Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác
Trang 1Tác giả: Zhenlei Wang, Ji Jiang, Pei Hu & Qian Zhao
PHÁT TRIỂN VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG
PHÁP UPLC – MS/MS TRONG PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI FOTAGLIPTIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NÓ TRONG HUYẾT
TƯƠNG VÀ NƯỚC TIỂU
10.4155/bio-2016-0243
Trang 2Nội dung thuyết trình
Trang 31 TỔNG QUAN
Trang 51.2 Chất chuyển hóa của fotagliptin
• Hai chất chuyển hóa chính là M1 và M2-1
• Nồng độ của hai chất chuyển hóa trong
huyết tương lớn hơn nồng độ của
fotagliptin ở chuột và chó
• Cần định lượng 2 chất chuyển hóa chính
để biết rõ hơn dược động học cũng như
đặc tính bài tiết của fotagliptin
Trang 62 THÍ NGHIỆM
Trang 72 THÍ NGHIỆM
2.1 Vật liệu và thuốc thử
Chất chuẩn bao gồm: fotagliptin, 2 chất
chuyển hóa M1 và M2-1, chất nội chuẩn
Công ty Dược Shenzhen Salubris (Trung Quốc)Acetonitril và metanol loại HPLC Honeywell Burdick & Jackson (Mỹ)
Acid formic và acid trifluoroacetic Sigma Aldrich (Mỹ)
Dung dịch amoniac và amoni acetat Sinopharm (Trung Quốc)Nước khử ion Hệ thống Millipore’s Milli-Q (Mỹ)
Huyết tương và nước tiểu người không
chứa thuốc
6 tình nguyện viên khỏe mạnh không dùng thuốc trong 2 tuần
Trang 82.2 Thiết bị
• Các mẫu được phân tích trên hệ thống MS/MS
UPLC-• Hệ thống Acquity UPLC-MS/MS (Waters Co.,
MA, USA) bao gồm:
- Bộ lấy mẫu tự động
- Lò cột
- Hệ thống quản lí dung môi 2 dòng
- Dữ liệu có được trên máy khối phổ 3 tứ cực API
5500 (Applied Biosystems, CA, USA)
- Phần mềm phân tích v1.4.2
2 THÍ NGHIỆM
Trang 92.3 Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ
2 THÍ NGHIỆM
Trang 102.3 Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ
• Quá trình rửa giải:
2 THÍ NGHIỆM
Trang 112.3 Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ
• Các thông số nguồn / khí được tối ưu hóa như sau:
Màn chắn khí 35 psiKhí va chạm 8 psiĐiện áp phun ion 5000 VNhiệt độ 600°CKhí nguồn ion 1 40 psiKhí nguồn ion 2 60 psi
2 THÍ NGHIỆM
Trang 122.3 Điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ
• Cấu trúc hóa học của fotagliptin (A), IS (B),
Trang 132.4 Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn và
các mẫu chuẩn kiểm tra
Pha chế Dung dịch hiệu chuẩn Mẫu chuẩn kiểm tra Dung dịch nội chuẩn
Dung dịch gốc 1 mg/ml trong acetonitrile 1 mg/ml trong nước – acetonitrile (1:1)Dung dịch đối
chiếu Pha loãng trong nước – acetonitrile (1:1) Pha loãng với nước - acid formic (50:1)
Chuẩn bị mẫu Pha dung dịch đối chiếu trong mẫu dịch sinh học trắng
Pha loãng Hệ số pha loãng = 50 Huyết tương - 10Nước tiểu - 50
-800/120/800 ng/ml 8000/1200/8000 ng/ml
Nước
tiểu
20.0/20.0/20.0 20,000/10,000/10,000 ng/ml
-40.0/40.0/40.0, 800/400/400, 16,000/8000/8000 ng/ml
40,000/20,000/20,000 ng/ml
2 THÍ NGHIỆM
Trang 142.5 Chuẩn bị mẫu thử
Huyết tương
2 THÍ NGHIỆM
Trang 152.5 Chuẩn bị mẫu thử
Nước tiểu
Pha loãng trực tiếp
Thêm 990 µL dung dịch nội chuẩn trong nước tiểu vào 100 µL mẫu nước tiểu rồi đem trộn đều Sau đó đem hỗn hợp pha loãng 100 lần bằng dung môi
acetonitrile-nước (1:9) bằng Tomtec Quadra 4
2 THÍ NGHIỆM
Trang 162.6 Thẩm định Phương pháp
• Theo hướng dẫn của FDA Hoa Kì, EMA và FDA Trung Quốc:
2 THÍ NGHIỆM
Trang 173 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trang 183.1 Phát triển Phương pháp
