SEMINAR xây DỰNG và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP UHPLC MSMS để ĐỊNH LƯỢNG các CHẤT CHỦ vận β2 TRONG nước TIỂU NGƯỜI và ỨNG DỤNG TRÊN mẫu THỬ lâm SÀNG

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP UHPLC-MS/MS

ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT

NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRÊN

MẪU THỬ LÂM SÀNG

1.TÓM TẮT VÀ GIỚI THIỆU

• Thuốc chủ vận beta 2 (salmeterol, salbutamol,

bambuterol,…) là thuốc thường được dùng để điều trị

hen suyễn và các bệnh viêm đường hô hấp mãn tính

1.TÓM TẮT VÀ GIỚI THIỆU

Không giống mẫu máu, mẫu nước

tiểu là mẫu không xâm lấn

Trong nước tiểu, chất chủ vận beta

2 thường được bài tiết dưới dạng chất chuyển hóa pha I hoặc pha II, kèm theo một tỷ lệ lớn thuốc chưa chuyển hóa, tùy thuộc vào liều

lượng và đường dùng

• Formoterol fumarate dihydrate

• Formic acid (LC–MS Ultra

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

• Indacaterol và formoterol-glucuronidase type II từ helix pomatia 13 C-glucuronidase type II từ helix pomatiad 3 mua từ AlsaChim (Illkirch Graffenstaden,France)

• Salmeterol xinafoate được cung cấp từ Tổng cục quản lý chất lượng thuốc và

chăm sóc sức khỏe Châu Âu (Strasbourg, France)

• Zilpaterol được lấy từ Spectra 2000 srl (Rome,Italy)

• Clenbuterol-glucuronidase type II từ helix pomatiad 6 được cung cấp bởi Viện Sức khỏe Cộng đồng và Môi trường Hà

Lan (RIVM, Bilthoven, Netherlands)

• Salbutamol-glucuronidase type II từ helix pomatiad 3 được mua từ LGC (Teddington, Middlesex, United Kingdom)

• Salmeterol-glucuronidase type II từ helix pomatiad 3 từ CDN Isotope (Pointe-Claire, Quebec, Canada)

• Hydrochloric acid (HCl) 37% được mua từ Carlo Erba (Milan, Italy)

• Nước tinh khiết thu được bằng cách sử dụng máy Milli-glucuronidase type II từ helix pomatiaQ® UF apparatus (Millipore,

Bedford, MA, USA)

2.1 Thuốc thử và hóa chất

Mẫu nước tiểu (3 mL)

Dung dịch amoni axetat 0,2 M ở pH 5,0

Các mẫu

Được ly tâm với tốc độ 3500 vòng / phút trong 5 phút

Hút 2,5 ml vào các ống thủy tinh 30 ml và thêm 25 μL dung dịch L dung dịch chất chuẩn nội (IS) (nồng độ 0,1 μL dung dịch g / mL)

Được thêm vào (2,5 ml) vào các mẫu, cùng với 10 μL dung dịch L của β-glucuronidase

Ủ trong 2 giờ ở 37 ◦C.

Được làm mát đến nhiệt độ phòng và sau đó được tải lên Cột trao đổi cation SPE Strata-XC 33 μL dung dịch m, 60 mg × 3 mL (Phenomenex, Castel Maggiore (BO), Ý), trước đây với điều kiện 2 mL metanol

và 2 mL nước siêu tinh khiết.

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2 Chuẩn bị mẫu

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Rửa giải với 2 mL amonium hydroxide trong methanol làm bay hơi dưới dòng nitơ nhẹ

và ở 50 ◦C bằng cách sử dụng

bộ tập trung mẫu Techne (Barlowworld Science, Stone, UK)

Sau đó được pha với

100 μL dung dịch L của metanol - 0,1% dung dịch nước axit formic (5:95, v / v) và được chuyển vào

lọ phân tích cho phân tích UHPLC- MS/MS

Sau khi nạp mẫu, cột

SPE được rửa bằng 2

mL HCl 0,1 M và sau đó

2 ml metanol.

