viêm dạ dày, ruột kết, loét hành tá tràng, tiêu chảy Axit phytic còn được sử dụng như thuốc giải độc cho sự nhiễm độc kim loại, sử dụng trong phòng ngừa và giảm bớt sự lắng cặn canxi, làm giảm nồng độ canxi trong máu qua đó kiểm soát được bệnh sỏi thận Nó còn có tác dụng ngăn ngừa sự mất nước khi tập luyện

Ngoài những tác động sinh lý nêu trên, người ta dự đoán rằng axit phytic còn có thể có những chức năng chưa biết khác

1.1.2 Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic

Một đặc tính bất lợi nổi bật nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật

là hiệu ứng kháng dinh dưỡng Hiệu ứng này tạo nên do nguyên nhân cấu trúc bất thường của axit phytic Khi phân tử axit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm phosphate của chúng sẽ mang tổng điện tích –12 Vì vậy, chúng có nhiều khả năng kết hợp với các ion dương hoá trị 1, 2, 3 hoặc hỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất không hoà tan, nên rất khó tiêu hoá Sự hình thành các hợp chất vô cơ không tan trong đường ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chất của cơ thể động vật Bởi vì axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như FeP

được đưa vào cơ thể động vật qua con đường thức ăn mà lẽ ra cơ thể động vật

có thể hấp thụ được, do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của nguồn thức ăn Vì vậy mà axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh dưỡng ở động vật, đặc biệt là các động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn

Với một số nguyên tố vi lượng, ví dụ như kẽm (Zn) thì giá trị dinh dưỡng của nó chịu ảnh hưởng rất lớn bởi axit phytic Một vài thí nghiệm đã cho thấy việc bổ sung dần dần axit phytic vào trong khẩu phần thức ăn của vật nuôi đã ảnh hưởng âm tính đến sự hấp thụ ZnP

2+

Pcủa cơ thể (cơ thể không hấp thụ được ZnP

2+

P) và tốc độ tăng trưởng trọng lượng của động vật thí nghiệm một cách rõ rệt

Axit phytic có khả năng kết hợp với protein tạo thành phức chất phytat- protein trong một khoảng pH rất rộng ở pH rất thấp, axit phytic mang điện tích âm lớn do sự phân ly của toàn bộ các gốc phosphat trong phân tử Trong

điều kiện này, axit phytic có thể làm hạn chế khả năng hoà tan của các protein bởi vì có sự liên kết ion giữa các gốc phosphat cơ bản với các gốc tự do của amino axit (L-lysin, histidin, arginin) Trong môi trường có tính axit, axit phytic liên kết chặt chẽ với các protein thực vật do đó điểm đẳng điện (pI) của các protein thực vật lúc này nằm trong khoảng pH = 4 - 5 ở khoảng pH = 6 -

8, cả axit phytic và protein thực vật đều mang điện tích âm Tuy nhiên, ở điều kiện này vẫn có thể hình thành phức chất giữa axit phytic và các protein Cơ chế xảy ra có thể là sự liên kết trực tiếp của axit phytic với proton ở các nhóm cuối cùng α-NHR 2 R và ε-NHR 2 R của gốc L-lysine tự do hoặc liên kết qua nhân tố trung gian là một cation đa hoá trị Cũng bởi liên kết với protein thực vật nên axit phytic làm giảm khả năng hoà tan và khả năng tiêu hoá của các protein này do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của chúng

Ngoài việc tạo phức chất với các khoáng chất và các protein, axit phytic còn tác động đến các enzym như trypsin, pepsin, α- amilaza, β- galactosidaza

và kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzym tiêu hoá quan trọng này

1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên

Axit phytic thường tồn tại ở dạng tiền khởi là muối của các ion kim loại

có một hay nhiều hoá trị hoặc có thể là hỗn hợp của chúng, chẳng hạn như hỗn hợp muối Kali – Magiê trong gạo, hỗn hợp Canxi – Magiê - Kali trong các hạt có dầu Các muối này thường tập trung ở một số vùng nhất định trong các hạt thực vật Axit phytic được tích luỹ dần trong hạt từ khi hạt non đến khi hạt trưởng thành trong suốt quá trình chín cùng với các chất dự trữ khác trong hạt như tinh bột, lipít Tuy nhiên, mức độ tập trung của axit phytic trong các hạt thực vật khác nhau là không giống nhau Ví dụ như trong các loại ngũ cốc, axit phytic được tích luỹ nhiều trong hạt phấn còn đối với các loại đậu thì axit phytic được tích luỹ nhiều trong các hạt tinh thể của chúng Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, ở cây một lá mầm như lúa, lúa mì thì trong nội nhũ và nhân của hạt hầu như không chứa phytat mà lượng phytat lại được tìm thấy chủ yếu trong phôi và trong lớp tế bào hạt phấn Ngược lại, ở cây hai lá mầm thì lượng phytat chủ yếu lại nằm trong thành phần nội nhũ (chiếm 99%) và chỉ có khoảng 1% là ở trong phôi (hay mầm) của hạt

Trong các nguyên liệu hạt dùng làm thức ăn gia súc, hàm lượng phospho ở dạng muối phytat không giống nhau Hàm lượng của phospho phytat trong một số nguyên liệu hạt dùng để sản xuất thức ăn gia súc được chỉ

ra ở bảng 1.1

Bảng 1.1: Hàm lượng phospho phytat trong một số nguyên liệu

thường dùng để sản xuất thức ăn gia súc

Nguyên liệu thường dùng sản xuất thức

1.2 Những nghiên cứu về phytaza

1.2.1.Khái niệm về phytaza

Phytaza là một enzym xúc tác cho phản ứng thuỷ phân axit phytic (myo

- inositol hexakisphosphate) thành các myo - inositol phosphate phân tử thấp hơn và các monophosphate vô cơ Trong một số trường hợp, phản ứng thuỷ phân có thể xảy ra hoàn toàn, giải phóng toàn bộ các gốc phosphat trong phân

tử axit phytic (hay phytat) và hình thành nên các myo - inositol tự do

Phytaza có tên gọi đầy đủ, theo quy ước quốc tế là: myo - inositol hexakisphosphat phosphohydrolase