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Tối ưu hóa phương pháp MS:
Chế độ ion hóa dương với ESI phát hiện chất phân tích tốt hơn
Acetonitril chọn làm dung môi pha động, nhiễu nền thấp
Các thông số nguồn/khí và hợp chất cũng được tối
ưu hóa
Trang 193.1 Phát triển Phương pháp
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trang 203.1 Phát triển Phương pháp
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Phương pháp chuẩn bị mẫu:
Mẫu huyết tương: phương pháp
chiết pha rắn được tiến hành trên
máy Tomtec Quadra 4 với SPE
loại Oasis™ MCX (30 mg, 2 ml)
Dung dịch rửa tối ưu là
metanol-nước (40:60) có hoặc không có
acid formic 2% và metanol: dung
dịch amoniac (20:1) là dung dịch
rửa giải cuối cùng tốt nhất
Mẫu nước tiểu: pha loãng trực
tiếp 1000 lần
Trang 223.2 Thẩm định Phương pháp
Tính tuyến tính – Độ nhạy – Độ đặc hiệu
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Độ nhạy : Phân tích sắc ký đồ m/z đại diện
Mẫu trắng huyết tương (A) và LLOQ (B) của Fotagliptin
Trang 23Mẫu trắng huyết tương (C) và LLOQ (D) của IS
Trang 24Mẫu trắng huyết tương (E) và LLOQ (F) của M1
Trang 25Mẫu trắng huyết tương (G) và LLOQ (H) của M2-1
Trang 26• Mẫu trắng nước tiểu (A) và LLOQ (B) của Fotagliptin
• Mẫu trắng nước tiểu (C) và LLOQ (D) của IS
Trang 27• Mẫu trắng nước tiểu (E) và LLOQ (F) của M1
• Mẫu trắng nước tiểu (G) và LLOQ (H) của M2-1
Trang 293.2 Thẩm định Phương pháp
Độ phục hồi – Hiệu ứng nền
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Độ phục hồi của mẫu huyết tương: Hiệu quả chiết tách không
phụ thuộc nồng độ và đạt yêu cầu cho phân tích định lượng
Hiệu ứng nền: Phương pháp phân tích không bị ảnh hưởng bởi
chất nội sinh trong huyết tương và nước tiểu
Trang 30-80 °C – 10 tháng
Ba chu kỳ đóng băng
Trang 31-80 °C – 5 tháng
Ba chu kỳ đóng băng
Trang 323.2 Thẩm định Phương pháp
Độ ổn định
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Độ chính xác – Độ đúng của độ tin cậy pha loãng:
• Trong huyết tương: 0.9/ 0.7/ 1.8% – 95.7/ 100.3/ 109.7%
• Trong nước tiểu: 1.2/ 3.0/ 3.4% – 96.5/ 102.2/ 93.4%
(tương ứng Fotagliptin/M1/M2-1)
Các mẫu ULOQ pha loãng 10 lần (huyết tương) và
50 lần (nước tiểu) sẽ không ảnh hưởng đến độ
chính xác và độ đúng của phương pháp
Trang 33• Đối tượng: 56 người Trung Quốc khỏe mạnh
• Mô hình: Nghiên cứu đơn liều ngẫu nhiên, mù đôi, kiểm soát giả
dược và leo thang liều
• Phê duyệt: Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Đại học Y Liên minh Bắc
Kinh
• Số lượng mẫu: 840 mẫu huyết tương, 390 mẫu nước tiểu trong 25 đợt
chứng minh sự hữu hiệu của phương pháp
Trang 343.3 Áp dụng Phương pháp
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• Đường cong nồng độ trung bình trong huyết tương theo thời gian cho liều 12.5
mg Fotagliptin benzoate (viên nang)
• Đường cong tỷ lệ của thuốc được bài tiết ở dạng không đổi qua nước tiểu theo thời gian cho liều 12.5 mg
Fotagliptin benzoate (viên nang)
Trang 354 KẾT LUẬN –
TẦM NHÌN TƯƠNG LAI
Trang 364 KẾT LUẬN – TẦM NHÌN TƯƠNG LAI 4.1 Kết luận
• Phương pháp lần đầu tiên được phát triển và thẩm định
• Quy trình được thẩm định hoàn toàn theo hướng dẫn của FDA Hoa Kỳ, EMA và FDA Trung Quốc
Trang 374 KẾT LUẬN – TẦM NHÌN TƯƠNG LAI 4.2 Tầm nhìn tương lai
Trang 38CÁM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ
CHÚ Ý LẮNG NGHE