SEMINAR xây dựng và THẨM ĐỊNH phương pháp UHPLC MSMS định lượng chất chủ vận beta 2 trong nước tiểu người và ứng dụng TRên mẫu thử lâm sàng _ sắc ký HIỆN đại

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

Xây dựng và THẨM ĐỊNH phương pháp UHPLC-MS/MS định lượng chất chủ vận Beta 2 trong nước tiểu người và ứng dụng TRên mẫu thử lâm sàng

Tác giả: Cristina Bozzolino, Marta Leporati, Federica Gani, Cinzia Ferrero, Marco Vincenti

1

NỘI DUNG THUYẾT TRÌNH

GIỚI THIỆU 1

GIỚI THIỆU

Các chất chủ vận β2 thường được dùng trong điều trị hen suyễn, rối loạn viêm đường hô hấp mãn tính,

COPD

Chất chủ vận β2 có thể bị lạm dụng trong thể thao và chăn nuôi là chất kích thích tăng trưởng

Đòi hỏi việc xác định và định lượng chất chủ vận β2 trong các dịch sinh học cần phương pháp phân tích

nhạy và chọn lọc

Trong nước tiểu, chất chủ vận β2 là thường được bài tiết dưới dạng chất chuyển hóa pha I hoặc pha II ,

kèm theo một tỷ lệ lớn thuốc không biến đổi

Phương pháp UHPLC-MS/MS phát hiện 24 chất chủ vận β2 trong nước

tiểu người

Phương pháp nghiên cứu 2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu và hoá chất

Salmeterol xinafoate Quality of Medicines & Health Care (Strasbourg, Pháp).

6

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu và hoá chất

DD chuẩn gốc trong methanol với nồng độ 1mg/ml Bảo quản 20 ˚C

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chuẩn bị mẫu

8

Mẫu nước tiểu

(3ml)

Ống tt 30ml +2.5 µL chuẩn nội (0.1µg/ml)

Lấy 2.5ml phía trên Amoni acetat 0.2M, PH=5

+10µL β-glucuronidase

Ly tâm 3500 vòng/ph trong 5ph

SPE Strata-XC 33 µm (làm ẩm với 2ml methanol +2ml nước tk)

Ủ trong 2h, 37˚C Làm nguội ở t˚ phòng

Chất phân tích mục tiêu Dịch rửa giải

Thể tích mẫu tiêm: là 1µl Tốc độ dòng 0.4ml/phút.

Dung môi pha động: Methanol + acid.formic 0.1%

Tổng thời gian chạy ; 15 phút 5% Methanol : 95% A.Formic (2 phút) Methanol : 5% - 80% (8 phút)

80% Methanol : 20% A.Formic (1 phút)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thông số hệ thống

Khí mang: 35 psi Nguồn khí phun: 45 psi Nguồn khí tạo nhiệt: 40 psi

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thông số hệ thống

10

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân tích mẫu bằng UHPLC - MS

Cấu tạo đầu dò khối phổ Triple Quad Agilent

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xác định mẫu nước tiểu

Mẫu nước tiểu được thu thập từ 60 bệnh nhân tuân thủ điều trị bằng thuốc chủ vận β2

Thuốc được dùng dưới dạng bình xịt định liều Inhaler

Các hoạt chất

Salbutamol(100 µg/nhát),

Salbutamol /beclometasone (100 µg/nhát), Salmeterol/ fluticasone (25 hoặc 50 µg/nhát),

Formoterol/ budesonide (4,5 hoặc 9 µg /nhát),

Formoterol / beclometasone (6 µg/nhát)

Indacaterol (150 µg/nhát )

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xác định mẫu nước tiểu

14

(ng/ml)

Bảng Bệnh nhân đang điều trị mãn tính: Các đặc điểm chung, thông tin điều trị và nồng độ thuốc β2 được xác định trong nước tiểu.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xác định mẫu nước tiểu

(ng/ml)

Bảng Bệnh nhân đang điều trị cấp tính: Các đặc điểm chung, thông tin điều trị và nồng độ thuốc β2 được xác định trong nước tiểu.