Dạng phytat là một phức chất của phospho với các muối khoáng, protein và các enzym trong các hạt thực vật Các dạng chất này được coi là yếu tố phi dinh dưỡng Phytaza sẽ giải phóng photpho chứa trong các hạt ngũ cốc, hạt đậu và hạt có dầu bằng cách phá vỡ cấu trúc phytat đồng thời giải phóng các muối khoáng như Ca, Mg, các axit amin kết dính trong phân tử phytat

Hoạt độ phytaza của chế phẩm enzym đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải hợp chất phytat (myo- inositol hexakis phosphate) thành các myo- inositol phosphat phân tử thấp hơn và các gốc phosphat vô cơ Hoạt độ phytaza được biểu thị bằng số đơn vị hoạt độ trong 1ml (hay 1g) chế phẩm

1.2.2 Phân loại phytaza

Tổ chức định tên enzym thuộc Hội Hoá sinh Quốc tế đã phân loại phytaza thành 2 loại là 3- phytaza (EC 3.1.3.8) và 6- phytaza (EC 3.1.3.26) Cách định tên này được dựa trên cơ sở xuất phát từ nhóm phosphat đầu tiên

được giải phóng ra từ phân tử phytat khi enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân Người ta thấy rằng loại 3- phytaza (tức enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân hợp chất phytat và giải phóng ra gốc phosphat đầu tiên ở vị trí số 3) thường có ở vi sinh vật còn 6- phytaza (là enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân hợp chất phytat

và giải phóng ra gốc phosphat đầu tiên ở vị trí số 6) có mặt chủ yếu ở trong thực vật

Đã có rất nhiều phytaza được phát hiện, các gen mã hoá cho chúng đã

được tách dòng và xác định trình tự Tuy nhiên chỉ có một số phytaza đã được

đưa vào sản xuất rất phổ biến trên thế giới Trong đó có hai loại có triển vọng nhất hiện nay là phytaza A được tách từ nấm mốc đặc biệt là loài nấm A niger, A ficuum, và phytaza C được tách từ vi khuẩn B subtilis

1.2.3 Đặc điểm cấu tạo và tính chất của phytaza

1.2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của phytaza

Phytaza là một enzym vì vậy nó mang bản chất là một protein có hoạt tính xúc tác. Chúng là những phân tử có khối lượng từ 20000 đến 1000000

dalton Kích thước phân tử protein của phytaza sản sinh từ các nguồn khác nhau thì khác nhau Người ta đã tính toán và tiến hành thí nghiệm xác định khối lượng phân tử của protein phytaza thu được từ một số nguồn khác nhau

Bảng 1.2: Khối lượng phân tử của một số phytaza từ các nguồn khác nhau

Nguồn thu phytaza Khối lượng theo lý

thuyết (kDa) Khối lượng theo thực nghiệm

Ví dụ như phytaza tích luỹ trong các hạt ngô đang nảy mầm là enzym mà phân tử protein của chúng bao gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử bằng nhau là 38 kDa Còn phytaza được tách chiết từ ruột của một loài chuột lại

được cấu tạo bởi 2 tiểu đơn vị là 2 băng protein có khối lượng được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid (SDS- PAGE) ước tính

khoảng 70 và 90 kDa Tuy nhiên người ta đã xác định được rằng chỉ có tiểu

đơn vị có kích thước 90 kDa là có khả năng thuỷ phân axit phytic vì hai băng protein này biểu hiện cho hai loại enzym khác nhau tương ứng là phosphataza kiềm tính và phytaza Có một trường hợp đặc biệt là phytaza thu được từ chủng Klebsiella aerogenes lại gồm hai dạng khác nhau Dạng thứ nhất có thể

coi là dạng enzym gốc, có kích thước lớn một cách khác thường (700 kDa) Dạng thứ hai có thể là một mảnh nhỏ của enzym gốc, có khối lượng phân tử rất thấp chỉ khoảng 10- 13 kDa nhưng nó lại mang đầy đủ hoạt tính của một enzym

1.2.3.2 Tính chất của phytaza

* Cơ chế thuỷ phân axit phytic của phytaza

Khi thuỷ phân axit phytic hay phytat, phytaza có tác dụng cắt đứt các liên kết trong phân tử axit phytic, phytat Quá trình cắt đứt này xảy ra nhanh hay chậm và hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ phản ứng, pH phản ứng, lượng cơ chất và lượng enzym Ngoài ra, nó còn bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại

Sau quá trình thuỷ phân, nó sẽ giải phóng các gốc phosphat, các myo- inositol và các muối khoáng

* Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của phytaza

Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzym xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ nhưng chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định mà ở đó, phần tử enzym vẫn còn bền và chưa bị biến tính Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzym thường tương đối rộng Đối với phytaza, người ta đã nghiên cứu và cho thấy rằng chúng có thể hoạt động trong khoảng 45-75P

độ này rất rộng, từ 37- 77P

0

PC Tuy nhiên tR opt R của một enzym thường không cố

định mà có thể thay đổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng Khi nhiệt độ nằm ngoài khoảng thích nghi, enzym có thể bị vô hoạt tạm thời hoặc vô hoạt hoàn toàn Nhiệt độ mà enzym bị mất hoạt tính xúc tác hoàn toàn gọi là nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ này thường vào khoảng trên 70P

0

PC ở nhiệt độ tới hạn, enzym bị biến tính, ít có khả năng phục hồi lại hoạt độ Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0P

Bảng 1.3: Nhiệt độ tối ưu của phytaza thu từ một số nguồn khác nhau

Nguồn thu Phytaza Nhiệt độ tối ưu (P

* pH tối ưu cho sự hoạt động của phytaza

pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và độ bền của protein enzym Đa số các enzym bền trong giới hạn pH giữa 5 đến 9 Độ bền của enzym đối với pH môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất, coenzym và CaP