2.2 Chuẩn bị mẫu

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Hệ thống Infinity 1290

UHPLC (Công nghệ Agilent,

Palo Alto,CA, USA),

bao gồm máy khử khí chân

không,bơm nhị phân,

bộ tiêm mẫu tự động

và một bộ điều nhiệt cột

Máy sắc ký lỏng được trang bị

BEH Waters (Milford, MA,

USA)

Cột BEH C18 (2.1mm×100mm×1.7µm) được duy trì ở 40 C và lọc tiền cột BEH C18 của Waters (Milford, MA, USA) (2.1mm×5mm×1.7µm)

2.3 UHPLC-MS/MS

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chương trình chạy

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thời gian Acid formic 0,1% (%) Methanol (%)

Máy UHPLC được kết nối với máy quang phổ khối tứ cực ba lần

(triple-quadrupole) QTRAP® 4500 (Sciex, Ontario, Canada), ion hóa bằng phương pháp ion hóa phun điện (ESI) – chế độ ion dương

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

độ đúng và độ chính xác trong xét nghiệm

Chất mang,chất phục hồi

và hiệu quả chất nền cũng

đã được nghiên cứu

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

10 mẫu nước tiểu từ các cá nhân khác nhau không

điều trị bằng chất chủ vận β2 đã được phân tích Sự

xuất hiện có thể có từ các chất nội sinh đã được

kiểm tra bằng cách theo dõi đặc tính sắc ký SRM

cho từng hợp chất tại khoảng thời gian lưu tương

ứng.

Tỉ số tín hiệu trên nhiễu (S / N) được đo tại thời gian lưu dự kiến S / N <3 được coi là đạt yêu cầu để xác minh tính đặc hiệu của phương pháp.

Tiêu chí xác định cho các chất phân tích được thiết lập theo Quyết định 2002/657/EC

Mỗi chất phân tích được thử nghiệm ở ba

nồng độ xác đinh thuộc khoảng tuyến tính Độ

chính xác thời gian lưu (tR) cũng được thử

nghiệm ở cùng nồng độ.

2.4.1 Tính đặc hiệu và chọn lọc

Analyte Experimentally Correlation LOD LOQ Lack of fit’s ANOVA Mandel’s RSD slope Back calculation

tested linearity coefficient (ng/mL) (ng/mL) test (Fexp ) (Fexp ) test (Fexp ) test (%) test (%)range (ng/mL) (R2 )

Lack of fit’s test − Fcrit = 2.776 (n1 = 4 and n2 = 24 degrees of freedom)

ANOVA − Ftab = 3.842 (n1 = 1 and n2 = 28 degrees of freedom).

Mandel’s test − Fcrit = 2.62 (n1 = 5 and n2 = 24 degrees of freedom) RSD slope test − %RSD threshold = 5.00%.

Back calculation test − % threshold = 20%.

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.4.2 Tuyến tính, LOD và LOQ

Độ đúng được chấp nhận khi nồng độ trung bình được xác định bằng thực nghiệm nằm trong phạm vi ±

15% so với dự kiến giá trị

Độ chính xác được coi là thỏa đáng khi giá trị CV% dưới 25% cho nồng độ thấp và dưới 15% cho các mức

khác

Đối với tất cả các phân tích, độ chính xác trong ngày (được biểu thị bằng hệ số biến thiên phần trăm, CV%) và độ đúng (được biểu thị bằng bias %) được đánh giá bằng cách phân tích mười mẫu nước tiểu với nồng độ ở mức hiệu chuẩn thấp, trung bình và cao ( cùng nồng độ được sử dụng để đánh giá tính chọn

lọc)

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP

2.4.3 Độ chính xác và độ đúng

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.4.4 Lượng dung môi tồn dư

Lượng dung môi tồn dư được đánh giá bằng cách tiêm năm mẫu nước

tiểu với tất cả các chất phân tích ở nồng độ cao hơn 5 ng / mL và năm

mẫu nước tiểu trống

Đảm bảo sự không có mặt của bất cứ chất nào làm ảnh hưởng thì tỷ lệ

S / N phải thấp hơn 3.

2.4.5 Ảnh hưởng nền mẫu và hiệu suất chiết

Level I Level II Level III Matrix Recovery (%)

effect (%)Analyte Conc Precision Accuracy Conc Precision Accuracy Conc Precision Accuracy Level I Level I Level II Level III

(ng/mL) (CV%) (bias%) (ng/mL) (CV%) (bias%) (ng/mL) (CV%) (bias%)

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.5 Mẫu nước tiểu thật

Mẫu nước tiểu thật được thu thập

từ 60 bệnh nhân tuân thủ điều trị

với chất chủ vận β 2 tại Bệnh viện

đại học San Luigi Gonzaga.

Các hoạt chất là:

• salbutamol (100 μg/ puff)

• salbutamol /beclometasone (100 μg/ puff)

• salmeterol / fluticasone (25 hoặc 50 μg/ puff )

• formoterol / budesonide (4.5 hoặc 9 μg/ puff)

• formoterol / beclometasone (6 μg/ puff)

• indacaterol (150 μg/ puff).

-agonist Patient Sex Age Time in therapy (h) Dose ( g) Urine concentration (ng/mL)

3.KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4 KẾT LUẬN

phép phát hiện đồng thời tất cả các

So với phương pháp đã sử dụng trước đây phân tích được nhiều chất hơn hơn

Thank You For

Listening