Kết quả - bàn luận

3

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Phát triển phương pháp

Hình 2 sắc ký đồ SRM của mẫu nước tiểu trắng pha ở 0.500 ng/mL cho tất cả các chất phân tích

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Thẩm định quy trình

18

• Tính đặc hiệu và chọn lọc

• Các sắc ký đồ SRM của các mẫu nước tiểu trắng được thu thập từ 10 đối tượng không được điều trị không có sự hiện diện của bất kỳ tín hiệu quan trọng nào (S/N <3) tại thời gian lưu tương đối của tất cả các hợp chất và chuẩn nội được nghiên cứu

• Cho thấy phương pháp này chọn lọc và không có mặt chất gây nhiễu trong các chất nền sinh học

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Thẩm định quy trình

Bảng 2 Khoảng hiệu chỉnh, bình phương hệ số tương quan(R2), giá trị LOD và LOQ, Lack of Fit’s, ANOVA, Mandel, RSD độ dốc

và kết quả kiểm tra tính toán lại cho tất cả các phân tích

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Thẩm định quy trình

20

• Tính tuyến tính

• Độ tuyến tính được nghiên cứu trong các dải nồng độ được trình bày trong Bảng 2 với

hệ số tương quan (r2) cao hơn 0,99

• LOD và LOQ

• Các giá trị LOD và LOQ (Bảng 2) thấp hơn ít nhất một bậc độ lớn so với các giá trị được ghi lại trong phương pháp fast-GC-MS trước đây

• Sự tăng độ nhạy này đặc biệt quan trọng đối với một số chất phân tích (salmeterol)

thường được bài tiết ở nồng độ thấp sau khi dùng

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Thẩm định quy trình

Bảng 3 Độ chính xác trong ngày (CV%), độ đúng (bias%), hiệu ứng nền và tỉ lệ phục hồi cho tất cả các phân tích được kiểm tra.

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Thẩm định quy trình

22

• Độ chính xác và độ đúng

• Dữ liệu trong ngày về độ đúng được báo cáo trong bảng 3

• CV% thấp hơn 15% cho tất cả các phân tích được pha ở nồng độ thấp, trung bình và

cao, chỉ có năm ngoại lệ (16% cho cimaterol, 19% cho ritodrine, 16% cho ractopamine, 17% cho mapenterol và 18% cho salmeterol ở mức hiệu chuẩn thấp nhất)

• Phần trăm độ lệch (bias%) nằm trong khoảng từ -4,7% đến + 15%

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Thẩm định quy trình

• Hiệu ứng nền và độ phục hồi

• Các giá trị độ thu hồi và hiệu ứng nền được đưa ra trong Bảng 3

• Độ thu hồi trung bình là 100%: tối thiểu là 80% đối với mapenterol ở mức 0,03 ng / mL, tối đa bằng 116% đối với fenoterol là 0,15 ng / mL

• Hiệu ứng nền trung bình được ước tính khoảng +1,2%: tối thiểu −33% đối với cimaterol, tối đa +23% đối với clenbuterol

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Thẩm định quy trình

24

• Carry-over

• Các sắc ký đồ không có sự hiện diện của bất kỳ tín hiệu quan trọng nào (tức là tỉ lệ S /

N luôn luôn <3) trong thời gian lưu dự kiến cho các chất phân tích được thử nghiệm,

ngoại trừ Procaterol có một số hiệu ứng carry-over ở 2 trong số 5 lần chạy

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Cải tiến phương pháp

• Phương pháp UHPLC-MS/MS được phát triển để thay cho quy trình fast-GC-MS trước đây

• Phương pháp mới này cũng nhanh không kém, không yêu cầu các bước tạo dẫn xuất và

xác định được tới 24 chất chủ vận β2

• Loại bỏ các tín hiệu gây nhiễu khỏi cấu hình SRM

• Tăng cường tính đặc hiệu và độ nhạy

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Kết quả thử nghiệm mẫu nước tiểu thực tế

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Kết quả thử nghiệm mẫu nước tiểu thực tế

Indacaterol

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Kết quả thử nghiệm mẫu nước tiểu thực tế

28 Salmeterol

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Kết quả thử nghiệm mẫu nước tiểu thực tế

Formoterol

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Kết quả thử nghiệm mẫu nước tiểu thực tế

30 Salbutamol

KẾT Luận 4

KẾT LUẬN

32

Phương pháp UHPLC – MS/MS được phát triển và xác nhận để xác định, định lượng đồng thời 24 chất đối kháng β trong nước tiểu người đã đủ để chứng minh nồng độ thực của các chất phân tích trong các mẫu bệnh nhân hen suyễn hoặc COPD

Cảm ơn các bạn đã chú ý lắng nghe!