2+

P

pH tối ưu (pHR opt R) cho hoạt động của phytaza thu được từ các nguồn khác nhau rất khác nhau pH thích hợp cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 2,2 đến 8 Hầu hết các phytaza từ vi sinh vật thường có pHR opt R nằm trong khoảng hẹp 4,5- 5,6 Tuy nhiên phytaza từ nấm, đặc biệt là A fumigatus lại có khoảng pH tối

ưu rộng Có ít nhất 80% trong loài có hoạt độ cực đại ở pH giữa 4 và 7,3 Thường thì giá trị pHopt cuả một enzym cũng không cố định mà phụ thuộc vào

nhiều yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ Qua các nghiên cứu cho thấy, trong cùng một điều kiện nhất định thì pHR opt R của phytaza của các chủng được tìm thấy hầu như chỉ ở một giá trị nhất định, riêng có hai loại phytaza từ A niger NRRL3135 và Citrobacter freundii khác với các

phytaza khác ở điểm là chúng có hai giá trị pHR opt R khác nhau Phytaza từ một

số loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có pHR opt R vào khoảng pH trung tính 7,5) Còn phytaza thu được từ thực vật như hạt đậu và phấn hoa (hoa Huệ tây) lại có pHR opt R cao hơn (thường khoảng 8,0)

(6,5-Bảng 1.4: pH tối ưu của một số phytaza từ một số nguồn thu khác nhau

Nguồn thu Phytaza pH tối ưu

1.2.4 Nguồn nguyên liệu để thu phytaza

Phytaza cũng như các loại enzym khác chúng rất phổ biến trong tự nhiên, chúng có mặt trong mô động vật, thực vật và đặc biệt là vi sinh vật Tuỳ vào từng nguồn nguyên liệu mà người ta có thể thu được phytaza nội bào hay ngoại bào hoặc cả nội bào và ngoại bào ở cùng một nguồn nguyên liệu

1.2.4.1 Phytaza từ nguồn thực vật

Phytaza có mặt phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt chúng có thể tách chiết và tinh chế từ các loại ngũ cốc như lúa mì, ngô [24], lúa mạch, gạo… và các loại đậu như: đậu xanh, đậu ấn độ, đậu lùn, đậu trắng California [52] Hoạt tính phytaza cũng tìm thấy trong cây khoai tây, củ cải, rau diếp, rau Bina, phấn hoa Huệ tây (hoa loa kèn)

1.2.4.2 Phytaza từ nguồn động vật

ở động vật, phytaza đã được tìm thấy trong ruột và dạ dày của các loài

động vật có dạ dày đơn ngăn như lợn và gia cầm Tuy nhiên, các phytaza này gần như không có ý nghĩa gì đối với việc phân giải phytate có trong thức ăn

được đưa vào dạ dày của động vật Qua kiểm tra, người ta đã thấy rằng nhiều loại inositol polyphosphat phosphatase (MIPP) mang lại hoạt tính phytaza đều

có trong hệ thống đường ruột của tất cả các con chuột đem làm thí nghiệm nhưng chủ yếu tập trung nhiều ở thận và gan của loài động vật này [49,50] Các nhà khoa học đã tách dòng và biểu hiện được thành phần inositol polyphosphatate phosphatase mang hoạt tính ở gan của loài chuột trên Một loại enzym giống phytaza cũng đã được tìm thấy ở loài động vật nguyên sinh

Paramecium

1.2.4.3 Phytaza từ nguồn vi sinh vật

Chúng ta đã biết rằng enzym nói chung có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật Nguồn vi sinh vật lại

vô cùng phong phú và đa dạng nên phytaza cũng như các loại enzym khác có thể được sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau Người ta đã phát hiện

và tách được phytaza ở rất nhiều loài nấm mốc, đặc biệt là Aspergillus [44]

Cho đến nay đã phân lập được trên 200 loài vi sinh vật từ đất có khả năng sinh tổng hợp phytaza Phần lớn các vi sinh vật này cho sản phẩm phytaza nội bào, chỉ có khoảng 30 loài trong số đó là có khả năng sinh tổng hợp phytaza ngoại bào Tất cả các vi sinh vật sản sinh phytaza ngoại bào thuộc loại nấm mốc, có 28 loài thuộc chủng Aspergillus, chỉ có một loại từ Penecillium và một

loại từ Mucor Trong 28 loài Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp phytaza ngoại

bào đã phân lập được có 21 loài thuộc nhóm A niger [14,48] Các nghiên cứu còn

khẳng định rằng chủng A niger là nguồn thu phytaza ngoại bào tốt nhất [21]

Phytaza cũng được phát hiện ra ở nhiều loài vi khuẩn khác nhau như A aerogenes, Pseudomonas sp, B subtilis [19], E coli [51], Klebsiella sp, B subtilis natto Vi

khuẩn sinh tổng hợp phytaza ngoại bào chỉ có hai loài đó là Bacillus và Enterobacter Một số nấm men như Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida cũng có khả năng sinh phytaza

ưu điểm của phytaza từ nguồn vi sinh vật

Mặc dù phytaza rất phong phú trong sinh giới, có thể có nhiều nguồn thu khác nhau song việc tách và thu chúng, nhất là tách với quy mô công nghiệp lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành trong những trường hợp mà vật liệu

có chứa một lượng lớn enzym cũng như cho phép thu được enzym với hiệu suất cao Trong tay con người có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để tách chiết bất kỳ một loại enzym nào nói chung Đó là các mô và cơ quan

động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật Trong các nguồn nguyên liệu sinh học trên thì chỉ có nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầy hứa hẹn vì việc sử dụng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzym sẽ khắc phục được khó khăn và hạn chế so với hai nguồn nguyên

liệu trên [3] Thực tế đã chứng minh tính ưu việt và khả năng to lớn của các nguồn nguyên liệu vi sinh vật:

 Thứ nhất, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzym nói chung và phytaza nói riêng với một lượng lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới quy mô cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng

 Thứ hai, từ vi sinh vật không những chỉ thu được một số lượng lớn các enzym khác nhau, mà từ một số rất lớn các vi sinh vật đã biết luôn luôn

có thể tìm được những vi sinh vật có phức hệ enzym thích hợp hơn nhiều với điều kiện của sản xuất Vi sinh vật có thể đồng hoá bất kỳ chất nào trong thiên nhiên trong khi đó có rất nhiều chất mà động vật và thực vật không thể đồng hoá được

 Thứ ba, phytaza của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh (đặc biệt là phytaza từ nấm mốc), vượt xa hoạt tính phytaza từ nguồn động vật và thực vật

 Thứ tư, hoạt tính của phytaza và khả năng sinh tổng hợp phytaza của vi sinh vật càng cao khi gây những biến chủng Điều này cho phép ta có thể thu được lượng enzym lớn với hoạt tính và độ thuần khiết cao

 Thứ năm, vi sinh vật sinh sản với tốc độ nhanh chóng, lại có kích thước

và khối lượng nhỏ nhưng lại có tỷ lệ enzym trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất chế phẩm enzym khá dễ dàng, thao tác thuận tiện, hiệu suất thu hồi cao Trong một thời gian ngắn, với một quy mô nhỏ có thể sản xuất một lượng lớn chế phẩm enzym

 Cuối cùng, thức ăn để nuôi vi sinh vật dễ kiếm, rẻ tiền nên sẽ giảm chi phí trong quá trình sản xuất, đem lại hiệu quả kinh tế lớn

Chính vì những lý do trên mà việc đề xướng và hoàn chỉnh phương pháp sản xuất phytaza từ vi sinh vật có một ý nghĩa rất lớn Hiện nay, trên thế giới

đã nghiên cứu sản xuất trên quy mô công nghiệp phytaza ở dạng đơn chất cũng như chế phẩm kỹ thuật với mức độ tinh khiết khác nhau, thường từ nấm

mèc vµ vi khuÈn [19,21,26] Mét sè phytaza thu ë c¸c nguån kh¸c nhau ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 1.5

B¶ng 1.5: Mét sè nguån nguyªn liÖu thu phytaza

NÊm mèc Aspergiluss niger NRRL 3135 Ngo¹i bµo

NÊm men Saccharomyces cerevisiae Ngo¹i bµo

C¸c lo¹i h¹t ®Ëu Néi bµo PhÊn hoa Typha latifolia Néi bµo

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp phytaza

của hầu hết vi sinh vật dao động từ 25-37 P

0

P

C (bảng 1.6) Còn pH thích hợp nhất cho sinh tổng hợp của hầu hết vi khuẩn và nấm dao động trong khoảng 5.0 – 7.0 Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào công bố quá trình sinh tổng hợp phytaza ở pH kiềm

Sự thông khí và tốc độ lắc môi trường là rất quan trọng để cung cấp đủ oxy và làm dàn đều tế bào vi sinh vật ra khắp môi trường nuôi cấy Quá trình sản xuất phytaza bằng chủng Schwanniomyces castelli được thực hiện trong

nồi lên men liên tục và được khuấy 600 vòng/phút [37] Qui trình với chủng A ficuum NRRL 3135 và A terreus được thực hiện trên máy lắc tốc độ 270

vòng/phút, còn chủng Baccillus sp DS11 sản sinh phytaza cực đại khi được

nuôi lắc 230 vòng/phút [22]

Bảng 1.6 Nhiệt độ, pH tối ưu sản xuất phytaza từ vi sinh vật

Vi sinh vật sinh enzyme Nhiệt độ

Nấm men

Nấm mốc

1.2.5.2 ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng

* ảnh hưởng của nguồn cacbon

Cacbon có mặt trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Khoảng một nửa chất khô của tế bào là cacbon Chính vì vậy những hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật

Nguồn cacbon cũng như nồng độ cacbon thích hợp là những yếu tố rất quan trọng cho sinh tổng hợp phytaza Glucoza được coi là nguồn cơ chất

thích hợp nhất cho sản sinh phytaza Lactobacillus amylovorus tổng hợp

phytaza tốt nhất với nguồn cacbon là glucoza 1% [42], còn nồng độ glucoza thích hợp với Bacillus subtilis là 2% [16] Cám lúa mỳ (6%) là nguồn cacbon

rất tốt cho sinh tổng hợp enzyme bằng chủng Baccillus sp DS11 [22]

Khi nguồn glucoza (2%) được thay thế bằng nguồn galactoza trong môi trường có chứa cao men, pepton, glucoza thì chủng Arxula adeninivoans cho

sản lượng phytaza cao gấp vài lần so với trên môi trường ban đầu [36] Nguồn 1% galactoza cũng rất phù hợp cho chủng S castelli sinh tổng hợp phytaza

[37]

Đối với nấm, khi những đường đơn như glucoza và sacaroza được sử dụng thì hệ sợi cũng như enzym được tạo thành mạnh mẽ, ví dụ như khi nuôi cấy A niger NRR3135 Tuy nhiên, một số bột ngũ cốc khi được sử dụng để

nuôi cấy nấm cũng giúp hệ sợi phân tán tốt và cho năng suất enzym cao Trong lên men rắn để thu phytaza bằng chủng Aspergillus ficuum người ta đã

sử dụng bột canola làm nguồn cơ chất, khi bổ sung glucoza 5.2% với bột canola thì làm tăng năng suất enzym [8]

* ảnh hưởng của nguồn nitơ

Cũng giống như cacbon, nitơ là nguyên tố rất quan trọng đối với đời sống của vi sinh vật Nó tham gia cấu tạo các axit amin, protein cũng như các cấu trúc của enzym Trong nuôi cấy vi sinh vật, người ta có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ hay hữu cơ Việc chọn được nguồn nitơ cũng như liều lượng nitơ thích hợp là rất cần thiết cho năng suất sinh tổng hợp enzym, cũng như hiệu suất về kinh tế Những nguồn nitơ hữu cơ như pepton được sử dụng rộng rãi trong lên men sản xuất phytaza Greaves và CS đã được sử dụng Pepton 1%

trong nuôi cấy Aeroobacter aerogenes[12] và nuôi cấy K oxytoca khi bổ sung

thêm 1% dịch chiết nấm men[17] Casein thuỷ phân 1% và (NHR 4 R)R 2 RSOR 4 R 0.1%

được sử dụng trong nuôi cấy sản xuất phytaza từ chủng B subtilis [30] Với

chủng A adeninivorans dịch chiết nấm men 1% và pepton 1% được coi là

những nguồn nitơ tốt [36] Kui Hong và CS (2001) đã nghiên cứu và thấy rằng nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt hơn nguồn nitơ hữu cơ trong quá trình lên men rắn thu phytaza, 1-2% muối NHR 4 RNOR 3 R thích hợp nhất cho chủng A niger

PD sản sinh phytaza[23]

* Nhu cầu vi lượng và vitamin

Ngoài nguồn cacbon và nitơ ra, một vài vi sinh vật rất cần những yếu tố

vi lượng và vitamin cho quá trình sinh trưởng và sinh enzym của mình Đặc biệt khi sản xuất phytaza bằng nấm men thì trong môi trường nuôi cấy luôn cần có các yếu tố vi lượng và vitamin [37] Tuy nhiên, việc bổ sung các yếu tố

vi lượng cũng như vitamin là không cần thiết đối với quá trình sinh tổng hợp phytaza của B subtilis [30], Bacillus sp DS 11 [22], nấm A niger ATCC 9142

và A ficuum NRRL 3135 [38]

* ảnh hưởng của hàm lượng photpho

Hàm lượng photpho vô cơ có trong môi trường nuôi cấy sẽ quyết định

đến khả năng sinh tổng hợp phytaza[38] Hầu hết nguồn photpho được sử dụng để nuôi cấy là KHR 2 RPOR 4 R và KR 2 RHPOR 4 R Ví dụ: nuôi cấy Bacillus sp DS 11

sử dụng môi trường có chứa KHR 2 RPOR 4 R (0.05%) và KR 2 RHPOR 4 R (0.04%) [22] Trong khi đó, đối với B subtilis thì sử dụng phytat natri (0.06%) và KHR 2 RPOR 4 R

0.1% Photphat có trong một số hợp chất hữu cơ lại ức chế sinh tổng hợp phytaza của một số loài nấm men và nấm mốc [38] Năng suất phytaza thu

được khi nuôi cấy nấm mốc trên môi trường có chứa bột ngũ cốc phụ thuộc hoàn toàn vào lượng photpho có trong loại bột ngũ cốc đó Hàm lượng photpho cao trong hạt ngũ cốc ngăn cản nấm mốc sản sinh phytaza [38] Sau khi loại bỏ photphat khỏi môi trường nuôi cấy, hoạt tính đặc hiệu phytaza của chủng A niger AbZ4 trong môi trường tăng lên 7.3 lần [53] Hiệu ứng điều

hoà, ảnh hưởng của nồng độ photpho cao lên quá trình sinh tổng hợp phytaza

đã được một số tác giả công bố như: Howson và Davis 1983, Han và Gallagher 1987, Ullah và Gibson 1987 Đối với vi khuẩn L amylovorus hàm

lượng photphat thích hợp nhất cho sinh tổng hợp phytaza là 240 mg/l [42] Hàm lượng photphat trong bột canola ảnh hưởng đến năng suất sinh phytaza của chủng A ficuum trong quá trình lên men rắn [9] Khả năng sinh tổng hợp

phytaza của chủng Cadida krusei phụ thuộc vào hàm lượng photphat có trong

môi trường, năng suất phytaza cao nhất thu được khi hàm lượng photphat trong môi trường là 0.5 mg/100ml, khi nồng độ photphat vượt quá 0.5 mg/100ml sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp enzym [31]

1.2.5.3 ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt

Khi những đường đơn như glucoza và fructoza được sử dụng là nguồn cacbon duy nhất trong nuôi cấy A niger NRRL 3135 thì hệ sợi tạo thành từng

đám trong môi trường lỏng và năng suất enzym thu được thấp Tuy nhiên, khi môi trường được bổ sung thêm chất hoạt động bề mặt (Natri oleat 0.5% v/v) thì hệ sợi phân tán đều khắp môi trường và năng suất của phytaza A tăng lên 4.7 lần so với mẫu đối chứng [38] Trong quá trình nuôi cấy lên men rắn chủng A carbonarius thì tỷ lệ sinh trưởng, khả năng sản sinh phytaza cũng

như mức độ phân giải axit phytic trong bột canola cao hơn khi có mặt Natri - oleat [3] Tương tự như Na-oleat, Tween 80 làm tăng tỷ lệ sinh tổng hợp phytaza cũng như khả năng phân giải axit phytic khi so sánh với mẫu đối chứng khi lên men trên bột canola, trong khi đó Triton X-100 không có tác

động đến quá trình này [9] Ngoài ra, SDS với nồng độ 0-1.5% cũng kích thích

sự sinh tổng hợp phytaza tăng lên gấp 2 lần [23]

1.2.6 Thu hồi và tạo chế phẩm phytaza

Tùy từng mục đích sử dụng mà người ta có thể tinh sạch enzym ở các mức độ khác nhau Hiện nay, người ta đã sử dụng các phương pháp để tinh

sạch phytaza bao gồm kết tủa phân đoạn bằng ethanol, axeton, amoni sulfat kết hợp với một số phương pháp mới như sắc ký trao đổi ion, lọc gel

Để giữ nguyên hoạt tính của phytaza ở nhiệt độ thường từ 6 tháng đến một năm người ta thường phải bổ sung vào nó một số chất bảo quản như: natri benzoat, glycerol, sorbitol… hoặc gắn enzym này lên các chất mang không hòa tan hoặc gắn chúng với nhau bằng các liên kết đồng hóa trị Các chất mang được lựa chọn thường là polyethylen glycol và các muối natri của axit malonic…

Trong thực tế, phytaza đã được sản xuất ra ở các dạng khác nhau Để có thể sử dụng được lâu và dễ dàng vận chuyển người ta thường sử dụng phytaza dưới dạng sấy khô hoặc bao trong một lớp vỏ chịu nhiệt Hầu như phytaza phục vụ chăn nuôi đều ở dạng thô, người ta thu hồi chúng bằng cồn hoặc amoni sulfat và thường ở một số dạng sau:

 Dạng lỏng là chế phẩm enzym thu từ canh trường được cô đặc ở nhiệt

 Dạng hạt nhỏ được tạo thành khi phối trộn phytaza đã cô đặc vào một

số nguyên liệu để giữ cho sự ổn định của enzym và kháng lại các điều kiện bất lợi như là nhiệt độ và độ ẩm cao

 Dạng có lớp vỏ chịu nhiệt là phytaza nằm trong một lõi có khả năng hấp thụ nước ít hơn 5% w/w của lõi và được bao phủ bởi một hay nhiều lớp nguyên liệu có thể hoà tan trong hệ thống tiêu hóa của động vật để giải phóng enzym này trong thời gian ngắn Lớp vỏ này giúp cho enzym

có khả năng chịu được nhiệt độ cao trong quá trình tạo viên

Trong công thức tạo thành chế phẩm phytaza dạng hạt nhỏ và có vỏ chịu nhiệt bao quanh được thể hiện ở patent EP0969089, người ta đã hoà từ

100 đến 250ml dung dịch phytaza (tổng hoạt độ của phytaza đạt khoảng 2500

đến 5000U) trong 1kg calcium lignosulfonate, và bổ sung nước trong suốt quá trình tạo hạt cho đến khi hạt được tạo ra với các đặc tính mong muốn Các hạt được làm khô trong thiết bị “fluid bed” ở 45P

0

PC, rồi sau cùng được phủ ra ngoài bằng lớp dầu cọ [32]

Nhìn chung quá trình tạo hạt có chứa enzym đều cần phải qua các bước sau: tạo lõi chứa enzym, tạo lớp vỏ chịu nhiệt bao quanh lõi và cuối cùng làm khô trong 30 phút bằng phương pháp sấy phun hoặc trong thiết bị fluid- bed Glatt WSG 15, rồi cho qua máy sàng có kích thước mắt sàng là 1,2mm

Theo thông báo trong patent US 2002/0173441 A1, Lima & đtg đã nghiên cứu tạo lõi chứa enzym bao gồm những cơ chất có khả năng hấp thụ nước từ 5 đến 10w/w (dựa trên trọng lượng của lõi) như là bột sắn, bột ngô và bột khoai tây để hấp phụ hết lượng enzym cần phải đạt Còn lớp vỏ mỏng chịu nhiệt được tạo bởi PEG 4000, titanium dioxide và kaolin [25]

Hoffmann-La Roche đã tạo chế phẩm phytaza và làm tăng tính ổn định chế phẩm bằng đường 5 cacbon như xylitol hoặc ribitol, polyethylene glycol muối natri của axit malonic, glutaric Bên cạch đó, theo patent WO2006056469 các protein đơn bào cũng có tác dụng làm ổn định và tăng tính chịu nhiệt của phytaza [10]

1.2.7 ứng dụng của phytaza

Như chúng ta đã biết enzym là những chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, do tế bào sống tổng hợp nên, điều khiển vận tốc và

đảm bảo các quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể sống một cách nhịp nhàng, cân đối, theo những chiều hướng xác định Enzym đã đảm bảo cho sự trao đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường giúp cơ thể tồn tại Enzym có hiệu xuất xúc tác cực kỳ lớn, cường lực xúc tác của nó có thể gấp

hàng triệu lần so với chất xúc tác thông thường Đặc biệt nó xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể

Nền kinh tế ngày càng phát triển đòi hỏi một môi trường trong sạch cùng với sự phát triển của tất cả các ngành công nghiệp, nông nghiệp, thương mại Vì vậy ngành công nghiệp sản xuất enzym không thể thiếu trong xã hội của chúng ta Enzym rất có ích cho con người trong việc nghiên cứu và sử dụng chúng để giải quyết các vấn đề quan trọng của khoa học, công nghiệp và

nó có vai trò to lớn trong nền kinh tế quốc dân Trong khoảng 20 năm trở lại

đây enzym được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác nhau như hoá học, y học, công nghiệp nhẹ đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm Do đó ở nhiều nước trên thế giới, việc sản xuất chế phẩm enzym đã trở thành một ngành công nghiệp lớn Ngành công nghiệp sản xuất chế phẩm enzym đã có những bước tiến nhảy vọt với tiến độ phát triển mạnh mẽ Phytaza đã được xác

định là có lợi ích cực kỳ to lớn cho nền nông nghiệp nói riêng và cho nền kinh

tế nói chung Chính vì vậy mà con người đã không ngừng khai thác nguồn lợi này và đã áp dụng phytaza trong nhiều lĩnh vực khác nhau

1.2.7.1 ứng dụng trong nông nghiệp

Việc sử dụng chế phẩm phytaza bổ sung vào thức ăn cho chăn nuôi ngày càng được tăng cường, bởi vì qua các nghiên cứu đã cho thấy rằng việc

bổ sung chế phẩm sinh học nói chung và chế phẩm enzym nói riêng vào thức

ăn cho gia súc, gia cầm đã đưa sản lượng lên rất cao với giá thành hạ Những năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta đã có nhiều tiến bộ đáng kể Cùng với việc nghiên cứu lai tạo giống và hoàn thiện các quy trình chăm sóc nuôi dưỡng thì khâu chế biến thức ăn cho chúng cũng là một nhân tố quyết định

đến hiệu quả trong chăn nuôi Chính vì vậy, người ta đã sử dụng chế phẩm enzym để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả năng chuyển hoá thức

ăn của chúng

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò tác động của phytaza đối với cơ thể động vật, đặc biệt là động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn

và cá Năm 1992, phytaza bắt đầu được thương mại hoá dưới dạng chế phẩm

để bổ sung vào thức ăn của chúng Từ những lợi ích mà phytaza có thể mang lại cho con người đã khiến ngày càng có nhiều ứng dụng của loại enzym này trên nhiều lĩnh vực khác nhau Người ta đã không ngừng nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao tính chất ưu việt của phytaza để những ứng dụng của chúng đạt hiệu quả hơn

Việc sử dụng chế phẩm phytaza để bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho vật nuôi không những cho phép các vật nuôi đồng hoá tốt thành phần phospho sẵn có trong thức ăn, tăng sự hấp thu protein và các nguyên tố khoáng mà còn giảm được sự ô nhiễm môi trường do hạn chế được lượng phosphat khó tiêu

được thải ra theo phân của động vật Hiệu quả của việc ứng dụng này đã được kiểm định Tại Mỹ, người ta dự tính rằng nếu phytaza được sử dụng trong thức

ăn cho tất cả các loài động vật dạ dày đơn ngăn thì sẽ giải phóng được một lượng phospho tương ứng với giá trị 168 triệu USD và loại trừ được 8,23x10P

4

P

tấn phosphat thải ra môi trường hàng năm ở Việt nam tác giả Nguyễn Thị Hoài Trâm và cộng sự đã thông báo về khả năng ứng dụng chế phẩm phytaza Ronozym P do Thuỵ sĩ sản xuất vào thức ăn chăn nuôi Kết quả cho thấy phytaza làm tăng tỷ lệ đẻ trứng lên 2% và tăng năng suất trứng sau 12 tuần là 1,86-1,99 quả/gà mái [4]

1.2.7.2 ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

Việc nghiên cứu sự chuyển hoá của axit phytic rất quan trọng trong công nghiệp sản xuất giấy Một loại phytaza chịu nhiệt đã được tìm thấy và người ta đã phát hiện rằng chúng có tiềm năng như một tác nhân sinh học mới

để làm giảm lượng axit phytic trong sản xuất giấy Sự phân huỷ axit phytic nhờ enzym có điểm lợi là không tạo ra các chất có khả năng gây ung thư và

các sản phẩm trung gian có tính độc cao Bởi vậy, việc sử dụng phytaza trong quá trình sản xuất giấy rất có lợi cho môi trường và điều này sẽ góp phần cho

sự phát triển của các công nghệ sạch trong tương lai

1.2.7.3 Điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate ứng dụng trong y học

Inositol phosphate và phospholipid có vai trò nòng cốt trong việc truyền tín hiệu qua màng và huy động nguồn canxi dự trữ trong tế bào Hơn nữa, một

số inositol triphosphate đặc hiệu đã được chứng minh rằng có khả năng phòng tránh một số bệnh tật bao gồm cả các bệnh dễ viêm nhiễm như bệnh viêm khớp hoặc bệnh về hô hấp như bệnh hen Mặt khác, người ta cũng đã dùng một số inositol triphosphate đặc hiệu khác như thuốc giảm đau [39] Đáng quan tâm hơn các este của inositol triphosphate được sử dụng là những chất ức chế hiệu quả chống lại sự lây nhiễm các bệnh do nhóm Retrovirus gây ra bao gồm cả HIV [40] Những ứng dụng dược học của một số myo-inositol

phosphate đặc hiệu trên đây ngày càng tăng lên Tuy nhiên, việc tổng hợp bằng con đường hoá học các myo-inositol phosphate này gặp rất nhiều khó

khăn trong quá trình sản xuất và bảo quản, vì qui trình được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ và áp suất rất cao Từ khi phytaza được phát hiện có hoạt tính thủy phân các myo-inositol hexaphosphate thành các dẫn xuất khác nhau thì

việc sản xuất myo-inositol tự do từ myo-inositol phosphate được thực hiện

bằng con đường sinh học để thay thế cho phương pháp tổng hợp hóa học Việc sản xuất D - myo- inositol 1,2,6-trisphosphate, D-myo-inositol 1,2,5-

trisphosphate, L-myo-inositol 1,3,4- trisphosphate và myo-inositol

1,2,3-trisphosphate bằng con đường thủy phân axit phytic nhờ phytaza từ nấm men

S cerevisiae đã được Siren nghiên cứu và thực hiện năm 1986 Phytaza cố

định đã được sử dụng để sản xuất các dẫn xuất myo-inositol phosphate khác

nhau Đương nhiên, lợi ích tổng hợp bằng con đường enzym thì mang tính đặc

hiệu cao, cho sản phẩm có độ tinh khiết cao và phản ứng diễn ra trong điều kiện "ôn hoà" hơn Ngoài việc sử dụng để làm thuốc, các dẫn xuất myo-

inositol phosphate còn được dùng làm cơ chất enzym cho những nghiên cứu sinh hoá, chuyển hoá trao đổi chất

1.3 Gen phyA và một số gen khác mã hóa cho phytaza từ vi

sinh vật

1.3.1 Gen phyA mã hóa cho phytaza của Aspergillus

Đây là gen mã hóa cho phytaza của nấm mốc A niger Nó đã được tách

dòng và xác định trình tự đầu tiên trong tất cả các gen mã hóa phytaza Gen

phyA có tính bảo thủ cao trong phạm vi nhiều loài

Người ta đã xác định được toàn bộ gen phyA mã hoá cho phytaza từ nấm

mốc A niger NRRL 3135 Trình tự này được đăng ký trong Ngân hàng gen

quốc tế với mã số M94550 [43] Đoạn gen mã hoá cho phytaza này cũng đã

được biểu hiện để thu lượng lớn và sản phẩm của nó đã được thương mại hoá

PhyA của nấm mốc A niger NRRL 3135 dường như có tính chịu nhiệt Nhiệt

độ tối ưu cho enzym này hoạt động được xác định là 58P

0

PC [43] Một trong những nguyên nhân để cho enzym này có khả năng chịu nhiệt độ cao là do sự

có mặt của 10 gốc cystein (Cys), những gốc này cho phép tạo thành 5 cầu disulfide Khi phân tích bằng nhiễu xạ tia X và hoá sinh học đã xác nhận điều này Sự có mặt của 5 cầu disulfit đã trở thành một điểm để nhận biết phyA của

vi sinh vật

Bên cạnh đó các tác giả khác cũng đã tách dòng thành công gen phyA từ

một số nấm mốc khác Gen phyA mã hoá cho phytaza của nấm mốc A fumigatus cũng đã được xác định Gen này có chứa một intron gồm 56

nucleotit được tìm thấy ở gần đầu 5’ của gen và nằm xen giữa hai exon Gen

phyA nêu trên mã hoá cho một enzym có chiều dài là 465 axit amin và có

trọng lượng phân tử 66,61kDa Gen phyA tách từ nấm A fumigatus này có độ

tương đồng là 48% so với phyA của nấm A niger và 29% so với gen phyB của

chủng A niger [28] Tác giả Van Hartingsveldt cũng đã tách dòng thành

công gen phyA mã hoá cho phytaza của nấm mốc A niger [43]

* PhyB:

PhyB là gen mã hóa cho một enzym ngoại bào có hoạt tính phytaza

cũng thuộc nhóm histidine acid phosphatase được tách từ nấm mốc A niger

NRRL 3135 Ngoài ra nó cũng có mặt ở một số chủng Aspergillus khác Wyss

& cs cũng đã cho rằng Phy B của nấm mốc có hoạt tính phytaza thấp hơn Phy

A nhưng ngược lại chúng có phổ đặc hiệu cơ chất rộng hơn [45]

1.3.2 Một số gen khác mã hóa cho phytaza trong tự nhiên

1.3.2.1 Gen phyC mã hóa phytaza của Bacillus

Gen phyC mã hóa cho vi khuẩn B subtilis VTTE-68013 có chiều dài

989 bp và có khung đọc mở gồm 330 axit amin

Promotơ của nó gồm trình tự -35 (-TTGACA-) và -10 (-TAACAC-)

được ngăn cách bởi 15 cặp bazơ Khi trình tự gen phyC của B subtilis VTT

E-68013 được so sánh với các trình tự trong ngân hàng gen thì không thấy có sự tương đồng với bất cứ một loại phytaza hay phosphataza nào Vì vậy, phytaza của Bacillus không thuộc nhóm histidine acid phosphatase, nhưng lại là

enzym có hoạt tính thủy phân muối phytat mạnh

Tuy nhiên, phyC có độ tương đồng đến 72% với gen yodV, vốn là một

loại gen nằm trên nhiễm sắc thể của B subtilis mà gen này được biết là một

tiền chất của 3-phytaza [20]

1.3.2.2 Gen mã hóa phytaza của E.coli

AppA là gen mã hóa cho phytaza của E.coli Trình tự của nó đã được

Dassa và cộng sự xác định vào năm 1990 Năm 1999, Rodriguez và cộng sự

dựa vào trình tự trên đã thiết kế cặp mồi để tách dòng gen này từ một chủng

E.coli có khả năng sinh phytaza có hoạt tính cao AppA2 là gen thứ hai được

phát hiện trong E.coli cũng có thể mã hóa được phytaza Cả hai gen này có

trình tự tương đồng khoảng 95% Điều này đã được chứng minh sau khi biểu hiện thành công trong nấm men P pastoris, thấy có sự sai khác 7 axit amin ở

trình tự đầu tiên

1.3.2.3 Gen mã hóa phytaza của nấm men

Một số gen mã hóa cho phosphataze axit trong nấm men đã được tách dòng và xác định trình tự Đó là các enzym được tách lần lượt từ

Schizosaccharomyces pombe được mã hóa bởi gen pho1, S cerevisiae được

mã hóa bởi gen pho3 và S pombe được mã hóa bởi gen pho4 Tuy nhiên, chỉ

có pho3 được tách dòng, được chuyển vào hệ biểu hiện nấm mốc A oryzae và

đã mang lại hoạt tính cao [27]

Chương 2 Vật liệu và Phương pháp 2.1 Vật liệu

2.1.1 Địa điểm và đối tượng nghiên cứu

- Các thí nghiệm của luận văn được tiến hành tại Phòng Nghiên cứu Vi sinh vật sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp & Công nghệ sau thu hoạch và Viện Công nghệ sinh học

- Bộ chủng Aspergillus niger sinh phytaza của Phòng Nghiên cứu Vi sinh vật

sau thu hoạch- Viện Cơ điện NN và Công nghệ sau thu hoạch

2.1.2 Hoá chất

Các hóa chất chuẩn:

• Phytaza chuẩn của Sigma, USA Canxi - phytat, Natri- phytat của Sigma, USA, Màng thẩm tích ( Dialyis membranes ) của Jurgens Scientific center

Các hóa chất thông dụng

• Agar (Việt Nam)- Axit lactic (Việt Nam), Axit citric - Axit axetic

CaClR 2 R, CaCOR 3 R, (NHR 4 R)R 2 RSOR 4 R, (NHR 4 R)R 3 RPOR 4 R, NaR 2 RHPOR 4 R, IR 2 R, KI, MgSOR 4 R,

KR 2 RHPOR 4 R, - FeSOR 4 R.7HR 2 RO NHR 4 RNOR 3 R, NaR 2 RSOR 4 R, KCl, FeSOR 4 R,, HR 3 RBOR 3 R, MnSOR 4 R.7HR 2 RO (Trung Quốc) Dầu thực vật, Saccaroza (Việt Nam), Pepton (Trung Quốc)

Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử:

Các hoá chất cho tách DNA, điện di DNA, điện di protein: MgClR 2 R, HCl (pH=8,8), ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), NaCl, β-mercaptoetanol, sodium dodecyl sulphate (SDS), kali axetat, natri axetat, etanol 100%, phenol, chlorofoc: isoamylalcohol (24:1), agaroza, NaOH, nitơR

tris-lỏng và ethydium bromit (EtBr), 4 loại deoxiribonucleotit triphosphat (dNTP)